Протеомный профиль мочи здорового человека в норме и при действии факторов космического полета

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ПАСТУШКОВА Л.Х.

ПРОТЕОМНЫЙ ПРОФИЛЬ МОЧИ ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА

Москва 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор доктор физико-математических наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией системной биологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории метаболомного и протеомного анализа Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Научно-исследовательский институт питания"

доктор медицинских наук, профессор, начальник медико-социального управления государственного общественного объединения «Московский Дом ветеранов войн и Вооруженных Сил»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится «____» ___________ 2015 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д.76А.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ и на сайте Института медико-биологических проблем Российской академии наук.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д.76А

Автореферат разослан «____» _______________ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

1. Основная характеристика

Актуальность проблемы

В настоящее время одним из интенсивно развивающихся направлений системной биологии является протеомика, изучающая белковый состав клеток, тканей, биологических жидкостей, организмов с использованием высокопроизводительных методов масс-спектрометрии (Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Григорьев А.И., 2014; Mischak H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et. al., 2013). Протеомика появилась в результате постепенного развития и усложнения классических методов исследования белков, начиная с гравиметрических и фотометрических до диск-электрофореза, градиентного и двумерного электрофореза. В настоящее время достаточно уверенно поддаются идентификации до 15,5 тысяч белков человека (Court M. et al., 2011; Bensimon A., Heck A.J.R., Aebersold R., 2012). Известно, что функции в организме осуществляются белками, что справедливо и для адаптации, которая реализовывается путем изменения спектра и количества работающих белков, которые формируют мультибелковые комплексы, с одной стороны, и сложные функциональные и динамичные сети, с другой (Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В., 2009; Bose B., 2013). Организация в функциональные модули отражает сложность и разнообразие протеома на субклеточном, клеточном и органном уровне. Белки, синтезируемые в различных типах клеток, имеют значительное представительство в биологических жидкостях организма человека, таких как кровь, моча, слюна, конденсат выдыхаемого воздуха (Hiemstra T.F. et al., 2011; Metzger J. et al., 2013). Состав этих сред может дать представление о механизмах адаптационных перестроек функций, что имеет громадное фундаментальное значение для физиологии, поскольку вскрывает пути приспособления сложной системы, которой является живой организм, поддерживающий постоянство состава внутренней среды, и осуществляющий активный поиск наиболее оптимального и устойчивого состояния, к необычному и никогда не встречавшемуся в эволюции биосферы Земли фактору - невесомости (Нефедов В.П., Ясайтис А.А., Новосельцев В.Н., 1991; Наточин Ю.В., 2008).

Экстремальные условия представляют собой один из немногих способов, позволяющих вызвать отклонение гомеостаза у здорового человека, для распознавания механизмов поддержания постоянства состава внутренней среды и сохранения резервов здоровья, адаптивного потенциала организма (Балаховский И.С., Наточин Ю.В., 1973; Григорьев А.И., Ларина И.М., Носков В.Б., 2006; Leach Huntoon C.S., Grigoriev A.I., Natochin Yu.V., 1998; Norsk P. et al., 2000; Drummer C. et al., 2000; Kotovskaya A.R., Fomina G.A., 2013). Список методов (условий), этически дозволенных и доступных для воздействий на здорового человека, приводящих к отклонению его гомеостаза, относительно короткий и включает в себя физические нагрузки, использование фармпрепаратов, манипуляции с питанием (Ларина И.М., Иванисенко В.А., Николаев Е.Н., Григорьев А.И., 2014; Edwards L.M. et al., 2012) или директивные изменения в солепотреблении (Titze J. et al., 2002), функциональные нагрузочные пробы (Носков В.Б., 2013), экологические исследования, включая воздействие экстремальныx температур, гипербарии и гипоксии и, наконец, космический полет (Газенко О.Г., Григорьев А.И., Наточин Ю.В., 1980; Моруков Б.В., Ларина И.М., Григорьев А.И., 1998; Оганов В.Б., 2003; Корнилова Л.Н., Алехина М.И., Темникова В.В., с соавт., 2006; Фомина Г.А., Котовская А.Р., 2008; Kozlovskaya I.B. et al., 1988; Oganov V.S. et al., 2010).

