Особенности протеома мочи здорового человека при влиянии факторов космического полета

азмещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.03.08 - Авиационная, космическая и морская медицина

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Особенности протеома мочи здорового человека при влиянии факторов космического полета

Образцова Ольга Анатольевна

Москва - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук, Федеральном государственном бюджетном Учреждении науки Институте биохимической физики им. Н. М. Эмануэля (ИБХФ РАН).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Ларина Ирина Михайловна

доктор физико-математических наук,

профессор Николаев Евгений Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Заведующий отделом клинико-физиологических исследований и экспертизы Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук

Воронков Юрий Иванович

доктор биологических наук, заведующий лабораторией медицинской протеомики ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» РАМН

Мошковский Сергей Александрович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биохимии имени А.Н. Баха

Защита диссертации состоится «____» ____________ 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу (123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а).

Автореферат разослан «____» _______________ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Протеомика, как одно из направлений системной биологии, активно развивается во многих странах мира и занимает ведущие позиции в научных программах современной прикладной и фундаментальной медицины, физиологии, а также фармакологии. Практическая значимость протеомных исследований определяется возможностью применения новейших технологических платформ и биоинформационных подходов в диагностике различных заболеваний, выяснении закономерностей функционирования клеток и открытием новых молекулярных мишеней для лекарственных соединений. Протеомика занимается систематическим исследованием белков с целью получения исчерпывающей информации об их структуре, механизмах образования комплексов, функциях и процессах регуляции в биологических системах. Каждый организм имеет индивидуальный протеомный профиль, который изменяется в процессе онтогенеза и приспособления к определенным условиям жизнедеятельности. Текущее состояние функционирующих систем организма, тканей и клеток определяется не только экспрессией определенных генов, но и различными вариантами сплайсинга и посттрансляционных модификаций синтезированных белков, что и является молекулярной основой вариабельности протеома.

Однако планируемое в будущем завершение инвентаризации белков организма человека с высоким уровнем достоверности их идентификации не сможет лечь в основу программ по поиску биомаркеров заболеваний без решения ряда вопросов (Mischak H., et al., 2007; Aebersold R. et al., 2013). Кроме вопросов стандартизации всех этапов исследований (Thongboonkerd V., 2007), еще более сложными представляются проблемы оценки биологической вариабельности белкового состава исследуемого биоматериала здоровых людей с целью определения диапазона физиологической нормы различных белков внутри человеческой популяции. Помимо значительных различий протеомного профиля у разных индивидуумов и естественных колебаний индивидуального протеома во времени (Sands J.M. & Layton H.E., 2009), существуют вариации количественного содержания и качественного состава белков, связанные с адаптивным ответом на изменение внешних условий. Адаптивные изменения количественного содержания и качественного состава белков биологических жидкостей организма здорового человека можно также наблюдать в модельных экспериментах, в частности, имитирующих воздействие отдельных факторов космической экспедиции. В ходе таких экспериментов, как длительная изоляция в гермообъекте и «сухая» иммерсия были выявлены изменения параметров обмена веществ, увеличение активности ряда ферментов, а также гормональная перестройка, направленная на уменьшение объема внеклеточной жидкости (Григорьев А.И., 1980; Суханов Ю.В., 1985; Каландаров С.К., и др., 1986, Ларина И.М. и др., 1999). Использование мочи в качестве биологического материала исследования при изучении адаптационных механизмов открывает ряд преимуществ. Прежде всего, это связанно с неинвазивностью, а также с простотой сбора и хранения данного биоматериала. До настоящего момента в области космической биологии не использовался имеющийся потенциал протеомики и незаслуженно мало уделялось внимания изучению пластичности протеома мочи под действием факторов космического полёта, что в свою очередь может предоставить данные для выявления генеза изменений в организме человека, происходящих под действием факторов космического полета.

Целью работы являлась характеристика протеомного профиля мочи здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета. В рамках достижения указанной цели решались следующие задачи:

1) выбрать наиболее воспроизводимый метод прямого протеомного профилирования образцов мочи здорового человека;

2) оценить вариабельность протеома мочи здорового человека;

3) оценить изменения протеомного профиля мочи здорового человека после продолжительных космических полетов;

4) охарактеризовать изменения белковой композиции мочи здорового человека при воздействии на его организм условий модельных экспериментов (иммерсии, изоляции в гермообъеме).

Научная новизна профилирование моча иммерсия

Охарактеризованы изменения белковой композиции мочи здоровых лиц после действия факторов длительных космических полетов и в ходе модельных экспериментов (105-суточная изоляция в гермообъеме и «сухая» иммерсия). В контролируемых условиях жизнедеятельности впервые получены параметры индивидуальной и групповой вариабельности протеома мочи здорового человека. Впервые показано, что полиурия в иммерсии, близкая, по механизму развития, салурезу, сопровождается физиологической протеинурией, развивающейся одновременно с изменениями реабсорбции натрия.

