Церебропротекторное, ноотропное и тимоаналептическое действие отечественных производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты при сахарном диабете

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЦЕРЕБРОПРОТЕКТОРНОЕ, НООТРОПНОЕ И ТИМОАНАЛЕПТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ 3-ОКСИПИРИДИНА И ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Рассохина Любовь Михайловна

Челябинск 2013

Работа выполнена на кафедре фармакологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Волчегорский Илья Анатольевич

Официальные оппоненты:

Воронина Татьяна Александровна Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" РАМН, лаборатория психофармакологии, заведующая

Венгеровский Александр Исаакович Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, кафедра фармакологии, заведующий

Новиков Василий Егорович доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздрава России, кафедра фармакологии с курсом фармации ФПК и ППС, заведующий

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «____»___________2013 года в _____часов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, по адресу: 454092, г.Челябинск, ул.Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан «______»__________________ 2013 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор медицинских наук Ю.С. Шишкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Одним из наиболее проблемных разделов лечения сахарного диабета (СД) является коррекция его поздних неврологических осложнений (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. М.: Медицина, 2005. 512 с.). Диабетические поражения нервной системы неизбежно возникают даже на фоне многолетней компенсации этого заболевания, достигнутой благодаря применению современных, эффективных и доступных сахароснижающих препаратов (Callaghan B.C., Hur J., Feldman E.L. Diabetic neuropathy: one disease or two? // Curr. Opin. Neurol. 2012. Vol. 25, № 5. Р. 536-541.). Высокая медико-социальная значимость нейропатических осложнений СД связана с нарастающей распространенностью, инвалидизирующими и жизнеугрожающими последствиями диабетических поражений периферической нервной системы (Дедов И.И., Удовиченко О.В., Галстян Г.Р. Диабетическая стопа. М.: Практическая медицина, 2005. 197 с.; Tesfaye S., Selvarajah D. Advances in the epidemiology, pathogenesis and management of diabetic peripheral neuropathy // Diabetes Metab. Res. Rev. 2012. Vol. 28, Suppl. 1. Р. 8-14.). Диабетические поражения центральной нервной системы (ЦНС) и, прежде всего, диабетическая энцефалопатия (ДЭ) привлекают внимание специалистов здравоохранения в значительно меньшей степени. Это связано с малосимптомной, «расплывчатой» клинической картиной и относительно медленным темпом прогрессирования начальных проявлений ДЭ. Тем не менее ДЭ характеризуется прогредиентным течением с самоускоряющиейся эскалацией аффективных расстройств и когнитивного дефицита, высоким риском фатальных цереброваскулярных катастроф и исхода в деменцию (Строков И.А., Захаров В.В., Строков К.И. Диабетическая энцефалопатия // Неврология, психиатрия, психосоматика. 2012, № 2. С. 30-40.). Развитие деменции на фоне прогрессирования ДЭ особенно часто отмечается у пациентов, страдающих СД 2 типа, которые также представляют собой группу риска по развитию болезни Альцгеймера (Hцlscher C. Diabetes as a risk factor for Alzheimer's disease: insulin signalling impairment in the brain as an alternative model of Alzheimer's disease // Biochem. Soc. Trans. 2011. Vol. 39, № 4. Р. 891-897). Накопленные к настоящему времени данные позволяют прогнозировать увеличение общего числа больных деменцией с 24 миллионов в 2001 году до 81 миллиона в 2040 году (Ferri C.P., Prince M., Brayne C. et al. Global prevalence of dementia: a Delphi consensus study // Lancet. 2005. Vol. 366, № 9503. Р. 2112-2117.). Это связано не только с увеличением популяционной доли пожилых и старых людей, но и со значительным нарастанием распространенности СД. В соответствии с текущим прогнозом предполагается, что к 2030 году число больных СД составит 552 миллиона человек, в основном за счет пациентов с СД 2 типа (Дедов И.И. Сахарный диабет - опаснейший вызов мировому сообществу // Вестн. РАМН. 2012. № 1. С. 7-13.). Несомненный прогресс в комплексном лечении СД способствует увеличению продолжительности жизни пациентов (Там же). Эти обстоятельства свидетельствуют о непрерывном нарастании медико-социальной значимости ДЭ, которая становится глобальной проблемой современного здравоохранения, требующей безотлагательного решения. Отсутствие стандартов диагностики, профилактики и лечения ДЭ диктует необходимость разработки эффективных, безопасных и экономически доступных подходов к предупреждению и терапии данного синдрома (Левин О.С., Ильясова Ф.Н. Когнитивные нарушения при сахарном диабете типа 2 // Consilium Medicum. 2012. Т. 14, № 9. С. 92-97.; Sima A.A. Encephalopathies: the emerging diabetic complications // Acta Diabetol. 2010. Vol. 47, № 4. Р. 279-293.).