В связи с современными аналитическими возможностями и фундаментальными научными запросами гравитационной физиологии возникает интерес к изучению белкового состава мочи, поскольку моча, как одна из биологических жидкостей организма человека, представляет собой привлекательный материал для использования в клинической диагностике и для теоретических исследований (Ларина И.М, с соавт. 2012; Mischak H., Thongboonkerd V., Schanstra J.P., Vlahou A., 2011; Metzger J. et al., 2012). Возможность многократного, самостоятельного (без помощи медперсонала) и не обременительного, неинвазивного сбора представительного для протеомики биологического материала, каковым является моча, принципиально важно в космической физиологии. Недостатками мочи, как источника данных о белковом составе внеклеточной жидкости, является низкая концентрация в ней белков, что выдвигает дополнительные требования к чувствительности аналитических методов (Николаев Е.Н., 2007; Nagaraj N. et al., 2012), высокая вариабельность белкового состава (Образцова О.А., 2013), обусловленная функциями почки по поддержанию водно-электролитного гомеостаза, а также предполагаемая трудность интерпретации результатов, полученных при исследовании данного биоматериала от здорового человека.

Протеомика достигла наиболее впечатляющих успехов в плане практического применения ее достижений именно в области исследований протеома мочи (He J.C. et al., 2012). Проект Human Kidney и Urine Proteome Project (HKUPP) (http://eurokup.org) был инициирован в 2005 году в рамках HUPO для содействия протеомным исследованиям в области нефрологии, понимания функции и патогенеза заболеваний почек, поиска биомаркеров и развития теоретических протеомных исследованиях в этой области (Vlahou A. et al., 2009; He J.C. et al. 2012).

Факторы космического полета вызывают адаптивные изменения во всех физиологических системах организма человека (Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1990; Баевский Р.М., с соавт., 2000; Оганов В.Б., 2003; Григорьев А.И., Козловская И.Б., Шенкман Б.С., 2004; Котовская А.Р. 2008; Носков В.Б., 2013). Это отражается на качественном и количественном составе белков, которые участвуют в адаптивных реакциях. Очевидно, белки, изменение уровня которых наблюдается в экстремальных условиях, не могут рассматриваться как потенциальные биомаркеры развития заболеваний, поскольку они участвуют в естественном молекулярном ответе организма в процессе адаптации к изменению условий жизнедеятельности (Пахарукова Н.А., 2010; Трифонова О.П., 2011; Киреев К.С., 2013; Образцова О.А., 2013; Mischak H. et. al., 2011; Metzger J. et. al., 2012).

Анализ белков с использованием различных биохимических методов, выполнявшийся ранее в космической биологии и медицине, не давал возможности прямого сравнения результатов в виду различной чувствительности и специфичности методов. Список исследованных белков в крови конкретного космонавта редко достигал 50 параметров (Попова И.А., с соавт., 1988; Григорьев А.И., Ларина И.М., 1999; Ларина И.М., 2003; Millet C. et al., 2001). Это является существенным ограничением при изучении механизмов изменения функций, поскольку большинство функций организма человека осуществляются значительно бтльшим числом белков. В свою очередь, это не позволяло получить и проанализировать целостную картину происходящих изменений. Современные протеомные методы дают возможность определять сотни белков за один хромато-масс-спектрометрический анализ с высокой точностью, специфичностью и чувствительностью (Nagaraj N. et al., 2012; Rodrнguez-Suбrez E. et al., 2014), что позволяет получить данные, пригодные для непосредственного сопоставления друг с другом и создать картину изменений композиции белков при воздействии факторов космического полета. Для понимания того, как формируются физиологические реакции на различные воздействия необходимо перебросить концептуальные и функциональные мостики от генетики к белкам, от белков к клеткам, далее к органам, и системам в организме (Hester R.L., Iliescu R., Summers R., Coleman T.G., 2011).

Таким образом, значение новых методов современной системной биологии имеет теоретический и прикладной аспекты, так как, основываясь на понимании физиологической адаптации здорового человека в экстремальных условиях, дают возможность разработать эффективные меры профилактики и коррекции неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлась характеристика протеома мочи здорового человека в норме и при действии реальных и моделируемых факторов космического полета для выявления и валидации биомаркеров адаптивных процессов.

