Агрегационная активность форменных элементов крови в норме и у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

агрегационная активность форменных элементов крови в норме и у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа

03.03.01 - физиология

14.03.03 - патологическая физиология

Роднина Ольга Сергеевна

Чита - 2013

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Кузник Борис Ильич

кандидат медицинских наук Страмбовская Наталья Николаевна

Официальные оппоненты:

Ефремов Анатолий Васильевич - д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России заведующий кафедрой патофизиологии с курсом клинической патофизиологии

Степанов Александр Валентинович - д.м.н., ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России заведующий кафедрой безопасности жизнедеятельности и медицины катастроф

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Барнаул)

Защита состоится «____» ____________ 2013 года в 9.00 на заседании диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, 672090, г. Чита, ул. Горького, 39А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздрава России, 672090, г. Чита, ул. Горького, 39А.

Автореферат разослан_______________________________________

дата

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.118.01

д.м.н., профессор И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В Российской Федерации, как и во всем мире, неуклонно возрастает заболеваемость сахарным диабетом (СД) [Дедов И.И., Шестакова М.В., 2011]. Значительная распространенность СД приводит к огромным экономическим затратам преимущественно за счет лечения осложнений таких как инсульт, инфаркт миокарда, ампутации нижних конечностей вследствие диабетической нейро- и ангиопатии, слепоты [Холодова Е.А., 2011]. Сахарный диабет входит в тройку заболеваний, наиболее часто приводящих к инвалидизации населения и смерти (другие 2 - атеросклероз и рак). Почти половина случаев смерти от диабета происходит среди людей в возрасте до 70 лет [Аметов А.С., 2012]. Патогенетически гипергликемия при СД ведёт к гемокоагуляционным и реологическим сдвигам, в частности, нарушению функции эндотелия сосудов, тромбоцитов, лейкоцитов, эритроцитов и их взаимодействию [Балаболкин М.И., 2000; Маланьина К.С., 2002].

В условиях нормы лейкоциты, тромбоциты и эритроциты лишь изредка вступают в реакцию друг с другом и эндотелием, но при различных патологических состояниях (малярия, серповидно-клеточная анемия, воспалительные заболевания) они образуют агрегаты непосредственно в кровотоке [Бельченко Д.И. и др., 2005, 2007; Бурячковская Л.И. и др., 2004, 2007; Кузник Б.И., 2010, 2012]. Однако характер взаимодействия между лейкоцитами, эритроцитами и тромбоцитами в условиях нормы и при сахарном диабете 1 и 2 типа до сих пор не изучался. Между тем, решение этой проблемы имеет не только теоретическое, но и важное практическое значение, ибо дает в руки врача еще один способ объективно оценить тяжесть патологического процесса и с большей долей вероятности прогнозировать развитие осложнений и, следовательно, предпринимать меры для их предотвращения.

За последние годы в лабораторную практику активно внедряются неинвазивные методы исследования системы крови. В частности, Израильской фирмой Elfi-Tech Ltd [Файн И.В. и др., 2007, 2010, 2012], предложен аппарат для неинвазивного изучения состояния системы гемостаза. Однако до сих пор не выяснялось, возможно, ли с помощью предлагаемого метода судить об агрегационной активности форменных элементов крови в условиях нормы и патологии.

Цель исследования. Изучить (in vitro, in vivo) особенности агрегационной активности форменных элементов крови в норме и у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов различной степени тяжести.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Установить содержание лейкоцитарно-эритроцитарных (ЛЭА) и эритроцитарно-тромбоцитарных (ЭТА) агрегатов в крови и их взаимосвязь с основными гематологическими показателями в норме, и при сахарном диабете 1 и 2 типа различной степени тяжести.

2. Выявить взаимосвязь между состоянием системы гемостаза, концентрацией гомоцистеина и содержанием лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов в норме и у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов.

3. Оценить спонтанную и индуцированную агрегационную активность тромбоцитов крови в норме и у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов различной степени тяжести, а также обнаружить взаимосвязь между агрегационной активностью тромбоцитов и содержанием лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов в норме и у больных сахарным диабетом 1 и 2 типов.

4. Сравнить результаты неинвазивного и инвазивного метода определения агрегационной активности форменных элементов крови у здоровых людей и больных сахарным диабетом.

Научная новизна. Впервые установлено, что с возрастом в крови у здоровых людей число лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов (ЛЭА) увеличивается, но при этом не отмечается гендерных различий.

У больных сахарным диабетом 1 и 2 типов по сравнению со здоровыми людьми число ЛЭА и ЭТА в крови резко возрастает и при этом нередко в месте контакта развивается экзоцитарный лизис эритроцитов. Чем тяжелее протекает заболевание, тем больше ЛЭА и ЭТА обнаруживается в крови. У больных СД 1 типа отмечается тенденция к повышению среднего объема эритроцитов и увеличение среднего объема тромбоцитов. Последнее свидетельствует о наличии незрелых активированных кровяных пластинок, появляющихся в циркуляции из-за повышенного их потребления в результате спонтанной гиперагрегации.

