Исследование уровня цитокинов у здорового человека при воздействии факторов космического полета и их наземном моделировании

Размещено на http://www.allbest.ru/

ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ЦИТОКИНОВ У ЗДОРОВОГО ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА И ИХ НАЗЕМНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Берендеева Татьяна Александровна

Москва, 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН

Научный руководитель: доктор медицинских наук, Моруков Борис Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна

доктор медицинских наук, профессор Коляскина Галина Ильинична

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский испытательный центр подготовки космонавтов имени Ю.А.Гагарина».

Защита диссертации состоится «___» ноября 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН

Автореферат разослан «___» октября 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Левинских М. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что комплекс экстремальных факторов, присущих космическому полету (КП), оказывает влияние на функциональное состояние физиологических систем организма, в том числе систему иммунитета [Константинова И.В., 1973; Тауlоr G. R., 1993], которая, наряду с нервной и гуморальной системами, интегрирует организм в единое целое, обеспечивает постоянство антигенного состава внутренней среды, жизнеспособность и активную реакцию организма на изменения внешней среды [Петров Р.В., 1978].

Проведенные ранее исследования иммунологической реактивности космонавтов и астронавтов, совершивших орбитальные полеты на космических кораблях «Салют», «Апполон», «Союз», «Спейс Шаттл» и орбитальных станциях «Скайлэб», «Салют-6, 7» и «МИР», показали, что даже кратковременное пребывание в космическом полете может приводить к возникновению ряда отклонений в функционировании системы иммунитета [Константинова И.В., 1988; Konstantinova I.V. et al., 1993; Stowe R.P. et al., 1999; Stowe R.P., Sams C.F. et al., 2001]. За 40 лет, прошедших с начала исследований иммунологической реактивности у космонавтов после завершения космических полетов, существенно изменились условия пребывания человека на борту космического комплекса. Специалистами ГНЦ РФ-ИМБП РАН разработан и внедрен в практику пилотируемых полетов комплекс медицинских мероприятий, направленных на профилактику отдельных эффектов микрогравитации и оказавших благоприятное действие на переносимость человеком условий КП [Kozlovskaya I.B, Grigoriev A.I. 1995; Kozlovskaya I.B, 2004]. Но, несмотря на выполнение рекомендованных мероприятий, у значительной части космонавтов в раннем периоде реадаптации к условиям Земли после длительных полетов на Международной космической станции (МКС) также наблюдались негативные сдвиги в функционировании иммунной системы [Rykova M.P. et al., 2008; Crucian B.E. et al., 2008]. Однако до настоящего времени механизмы, лежащие в основе выявленных изменений, остаются мало изученными.

Функционирование иммунной системы зависит от информационных сигналов, передаваемых цитокинами. Цитокины могут быть выделены в самостоятельную систему регуляции основных функций организма, существующую наряду с нервной и эндокринной системами регуляции и связанную в первую очередь с поддержанием иммунного гомеостаза [Mosmann T.R., 1986; Belardelli F., 1995].

Единичные исследования сообщают о влиянии КП на продукцию некоторых цитокинов иммунокомпетентными клетками [Константинова И.В., 1983; Manie S., 1991; Sams C., 1992; Sonnenfeld G., 2002]. В частности, рядом американских авторов было показано, что по завершению коротких космических полетов у астронавтов снижалась продукция ИЛ-2 и ИФН-г CD3⁺-клетками, CD4⁺- и CD8⁺-лимфоцитами, а также наблюдалась тенденция к повышению синтеза ИЛ-10 иммунокомпетентными клетками [Crucian B.E, 2000; Crucian B.E., Stowe R.P., 2008]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о продукции цитокинов после продолжительных космических полетов.

В связи с этим остается актуальной проблема детального анализа функционирования цитокиновой системы, играющей важную роль в процессах регуляции антигенно-структурного гомеостаза.

Эффективно исследовать многие аспекты функционирования физиологических систем позволяет моделирование факторов КП. Наземные экспериментальные исследования с участием испытателей-добровольцев в замкнутых, сопоставимых с обитаемыми отсеками пилотируемых комплексов гермообъектах, моделирование эффектов микрогравитации в эксперименте с «сухой» иммерсией, воздействие перспективных для использования газовых сред обеспечивают получение важной информации о процессах адаптации к новым условиям на разных этапах воздействия (Баранов В.М., 1997, 2001).

Цель работы: изучение уровня цитокинов у здорового человека при воздействии на организм факторов космического полета и их наземном моделировании.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать уровень цитокинов у космонавтов на этапах подготовки и после завершения коротких и длительных космических полетов;

2. Оценить уровень цитокинов у здорового человека в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией, моделирующей эффекты влияния микрогравитации;

3. Изучить уровень цитокинов у здорового человека в эксперименте с 9-суточной изоляцией в гермообъекте в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде;

4. Исследовать цитокиновый статус у испытателей-добровольцев в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъекте с искусственной средой обитания

Научная новизна работы

Впервые проведено комплексное изучение показателей, характеризующих продукцию цитокинов эффекторными клетками врожденного и адаптивного иммунитета при воздействии на организм здорового человека факторов КП.