Практическая значимость работы

Опробованный в работе биоинформационный метод анализа результатов протеомных исследований позволил выполнить анализ огромного массива данных, выявить белки, являющиеся важными участниками физиологических процессов, и отвечающие на определенный воздействующий фактор. Проведенный анализ изменений протеомного состава мочи здорового человека во время его жизнедеятельности в гермообъекте позволил реконструировать сеть взаимодействий, обнаруженных в моче белков с физиологическими процессами, происходящими во многих тканях и органах, а также структурировать экспериментальные данные на основе существующих физиологических представлений и сформулировать перспективные гипотезы для последующей их верификации в эксперименте.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Технологическая платформа, включающая прямое масс-спектрометрическое профилирование после префракционирования мочи на магнитных частицах MB-HIC, является информативным и воспроизводимым методом анализа ее белковой композиции;

2. Изменения вариабельности протеомного профиля мочи в стандартизированных условиях (эксперимент со 105-суточной изоляцией в гермообъекте и 5-суточная «сухая» иммерсия) отражают индивидуальные особенности приспособительных реакций здоровых лиц;

3. Длительные космические экспедиции и эксперименты, моделирующие факторы космического полета, вызывают функциональные изменения белковой композиции мочи и связаны как с внешним воздействием, так и с модификациями внутренней среды организма.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях: VIII конференция молодых ученых специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля, 2009, Москва; Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», 25-27 ноября 2009г., Москва; French-Russian-Belorussian Conference: Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach. - French-Russian conference, Angers University, France, 10 - 14 March 2010.; IX конференция молодых ученых специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики, 14 апреля, 2010, Москва; 31st Annual International Gravitation Physiology Meeting: Trieste, Italy, 13 - 18 June, 2010; IV Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, 2010; Х Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос, 19 апреля 2011, Москва; V Российский симпозиум «Белки и пептиды», 8 - 12 августа 2011, Петрозаводск; 2-ая Международная научно-практическая конференция "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика. Протеомика. Биоинформатика", Новосибирск, 2011; HUPO 2011, 10th World congress, Geneva, Switzerland, September 4 - 7, 2011; Космический форум 2011, посвященный 50-летию полета в космос Ю.А. Гагарина, 18 - 19 октября Звездный городок, 20 - 21 октября Москва; Международный симпозиум, посвященный итогам выполнения проекта «МАРС-500», Москва, 23-25 апреля 2012; 33th Annual International Society for Gravitational Physiology Meeting, «Life in Space for Life on Earth», Aberdeen - United Kingdom, 18-22 June, 2012; Proteomic Forum, Berlin, Germany, 17 - 21 March, 2013.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 21 печатная работа, в том числе 7 статей в журналах из перечня Высшей Аттестационной Комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследований с обсуждением, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 5 рисунками. Список использованной литературы содержит 39 отечественных и 170 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы исследования

В качестве объекта исследований были использованы:

1 - образцы мочи, полученные от шести российских космонавтов в возрасте от 35 до 51 года, выполнивших космические полеты длительностью от 169 до 199 суток на МКС, и добровольно участвовавшие в космическом эксперименте «Протеом», в рамках которого осуществлялся сбор биологических образцов за 45 - 60 суток до полета, а также на первые и седьмые сутки после приземления; 2 - образцы мочи шести добровольцев в возрасте от 25 до 41 года. Моча для протеомных исследований собиралась в фоновом периоде за семь дней до начала эксперимента, еженедельно в течение 105-суточной изоляции, а также в первый и седьмой день периода реадаптации; 3 - образцы мочи от шести здоровых добровольцев-мужчин в возрасте от 21 до 29 лет, обследованных в ходе эксперимента с 5-суточной «сухой» иммерсией (СИ), полученные за 7, 2-е сутки до начала эксперимента (фон), на 2-е, 3-и и 5-ые сутки «сухой» иммерсии и на 1-е, 3-и, 7-е и 15-е сутки после окончания.

Все добровольцы были допущены врачебно-экспертной комиссией к проведению испытаний. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при Институте медико-биологических проблем РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, получено письменное Информированное согласие. Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по Биомедицинской Этике РАН.