В качестве перспективных лекарственных средств (ЛС) для решения этой задачи можно рассматривать оригинальные отечественные производные 3-оксипиридина (3-ОП) и янтарной кислоты (ЯК). Первым зарегистрированным препаратом этой группы является эмоксипин (2-этил-6-метил-3-оксипиридина гидрохлорид), синтезированный в начале 1960-х годов в Институте биохимической физики РАН Л.Д. Смирновым, В.И. Кузьминым, К.М. Дюмаевым, С.Б. Гашевым. Его действие подробно изучено группой исследователей под руководством академика РАН Н.М. Эммануэля (Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС. М.: Изд-во Института биомедицинской химии РАМН, 1995. 271 с.). Эмоксипин используется в основном в офтальмологической практике. В начале 1980-х годов в ГУ НИИ фармакологии РАМН Л.Д. Смирновым и В.И. Кузьминым синтезирован мексидол (2-этил-6-метил-3-тлоксипиридина сукцинат). Его фармакологическая активность изучена Т.А. Ворониной, С.Б. Середениным, А.В. Еремеенко, Л.Д. Лукьяновой и др. под общим руководством академика РАМН А.В. Вальдмана (Середенин С.Б., Воронина Т.А. Современная фармакотерапия эмоционально-стрессовых расстройств // Вестн. эстетической медицины. 2009. Т. 8, № 3. С. 32-40.). Широкий спектр фармакологических эффектов мексидола может быть сведен к двум основным действиям: собственно нейропротекторному и вазотропному (Воронина Т.А. Мексидол: спектр фармакологических эффектов // Журн. неврологии и психиатрии. 2012. № 12. С. 86-90.). Это делает его особенно перспективным для лечения ДЭ, которая справедливо рассматривается как дисциркуляторно-метаболическая патология головного мозга (Коркина М.В., Елфимова Е.В. Диабет и когнитивное старение // Журн. неврологии и психиатрии. 2004. № 3. С. 80-84.). На сегодняшний день не сформулированы четкие отличия в спектре фармакологических эффектов эмоксипина и мексидола. Мексидол отличается от эмоксипина наличием сукцинатного аниона. В связи с этим заслуживает внимания препарат ЯК реамберин, разработанный и внедренный в клиническую практику в начале 2000-х годов специалистами отечественной фармацевтической компании ООО «НТФФ«ПОЛИСАН» (Реамберин: реальность и перспективы: сб. науч. ст. СПб, 2002. 168 с.). В настоящее время реамберин интенсивно применяется в качестве антигипоксического и дезинтоксикационного средства.

Эмоксипин, реамберин и мексидол, представляющие своеобразный ряд производных 3-ОП и ЯК, были подробно изучены при дистальной симметричной сенсомоторной полинейропатии у больных СД. Они продемонстрировали выраженное антинейропатическое действие и способность к снижению коморбидных тревожно-депрессивных расстройств (Волчегорский И.А., Москвичева М.Г., Чащина Е.Н. Влияние антиоксидантов на проявления сенсомоторной полиневропатии и аффективные нарушения при сахарном диабете // Журн. неврологии и психиатрии. 2005. Т. 105, № 2. С. 41-45.). Основой терапевтического эффекта производных 3-ОП и ЯК принято считать их антиоксидантное и антигипоксическое действие (Галенко-Ярошеский В.П., Гулевская О.Н., Зеленская А.В. и др. Современные проблемы коррекции нарушений окислительного гомеостаза в практике экспериментальной фармакологии // Новые технологии. 2011. № 2. С. 166-171.). Это свидетельствует об актуальности и перспективности изучения эффективности эмоксипина, реамберина и мексидола в лечении ДЭ. Особого внимания заслуживает сопоставление их потенциальных церебропротекторных эффектов с действием б-липоевой кислоты (б-ЛК), которая в течение длительного времени рассматривалась в качестве эталонного средства лечения диабетических нейропатий (Ziegler D., Tritschler H.-J., Строков И.А. и др. Лечение диабетической полиневропатии тиоктовой кислотой // Фарматека. 2008. № 17. С. 28-36.).

Цель исследования

Провести сравнительное экспериментальное изучение церебропротекторного, ноотропного и тимоаналептического действия производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты (эмоксипина, реамберина и мексидола) при сахарном диабете в сопоставлении с их влиянием на расстройства углеводного и липидного обмена, а также в зависимости от их антиоксидантной, антигипоксической, сахароснижающей и инсулин-потенциирующей активности. Оценить возможности клинического применения производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты с целью коррекции аффективных нарушений и когнитивного дефицита у больных сахарным диабетом. оксипиридин янтарный кислота диабет

Задачи исследования

1. Изучить влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на устойчивость к острой гипоксии и чувствительность к инсулину в зависимости от способности исследуемых препаратов модулировать липидную пероксидацию in vitro.

2. Изучить влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на толерантность к нагрузке глюкозой.

3. Изучить влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на выраженность гипергликемии при аллоксановом диабете.

4. Изучить влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на выраженность дислипидемии и состояние системы «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита» при аллоксановом диабете.

5. Изучить влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на изменения клеточного состава и гистохимические проявления оксидативного стресса в кортикальных и диэнцефальных структурах головного мозга крыс с аллоксановым диабетом.

6. Изучить влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на выраженность расстройств мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения экспериментальных животных с аллоксановым диабетом.

7. Провести экспериментальное сопоставление терапевтической эффективности производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты при аллоксановом диабете с действием б-липоевой кислоты, используемой в качестве препарата сравнения.