Установлено, что при адаптации к условиям длительного КП развивается дисбаланс цитокинов, продуцируемых иммунокомпетентными клетками, в частности, происходит изменение соотношения содержания цитокинов, регулирующих клеточно-опосредованные (Тh1) и гуморальные (Тh2) иммунные реакции.

Исследования, проведенные при моделировании факторов КП в наземных экспериментах, выявили функциональный полиморфизм реакций цитокиновой системы, связанный с концептуальными особенностями различных моделей и индивидуальными адаптационными возможностями организма. цитокин космонавт полет цитокиновый

Практическая и научная значимость работы

Результаты проведенных исследований показали, что при мониторинге состояния иммунной системы человека во время воздействия различных факторов КП наиболее информативным является метод комплексного изучения показателей цитокинового статуса.

Практическую значимость представляют данные о том, что при действии факторов КП существенную роль в развитии каскадной реакции цитокиновой сети играют индивидуальные особенности. Выявление таких особенностей до полета чрезвычайно важно как для исследовательских целей, так и отбора "устойчивых" к воздействию неблагоприятных факторов среды обитания кандидатов в космонавты.

Изучение уровня цитокинов позволит выбрать специфическую стратегию коррекции нарушений иммунореактивности при воздействии на организм экстремальных факторов окружающей среды, которая, кроме корригирующего эффекта, могла бы улучшить качество жизни человека, находящегося в этих условиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

Длительные космические полеты приводят к снижению продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками периферической крови, что указывает на снижение резервных возможностей эффекторных клеток иммунной системы.

В наземных экспериментах при моделировании факторов космического полета показано, что реакция цитокиновой системы на экспериментальные воздействия характеризуется изменением Тh1/ Тh2 иммунного баланса.

Апробация работы и публикации

Основные результаты и положения работы были доложены и опубликованы в материалах VII, VIII и IX Конференций молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики (Москва 2008, 2009, 2010); 17^th Humans in Space (Москва, 2009); 60^th International Astronautical Congress (Daejeon, Republic of Korea).

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол № 5 от 15 июня 2010г.)

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 97 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов, практических рекомендаций, выводов и списка литературы из 117 источника, в том числе-75 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 25 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В соответствии с задачами работы была подготовлена и выполнена программа научных исследований в до- и послеполетных клинико-физиологических обследованиях космонавтов, а также в наземных модельных экспериментах. Содержание и общий объем проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Объем и структура исследований

Проведенное исследование	Продолжитель- ность, сутки	Количество обследованных	Возраст обследованных, лет
1. Космические полеты на МКС
1.1. Кратковременные космические полеты	10 - 11	6	32 - 51
1.2. Продолжительные космические полеты	170 - 199	9	37 - 62
2. Модельные наземные эксперименты
2.1. Эксперимент с изоляцией в гермообъекте в гипербарической кислородно- азотно-аргоновой среде	9	4	27 - 48
2.2. Модельный эксперимент с иммерсией на пленке	7	5	18 - 32
2.3. Модельный эксперимент с длительной изоляцией в гермообъеме	105	6	25 - 38

Материалом для исследований служила периферическая кровь обследованных, взятая из кубитальной вены по стандартной методике в асептических условиях, утром, натощак. Взятие проб крови у космонавтов проводилось за 60 суток до старта и на 1-7-е сутки после приземления; у испытателей-добровольцев, участвующих в наземных модельных экспериментах - в фоновом периоде, во время воздействия и после его завершения.

Исследованные параметры:

1) Содержание цитокинов в сыворотке крови (ИЛ-1б, ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИФН-г, ФНО-б);

2) Спонтанный и митогениндуцированный синтез цитокинов иммунокомпетентными клетками периферической крови (ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИФН-, TNF-);

3) Уровень цитокинсодержащих (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-г, ФНО-б) лимфоцитов (CD4+ Т-хелперов) в периферической крови;

4) Параметры иммунного статуса (относительное и абсолютное содержание лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+клеток).

Исследования содержания цитокинов в сыворотке крови проводили с помощью полуавтоматического биочипового иммунохемилюминесцентного анализатора Evidence investigator (Randox Labs, Великобритания), с использованием коммерческого набора, согласно руководству производителя.

Способность иммуноцитов секретировать цитокины в системе in vitro изучали в 24-часовых стимулированных липополисахаридом Escherichia coli O127 (ЛПС, Sigma) (10 мкг/мл), а также в 48-часовых стимулированных фитогемагглютинином (ФГА, Sigma) (20 мкг/мл) культурах клеток периферической крови. Спонтанную выработку цитокинов определяли, культивируя иммуноциты в полной культуральной среде RPMI-1640 без добавления стимуляторов. Культивирование проводили в СО₂-инкубаторе Binder (Binder GmbH, Германия) при температуре 37°С в атмосфере с 5% СО₂.

В супернатантах культур содержание цитокинов определяли с использованием коммерческого набора Flow Cytomix (Bender MedSystems, Австрия) для определения 11 цитокинов методом проточной цитометрии [Kellar K.L., Douglass J.P., 2003]. Анализ содержания цитокинов в исследуемых образцах проводили на цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Концентрация каждого цитокина вычислялась с помощью программы FlowCytomix Pro и являлась функцией интенсивности флюоресценции.