В ходе работы решались следующие задачи:

- исследовать протеом мочи здорового человека (мужчин в возрасте от 19 до 54 лет);

- изучить возрастные особенности протеома мочи здоровых добровольцев;

- идентифицировать постоянную и вариабельную части протеома мочи здорового человека в нормальных условиях жизнедеятельности;

- изучить вариабельность белковой композиции мочи в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормы потребления соли в РФ;

- изучить характер адаптивных перестроек протеома мочи при воздействии различных факторов космического полета;

- исследовать характер адаптивных перестроек протеома мочи в острый период реадаптации после длительных космических полетов;

- адаптировать современные биоинформационные технологии для построения сетей молекулярных взаимодействий на основании данных по протеому мочи здорового человека.

Научная новизна

С помощью высокотехнологичных протеомных методов на основе хромато-масс-спектрометрии впервые охарактеризован протеом мочи здоровых добровольцев в возрасте от 19 до 54 лет, отобранных специальной врачебно-экспертной комиссией. Анализ протеома мочи позволил изучить и выявить возрастные особенности здоровых добровольцев.

Впервые показано, что белки, которые являются постоянными в протеоме мочи здорового человека, при его исследовании в течение длительного промежутка времени (530 суток), по своим молекулярным функциям и биологическим процессам, в которых они участвуют, имеют низкую функциональную связанность между собой.

Впервые показано, что протеом мочи может служить индикатором различных физиологических состояний организма здорового человека. В проведенных исследованиях проанализирована индивидуальная и групповая вариабельность белкового состава мочи здорового человека.

Впервые установлено, что состояние некоторых физиологических систем здоровых молодых мужчин, изменяется в зависимости от уровня солепотребления в диапазоне нормального суточного потребления соли в РФ (4-12г/сут.).

Анализ белковой композиции мочи впервые позволил выявить белки, принимающие участие как в период острой адаптации к антиортостатической гипокинезии, а также в восстановительный период после завершения эксперимента.

Впервые идентифицированы белки, которые демонстрируют ассоциативную связь с функциями выделительной системы и чувствительностью к иммерсионному воздействию, что подтверждается корреляцией встречаемости этих белков в образцах, собранных в различные периоды эксперимента с изменяющимися параметрами водно-солевого обмена.

Биоинформационными методами анализа, а также методом ручной аннотации белков и биологических процессов, впервые удалось связать хорошо известные и документированные ранее факты и физиологические особенности состояния космонавтов на первые сутки после завершения полетов, с выявленными в моче белками, участниками различных процессов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Практическая значимость работы заключается в идентификации белков, определении тканей, процессов, характеризующих протеом мочи здорового человека. Характерные изменения протеома мочи, обусловленные возрастными особенностями метаболизма и его регуляции, следует учитывать в клинически-ориентированных исследованиях протеома мочи, а также при поиске фармакологических мишеней для терапии.

Практическая значимость работы заключается в выявлении белков, которые могут представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме здорового человека при действии факторов космического полета, а также использоваться как стандарты при определении концентрации других белков в моче.

Полученные данные о изменениях протеома мочи в контролируемых условиях существенно расширяют современные представления о возможных механизмах влияния различного уровня приема соли (6 - 12 г/сутки) на организм человека.

Результаты исследования показателей, характеризующих протеомную композицию мочи при действии факторов космического полета, дают более полное представление о механизмах адаптации физиологических систем организма человека в острый период адаптации к земной гравитации.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1. Протеом мочи здорового человека, при изучении его высокотехнологическими методами на основе хромато-масс-спектрометрии, отличается вариабельностью, связанной как с возрастными особенностями метаболизма, так и с уровнем двигательной активности и характером рациона питания.

2. Анализ протеома мочи здорового человека в условиях действия на организм различных факторов выявляет сотни белков-участников адаптивных процессов, большинство из которых в этой связи ранее не изучалось.

3. Биоинформационные методы анализа позволяют верифицировать белковый состав образцов мочи через известные биохимические процессы и физиологические особенности состояния человека, как при наземном моделировании эффектов, так и при исследовании космонавтов после завершения полетов.