8. Изучить зависимость выраженности метаболических, церебропротекторных и психотропных эффектов производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты, а также б-липоевой кислоты от дозировок и кратности введения соответствующих лекарственных препаратов животным с экспериментальным сахарным диабетом. Сопоставить полученные данные с влиянием производных 3-оксипиридина, янтарной и б-липоевой кислоты на липидную пероксидацию in vitro, чувствительность к инсулину, толерантность к сахарной нагрузке и устойчивость к гипоксии.

9. На основании анализа результатов экспериментальных исследований выявить среди изучаемых производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты наиболее эффективное и безопасное лекарственное средство и провести его клинико-фармакологическую и фармакоэкономическую оценку в сравнении с препаратом б-липоевой кислоты по влиянию на качество жизни, аффективные и когнитивные расстройства у больных сахарным диабетом в сопоставлении с влиянием на показатели углеводного, липидного обмена и систему «перекисное окисление липидов - антиоксидантная защита».

Методология и методы исследования

Работа включает экспериментальный и клинико-фармакологический разделы. Экспериментальный раздел исследования был осуществлен на лабораторных грызунах (мыши, крысы) с использованием модели аллоксанового диабета. В период с 4 по 17 день после индукции аллоксанового диабета проведено изучение церебропротекторного, ноотропного и антидепрессивного действия эмоксипина, реамберина и мексидола в сопоставлении с их влиянием на расстройства углеводного и липидного обмена, а также в зависимости от их антиоксидантной, антигипоксической, сахароснижающей и инсулин-потенциирующей активности. В качестве препарата сравнения изучалась б-липоевая кислота. Клинико-фармакологический раздел исследования был посвящен клинической и фармакоэкономической оценке наиболее эффективного и метаболически безопасного производного 3-оксипиридина и янтарной кислоты, отобранного по результатам экспериментальной терапии. Клиническая эффективность применения этого ЛС была сопоставлена с действием б-липоевой кислоты в рамках краткосрочного, проспективного, плацебо-контролируемого, простого «слепого», рандомизированного исследования влияния изученных препаратов на динамику нарушений аффективного статуса, когнитивных функций, качества жизни, показателей углеводного и липидного обмена у больных СД. В работе использованы биохимические, гистологические, гистохимические, морфометрические, клинико-лабораторные, психометрические, фармакоэкономические, статистические методы исследования.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достаточный массив фактических данных, избранный дизайн и методы исследования, адекватные сформулированным в работе целям и задачам, корректный и разносторонний статистический анализ обеспечили достоверность полученных результатов, сформулированных выводов, положений и рекомендаций.

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы в материалах Российского национального конгресса кардиологов «Повышение качества и доступности кардиологической помощи» (Москва, 2008), 2-го Чешско-Российского медицинского Форума «Инновационные технологии в медицине» (Чехия, Брно, 2008), V Российской конференции с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008), 3-го Международного Китайско-Российского фармакологического симпозиума (Китай, Харбин, 2008), научной сессии, посвященной 65-летию медицинской академии «Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения» (Челябинск, 2009), Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» (Челябинск, 2009), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Ученые Урала и Сибири - развитию отечественной фармации: от синтеза до инновационных лекарственных средств» (Новосибирск, 2011), Конгресса «Здравоохранение Российской Федерации, стран СНГ и Европы» (Москва, 2011), Российской научно-практической конференции «Фундаментальные вопросы гематологии. Достижения и перспективы» (Челябинск, 2012), IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012).

Апробация работы состоялась на расширенном заседании кафедры фармакологии с участием сотрудников кафедры профессиональных болезней и клинической фармакологии, кафедры клинической фармакологии и терапии факультета дополнительного профессионального образования Государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России) с приглашением врачей клинических баз, на которых выполнялось исследование.

Автор лично теоретически разработал и практически реализовал концепцию исследования на основе научно-информационного поиска, выполнения экспериментального раздела работы на лабораторных животных, организации многоцентрового клинического исследования, проведения комплексного психометрического обследования больных, организации и контроля за выполнением лабораторных исследований, самостоятельной статистической обработки первичных данных, анализа и интерпретации ее результатов. Автором лично сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы, практические рекомендации, написан текст диссертации.

Положения, выносимые на защиту

1. Моделирование аллоксанового диабета приводит к раннему развитию гипергликемии, дислипидемии и оксидативного стресса, сопровождающихся быстропрогрессирующим нарушением клеточного состава кортикальных и диэнцефальных структур головного мозга с сопутствующими расстройствами мотивированного поведения экспериментальных животных и их способности к условнорефлекторному обучению.

2. Оригинальные отечественные производные 3-оксипиридина и янтарной кислоты (эмоксипин, реамберин и мексидол) обладают модулирующим влиянием на липидную пероксидацию, устойчивость к гипоксии, чувствительность к инсулину, толерантность к нагрузке глюкозой и могут быть использованы для коррекции метаболических, нейроморфологических и поведенческих расстройств при экспериментальном сахарном диабете.

3. Применение эмоксипина, реамберина и мексидола при аллоксановом диабете корригирует гипергликемию в зависимости от способности изученных лекарственных средств увеличивать толерантность к сахарной нагрузке, а также уменьшает дислипидемию в зависимости от их антигипоксической активности.

4. Курсовое применение производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты при аллоксановом диабете корригирует СД-ассоциированные нарушения клеточного состава церебральных структур, а также сопутствующие расстройства мотивированного поведения и условнорефлекторного обучения в зависимости от характера влияния изученных лекарственных средств на липидную пероксидацию.