Выделение мононуклеарных клеток крови (МНК) осуществляли на градиенте плотности фиколл-пак. Взвесь мононуклеаров помещали в культуральную среду и доводили концентрацию клеток до 1х10⁶ клеток/мл.

Для определения внутриклеточного синтеза цитокинов в лимфоцитах периферической крови в культуру МНК добавляли форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА, 50 нг/мл) и ФГА (10 мкг/мл) для запуска процессов активации, а также брефелдин-А (10 мкг/мл). Инкубацию проводили в течение 18 часов. Определение цитокинсодержащих лимфоцитов (CD4+ Т-хелперов) периферической крови осуществляли методом проточной цитофлюориметрии [Sander B., Hoiden I., Andersson U., еt al., 1993] с использованием коммерческого набора Cytodetect (IQ Products, Нидерланды). Анализ проводили на проточном цитометре FACSCalibur в программе CellQuest.

Определение содержания лейкоцитов, а также абсолютного и относительного количества лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов в периферической крови проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Celltac- МЕК 6318K (Япония).

Определение поверхностных рецепторных структур лимфоцитов проводили мультипараметрическим методом иммунофлюоресцентного анализа с использованием моноклональных антител (МАТ) (IQ Products, Нидерланды). В периферической крови оценивали абсолютное и относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности антигены CD3, CD4, CD8. Учет результатов исследований методом проточной лазерной цитометрии проводили на цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) в программах Simulset и CellQuest.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» для Windows. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали, используя непараметрический метод анализа повторных измерений Уилкоксона. Данные представлены в виде среднего значения стандартная ошибка среднего.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Иммунный статус.

При иммунологическом обследовании космонавтов после завершения длительных космических полетов установлено повышение абсолютного количества лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов периферической крови, в частности CD3⁺-, CD3⁺CD4⁺-, CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов (табл. 2). Такие же изменения количественных параметров основных клеточных пулов в периферической крови наблюдались и у участников экспериментов, моделирующих специфическое комплексное воздействие некоторых факторов космического полета. Вероятно, эти изменения являются неспецифической реакцией иммунной системы на стрессовое воздействие, и носят адаптивный характер [Brenner I., 1999; Philp R.B., 1975; Shinomiya N., 1994]. Так как количество цитокинпродуцирующих клеток изменялось, полученные уровни цитокинов в стимулированных культурах периферической крови пересчитывали индивидуально с учетом абсолютного количества мононуклеартных клеток и выражали в пкг/мл/10⁶МНК для лимфоцитарного и в пкг/мл/10⁵МНК для моноцитарного звена.

Цитокиновый профиль у космонавтов до и после космических полетов.

Анализ уровня цитокинов в сыворотке крови у космонавтов после космических полетов различной продолжительности в ряде случаев выявил снижение содержания ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ФНО-б (на 23-35%). Изменение уровней данных цитокинов может служить пусковым механизмом для реактивации латентной инфекции во время космического полета. Это предположение основано на ряде фактов, полученных ранее американскими исследователями, которые свидетельствуют о наличии реактивации латентных герпесвирусных инфекций у астронавтов после завершения кратковременных КП [Stowe R.P. et al., 2001, Pierson D.L. et al., 2005; Mehta S.K. et al., 2005].

Исследование цитокинпродуцирующей способности иммунокомпетентных клеток показало, что на первые сутки после приземления у космонавтов, совершивших короткие КП, отмечена тенденция к снижению продукции ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-б клетками моноцитарно-макрофагального ряда при стимуляции ЛПС (рис. 1А). Анализ продукции цитокинов клетками адаптивного иммунитета - лимфоцитами в ответ на стимуляцию ФГА выявил тенденцию к снижению продукции ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-10, ФНО-в у космонавтов (рис. 2Б). Снижение способности к продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками может происходить вследствие нарушений как на уровне клеточных взаимодействий, продукции и экспрессии рецепторных белков, так и на уровне процессов транскрипции, трансляции, на стадии секреции финального продукта. Таким образом, недостаточная продукция цитокинов, в той или иной степени отражает снижение функциональной активности иммунокомпетентных клеток у космонавтов, описанной рядом авторов [Konstantinova I.V., 1993, Taylor C.R., 1983]. Было отмечено повышение уровня продукции ИФН-г, ключевого фактора, определяющего развитие клеточного типа иммунного ответа. В связи с чем целесообразной являлась оценка динамического равновесия клеточно-опосредованных иммунных реакций (Th1) и гуморального иммунитета (Th2).

Для этого было проанализировано соотношение ИФН- и ИЛ-10, условно принятых в литературе маркерами Тh1- и Тh2- ответа соответственно. Анализ полученных данных выявил повышение этого показателя на 58%.