4. Данные протеома мочи, наряду с построением и анализом молекулярных сетей с участием выявляемых белков, предоставляют гипотезы о новых механизмах адаптации организма здорового человека.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях: Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 25-27 ноября 2009 г., Москва; French-Russian-Belorussian Conference: Neurovascular impairment induced byen vironmenta lconditions: molecular, cellular and functional approach. - French-Russian conference, Angers University, France, 10 - 14 March 2010; 31stAnnual International Gravitation Physiology Meeting: Trieste, Italy, 13 - 18 June, 2010; IV Всероссийской конференции-школе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», 8 - 12 августа 2011, Петрозаводск; 2-ой Международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика. Протеомика. Биоинформатика", Новосибирск, 2011; 10th HUPO World congress, Geneva, Switzerland, September 4 - 7, 2011; Космическом форуме 2011, посвященном 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина, 18 - 19 октября в Звездном городке; Международном симпозиуме, посвященном итогам выполнения проекта «МАРС-500», Москва, 23-25 апреля 2012; 33th Annual International Society for Gravitational Physiology Meeting, «Life in Space for Life on Earth», Aberdeen - United Kingdom, 18-22 June 2012; Proteomic Forum Berlin, Germany, 17 - 21 March, 201311th Annual World Congress HUPO, Boston, Massachusetts, USA, September 9-13, 2012; в Докладах III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», в Казани, 22-24 ноября 2012; 8th International Conference on «Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology» BGRS/SB-2012, Novosibirsk, Russia June 25-29, 2012; 12th Annual World Congress HUPO, Yokohama, Japan, September 14-19, 2013; «Human in space symposium» Cologne, Germany, July, 2013; French-Russian Conference «Head out water immersion symposium & Baroreflex and heart rate variability» Angers, France 28-30 April, 2014; The Ninth International Conference on Bioinformatics оf Genjme Regulation and Structure/Systems Biology, Novosibirsk, Russia, June 23-28, 2014; 13th Human Proteome Organization World Congress, October 5-8, Madrid, 2014.

По теме диссертации опубликовано 29 печатных работ, в том числе, 17 статьи в журналах из перечня Высшей Аттестационной Комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 23.12. 2014 г.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке программ Президиума РАН и Роскосмоса, а также грантов президента РФ «Поддержка ведущих научных школ» и РФФИ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 303 страницах и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 6 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 325 отечественных и 686 иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами и 20 рисунками, 3 графиками, 1 схемой.

2. Основное содержание работы

Объем и условия исследований

Содержание и общий объем проведенных исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1. Объем и структура исследований

Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Использовали образцы мочи 52 здоровых добровольцев в возрасте 19-54 лет, не подвергавшихся воздействиям и находившихся в привычных условиях жизнедеятельности.

Моделирование факторов космического полета в наземных условиях (105 и 520-суточные изоляции в гермообъеме, 5-суточная «сухая» иммерсия) проводили на экспериментальных стендах ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Общие условия проведения комплексных испытаний, циклограмма исследований, научно-практические цели экспериментов описаны Козловской И.Б. (2008), Моруковым Б.В. (2011). 21-суточная АНОГ -6° проводилась на базе исследовательского центра МЕДЕС (Тулуза) во Франции.

Исследования влияния факторов космического полета на протеомный профиль мочи были выполнены в рамках космического эксперимента «Протеом» до и после завершения длительных (169-199 суток) экспедиций на орбитальной космической станции МКС с участием 15 космонавтов.

В качестве контроля использовались образцы дублеров космонавтов. Эти лица проходили аналогичную подготовку, имели тот же рацион питания и водопотребления, что и члены основного экипажа. Все обследуемые космонавты и дублеры добровольно участвовали в эксперименте «Исследование протеома крови и мочи у основных и дублирующих членов экипажей до и после космических полётов на МКС («Протеом»).

Материалом для протеомного анализа мочи служила средняя порция второй утренней фракции, которая является наименее вариабельной по белковому составу и поэтому наиболее пригодной для протеомных исследований (Fiedler G.M. et al., 2007; Zьrbig P. et al., 2011).

Взятие проб мочи у космонавтов проводилось за 30-45 суток до старта и на 1-7-е сутки после приземления, у испытателей-добровольцев - в фоновом периоде, во время воздействия и после его завершения. Добровольцы, принимавшие участие в наземных экспериментах, были допущены врачебно-экспертной комиссией ГНЦ РФ - ИМБП РАН к проведению испытаний. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ-ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследованиях, было получено добровольное информированное согласие. Протокол эксперимента «Протеом» был одобрен Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН и Международным экспертным советом по исследованиям на человеке на МКС (HRMRB).