5. Эмоксипин, реамберин и мексидол не уступают по своей терапевтической эффективности при аллоксановом диабете б-липоевой кислоте.

6. Мексидол, одновременно являющийся производным 3-оксипиридина и янтарной кислоты, характеризуется оптимальным балансом между терапевтической эффективностью и метаболической безопасностью при аллоксановом диабете. Это позволяет рассматривать мексидол как предпочтительное производное 3-оксипиридина и янтарной кислоты для клинического применения у больных сахарным диабетом.

7. При курсовом двухнедельном введении больным сахарным диабетом мексидол не уступает б-липоевой кислоте по корригирующему влиянию на параметры углеводного обмена и аффективного статуса.

Научная новизна

Впервые проведено целенаправленное систематическое изучение структурно-родственных отечественных производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты (эмоксипина, реамберина, мексидола) на проявления экспериментальной диабетической энцефалопатии.

Впервые показано, что моделирование аллоксанового диабета в эксперименте на крысах приводит к формированию нейроморфологических и поведенческих проявлений диабетической энцефалопатии уже через 96 часов после введения аллоксана с дальнейшим непрерывным прогрессированием на протяжении последующих двух недель.

Впервые показано, что наличие сукцинатного аниона в структуре отечественных производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты способствует развитию прооксидантного эффекта и ограничивает антиоксидантное действие 3-оксипиридинового катиона.

Впервые установлено инсулин-потенциирующее действие эмоксипина и реамберина, а также способность эмоксипина, реамберина и мексидола увеличивать толерантность к нагрузке глюкозой. Впервые продемонстрировано, что позитивное влияние производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты на толерантность к нагрузке глюкозой прямо зависит от их антигипоксического потенциала. Впервые показано, что курсовое применение эмоксипина, реамберина, мексидола и б-липоевой кислоты при аллоксановом диабете корригирует гипергликемию в прямой зависимости от способности изученных лекарственных средств увеличивать толерантность к сахарной нагрузке.

Впервые показано, что влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на выраженность дислипидемии при аллоксановом диабете существенно зависит от их антигипоксической активности.

Впервые продемонстрировано, что наличие 3-оксипиридинового катиона в структуре отечественных производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты и их антиоксидантная активность in vitro играют определяющую роль в реализации церебропротекторного, ноотропного и гипогликемизирующего эффектов изученных лекарственных средств при аллоксановом диабете. Показано, что наличие сукцинатного компонента в структуре отечественных производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты определяет преимущественную локализацию церебропротекторного действия этих лекарственных средств на уровне поверхностных слоев первичной соматосенсоной коры крыс с аллоксановым диабетом.

Впервые показано, что отечественные производные 3-оксипиридина и янтарной кислоты не уступают б-липоевой кислоте, изученной в качестве препарата сравнения, по способности корригировать метаболические, нейроморфологические и когнитивно-аффективные нарушения при сахарном диабете.

Теоретическая и практическая значимость работы

Установленные факты отражают новые, ранее неизвестные аспекты фармакодинамики отечественных производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты (эмоксипина, реамберина и мексидола) при лечении сахарного диабета. Установленные факты свидетельствуют о том, что антиоксидантная и антигипоксическая активность является определяющей в реализации корригирующего влияния изученных лекарственных средств на расстройства метаболизма и поражение центральной нервной системы при сахарном диабете.

Полученные в процессе диссертационной работы результаты свидетельствуют о целесообразности включения мексидола в схему комплексного лечения сахарного диабета. Подобное расширение стандартных схем лечения сахарного диабета позволит рассчитывать на эффективную и безопасную коррекцию нарушений углеводного обмена и аффективного статуса больных.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России на кафедре Фармакологии в разделе «Средства, влияющие на центральную нервную систему» по темам «Антидепрессивные средства», «Ноотропные средства», на кафедре Химии фармацевтического факультета при изучении фармацевтической и токсикологической химии в разделе «Алифатические органические соединения» по теме «Предельные карбоновые кислоты», в разделе «Группы веществ, изолируемых экстракцией и сорбцией» по теме «Химико-токсикологический анализ производных барбитуровой кислоты» и в вариативной дисциплину по выбору «Спектральные методы в современном анализе», на кафедре Госпитальной терапии № 2 в цикле «Эндокринология» по теме «Дифференциальная диагностика при синдроме гипергликемии. Стандарты диагностики и лечения сахарного диабета», а также в модуле специальных дисциплин по теме «Сахарный диабет» для интернов по специальности «Терапия», «Эндокринология» и ординаторов по специальности «Общеврачебная практика (семейная медицина)».

Результаты диссертационного исследования используются в клинической практике МБУЗ «Ордена Трудового Красного Знамени Городская клиническая больница №1» и МБУЗ «Городская клиническая больница №9» г.Челябинска, а также Клиники ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России.