Таблица 2

Показатели иммунного статуса обследованных, х10⁹/л (Мm)

Показатели	Период обследования	лейкоциты	лимфоциты	моноциты	CD3+	CD3+CD4+	CD3+CD8+
Продолжительные космические полеты, n=9	-60 сутки (фон)	5,340,56	2,000,17	0,280,05	1,500,13	0,820,08	0,550,07
	+1 сутки	8,270,98*	2,610,26*	0,610,09*	2,150,25*	1,270,13*	0,760,12
	+7 сутки	5,740,47	2,170,21	0,390,05*	1,670,17	0,940,09	0,580,08
Кратковременные космические полеты, n=6	Фон	7,531,04	2,200,51	0,480,14	1,510,43	0,890,26	0,550,20
	+1 сутки	7,830,62	2,130,16	0,570,15	1,480,13	0,940,08	0,480,06
Эксперимент с изоляцией в гермообъекте в гипербарической кислородно- азотно-аргоновой среде, n=4	-3 сут (фон)	5,950,43	1,880,30	0,300,04	1,320,22	0,790,06	0,440,15
	6-е сутки в условиях нормоксии	5,980,23	1,950,33	0,350,03	1,410,16	0,870,05	0,440,12
	3-е сутки в условиях гипоксии	6,730,39	1,930,30	0,550,10	1,430,23	0,890,10	0,460,13
	+1 сутки	7,650,39*	3,050,51*	0,730,05*	2,210,37*	1,390,16*	0,670,20
Модельный эксперимент с иммерсией на пленке, n=5	-7 сутки (фон)	4,480,18	1,70,1	0,200,02	1,240,12	0,680,04	0,440,06
	7 сутки	6,320,21*	2,100,09*	0,300,05	1,490,11*	0,860,01*	0,570,08
	+7 сутки	4,960,58	1,600,25	0,300,02	1,140,19	0,610,04	0,430,11
Модельный эксперимент с длительной изоляцией в гермообъеме, n=6	-14 сутки (фон)	4,550,43	1,880,15	0,130,02	1,460,12	0,780,09	0,570,08
	17-е сутки в условиях изоляции	4,780,39	2,570,19*	0,230,02*	2,060,19*	1,140,16*	0,640,04
	105-е сутки в условиях изоляции	4,420,56	2,130,17*	0,170,02	1,680,15	0,980,11*	0,590,07
	+7 сутки	4,370,32	1,630,12*	0,170,02	1,240,09	0,670,05	0,420,06*

* р<0,05

Таким образом, особенностью цитокинового профиля космонавтов после завершения коротких космических полетов является сдвиг иммунного баланса в сторону Th1-ответа, что указывает на преобладание клеточного типа иммунного реагирования.

Рисунок 1 Уровень продукции цитокинов клетками периферической крови у космонавтов до и после коротких космических полетов, n=6. А-при стимуляции in vitro ЛПС, Б-при стимуляции in vitro ФГА

Изучение продукции цитокинов моноцитами у космонавтов - участников длительных экспедиций на МКС показало, что на 1 сутки после посадки происходило снижение продукции ИЛ-8 и наблюдалась тенденция к снижению ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-б (рис. 2А). Продукция Th1- и Th2- цитокинов лимфоцитами периферической крови также

Рисунок 2 Уровень продукции цитокинов клетками периферической крови у космонавтов до и после длительных космических полетов, n=9. А-при стимуляции in vitro ЛПС, Б-при стимуляции in vitro ФГА. * р<0,05

имела тенденцию к снижению на 1-е сутки после посадки (рис. 2Б). Среднее значение на группу соотношения ИНФ-г/ИЛ-10 существенно не изменялось, однако, при индивидуальном анализе выявлено снижение этого соотношения на 22-86% у 5 из 9 обследованных космонавтов на 1-е сутки после длительных КП, а на 7-е сутки - на 12-81%.

Ценным дополнением к комплексу исследования системы цитокинов является определение количества цитокинпродуцирующих лимфоцитов в периферической крови. У троих космонавтов, совершивших длительные полеты, исследовалось относительное количество лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией ИФН-г, ФНО-б, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 в стимулированных специфическим митогеном культурах лимфоцитов.

При анализе полученных данных было установлено, что у двух космонавтов после завершения длительного КП выявлена существенная разница в динамике изменений уровня цитокин-содержащих клеток в периферической крови. При стимуляции ФМА и ионофором Са²⁺ количество ИЛ-2-, ИЛ-4-, ИЛ-10- и ФНО-б-содержащих клеток в одном случае понижалось (рис. 3А), что сопровождалось снижением этих же цитокинов в супернатантах культур периферической крови на первые сутки после приземления по сравнению с предполетными значениями. Во втором случае, наоборот, количество цитокин-содержащих клеток повышалось (рис. 3Б), но при этом уровни аналогичных цитокинов в супернатантах культур периферической крови были ниже фоновых значений. Вероятно, в послеполетном периоде наряду с уменьшением способности лимфоцитов к синтезу цитокинов, существует механизм, препятствующий секреции вновь синтезированных медиаторов из клетки. Еще у одного обследованного космонавта, участника длительного КП, получено значительное снижение ИЛ-2-содержащих

Рисунок 3 Относительное количество лимфоцитов с внутриклеточной экспрессией цитокинов при стимуляции ФМА у космонавтов А, Б, В до и после завершения длительного космического полета

лимфоцитов и повышение ФНО-б-содержащих клеток, как на первые, так и на 7 сутки послеполетного периода (рис. 3В). У данного космонавта было выявлено также снижение ИЛ-2 и ФНО-б в супернатанте культуры крови.