Методы исследований

Каждый образец мочи предварительно центрифугировали 10 минут при 4°С, 2 000 g для удаления загрязнений в виде крупных мертвых клеток, их фрагментов, отбирали надосадочную фракцию, которую замораживали при температуре -80°С для длительного хранения. В дальнейшем замороженные образцы размораживали при комнатной температуре и центрифугировали 10 минут при 4°С, 2 000 g.

Процедура подготовки образцов для протеомного анализа состояла из следующих этапов (Fliser D. et al., 2005; Mischak H. et al., 2007; Валеева О.А. с соавт., 2011):

1) концентрирование образцов (надосадочную жидкость) центрифугированием с использованием фильтров Amicon Ultra Ultracel-15 3k при 2 000 g, 50 минут, +4°C, до 20-ти кратного уменьшения объёма;

2) высушивание образцов в вакуумном концентраторе при +30°C;

3) восстановление (перерастворение осадка в буфере для восстановления - 0,2 М Tris основной (рН 8,5), 2,5 мМ EDTA, 6М Guanidine-HCL, добавление ДТТ - 15 минут при 70°C) и алкилирование (добавление йодацетата натрия - 30 минут при комнатной температуре в темноте) выделенной белковой фракции для денатурации белков, разрыва S-S мостиков и предотвращения обратного образования дисульфидных связей;

4) осаждение белков ацетоном с 0,1% ТФУ при -20оС 8-19 часов и получение сухого белкового осадка (при последовательной промывке три раза этанолом с перерастворением осадка, полученного центрифугированием при 2 000 g, 10 минут, +4°C);

5) трипсинолиз - образец растворяли в ABB ((NH4)2HCO3) буфере (pH 8,0) до конечной концентрации 1 мг/мл белка, определенной методом по Бредфорду (Bio-Rad), и добавляли трипсин 1:60 по массовым частям к белку и инкубировали при 37°C 8-12 часов.

С целью оценки вариабельности масс-спектров образцов мочи выполняли прямое профилирование образцов, после их концентрирования до 20-ти кратного уменьшения объема. Очистка и концентрация белков из проб мочи осуществлялась с помощью магнитных частиц MB-HIC («BrukerDaltonics») для специфического захвата протеинов и пептидов на основании гидрофобного взаимодействия перед последующим масс-спектрометрическим анализом методом MALDI-TOF (Fiedler G.M. et al., 2007). Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре Autoflex III TOF/TOF («Bruker Daltonics»), работающем в положительном линейном режиме в диапазоне масс от 1 000 до 17 000 Да. Далее по каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) для каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»). Эти данные экспортировали в таблицы MSExcel, и значения площадей в повторных измерениях усредняли. Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ Flex Analysis 3.0 и Statistica 6.0. Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows) (Tiss A. et al., 2007; Пахарукова Н.А., с соавт., 2009).

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия) - масс-спектрометра ионного циклотронного резонанса, совмещенного с линейной квадрупольной ионной ловушкой, использующейся для накопления ионов и получения спектров фрагментации (МС/МС) ионов, индуцированным столкновением. Весь анализ осуществлялся при помощи программы Xcalibur (ThermoElectron, Германия) в 2-х стадийном режиме автоматического измерения спектров.

Биоинформационные методы в анализе результатов включали поиск и идентификацию белков по базе данных IPI-human (международные индексы белков, International protein indices) (version 3.65; 86379 sequences; 34740770 residues) при помощи программы Mascot (MatrixScience, Великобритания; version 2.0.04) (Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S., 1999) на основе списка из точных масс пептидов и масс их фрагментов. Первым этапом поиска является сравнение измеренных масс продуктов МС-МС пептидов для всех записей последовательностей в базе данных с теоретическими масс-спектрами фрагментации. По степени совпадения определялся Mascot Score, являющийся индексом достоверности того, что детектируемым пептидам соответствует определенный белок из конкретной базы данных. Использовались следующие основные параметры для поиска: 1) enzyme - trypsin; 2) peptide tolerance ±5 ppm; 3) MS/MS (fragments) toletrance ±0,5 Дa. В списке белков, полученном в результате Mascot-поиска, достоверными считались только те белки, для которых были идентифицированы 2 и более триптических пептида с рейтингом (Score) более 24. Для автоматического отбора и сравнительного анализа белков, результаты Mascot-поиска обрабатывались с помощью специальной программы, разработанной в лаборатории профессора Е.Н. Николаева (Агрон И.А. с соавт., 2010).