Методы исследования

Получение образцов мочи. Сбор биологического материала осуществлялся в стерильные емкости, в виде второй утренней фракции после пробуждения, срединной её части для снижения контаминации образца компонентами непочечного происхождения. После получения пробы мочи, каждый образец замораживали и хранили при -80°С до проведения протеомных исследований. В дальнейшем замороженные образцы размораживали и концентрировали до 20-тикратного уменьшения объема супернатанта. Полученный таким способом образец высушивали в вакуумном концентраторе.

Предобработка образцов мочи с использованием магнитных частиц ClinProt MB HIC C8 («Bruker Daltonics»). Очистка и концентрация белков из проб мочи осуществлялась с помощью наборов магнитных частиц MB HIC C8. Все шаги пипетирования растворов, отделения магнитных частиц и нанесения на MALDI-мишень AnchorChip (600/384) выполнялись роботом ClinProtrobot с помощью программы ClinProtRobot 1.3 («Bruker Daltonics»). В качестве матрицы использовали б-циано-4-гидроксикоричную кислоту (0,3 мг/мл в растворе ацетон/этанол в соотношении 1:2). Каждый образец префракционировали в двух повторах, и с каждого повтора в дальнейшем было получено по 4 спектра. Использовали растворители высокой степени очистки («Merck», Германия).

Масс-спектрометрические измерения. Масс-спектры (диапазон масс от 1000 до 17000 Да) были получены на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics), работающем в положительном линейном режиме. Калибровка масс-спектрометра осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»).

Анализ масс-спектров. По каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»)). Эти данные экспортировали в таблицы MS Excel, и значения площадей в повторных измерениях усредняли. Кроме того, проводился контроль качества всех полученных спектров с помощью программ Flex Analysis 3.0 и Statistica 6.0 (кластерный анализ, древовидная кластеризация, мера расстояния - евклидово расстояние).

Статистический анализ: Статистический анализ проводили с использованием непараметрического критерия Уилкоксона (программа Statistica 6.0 для Windows). Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05.

Пробоподготовка образцов мочи к хромато-масс-спектрометрическому анализу. Осаждение белка мочи проводили согласно протоколу обработки мочи для скрининга, утвержденному на рабочем совещании во время конференции HUPO-2007, Сеул, Корея (состав участников: Е.Н. Николаев, К. Масселон, С.А.Мошковский, В.Г.Згода, В.Брюн).

Хромато-масс-спектрометрический анализ. Хромато-масс-спектрометрическая методика для анализа проб мочи человека была разработана на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США). Идентификацию пептидов из MS/MSS спектров проводили с помощью поисковой системы Mascot.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Прямое протеомное профилирование мочи здоровых добровольцев в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией. Выполнено обследование 6 здоровых добровольцев-мужчин в возрасте от 21 до 29 лет. Проведенные физиологические исследования выявили увеличение диуреза примерно на 90% в первый день иммерсии, который оставался на таком уровне в течение всего эксперимента. То же самое можно сказать и о частичном водном балансе - в первый день он становился отрицательным, и оставался таковым на всем протяжении воздействия условий данной модели. В период реадаптации происходило компенсаторное уменьшение диуреза и увеличение водного баланса. Биохимическими исследованиями были определены уровни Na+, K+, Cl-, Ca2+, белков, мочевины, креатинина в крови, которые, наряду с осмоляльностью, оставались в пределах нормы на протяжении всего эксперимента. В то же время, была выявлена значительная потеря натрия с мочой в начале иммерсии (с двукратным увеличением в первые сутки эксперимента). Динамика экскреции хлора с мочой была сходной. Уровень экскреции калия с мочой имел незначительные изменения. Отмечено, что осмоляльность мочи значительно уменьшилась во время иммерсии. Мочевина и креатинин мочи изменялись незначительно, а клиренс креатинина в течение эксперимента не менялся. После прямого профилирования образцов мочи было получено в среднем по эксперименту (включая фоновый и реадаптационный периоды) 213 пика в диапазоне масс от 1 000 Да до 10 000 Да при соотношении сигнал/шум = 5. Анализ данных с подсчетом коэффициентов вариации по всем пикам, показал, что технический коэффициент вариации МС-метода после префракционирования образцов магнитными частицами MB-HIC был равен 0,25. Был подсчитан средний коэффициент вариации по всем полученным пикам, который составил 0,48. Показано, что в течение всего экспериментального периода (включая фоновый и реадаптационный периоды) 61 пик (или 28% из выявляемого общего числа пиков) характеризовались большим коэффициентом вариации, превышающим технический коэффициент более чем в два раза. Очевидно, эти пики представляют наиболее пластичную часть мочевого протеома и относятся к белкам, содержание которых в моче могло резко меняться. В результате проведенного статистического анализа было выявлено, что 92 из 213 полученных пиков достоверно изменяются по сравнению с первой фоновой точкой (-8 сутки). Наибольшее количество изменений отмечено на 5-ые сутки эксперимента и на первые сутки после его окончания. Все отмеченные на данных точках пики обладают разнонаправленными изменениями, характеризующимися как увеличением, так и уменьшением их площади, относительно фона. Детальный анализ числа масспектрометрических пиков, выявляемых в образцах, собранных в различные сроки СИ показал, что доля пиков увеличенной и сниженной площади, косвенно свидетельствующей о концентрации белка, из которого получен данный фрагмент, на вторые сутки СИ была идентичной фоновой. На протяжении СИ наибольшее различие в доле (относительно фона) возросших и уменьшившихся по площади пиков приходилось на 4-ые сутки с выравниванием к концу СИ. В периоде реадаптации преобладала доля сниженных пиков с практическим восстановлением фонового соотношения через неделю. Тенденции увеличения, по сравнению с фоном относительного числа пиков большей площади соответствовала тенденция роста показателя реабсобции натрия. Кроме того, именно на 4-ые сутки СИ отмечалось наиболее выраженное снижение клиренса осмотически активных веществ (p<0,05). Следовательно, полиурия при СИ, близкая, по механизму развития салурезу на фоне ускоренного тока мочи по канальцам нефрона, сопровождается физиологической протеинурией, которая, как полагают, может зависеть от участия V1-рецепторов, и изменения продукции NО (Кутина А.В., 2009).