Таким образом, несмотря на значительные индивидуальные различия, при оценке общей направленности изменений продукции цитокинов МНК периферической крови относительно фоновых значений, на 1-е сутки после приземления преобладает снижение как продукции цитокинов моноцитарно-макрофагальным звеном при стимуляции ЛПС, так и продукции их лимфоцитами при стимуляции ФГА у космонавтов, совершивших длительный полет, что может являться признаком угнетения их функциональной активности. Снижение соотношения ИНФ-г/ИЛ-10 указывает на сдвиг цитокинового баланса в сторону Th2 гуморального иммунного ответа.

Цитокиновый профиль у испытателей-добровольцев в условиях 7-суточной «сухой» иммерсии.

В эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией (СИ), имитирующей некоторые физиологические эффекты микрогравитации, испытатели-добровольцы погружались в воду, будучи отделенными от нее водонепроницаемой тканью [Шульженко Е.Б., Виль-Вильямс И.Ф., 1976]. На 7 сутки пребывания в эксперименте у обследованных было выявлено статистически значимое снижение сывороточного уровня ФНО-б - важного провоспалительного цитокина, характеризующегося участием в процессах противовирусной и противоопухолевой защиты. Кроме того, была отмечена тенденция к снижению содержания ИЛ-2, ИЛ-1в - медиаторов воспалительных реакций, участников процессов активации и пролиферации Т-клеток в ходе иммунного ответа, а также снижение ИЛ-8 - важного хемокина. Полученные результаты могут являться неблагоприятным признаком, в частности, в связи с тем, что проведенный корреляционный анализ выявил тесные взаимосвязи между сывороточными уровнями ФНО-б, ИЛ-1в, ИЛ-8 и уровнями специфических антител к Ureaplasma Urealiticum и Herpes virus 2, 6 типа. Корреляционные взаимосвязи между данными показателями были отмечены также рядом авторов у людей с различными заболеваниями инфекционно-воспалительного генеза [Порсохонова Д.Ф. и др., 2005].

Изучение продукции цитокинов моноцитами периферической крови выявило значительную гетерогенность индивидуальных значений содержания ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-1в, ФНО-б, связанную, вероятно, с различием функциональных резервов организма испытателей (рис. 4А).

При анализе общей направленности изменений продукции цитокинов лимфоцитами периферической крови относительно фоновых значений, установлено, что на 7-е сутки иммерсии преобладало повышение стимулированной ФГА продукции цитокинов лимфоцитами (рис. 4Б). Выявленное повышение исследованных параметров, по-видимому, демонстрирует классическую реакцию активации, напряжения цитокиновой системы, мобилизации функциональных резервов в ответ на действие стрессирующего фактора.

На 7-е сутки пребывания в условиях «сухой» иммерсии выявлено снижение соотношения ИФН-/ИЛ-10 у четырех обследованных на 21-55% по сравнению с фоном, указывающее на активацию Th2-лимфоцитов, а в периоде реадаптации снижение на 22-72% выявлено у троих испытателей. Средне-групповое значение при этом существенно не изменялось.

А

Б

Рисунок 4 Схематичное изображение количества изменений продукции цитокинов в супернатантах стимулированных культур МНК периферической крови в условиях СИ и в периоде реадаптации. А - продукция цитокинов моноцитарно-макрофагальным звеном при стимуляции ЛПС, Б - продукция цитокинов лимфоцитами при стимуляции ФГА

При моделировании эффектов микрогравитации выявлено снижение соотношения ИФН-/ИЛ-10, что повышает вероятность направления дифференцировки лимфоцитов по Тh2 пути.

Таким образом, результаты исследований функциональных резервов иммунокомпетентных клеток в нагрузочных тестах с митогенами показали, что адаптация к условиям моделируемой микрогравитации потребовала определенного напряжения системы иммунитета, о чем свидетельствует повышение способности клеток к продукции цитокинов, и связана с поляризацией иммунного ответа по Тh2-механизму.

Продукция цитокинов клетками периферической крови в условиях 9-суточной изоляции в барокамере под повышенным давлением в кислородно-азотно-аргоновой среде (КААрСр).

Эксперимент с пребыванием в герметичном объекте в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде является моделью одного из возможных факторов КП - искусственной среды обитания с использованием специальных пожаро-безопасных газовых сред, которые могут быть применены, в частности, на космических станциях. Для обеспечения условий пожаробезопасности в гермообъектах перспективным является использование гипоксической аргоносодержащей газовой среды, так как с одной стороны, при содержании кислорода менее 15% возгорание не возникает [Тюрин В.И., 1998], а с другой - введение аргона в состав газовой смеси может улучшить переносимость такой гипоксии [Pavlov B.N., 1998]. Экспериментальный водолазный «спуск» методом длительного пребывания под повышенным давлением с использованием КААрСр осуществляли в главном водолазном комплексе ГВК-250 ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Условия пребывания испытателей в ходе эксперимента менялись. Так, первые 6 суток испытатели находились в условиях гипербарической (5 м вод.ст.) нормоксической (13,7% кислорода) КААрСр, следующие 3 суток - в гипербарической гипоксической (9,9% кислорода) КААрСр, на 1 сутки реадаптации проходили декомпрессию в воздушной среде.