Затем, для определения места образования, функции выявленных в моче белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют, использовались биоинформационные ресурсы: UniProt KB (Magrane M., Consortium U., 2011), Tissue-specific Gene Expression and Regulation (TiGER) [Liu X. et al., 2008] и Gene Ontology (GO) (Ashburner M. et al., 2000).

Для анализа тканеспецифичности экспрессии и тканевой локализации белков, выявленных в моче, использовались базы данных TiGER (LiuX. et al., 2008), The Human Protein Atlas (Uhlen M. et al., 2010), Pax DB (Wang M. et al., 2012), UniProt KB (Magrane M., Consortium U., 2011), DAVID (Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009). Для определения молекулярных функций, биологических процессов и клеточных компонент Gene Ontology использовалась база данных UniProt-GOA (file: gene_association.goa_human, Submission Date: 5/13/2013) (Dimmer E.C. et al., 2012). Для оценки сверхпредставленности биологических процессов, молекулярных функции, связанных с выявленными белками, использовался Hypergeometric test (Fisher'sexact test) с поправкой на множественное сравнение Benjamini-Hochberg. Расчеты проводились с помощью программы BiNGO (Maere S., Heymans K., Kuiper M., 2005). Сверхпредставленные процессы - это статистически значимо более представленные процессы в группе белков по сравнению с некоторой референсной (контрольной) группой. В качестве контроля выбирались все белки человека, для которых известны биологические процессы. Оценка представленности тканей проводилась с помощью программы DAVID (Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A., 2009), в которой использовался метод EASE score с поправкой Benjamini на множественное сравнение и база UPtissue. Построение ассоциативных генных сетей между белками осуществлялось с помощью AND System (Demenkov P.S., Ivanisenko T.V., Kolchanov N.A., Ivanisenko V.A., 2011).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Исследование протеома мочи здоровых добровольцев. Возрастные изменения

Известно, что протеом мочи характеризуется большой биологической вариабельностью, которую определяют не только генетическое различия индивидуумов, но и нормальные вариации почечной функции, которая оказывает влияние на концентрацию в моче тех или иных компонентов. Качественное изучение протеома мочи избавлено от влияния части из этих факторов, связано с частотой выявления белков, а не с концентрацией.

Исследование вариабельности протеома мочи в норме выполнено при анализе белковой композиции мочи 52 здоровых добровольцев в обычных условиях жизнедеятельности. Было идентифицировано 259 различных белков, для 141 из них тканевая принадлежность оказалась известной. Белки, присутствующие в моче, представляют почти все ткани организма. Наибольшая их часть экспрессируется в печени (32), почках (17), в клетках крови (13) (табл. 2).

Таблица 2. Тканевая представленность белков по базе данных TiGER

Данные белки являются участниками 715 биологических процессов, происходящих в различных клетках и тканях организма. Наибольшую группу составили внутриклеточные процессы (139), затем - процессы метаболизма и каскады сигнальных путей (117) (табл. 3).

Таблица 3. Группы биологических процессов, выявленные с помощью программы Gene Ontology

Выявление возраст-зависимых изменений состава белков в моче показало, что с возрастом число различных белков в моче здорового человека слабо, но достоверно увеличивается (R = 0.566, p-value=1.24E-05) (рис. 1).

Рисунок 1. Зависимость количества белков от возраста испытуемых

По современным представлениям, анатомо-функциональное старение в самих почках отражается на составе белков, выводимых с мочой (Glassock R.J., Rule A.D., 2012). Известно, что возрастное снижение веса почек начинается с 40-50 лет, к 70-80 годам достигает 10-30% (Rao U.V., Wagner H.N. Jr., 1972). Со временем происходит отложение коллагена в боуменовой капсуле, медиальная гипертрофия и гиалиноз артериол (Mancilla E. et al., 2008; Rule A.D. et al., 2010).