Исследование вариабельности протеома мочи здорового человека в эксперименте с контролируемыми условиями жизнедеятельности. Проведение наземных модельных экспериментов в замкнутых гермообъектах позволяет получить экспериментальные данные о состоянии здоровья и работоспособности человека благодаря максимально стандартизированным условиям жизнедеятельности в замкнутом пространстве (газовый состав воздуха, температура, влажность, микробиологические условия, двигательная активность, режим дня, рацион питания и потребление воды). В эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъеме были проанализированы образцы мочи, полученные в фоновом периоде, во время изоляции и после ее окончания у 6 участников испытаний. При прямом профилировании образцов мочи после обработки магнитными частицами MB-HIC в масс-спектрах было получено, в среднем, по 117 пиков на образец в диапазоне масс от 944 Да до 10 763 Да. В результате исследования было показано, что в течение всего эксперимента 36 пиков (или 30,7% из выявляемого числа) характеризовались большим коэффициентом вариации, превышающим технический коэффициент (0,25) более чем в два раза (Рисунок 1).

Рисунок 1. Доля m/z пиков, полученных после префракционирования мочи шести участников эксперимента магнитными частицами MB-HIC, и характеризующихся высокими значениями коэффициентов вариации.

Отмечено, что все эти пики, составляющие наиболее пластичную часть изучаемого субпротеома, обладают значительной межиндивидуальной вариабельностью. Так, пик с масс-зарядным соотношением (m/z) = 4750,86 имеет высокую степень разброса среди результатов, полученных у пяти участников эксперимента (CV = 0,64 - 1,05), а пик с m/z = 9748,51, соответственно, среди четырех участников (CV = 0,58 - 1,02). Также можно отметить пик с m/z = 2192,71 с высоким коэффициентом вариации у двух добровольцев (CV = 0,58 и CV = 0,82 соответственно). Было установлено, что данный пик является фрагментом белка гепцидина-20, служащим основным сигнальным фактором, контролирующим процессы высвобождения железа из мест его депонирования в организме (Kemna E, et al., 2005; Piperno A, et al, 2009). Гепцидин образуется в печени в ответ на действие провоспалительных цитокинов острой фазы, а также при перегрузке организма железом. Ранее, Douglas G Ward et al. предположили, что гепцидин-20 может являться биомаркером рака толстой кишки (Ward DG, 2008). Средний коэффициент вариации, вычисленный по всем пикам для каждого участника эксперимента, колебался в пределах 0,31 - 0,39, что превышает техническую погрешность метода и выявляет диапазон индивидуальной вариабельности. Полученные результаты ясно показывают выявление и сохранение индивидуальной вариабельности в протеоме мочи здорового человека на 31% по сравнению с фоновыми показателями после 105-суточной изоляции в гермообъекте. Следовательно, вариабельность протеомного профиля мочи в данном случае может отражать индивидуальные особенности приспособительных реакций каждого участника.