В нормоксических гипербарических условиях наблюдалась тенденция к повышению уровней продукции ИЛ-1в, ИЛ-6, ФНО-б по сравнению с фоновыми значениями (рис. 5А). Полученные данные свидетельствуют также о том, что ЛПС-индуцированная продукция ИЛ-8 была снижена, тогда как способность иммунокомпетентных клеток спонтанно вырабатывать ИЛ-8 у обследованных лиц оказалась значительно повышена на 6 сутки пребывания в нормоксической гипербарической среде. Это свидетельствует, во-первых, о наличии предсуществующей активации иммунокомпетентных клеток, приводящей к усилению их способности спонтанно вырабатывать ИЛ-8, и, во-вторых, о снижении их реактивности, что выражается в нарушении способности реагировать усилением выработки цитокина в ответ на стимуляцию.

В условиях гипоксии (9 сутки эксперимента) наблюдалась тенденция к снижению продукции ИЛ-1в и ИЛ-8, а также к повышению уровня ИЛ-6 в данном случае, вероятно, проявляющего свои противовоспалительные свойства, а именно, способность запускать механизмы, ограничивающие воспаление в условиях гипоксии, ингибировать синтез провоспалительных цитокинов [Yan S.F., 1995; Tamm M., 1998]. При выявленной однонаправленности изменений исследованных параметров у всех испытателей, тем не менее, различия с фоновыми значениями не были статистически достоверны ввиду больших индивидуальных вариаций.



Рисунок 5 Уровень продукции цитокинов иммуноцитами периферической крови в условиях 9-суточной изоляции в барокамере под повышенным давлением в кислородно-азотно-аргоновой среде, n=4. А - при стимуляции клеток крови in vitro ЛПС, Б - при стимуляции клеток крови in vitro ФГА

Изучение ФГА-индуцированной продукции цитокинов МНК периферической крови испытателей, находящихся в гипербарических условиях, показало, что в большинстве случаев наблюдалось снижение уровней ИФН-г, ИЛ-2, ИЛ-10, ФНО-в как в условиях нормоксической, так и в гипоксической КААрСр, а также на первые сутки реадаптации (рис. 5Б). Исключением является ИЛ-6, с его значительным повышением в условиях гипоксии, как противовоспалительного фактора.

Известно, что гипоксия влияет на продукцию провоспалительных медиаторов различными типами клеток [Naldini A., Pucci A., 2001]. В частности, гипоксия может повышать продукцию ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-г МНК периферической крови при наличии или отсутствии стимуляции Т-клеток [Naldini А., Carraro F., 1997]. Полученные в данном исследовании результаты, по-видимому, характеризуют фазу истощенного функционирования иммуноцитов. Таким образом, пребывание в условиях гипербарии характеризуется снижением продукции цитокинов лимфоцитарным звеном иммунитета.

На первые сутки реадаптационного периода сниженными остаются 90% изученных показателей. Эти данные, по-видимому, свидетельствуют о воздействии на человека повторного стресса, связанного с процессом декомпрессии.

Несмотря на то, что произошло снижение как Th1-, так и Th2-цитокинов, анализ их соотношения выявил преобладание гуморального типа иммунного реагирования у большинства обследованных, у одного испытателя наблюдалось преобладание Тh1-типа реагирования. Среднее значение на группу соотношения ИФН-/ИЛ-10 снижалось на 6 и 9 сутки эксперимента на 50% и 54%, соответственно.

Результаты проведенного исследования цитокинового профиля в эксперименте с 9-суточной изоляцией в барокамере в нормоксической и гипоксической кислородно-азотно-аргоновой среде, позволяют сделать заключение о том, что адаптация к этим условиям в большинстве случаев сопровождалась повышением продукции цитокинов клетками моноцитарно-макрофагального звена на 6 сутки эксперимента и снижением продуции цитокинов клетками адаптивного иммунитета во все исследованные периоды экспериментального воздействия.

Таким образом, возможность длительного пребывания человека в условиях воздействия комплекса гипербарических факторов в совокупности с применением нормоксических и гипоксических кислородно-азотно-аргоновых сред определяется состоянием регуляторных систем, а также наличием функциональных резервов физиологических систем организма, в том числе, цитокиновой регуляции иммунной системы.

Уровень продукции цитокинов клетками периферической крови в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъекте с искусственной средой обитания.

Для реализации модельного эксперимента с длительной изоляцией использовался герметично замкнутый объект, сопоставимый по объемам с реальными космическими объектами, с технической инфраструктурой.

Исследование функциональных изменений цитокиновой системы регуляции в эксперименте со 105-суточной изоляцией испытателей-добровольцев в гермообъекте показало, что к моменту предполагаемого окончания периода адаптации к новым условиям функционирования физиологических систем организма (17 сутки), а также на заключительном периоде изоляции (105 сутки) и в периоде реадаптации (+7 сутки) выявлен ряд изменений. Так, ЛПС-индуцированный уровень синтеза ИЛ-8 снижался, наблюдалась тенденция к снижению ИЛ-1в, ИЛ-6 у обследованных на 17-е сутки изоляции (рис. 6А). На 105-е сутки и в периоде реадаптации выявлено снижение продукции ИЛ-1в по сравнению с фоновыми значениями.