Публикации

Соискатель имеет 76 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 27 научных работ общим объемом 6 печатных листов, в том числе 18 статей в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий для опубликования основных научных результатов диссертаций. Соискателем опубликовано 7 работ в материалах всероссийских и международных конференций и симпозиумов, 2 статьи - в региональных изданиях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 344 листах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 48 таблицами, 20 рисунками. Список литературы содержит 525 источников, из которых 230 опубликовано в отечественной литературе и 295 - в зарубежных изданиях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнялась в 2006-2012гг. на кафедре фармакологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России (с 1.04.2013г. - ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России), на базе эндокринологических отделений МБУЗ «Ордена Трудового Красного Знамени Городская клиническая больница №1» и МБУЗ «Городская клиническая больница №9» г.Челябинска, а также центра «Диабетическая стопа» Клиники ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России в соответствии с планом научно-исследовательских работ по темам «Фармакология оксидативного стресса и иммуно-эндокринных взаимодействий» (№ госрегистрации 0120.0 511655) и «Клинико-экспериментальное изучение новых аспектов фармакодинамики производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты и обоснование их применения по новым показаниям» (№ госрегистрации 012011533159).

Экспериментальный раздел работы выполнен на 973 белых беспородных мышах массой 18-25 г и 893 белых беспородных крысах массой 140-250 г. Организация работы соответствовала этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных (Копаладзе Р.А. Регламентация экспериментов на животных - этика, законодательства, альтернативы // Успехи физиологических наук. 1998. Т. 29, № 4. С. 74-92.), отражённым в международных и российских нормативно-правовых документах (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123 от 18 марта 1986г. Страсбург, 1986. 15 с.; Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19 июня 2003г. М., 2003. 22 с.). Эвтаназию грызунов осуществляли диэтиловым эфиром ингаляционно. Основные характеристики изученных лекарственных препаратов представлены в таблице 1.

Таблица 1

Лекарственные препараты, использованные в исследовании

Исследуемые препараты вводили лабораторным животным в дозах, экстраполированных из разовых дозировок терапевтического диапазона для человека с учётом различий в величинах относительной площади поверхности тела (Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников и др. Челябинск: Изд-во Челябинского гос. пед. ун-та, 2000. 167 с.). Во всех случаях минимальной дозой изучаемого диапазона являлась Ѕ от расчетного эквивалента средней терапевтической дозы (ЭСТД). В качестве максимальной дозировки использовался удвоенный ЭСТД (таблица 2). Исследуемые препараты разводили в 0,9 % растворе NaCl и применяли внутрибрюшинно. Животные контрольных подгрупп получали тем же путем соответствующие объемы 0,9 % раствора NaCl.

Для оценки антиоксидантного потенциала исследуемых препаратов изучалось их действие на липопероксидацию in vitro. Влияние изучаемых ЛС на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) in vitro оценивали по изменениям накопления веществ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой в 2% гомогенатах головного мозга крыс, инкубируемых в атмосфере воздуха при 37⁰С в течение 60 минут (Там же, с. 9). ПОЛ-модулирующее действие каждого ЛС изучали в диапазоне от нано- до миллимолярной концентрации.

Таблица 2

Разовые дозы использованных лекарственных препаратов

В экспериментах по изучению влияния эмоксипина, реамберина, мексидола и б-ЛК на чувствительность к инсулину in vivo изученные ЛС вводили интактным крысам однократно внутрибрюшинно, после чего проводили струйную внутривенную инфузию нейтрального раствора инсулина для инъекций (Хумулин регуляр, «Eli Lilly», Франция) в дозе 40 IU/кг. Чувствительность животных к инсулину оценивали по латентности развития инсулиновой комы (Там же, с.9).

В экспериментах по оценке влияния эмоксипина, реамберина, мексидола и б-ЛК на толерантность к нагрузке глюкозой через 30 минут после однократного введения ЛС у крыс забирали кровь из хвостовых вен для регистрации исходных значений гликемии и выполняли тест толерантности к глюкозе (ТТГ). С этой целью применяли нагрузку глюкозой в дозе 2 г/кг (5 мл/кг 40% раствора глюкозы, внутрибрюшинно). Изменения гликемии в динамике ТТГ регистрировали через 60 и 120 минут после сахарной нагрузки.

Для оценки антигипоксического потенциала изученные препараты вводили мышам за 30 минут до моделирования острой гипоксической гипоксии. Влияние эмоксипина, реамберина, мексидола и б-ЛК на устойчивость к гипоксии оценивали по латентности асфиксической гибели мышей в тесте «асфиксии утопления» (Кулинский В.И., Ольховский И.А., Ковалевский А.Н. Защитное действие агонистов б-адренорецепторов при гипоксической гипоксии // Бюл.экспериментальной биологии и медицины. 1986. № 6. С. 669-671.).

Моделирование аллоксанового диабета у крыс осуществляли путем внутрибрюшинного введения аллоксана тригидрата («La Chema», Чехия) или аллоксана моногидрата («ДИА^эМ», Россия) в эквивалентных дозах (200 мг/кг и 163 мг/кг соответственно). Экспериментальный СД у мышей вызывали путем подкожного введения аллоксана тригидрата или аллоксана моногидрата в дозах 300 мг/кг и 245 мг/кг соответственно. Через 72 часа после индукции СД животных, получивших инъекцию аллоксана, равномерно распределяли на подгруппы экспериментальной терапии и контроля. Каждый препарат вводили животным внутрибрюшинно 1 раз в сутки на протяжении 1, 7 и 14 дней. Для предотвращения фатального кетоацидоза и гибели животных, начиная с 4 дня после инъекции аллоксана всем лабораторным грызунам с 7-ми и 14-дневным курсом терапии экспериментального СД проводили базисную инсулинотерапию путем подкожного введения инсулина аспарта двухфазного (НовоМикс 30 Пенфилл, «Novo nordisk», Дания) в дозах 3 IU/кг для крыс и 6 IU/кг для мышей. Через сутки после окончания экспериментальной терапии оценивали параметры мотивированного поведения животных, которых затем наркотизировали диэтиловым эфиром, декапитировали и получали кровь для биохимических исследований. У крыс дополнительно извлекали головной мозг для последующего гистологического изучения.