Выявление и анализ белок-белковых взаимодействий на основе изучения протеома мочи здорового человека в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъекте. В данном исследовании с целью изучения протеома мочи здоровых людей в условиях 105-суточной изоляции при строго контролируемых условиях жизнедеятельности, был проведен анализ образцов мочи, полученных от шести здоровых мужчин в возрасте от 26 до 41 года. В результате проведенного хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов было обнаружено 690 протеотипических пептидов, однозначно идентифицирующих белки человека. Список этих белков был подвергнут классификации с целью выявления групп протеинов, чья динамика появления и исчезновения из образцов мочи добровольцев обладала достоверным сходством в течение эксперимента, для чего был проведен иерархический кластерный анализ. В результате, значимые отличия были обнаружены для нескольких кластеров белков. Нами был выбран кластер 87, который оказался наиболее тесно ассоциирован с водно-электролитным обменом. Белки данного кластера представляли функционально-разнородную группу. Их анализ выполнялся по литературным данным. Так, один из них, CD44_HUMAN - это рецептор для гиалуроновой кислоты, через связь с которой опосредуются как межклеточные взаимодействия, так и взаимодействия клеток с межклеточным матриксом (Dougherty G.J., et al, 1991; Stamenkovic I., et al, 1989). Данный белок (рецептор) также обладает высоким сродством к другим лигандам, таким как остеопонтин, коллагены различного типа, металлопротеиназы. Среди выявленных белков оказался остеопонтин (OSTP_HUMAN), синтезируемый в костной ткани и интенсивно связывающийся с гидроксиапатитом. Он интегрирует минерализующийся матрикс, и важен для клеточно-матриксного взаимодействия (Fukudome K., et al, 1994; Kiefer M.C., et al, 1989; Young M.F., et al, 1990). Считают, что он функционирует как цитокин, увеличивая образование интерферона-гамма и интерлейкина 12 и, одновременно, снижая продукцию интерлейкина 10, что дает ему возможность участвовать в организации иммунной реакции 1 типа. Идентифицированый EPCR_HUMAN - белок рецептора комплекса гистосовместимости CD1 эндотелиальных клеток - стимулирует образование связи с тромбин-тромбомодулин комплексом; и таким образом играет роль в реакциях, контролирующих процесс свертывания крови и воспаления (Simmonds R.E., et al, 1999). Выявленный белок ICOSL_HUMAN - лиганд индуцибельного ко-стимулятора Т-клеток (ICOS), представляющего собой члена семейств белков CD28, В7 (Yoshinaga S.K., et al, 2000). Это - лиганд, связывающийся с поверхностным рецептором Т-клеток, который стимулирует пролиферацию В-клеток и их дифференциацию, играющий важную роль в местном воспалительном ответе и запуске вторичного иммунного ответа (Gleich G.J., et al, 1986). Идентифицированный нами RNAS2_HUMAN - является несекретируемой пиридин-специфической рибонуклеазой, обладающей цитотоксическими свойствами, избирательным хемотаксисом для дендритных клеток (Prost S., et al, 2002; Teufel D.P., et al, 2003). Кроме того, к кластеру 87 принадлежал YIPF3_HUMAN - маркер гемопоэза, мембранный белок, который синтезируется на ранних стадиях гемопоэтическими стволовыми клетками (Lievens S, et al 2010). Наконец, в кластере 87 присутствовал альбумин - ALBU_HUMAN, основной транспортный белок плазмы крови, который выполняет транспортные функции для воды, ионов кальция, натрия, калия, жирных кислот, гормонов, билирубина и участвует в поддержании осмоляльности плазмы крови.

В дальнейшем была проведена реконструкция ассоциативной интерактомной сети кластера 87 с помощью программ ANDCell и ANDVisio (Деменков П.С., 2008), которая позволила выявить новые белки, связанные с водно-электролитным обменом (Рисунок 2). Проведенный анализ позволил построить гистограмму распределения данных белков по принадлежности к тканям, органам и жидкостям тела, в результате которого оказалось, что наибольшую группу (73 белка) составили белки, синтезируемыми повсеместно, в большинстве тканей и клеток организма человека. В эту группу входили, в основном, внутриклеточные и мембранные белки. Другую крупную группу (51 протеин) представляли белки клеток крови, в том числе синтезируемые в иммунокомпетентных клетках. Появление данной группы белков позволяет судить о немаловажной роли сердечно-сосудистой системы в формировании адаптивной реакции в ответ на влияние длительной изоляции и требует детального рассмотрения в дальнейших исследованиях. Белки печени (их было 25), желудочно-кишечного тракта (13), других висцеральных органов (12) - также были выявлены в интерактомной сети.

Рисунок 2. Ассоциативная интерактомная сеть для кластера 87. Белки кластера показаны большими шарами, новые белки, вовлеченные в интерактомную сеть, показаны малыми шарами. В сети также указаны взаимосвязи белков с NaCl (sodium chloride).