Исследована зависимость между молекулярной массой выводимых белков и возрастом добровольцев. Оказалось, что с возрастом достоверно увеличивается средняя молекулярная масса экспрессируемых белков (R= 0.428558, p-value=0.00079) (рис. 2).

Рисунок 2. Зависимость средней молекулярной массы белков от возраста

Среди анализируемых белков были выделены 23 белка, которые достоверно чаще встречаются в моче с увеличением возраста обследуемых (p<0.05). Для 21 из них тканевая принадлежность известна. Один белок - регулятор передачи сигналов через рецепторы, сопряженные с G-белком (RGSL1) (МD 125,69) достоверно исчезает с возрастом (табл. 4).

Таблица 4. Белки, достоверно чаще встречающиеся в моче с увеличением возраста добровольцев (p<0.05)

Для 23 белков, с помощью программы BiNGO было выявлено 30 сверхпредставленных процесса, которые были объединены в 9 групп (табл. 5).

Таблица 5. Группы процессов для 23 белков, достоверно чаще встречающихся в моче с увеличением возраста

Таким образом, среди значимо коррелирующих с возрастом сверхпредставленных процессов можно отметить процессы, связанные с адгезией, с функциями иммунной системы, метаболизмом углеводов, обменом витамина D, регуляцией апоптоза дендритных клеток, гемостазом и другие.

• 1. Постоянно присутствующие белки в моче здоровых людей

Достоверные источники для оценки вариабельности содержания тех или иных

белков в моче у здоровых лиц малочисленны (Sun W. et al., 2009; Liu X. et al., 2012; Lei T. et al., 2013). Используя преимущество контролируемых условий комплексного эксперимента с длительной изоляцией (520 суток), было проведено исследование протеомного состава мочи 6 здоровых добровольцев. В образцах мочи участников было обнаружено 256 различных белков, семь из которых присутствовали на протяжении всего исследования: эпидермальный фактор роста, полимерный рецептор иммуноглобулина, ингибитор сериновых протеаз плазмы, белок AMBP, цитокератин 1, коллаген альфа-1 (VI) цепи, сывороточный альбумин. Согласно базе данных TiGER, эти постоянные белки распределены по более, чем 20 тканям. Наибольшим количеством белков оказались представлены печень, плазма и моча (все 7 белков); следующими тканями по представленности являются кожа и тромбоциты (6 белков). Статистический анализ сверхпредставленности тканей показал, что печень является наиболее статистически значимо представленным органом. Согласно полученным данным, 5 из 7 постоянных белков могут экспрессироваться в печени, и попадать в мочу из крови. Вторым статистически значимо представленным источником постоянных белков оказались клетками крови.

Чтобы выяснить насколько постоянные белки являются связанными в молекулярно-генетических сетях, реконструировали ассоциативную генную сеть с помощью программы ANDSystem, в которой постоянные белки были стартовыми вершинами (или хабами) (рис. 3).

Рисунок 3. Ассоциативная сеть взаимодействия постоянных белков протеома мочи. Крупными красными шариками выделены постоянные белки. Мелкие красные шарики - добавленные при реконструкции новые белки, показывают отдельные взаимодействия между парой белков.

Из представленной сети видно, что постоянные белки оказались не сильно связанными друг с другом. Анализ сверхпредставленности молекулярных функций и биологических процессов GeneOntology показал низкую функциональную связанность этих белков между собой. Полученные данные позволяют заключить, что идентифицированные белки могут представлять собой независимые маркеры различных состояний и процессов в организме здорового человека, а также использоваться как стандарты при определении концентрации других белков в моче.

1.3. Влияние особенностей диеты (уровня солепотребления) на белковый состав мочи.

На характер протеома мочи воздействует целый комплекс факторов. Один из основных из них - это питание, в том числе, поступление в организм основных нутриентов, включая соль. Концепция идеального кардиоваскулярного здоровья, разрабатываемая в США, предусматривает регулирование потребления соли в качестве критически важной компоненты программы. Следует отметить, что нормы потребления соли в РФ в настоящее время выше, чем в Америке и Европе.