Выраженность расстройств углеводного обмена у крыс и мышей оценивали по показателям гликемии натощак глюкозооксидазным методом с помощью стандартных наборов («Новоглюк - К, М (500)», ЗАО «Вектор - Бест», Новосибирск). Дополнительно в сыворотке крови крыс регистрировали концентрацию фруктозамина (ФА) в мкМоль/1г альбумина (Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.). О состоянии липидного обмена у крыс судили по содержанию общего холестерина (ОХС) и триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови (Там же). Уровень продуктов ПОЛ в сыворотке крови определяли спектрофотометрически с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г. и др. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови // Вопр. мед. химии. 1989. Т. 35, № 1. С.127-131.). Результаты выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.) - Е₂₃₂/Е₂₂₀ (относительное содержание диеновых коньюгатов; ДК) и Е₂₇₈/Е₂₂₀ (уровень кетодиенов и сопряженных триенов; КД и СТ). О состоянии антиоксидантной защиты (АОЗ) судили по содержанию б-токоферола (б-ТК) и церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови. Концентрацию б-ТК определяли с использованием реактива Эммери-Энгель и поправкой на оптическое поглощение каротинов (Спиричев В.Б., Матусис И.И., Бронштейн Л.М. Витамин Е // Экспериментальная витаминология: справочное рук. Минск, 1979. С. 18-57.). Уровень ЦП регистрировали модифицированным методом Ревина (Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. Минск, 1976. 311 с.).

Образцы головного мозга крыс разделяли на отделы по методу J. Glovinsky and L.L. Iversen (Glowinski J., Iversen L.L. Regional studies of catecholamines in the rat brain. I. The disposition of H3-norepinephrine, H3-dopamine and H3-DOPA in various regions of the brain // J. Neurochem. 1966. Vol. 13, № 8. P. 655-669.). Для гистологического анализа отбирали участки первичной соматосенсорной коры (слои I-III и IV-VI поля Par 1), гиппокамп (поле СА1) и гипоталамус (паравентрикулярное ядро - ПВЯ). Гистологические срезы окрашивали по методу Ниссля для выявления нейронов, по методике Снесарева для выявления астроцитов и по технологии Мийагавы в модификации Александровой для выявления олигодендроцитов и микроглиоцитов, для выявления липофусцина применяли окраску по Шморлю (Сапожников А.Г., Доросевич А.Е. Гистологическая и микроскопическая техника: рук. Смоленск: САУ, 2000. 476 с.). Морфометрический анализ гистологических препаратов проводился на микроскопе Leica DMRXA с помощью компьютерной программы ImageScope (Германия) в 10 полях зрения. Количество клеток всех изученных популяций рассчитывали на 1 мм² среза. Дополнительно учитывали процентную долю площади нейронов, занимаемую тигроидной зернистостью, а также процентную долю нейронов, содержащих липофусцин. При изучении структур гиппокампа проводилась регистрация пирамидных и корзинчатых нейронов с последующим исчислением их процентного и абсолютного содержания.

Для изучения влияния ЛС на аффективный статус лабораторных животных с аллоксановым диабетом проводилось исследование их поведения в тесте «открытое поле». При наблюдении за крысами применялся вариант актографа, разработанный И.А. Волчегорским и соавт. (Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников и др. Челябинск: Изд-во Челябинского гос. пед. ун-та, 2000. 167 с.), при работе с мышами - описанный в работе M.L. Weischer (Weischer M.L. Eine einfache versuchsanordnung zur quantitativen beurteilung von motilitat und neugierverhalten bei mausen // Psychopharmacology. 1976. Vol. 50. P. 275-279.). По завершении тестирования крыс в «открытом поле» оценивали их способность к выработке условного рефлекса активного избегания (УРАИ) плаванием за одну попытку (Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж.П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991. 399 с.). О качестве формирования УРАИ судили по кратности снижения латентного периода избегания через 24 часа после обучающей попытки. После завершения тестирования мышей в «открытом поле» выполняли шестиминутный тест подвешивания за хвост с регистрацией длительности «поведения отчаяния», являющегося гомологом депрессивных расстройств у человека (Steru L., Chermat R., Thierry B. et al. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice // Psychopharmacology. 1985. № 85. P. 367-370.).

Клинико-фармакологический раздел исследования одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Минздрава России (протокол № 1 от 14 сентября 2010г.) и соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации последнего пересмотра (WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/index.html.) и Национального стандарта Российской Федерации (Надлежащая клиническая практика: ГОСТ Р 52379-2005. М.: Стандартинформ, 2005. 39 с.). Все больные подписывали Форму информированного согласия до момента включения в исследование. Отбор больных для исследования осуществлялся в соответствии с клиническими критериями включения и исключения.