Таким образом, проведенный анализ показал, что в контролируемых условиях жизнедеятельности в моче здоровых обследуемых выявлялись белки различного происхождения. Динамика появления или исчезновения из мочи части из них тесно коррелировала с режимом солепотребления в эксперименте.

Протеомный профиль мочи космонавтов после продолжительных космических полетов на МКС. В данном разделе проводился анализ изменений белковой композиции мочи 6 российских космонавтов в возрасте от 35 до 51 года, совершивших продолжительные полеты в экспедициях на Международной космической станции длительностью от 169 до 199 суток. В результате прямого профилирования было получено 134 MS-пиков в диапазоне масс от 1000 до 9900 Да. С помощью критерия Уилкоксона были обнаружены достоверные отличия по 31 пику (23,1% от всех пиков протеомного профиля) на 1-ые сутки, по 9 пикам (6,7%) на 7-ые сутки после приземления, а также по 4 пикам (2,9%) на 1-ые и 7-ые сутки по сравнению с фоном (p<0,05). Таким образом, в составе пиков масс-спектра образцов мочи космонавтов после длительного полета были обнаружены достоверные отличия по сравнению с фоном (32,8%). В результате хромато-масс-спектрометрического анализа всех образцов в данном исследовании было выявлено в среднем в каждой пробе мочи 108 различных пептидов (от 55 до 142), а всего, во всех пробах - 430 различных пептидов. Анализ показал, что из общего числа обнаруженных пептидов (430) двадцать (20) были общими для всех сроков обследования, т.е. встречались в образцах мочи перед полетом, на первые и седьмые сутки после окончания полета. После установления их соответствия белкам (по UniProt) был проведен анализ их клеточной локализации, тканевой специфичности и функций, которые оказались достаточно разнообразными (Таблица 1). Установлено, что в моче космонавтов выявлялись белки различного происхождения. Значительная часть белков, преодолевающих гломерулярный фильтр, поступала в мочу из крови. Белки, синтезируемые в почках и предстательной железе, также достоверно выявлялись в моче. Происхождение плазменных белков, выявленных в моче, также было различным; это были как собственно протеины крови, осуществляющие в ней свою функцию, так и продукты «подтекания» тканей, или внутриклеточные белки, поступающие в кровь в результате клеточной гибели (апоптотической или в результате протеолиза) (Jia L, et al, 2009; Anderson N.L., et al, 2002). Помимо стабильной части мочевого протеома, нами были выявлены пять белков, которые переставали обнаруживаться в пробах мочи в первые сутки после космического полёта, однако были выявлены в предполетном периоде. Ими являлись рецептор тирозинкиназы, цитоскелетный кератин-1, рецептор, сопряженный с G-белком, семейства С, интер-альфа (глобулин) ингибитор Н4, а также белок с генным названием SERPING1. Их происхождение и функции различны. Так, рецептор тирозинкиназы данного типа экспрессируется в нормальных тканях толстого кишечника и служит сигнальной молекулой для специфических клеток мезодермального происхождения. Белок цитоскелета - кератин I типа - экспрессируется во всех супрабазальных клетках и является важным маркером дифференцировки эпителия и участником воспалительного процесса. Мембранный рецептор, сопряженный с G-белком семейства С, экспрессируемый в желудке, почках, печени, поджелудочной железе и простате, индуцируемый ретиноевой кислотой. Серпинг (SERPING1) - ингибитор сериновых (цистеиновых) протеиназ C1 - блокирует деятельность нескольких белков в крови, включая плазменный каллекреин и активизированную форму фактора XII. Интер-альфа (глобулин) ингибитор Н4 представляет собой эндопептидазу серинового типа.

Таблица 1. Общие белки, для всех образцов мочи белки, выявленные на всех сроках обследования.

Более значимым представлялся анализ функций группы белков, для которых были выявлены динамические изменения в ходе исследования, и которые, напротив, не выявлялись в моче до космического полёта, но появлялись в большинстве проб в первые сутки после его завершения (Рисунок 3). Эти белки участвуют в различных биологических процессах и функциях организма (Таблица 2).

Рисунок 3. Представленность белков в моче космонавтов (А - до полета, Б - на 1-ые сутки после окончания полета, В - на 7-ые сутки после окончания полета).