Анализ влияния различного уровня солепотребления на протеом мочи проводился в несколько этапов. Сначала определялся список белков, непосредственно связанных с различным режимом приема соли внутри эксперимента, затем анализировались ткани, в которых данные белки преимущественно эксперессируются, и, наконец, выполнялся анализ сверхпредставленных процессов, в которых данные белки участвуют.

Анализ включал в себя сравнение всего протеомного фенотипа, характеризующего композицию мочи в различные периоды эксперимента, как на регламентируемом приеме соли, так и на не контролируемом солепотреблении.

Было показано, что при 105-суточной изоляции в контролируемых условиях частота выявления 21 белка в моче достоверно коррелирует с изменением режима приема соли (табл. 6).

Таблица 6. Список белков, частота выявления которых в моче достоверно коррелирует с солепотреблением

Примечание: R - коэффициент корреляции Пирсона; corr p-value - p-value с поправкой Бенджамини Хокберга (BenjaminiHochberg) на множественность сравнения; adjust- поправка на множественность сравнения.

Рисунок 4. Ассоциативная сеть взаимодействия белков с NaCl, выявленных с помощью программы ANDvisio.

Мелкие красные шарики - добавленные при реконструкции молекулярных цепей «новые» белки (т.е. не выявляемые в данном исследовании), чёрные линии с зелёными точками показывают отдельные взаимодействия между парой белков.

С помощью программы ANDvisio была определена ассоциативная сеть взаимодействия данных белков с NaCl, где крупными красными шарами выделены белки, достоверно коррелирующие с солепотреблением (рис. 4).

Для 13 белков, достоверно коррелирующих с солепотреблением, была определена тканевая принадлежность с помощью базы Tiger (табл. 7).

Таблица 7. Список тканей, являющихся преимущественными источниками белков, связанных с уровнем солепотребления в контролируемых условиях

В этих тканях в 90 биологических процессах, участвуют белки, связанные с солепотреблением. Наиболее сверхпредставленными процессами среди них оказались: метаболизм (анаболизм и катаболизм) гликозаминогликанов; структурны морфогенез; процессы клеточной адгезии; организация внеклеточного матрикса.

На основе данных, полученных в 105-суточной изоляции, было выполнено построение протеомного фенотипа с использованием программы SOM - метода машинного обучения c построением самоорганизующихся карт. Основной принцип построения таких карт состоит в том, что белки с похожей временной динамикой частоты идентификации испытуемых группируются вместе, в то время как белки с различной динамикой стремятся локализоваться в различных областях карты. Для выделения протеомных фенотипов использовалось цветовое кодирование двумерной мозаики, отражающее на карте кластеры белков, обладающих повышенной (красный цвет) или пониженной (синий цвет) частотой выявления. Таким образом, в каждой временной точке эксперимента формировался единый ландшафт, представляющий собой «портрет» соответствующего протеомного фенотипа.

В дальнейшем эти изображения использовались для оценки сходства образцов и выбора дифференциальных характеристик. Частота выявления белков существенно менялась по ходу эксперимента, что отражалось в изменениях протеомных фенотипов. С помощью метода машинного обучения c построением самоорганизующихся карт, последовательно сгруппированы экспериментальные точки по трем временным периодам: «раннему», «промежуточному» и «позднему» (рис. 5).

Рисунок 5. Галерея ландшафтов белков, построенная с помощью самоорганизующихся карт, иллюстрирующая частоту их выявления в различных временных точках эксперимента.

Подобная кластеризаци позволила увидеть, как состояние физиологических систем добровольцев систематически и последовательно изменялось в течение эксперимента (табл. 8).

С помощью биоинформационных подходов было выявлено влияние изменений в уровне солепотребления (6-12г/день) как на динамику протеома мочи здоровых людей в контролируемых условиях, так и на активность протекающих биологических процессов.

В начальный период контролируемого солепотребления в 12 г/сут отмечались: максимальная активность синтеза белка, активация адаптивной иммунной системы, провоспалительных белков. Так же активировались процессы ангиогенеза, клеточной адгезии, процессы почечной экскреции натрия и регуляции водного баланса.

Таблица 8. Суммация эффектов, наблюдаемых при различном уровне солепотребления

Примечание: 1) обогащенный анализ; 2) PSF анализ; 3) представляющие собо...