Критерии включения: СД 1 типа (инсулинзависимый) - E10, СД 2 типа (инсулиннезависимый) - E11.

Критерии исключения: длительность СД менее 6 месяцев, острые осложнения СД, острый коронарный синдром, острые нарушения церебрального кровообращения, острые инфекционные заболевания, ишемическая форма синдрома диабетической стопы (СДС), диабетическая нефропатия III-IV стадии, онкологические заболевания, алкоголизм, беременность, лечение препаратами ацетилцистеина, аллилтиамина и токоферола, любое неблагоприятное изменение состояния в процессе комплексного лечения.

С помощью процедуры динамической рандомизация пациенты были распределены на три группы. Больным 1 группы дополнительно к базисному лечению проводили ежедневное внутривенное капельное введение 200 мл «поляризующей смеси» (10 мл 4% раствора калия хлорида, 10 мл раствора панангина, 4 единицы инсулина в 200 мл 5% раствора глюкозы). Данное воздействие рассматривалось как «активная плацебо-терапия» (Аведисова А.С., Чахова О.В., Люпаева Н.В. Плацебо-эффект в психиатрии: обзор литературы // Рос. психиатр. журн. 2003. № 3. С. 65-71.). Больные 2 группы ежесуточно получали внутривенные капельные инфузии 300 мг мексидола в 200 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Больным 3 группы тем же путем ежедневно вводили 600 мг б-ЛК, разведенной в 200 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Длительность инфузионной терапии во всех группах составила 14 дней. В процессе выполнения работы из исследования выбыли два пациента, оставшиеся 90 больных были включены в анализ эффективности исследованных ЛС.

У всех больных, включенных в исследование, была выявлена дистальная симметричная сенсомоторная полинейропатия с признаками нейропатической и нейроишемической форм СДС 0 - I стадии по Wagner (Wagner F.W. A classification and treatment program for diabetic, neuropatic and dysvascular foot problems // The American Academy of Ortopaedic Surgeons instructional course lectures. St. Louis: Mosby Year Book, 1979. P. 143-165.). 78 пациентов страдало артериальной гипертонией, 74 - энцефалопатией смешанного (дисциркуляторно-метаболического) типа, у 7 больных имелись указания на острое нарушение мозгового кровообращения в анамнезе. У многих пациентов было диагностировано ожирение (39 больных), катаракта (33 человека), ишемическая болезнь сердца (29 пациентов). Несколько реже отмечалась диабетическая ретинопатия, диабетическая нефропатия с хронической почечной недостаточностью 0 - II стадий, хронический пиелонефрит, патология гепатобиллиарной системы и остеохондроз. В отдельных случаях наблюдались язвенная болезнь желудка и 12-перстной кишки, хронический панкреатит, остеоартроз, бронхиальная астма и хроническая обструктивная болезнь легких, гипотиреоз, узловой зоб, доброкачественная гиперплазия предстательной железы и паркинсонизм.

Наряду с препаратами инсулина и (в случае СД 2 типа) пероральными сахароснижающими средствами всем больным проводили терапию поздних осложнений СД и сопутствующих заболеваний. Межгрупповое сопоставление частоты назначения средств базисной терапии продемонстрировало отсутствие достоверных различий по большинству перечисленных позиций (p = 0,093 - 0,936). Единственное исключение составила частота назначения индапамида, которая оказалась выше в группе больных, получавших б-ЛК (p = 0,022). Исходные различия подобного рода допускаются в контролируемых исследованиях эффективности ЛС при условии сопоставимости сформированных групп по важным показателям клинического и метаболического статуса, а также частоте использования подавляющего большинства средств базисной терапии (Двойрин В.В., Клименков А.А. Методика контролируемых клинических испытаний. М.: Медицина, 1985. 144 с.). Сформированные группы были однородны не только по основным демографическим и анамнестическим характеристикам (таблица 3), но и по частоте встречаемости поздних осложнений СД и сопутствующих ему заболеваний (p = 0,11 - 0,977).

Таблица 3

Анализ сопоставимости групп больных сахарным диабетом по основным демографическим и клинико-анамнестическим показателям

За день до начала лечения и по истечении двух недель у больных проводили психометрическое и клинико-лабораторное обследование. Квантифицированное изучение аффективных расстройств проводили с помощью шкалы депрессии Бека (ШДБ) с раздельной регистрацией каждой из 21 категории симптомов и жалоб (Белова А.Н., Щепетова О.Н. Шкалы, тесты и опросники в медицинской реабилитации: рук. для врачей и науч. работников. М.: Антидор, 2002. 440 с.). Выраженность тревоги оценивали с помощью шкалы самооценки тревоги Цунга (ШТЦ) (Там же). Критерием развития депрессии считали суммарный балл по ШДБ ? 11 баллов (Rubin R.R., Knowler W.C., Ma Y. et al. Depression symptoms and antidepressant medicine use in diabetes prevention program participants // Diabetes Care. 2005. Vol. 28, № 4. P. 830-837.). Для изучения внимания применяли таблицы Шульте с исчислением интегральных показателей «врабатываемости» и «психической устойчивости» (Дьяконов И.Ф., Овчинников Б.В. Психологическая диагностика в практике врача: рук. для врачей. СПб.: СпецЛит, 2008. 144 с.). Интеллектуальные возможности больных оценивали с помощью «прогрессивных матриц» Равена, результаты выражали в единицах стандартного IQ (Новые тесты IQ / сост. М. Кошелева. Ростов-н/Д: Феникс, 2002. 352 с.). О качестве жизни (КЖ) судили по результатам заполнения русскоязычной версии опросника SF-36v2. Выраженность нарушений углеводного обмена оценивали по содержанию гликозилированного гемоглобина (HbA_1C), уровню циркулирующего ФА и показателям суточного профиля гликемии. О состоянии липидного обмена судили по содержанию ОХС и ТГ в сыворотке крови, а также по унифицированным показателям липопротеинового распределения холестерина и индексу атерогенности (Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб.: Питер пресс, 1995. 304 с.). Уровень продуктов ПОЛ и состояние АОЗ оценивали согласно описанию в экспериментальном разделе. Фармакоэкономический анализ эффективности применения изученных ЛС проводили по показателю «затраты-эффективность». Расчеты основывали на объеме финансовых средств, израсходованных на приобретение исследованных препаратов. Показатели эффективности определялись по результатам статистической обработки полученных данных.