На 105-е сутки изоляции наблюдалась тенденция к снижению синтеза Тh1-клетками ИЛ-2, ИФН-г и к повышению ИЛ-5, синтезируемого Тh2-лимфоцитами периферической крови при стимуляции ФГА (рис. 6Б). Избыточная активация Тh2-клонов определяет тип иммунного реагирования и направляет иммунный ответ по гуморальному типу развития. Об этом свидетельствует снижение соотношения ИФН-г/ИЛ-10 на 17-е сутки у троих испытателей на 17-48%, на 105-е у четверых обследованных на 30-47%, в периоде реадаптации на 12-73%.



Рисунок 6 Уровень продукции цитокинов клетками периферической крови у испытателей-добровольцев в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъекте с искусственной средой обитания, n=6. А-при стимуляции in vitro ЛПС, Б- при стимуляции in vitro ФГА. * р<0,05

Таким образом, изучение цитокинового профиля у испытателей-добровольцев в эксперименте со 105-суточной изоляцией в гермообъекте показало, что на этапе, предполагающем завершение острых адаптационных реакций организма к новым условиям (17 сутки изоляции), происходит снижение уровня цитокинов, продуцируемых моноцитарно-макрофагальным звеном периферической крови в ответ на стимуляцию ЛПС. При длительном пребывании в условиях гермообъекта (105 сутки) у большинства обследованных выявлено тенденция к снижению способности лимфоцитов в функциональном нагрузочном тесте с ФГА продуцировать ИФН-г, ИЛ-2, ИЛ-6. Эти данные свидетельствуют о снижении резервных возможностей иммунокомпетентных клеток в условиях длительной изоляции человека в условиях гермообъекта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что цитокиновая система регуляции антигенно-структурного гомеостаза организма чувствительна к воздействию экстремальных факторов КП. После завершения длительных КП происходит снижение резервных возможностей иммунокомпетентных клеток, что выражается в изменении продукции цитокинов моноцитарно-макрофагальным и лимфоцитарным звеньями в ответ на адекватную стимуляцию. Пребывание в условиях наземного моделирования некоторых эффектов факторов КП, а именно, в эксперименте с «сухой» иммерсией, изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания - также влияет на способность иммунокомпетентных клеток продуцировать цитокины. Причем в эксперименте с 7-суточной «сухой» иммерсией происходит усиление стимулированной продукции цитокинов, активация резервов системы иммунитета, а в условиях изоляции и гипербарического воздействия на участников эксперимента, наоборот, происходит снижение изученных параметров. Это свидетельствует о вовлечении различных механизмов адаптивного ответа системы цитокинов при воздействии этих экстремальных факторов.

Выявленное изменение баланса цитокинов, синтезируемых Th1- и Th2-лимфоцитами, влечет за собой, в ряде случаев, снижение соотношения ИНФ-г/ИЛ-10, указывающее на сдвиг цитокинового баланса в сторону Th2 гуморального иммунного ответа. Эти изменения в условиях длительного воздействия могут повлечь за собой нарушения иммунитета, которые редко манифестируют как острые заболевания, а гораздо чаще способствуют развитию хронических инфекционных и аллергических заболеваний [Волчек И.А., 1999]. В этой связи, очевидно, необходим мониторинг сбалансированности цитокиновой регуляции, от которой во многом зависит состояние системы иммунитета и степень напряженности регуляторных систем всего организма.

В данной работе показано, что динамика изменений продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками при воздействии на организм факторов космического полета может отличаться индивидуальной направленностью, что объясняется, по-видимому, различной иммунологической реактивностью, складывающейся в онтогенезе и генетически обусловленной, так как известно, что геном человека в значительной мере определяет гомеостаз и адаптоспособность клеток, тканей, органов и организма в целом. В этой связи выявление индивидуальных особенностей функционирования системы цитокинов с помощью функциональных нагрузочных тестов может стать значимым при отборе космонавтов и прогнозе адаптационных возможностей организма к воздействию экстремальных факторов, в том числе и условиям межпланетного космического полета.

Очевидно, что дальнейшее изучение системы цитокинов, характеристика взаимосвязей с другими элементами иммунной системы позволит определить роль выявленных изменений в поддержании антигенно-структурного гомеостаза.

ВЫВОДЫ

1. После завершения коротких КП у космонавтов выявлены изменения как в сторону повышения, так и в сторону снижения продукции цитокинов (ИЛ-1в, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-б, ФНО-в, ИФН-г) МНК периферической крови. Отличительной особенностью цитокинового профиля является сдвиг иммунного баланса в сторону Th1-клеточного иммунного ответа.

2. На первые сутки после завершения длительных КП у космонавтов отмечено снижение продукции цитокинов МНК периферической крови как моноцитарно-макрофагального, так и лимфоцитарного звена, свидетельствующее об уменьшении резервных возможностей иммунокомпетентных клеток.

3. При наземном моделировании физиологических эффектов микрогравитации в эксперименте с 7-суточной «сухой иммерсией» продукция цитокинов у испытателей-добровольцев характеризовалась вариабельностью направленности и интенсивности изменений. Выявленные особенности могут быть связаны с разными исходными потенциальными возможностями иммунокомпетентных клеток.