1 - Альфа цепь фибриногена9 - Пролактин-индуцируемый пептид

2 - Секретируемый и трансмембранный белок 110 - Коллаген альфа-1(I) цепь

3 - V-IV участок каппа-цепи иммуноглобулина11 - Витронектин

4 - Альфа-1-антихимотрипсин12 - Ревматоидный фактор D5 легкая цепь

5 - N-ацетил гликозамин-6-сульфатаза13 - Пептидогликан-распознающий протеин-1

6 - Уромодулин14 - Гранулин

7 - Панкреатическая рибонуклеаза15 - L-лактат дегидрогеназа В цепь

8 - Цистатин-М

Полученные данные, касающиеся тканевой принадлежности белков мочи, чья присутственность возросла после полета, не отражают более интенсивного разрушения и затем поступления белков мышечной ткани (и их фрагментов) в кровь, и затем - в мочу. Возможно, при той продолжительности полета, которой характеризовалась исследуемая группа космонавтов, процессы ремоделирования белков в мышцах уже достигли равновесного состояния. Таким образом, исследование протеомного профиля мочи космонавтов после продолжительных космических полетов на МКС позволило определить как стабильную, так и пластичную часть субпротеома с анализом их субклеточной локализации и тканевой специфичности.

Таблица 2. Белки мочи, представленность которых в моче возросла после космического полета.

ВЫВОДЫ

1. Прямое масс-спектрометрическое профилирование является надежным и информативным методом при проведении анализа и оценки белкового состава биологических жидкостей (в среднем, в диапазоне масс от 900 Да до 12 000 Да).

2. Протеомный профиль мочи в контролируемых условиях модельных экспериментов характеризуется высокой групповой и индивидуальной вариабельностью, несмотря на стандартизированные условия жизнедеятельности обследуемых (уровни потребления основных нутриентов, жидкости, уровень двигательной активности, состав атмосферы, ритм сна-бодрствования). Во время 105-суточной изоляции шестерых здоровых мужчин в гермообъекте была выявлена наиболее пластичная часть мочевого субпротеома, составляющая 30,7% из выявляемого числа МС-пиков, с коэффициентом вариации, превышающим технический более чем в два раза. Все эти пики обладают значительной групповой вариабельностью. Диапазон индивидуальной вариабельности, вычисленный по всем пикам, колебался в пределах 0,31 - 0,39, что превышает аналитическую вариабельность метода.

3. В 5-суточной «сухой» иммерсии около трети МС-пиков характеризовались коэффициентом вариации в несколько раз превышающим аналитическую вариабельность метода. Выявлено соответствие тенденций роста относительного количества МС-пиков с большей, чем в фоне, площадью и увеличения показателя реабсобции натрия. На 4-ые сутки СИ также отмечалось наиболее выраженное снижение клиренса осмотически активных веществ (p<0,05). Следовательно, полиурия при СИ, близкая по механизму развития салурезу, сопровождается физиологической протеинурией.

4. Анализ белок-белковых взаимодействий, выполненный в эксперименте со 105-суточной изоляцией на основе данных протеома мочи с помощью биоинформационных методов с применением программ ANDCell и ANDVisio, позволил выявить сети взаимодействий, состоящие более чем из 200 белков, динамика присутственности которых в моче оказалась тесно связанной с уровнем потребления натрия обследуемыми.

5. Исследование протеомного профиля мочи космонавтов после продолжительных космических полетов на МКС позволило определить группу из 15 белков мочи, которые в основном выявлялись после полета, а также стабильную часть субпротеома, представленную 21 белком с различной тканевой специфичностью и субклеточной локализацией.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Валеева О. А., Пастушкова Л. Х., Пахарукова Н. А., Доброхотов И. В., Ларина И. М.. Вариабельность протеома мочи здорового человека в эксперименте с 105-суточной изоляцией в гермообъекте. Физиология человека, том 37, № 3, Май-Июнь 2011, С. 98-102;

Носков В.Б., Ларина И.М., Пастушкова Л.Х., Доброхотов И.В., Валеева О.А., Купэ М., Кусто M.A., Новоселова А.M. Функционирование почек и состояние жидкостных сред организма человека в условиях 5-суточной иммерсии. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2011. Т. 45. № 6, С. 22 - 26;

Ларина И.М., Колчанов Н.А., Доброхотов И.В., Иванисенко В.А., Деменков П.С., Тийс Е.С., Валеева О.А., Пастушкова Л.Х., Николаев Е.Н. Реконструкция ассоциативных белковых сетей, связанных с процессами регуляции обмена и депонирования натрия в организме здорового человека, на основе изучения протеома мочи. Физиология человека, т. 38, № 3, 2012, С.107-115;

L.Kh. Pastushkova, O.A. Valeeva, A.S. Kononikhin, E.N. Nikolaev, I.M. Larina, I.V. Dobrokhotov, I.A. Popov, V.I. Pochuev, K.S. Kireev, A.I. Grigoriev. Changes in urine protein composition in human organism during long term space flights. Acta Astronautica 81 (2012) 430-434.