Статистический анализ полученных данных проведен с использованием пакетов прикладных программ SPSS - 13.0 и StatSoft Statistica v. 6.0. В экспериментальной части исследования полученные данные были обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). О достоверности межгрупповых различий судили с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни, Вальда-Вольфовица и Колмогорова-Смирнова. Анализ динамики гликемии при выполнении ТТГ проводился с помощью парного критерия Вилкоксона. Межгрупповые сопоставления показателей летальности проводили с помощью точного критерия Фишера. В клинико-фармакологической части работы качественные (номинальные) показатели, характеризующие сформированные группы пациентов на начальном этапе исследования, выражали абсолютным числом больных, обладающих изучаемыми признаками. Количественные (интервальные) и порядковые (ординальные) данные обработаны методами дескриптивной статистики и представлены в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). Исходную сопоставимость групп оценивали с помощью критерия Краскелла-Уоллиса. О динамике интервальных и ординальных показателей в процессе лечения судили по средним величинам сдвига изучаемых параметров от исходного уровня с расчетом M±m. Эффективность базисной терапии оценивали по величине сдвигов изучаемых параметров от исходных величин в группе «активная плацебо-терапия» с определением статистической значимости при помощи парного критерия Вилкоксона. Влияние мексидола и б-ЛК на динамику изучаемых показателей в процессе лечения считали значимым только при достоверной неоднородности групп, установленной с помощью критерия множественных сравнений Краскелла-Уоллиса. Характер соответствующих межгрупповых различий уточняли с помощью критерия Манна-Уитни. Для изучения статистических взаимосвязей рассчитывали показатель ранговой корреляции по Спирмену (r_s). Проверку статистических гипотез во всех случаях выполняли при критическом уровне значимости р = 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальный раздел. Учитывая ключевую роль оксидативного стресса в развитии нейропатических осложнений СД и позиционирование производных 3-ОП и ЯК в качестве антиоксидантов, начальные этапы исследования были посвящены изучению влияния эмоксипина, реамберина и мексидола на липидную пероксидацию in vitro в сравнении с б-ЛК. Установлено, что исследованные ЛС неоднозначно действовали на свободнорадикальное окисление. При этом реамберин и б-ЛК оказали прямое прооксидантное действие in vitro, которое начиналось с микромолярных концентраций и достигало максимума при их миллимолярной концентрации (рисунок 1Б, Г). Производные 3-ОП эмоксипин и мексидол, наоборот, продемонстрировали антиоксидантную активность, выраженность которой у эмоксипина оказалась существенно выше, чем у мексидола (рисунок 1А, В). По - видимому, это различие является результатом присутствия ЯК в составе мексидола. Более того, максимальная (миллимолярная) концентрация мексидола оказала выраженный прооксидантный эффект. Прооксидантное действие реамберина и мексидола в максимальных концентрациях, вероятно, является результатом сукцинатдегидрогеназного окисления содержащейся в них ЯК фрагментами внутренних мембран митохондрий, присутствующих в стандартных гомогенатах головного мозга крыс.

Рисунок 1 Влияние эмоксипина (А), реамберина (Б), мексидола (В) и б-липоевой кислоты (Г) на переокисление липидов головного мозга крыс in vitro

Выявленные особенности ПОЛ-модулирующего действия производных 3-ОП и ЯК могут быть непосредственно связаны с их влиянием на чувствительность к инсулину. Справедливость этого положения иллюстрируется продемонстрированным в следующей серии экспериментов инсулин-потенциирующим действием б-ЛК и реамберина (таблица 4), характеризовавшихся прооксидантным действием in vitro. Особенно наглядно этот эффект проявился для б-ЛК, которая увеличивала скорость развития инсулиновой комы в 1,9 - 2,7 раза от контрольных значений в прямой зависимости от примененной дозы. Аналогичная закономерность была установлена для реамберина, ускорявшего развитие инсулиновой комы в 1,6 - 1,8 раза. Эмоксипин и мексидол обладали менее выраженной инсулин-потенциирующей активностью, которая подчинялась нелинейной зависимости от дозы (таблица 4). В обоих случаях максимальное снижение латентности инсулиновой комы (в 1,2 раза от контроля) отмечалось в середине изученного диапазона доз (ЭСТД).