4. В эксперименте с 9-суточным пребыванием человека в гермообъеме в гипербарической нормоксической и гипоксической кислородно-азотно-аргоновой среде происходит усиление митоген-индуцированной продукции цитокинов моноцитарно-макрофагальным звеном и снижение синтеза цитокинов лимфоцитами периферической крови.

5. В условиях длительной 105-суточной изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания на 17-е, 105-е сутки у испытателей-добровольцев выявлено снижение продукции цитокинов моноцитарно-макрофагальным звеном, а на 105-е сутки изоляции - снижение продукции цитокинов лимфоцитами.

6. Пребывание космонавтов в условиях длительного орбитального полета и испытателей-добровольцев в условиях моделируемых факторов КП сопровождается значительным повышением в периферической крови количества клеток-продуцентов и снижением их способности к синтезу цитокинов.

7. Изучение продукции цитокинов оппозиционными пулами лимфоцитов (Тh1 и Th2) в условиях наземных экспериментов с моделированием факторов КП и после завершения длительных КП выявило снижение соотношения ИНФг/ИЛ-10, что указывает на сдвиг цитокинового баланса в сторону Th2 гуморального иммунного ответа.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Несмотря на трудности выявления причинно-следственных отношений в пределах цитокиновой сети, необходим мониторинг функционального состояния и оценка резервных возможностей при воздействии на организм человека экстремальных факторов внешней среды. Присутствие в иммунологическом контроле показателей спонтанной и индуцированной продукции цитокинов иммунокомпетентными клетками может явиться продуктивным методологическим подходом для выявления начальных этапов развития иммунодефицитов при воздействии на организм экстремальных факторов. Поскольку для профессионального отбора и выбора средств профилактики наибольшее практическое значение имеет возможность составления индивидуального прогноза, становится очевидным необходимость такого мониторинга.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Показатели системы иммунитета здорового человека в эксперименте с изоляцией в гермообъекте в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде. Авиакосмическая и экологическая медицина, 2009, том 43, №3. С. 28-33 (соавторы: М.П. Рыкова, Е.Н. Антропова, Ю.А. Попова, И.М. Ларина, Б.В. Моруков).

2. Состояние системы иммунитета человека в условиях 7-суточной «сухой» иммерсии. Авиакосмическая и экологическая медицина, 2009, том 43, №5. С. 36-42 (соавторы: М.П. Рыкова, Е.Н. Антропова, И.М. Ларина, Б.В. Моруков).

3. Показатели врожденного и адаптивного иммунитета у космонавтов после длительных космических полетов на Международной космической станции. Физиология человека, 2010, том 36, № 3. С. 1 - 12 (соавторы: Б.В. Моруков, М.П. Рыкова, Е.Н. Антропова, С.А. Пономарев, И.М. Ларина).

4. Состояние системы адаптивного иммунитета человека в условиях 105-суточной изоляции в гермообъекте с искусственной средой обитания. Авиакосмическая и экологическая медицина (в печати), (соавторы: Б.В. Моруков, М.П. Рыкова, Е.Н. Антропова, С.А. Пономарев).

5. T-cell immunity and cytokine production in cosmonauts after long-duration space flights. Acta Astronautica (в печати), (co-authors: Morukov B., Rykova M., Antropova E., Ponomaryov S., Larina I.).

6. Исследование раннего периода адаптации системы иммунитета к условиям моделируемой микрогравитации. Сб. тезисов VII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики, и приуроченной к 45-летию ГНЦ РФ-ИМБП РАН, Москва, 2008, с. 7.

7. Immune system dysregulation after long-duration space flight. Abstr. 17^th Humans in Space Moscow, Russia, June 7-11, 2009, p.16 (co-authors: Morukov B., Rykova M.,Antropova E., Larina I.).

8. Psychoneuroimmunological status in conditions of 18-hour bed rest with a headown tilt Abstr. 17^th Humans in Space Moscow, Russia, June 7-11, 2009, p.91 (co-authors: Nichiporuk I., Vassilieva G., Rykova M., Antropova E., Larina I.).

9. Цитокиновый профиль и иммунный статус здорового человека в эксперименте с изоляцией в гермообъекте в гипербарической кислородно-азотно-аргоновой среде. Сб. тезисов VIII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики, Москва, 2009, с. 7 - 8.

10. Взаимосвязи психонейроэндокринной системы и иммунного статуса в условиях кратковременной антиортостатической гипокинезии и 7-суточной «сухой» иммерсии. Сб. тезисов докладов VII Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия, 29 сентября-02 октября 2009, с. 314-315. (соавторы: Ничипорук И.А., Васильева Г.Ю., Рыкова М.П., Антропова Е.Н., Белоусова И.В.)

11. Цитокиновый профиль и иммунный статус здорового человека в условиях 7-суточной «сухой» иммерсии. Сб. тезисов IX Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики, Москва, 2010, с. 20 - 21.

Список сокращений

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

КААрСр - кислородно-азотно-аргоновая среда

КП - космический полет

ЛПС - липополисахарид

МАТ - моноклональные антитела

МКС - международная космическая станция

МНК - мононукларные клетки

СИ - «сухая» иммерсия

Th-лимфоциты - лимфоциты Т-хелперы

ФГА - фитогемагглютинин

ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат

ФНО - фактор некроза опухолей

Размещено на Allbest.ru

...