Пастушкова Л.Х., Валеева О.А., Кононихин А.С., Николаев Е.Н., Попов И.А., Ларина И.М., Доброхотов И.В., Иванисенко В.А., Тийс Е.С., Колчанов Н.А. Анализ белковых взаимодействий на основе изучения протеома мочи человека в эксперименте со 105-суточной изоляцией. Авиакосмическая и экологическая медицина. 2012. Т. 46. № 2, С. 37 - 43.

Пастушкова Л. Х., Пахарукова Н. А., Новоселова Н.М., Доброхотов И. В., Валеева О.А., М.-А. Кусто, Ларина И. М. Прямое протеомное профилирование мочи и сыворотки крови человека в эксперименте с 5-суточной «сухой» иммерсией. Авиакосмическая и экологическая медицина, Т. 46. № 4, 2012. С. 31 - 37

Пастушкова Л.Х., Валеева О.А., Кононихин А.С., Николаев Е.Н., Ларина И.М., Доброхотов И.В., Попов И.А., Почуев В.И., Киреев К.С. Изменения белковой композиции мочи человека после продолжительных орбитальных полетов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013 г. Т. 156. № 8, С. 166

Е.Н. Николаев, И.А. Попов, А.С. Кононихин, С.А. Мошковский, О.Н. Харыбин, И.А. Агрон, Д.М. Автономов, Н.А. Христенко, М.И. Индейкина, Л.Х. Пастушкова, И.М. Ларина, О.А. Валеева, О.П. Трифонова, И.В. Доброхотов, Н.А. Пахарукова. Разработка хромато-масс-спектрометрических методов быстрого анализа протеома мочи. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Сборник тезисов, 25-27 ноября 2009г., Москва, стр.136-137.

Валеева О.А., Доброхотов И.В. Подготовка и масс-спектрометрическое профилирование образцов мочи здорового человека в норме и при моделировании физиологических эффектов космического полета. Материалы VIII конференции молодых ученых специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля, 2009, Москва. С.10.

Христенко Н.А., Валеева О.А. Масс-спектрометрическое исследование протеома мочи здорового человека. Материалы VIII конференции молодых ученых специалистов и студентов, посвященная Дню космонавтики, 14 апреля, 2009, Москва. С.56.

Valeeva O. A., Pakharukova N.A., Dobrokhotov I. V., Pastushkova L.Kh., Larina I.M. Influence of 105-daily isolation on variability of urine proteins. French-Russian-Belorussian Conference: Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach. - French-Russian conference, Angers University, France, 10 - 14 March 2010.

Валеева О.А., Доброхотов И.В. Исследование методами масс-спектрометрии динамики изменения протеома мочи при длительной изоляции человека. IX конференция молодых ученых специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики - Москва, 14 апреля 2010, С. 23.

Valeeva O.A., Pastushkova L.Kh., Dobrokhotov I.V., Nikolaev E.N., Popov I.A., Kononihin A.S., Ivanisenko V.A., Larina I.M. Dynamic changes of supposed biomarkers of non-osmotic deposition of sodium in the urine of healthy persons during 105-daily isolation. 31st Annual International Gravitation Physiology Meeting: Trieste, Italy, 13 - 18 June, 2010.

Кононихин А.С., Автономов Д. М., Попов И.А., Валеева О.А., Пастушкова Л.Х., Доброхотов И.В., Ларина И.М., Николаев Е.Н. Исследование динамики изменение протеома мочи у здоровых людей в течение 105-суточной изоляции. IV Всероссийская конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Звенигород, 2010, С 102;

Валеева О. А., Исследование протеома мочи после длительных космических полетов. Х Конференция молодых ученых, специалистов и студентов, посвященная 50-летию со дня первого полета человека в космос. 19 апреля 2011, Москва, С. 18.

Доброхотов И.В., Валеева О.А., Пастушкова Л.Х., Николаев Е.Н., Попов И.А., Кононихин А.С., Иванисенко В.А., Ларина И.М. Исследование динамики изменения белков-маркеров неосмотического депонирования натрия у здоровых людей. V Российский симпозиум «Белки и пептиды», 8 - 12 августа 2011, Петрозаводск.

Тийс Е.С., Деменков П.С., Доброхотов И.В., Валеева О.А., Пастушкова Л.Х., Николаев Е.Н., Ларина И.М., Колчанов Н.А., Иванисенко В.А. Автоматическая реконструкция ассоциативных генных сетей на примере анализа протеома мочи. 2-ая Международная научно-практическая конференция "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: Геномика. Протеомика. Биоинформатика", Новосибирск, 2011; С. 189