Как у здоровых испытуемых, так и больных выявлены прямые корреляционные связи между числом изучаемых агрегатов и содержанием лейкоцитов, агрегационной активностью тромбоцитов, концентрацией фибриногена, Д-димеров и обратные - между уровнем естественных антикоагулянтов. У больных СД установлена прямая корреляционная связь между содержанием ЛЭА, ЭТА и концентрацией гомоцистеина.

Показано, что у больных СД 1 типа, по сравнению с пациентами СД 2 типа, усилена спонтанная агрегация тромбоцитов. При СД 1 типа у значительной части больных выявляется вторичная гипоагрегация, тогда как при СД 2 типа превалирует первичная гиперагрегация.

Впервые установлено, что с помощью анализа спеклов и динамического рассеивания света можно судить об агрегационной активности форменных элементов крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют описать феномен эндогенного образования агрегатов между лейкоцитами, эритроцитами и тромбоцитами в норме и у больных СД-1 и СД-2 типов, а также оценить их взаимосвязь с некоторыми параметрами гемограммы и системы гемостаза. Одновременно, выявленные результаты уточняют патогенез микроциркуляторных нарушений при сахарном диабете 1 и 2 типов. Предлагаемый неинвазивный метод оценки состояния системы гемостаза в экстренных случаях позволяет составить представление об агрегационной активности различных форменных элементов крови.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной и патологической физиологии ГБОУ ВПО ЧГМА, а также в работу эндокринологического отделения Забайкальской краевой клинической больницы.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной - 55-летию ЧГМА "Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины" (Чита, 2008); Всероссийской научно практической конференции с международным участием "Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению" (Москва, 2011); Шестой Всероссийской конференции с международным участием "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" (Москва, 2013); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 60-летию ЧГМА "Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины" (Чита, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых изданиях, определенных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 фотографиями, 3 рисунками и 38 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов исследования, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, состоящего 130 отечественных и 69 зарубежных источников.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В норме в крови содержание ЛЭА с возрастом имеет тенденцию к увеличению, при этом преобладают нейтрофильно-эритроцитарные агрегаты, гендерных различий в содержании агрегатов не выявлено. Отмечаются прямые корреляционные связи между количеством ЛЭА и содержанием лейкоцитов, фибриногена, Д-димеров, РФМК; агрегацией тромбоцитов и обратные - с активностью протеина С и антитромбина ЙЙЙ.

2. В крови больных СД 1 и СД 2 типов наблюдается увеличение числа лейкоцитов, способных образовывать агрегаты с эритроцитами и эритроцитов, взаимодействующих с тромбоцитами. Чем тяжелее протекает заболевание, тем больше количество ЛЭА и ЭТА регистрируется в крови. Отмечается прямая корреляционная зависимость между содержанием ЛЭА, ЭТА с одной стороны и количеством лейкоцитов, эритроцитов, основными показателями коагуляционного гемостаза, уровнем гомоцистеина - с другой. Одновременно выявляются обратные корреляционные связи между числом ЛЭА и ЭТА и активностью антитромбина ЙЙЙ и протеина С.

3. У больных СД 1 типа в большей степени повышена спонтанная агрегация тромбоцитов, чем у страдающих СД 2 типа. При индукции агрегации различными лигандами у пациентов СД 1 типа отмечается вторичная гипоагрегация кровяных пластинок, тогда как у больных СД 2 типа - первичная гиперагрегация, что свидетельствует о более тяжелых расстройствах агрегационной активности тромбоцитов у больных СД 1 типа.

4. Разработанный с помощью лазерного допплера и анализа спеклов неинвазивный метод косвенно позволяет оценить состояние агрегационной активности форменных элементов крови в норме и у больных СД 1 и 2 типа.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki (1964, 2000 ред.)).

В группу сравнения (здоровые) методом сплошной выборки были включены 86 человек (59 женщин, 27 мужчин), проживающих в городе Чита и считающих себя относительно здоровыми, средний возраст которых составил 41,5±12,1 лет.

Критерии включения в группу здоровых: отсутствие объективных признаков острых или обострения (осложнения) хронических заболеваний; отсутствие гипергликемии, артериальной гипертензии, дислипидемии.

Критерии исключения из контрольной группы: беременность; острые и хронические заболевания в стадии обострения; сахарный диабет 1 и 2 типов; прием лекарственных препаратов, повышающих в крови уровень гомоцистеина, глюкозы; курение; вегетарианство.

В клиническую группу были включены 116 больных: сахарным диабетом 1 типа - 38 пациентов (18 мужчин (47,4%) и 20 женщин (52,6%)), 78 пациентов с сахарным диабетом 2 типа (16 мужчин (20,5%) и 62 женщин (79,5%)). Все наблюдаемые находились на стационарном лечении в диабетологическом центре на базе эндокринологического отделения Краевой клинической больницы города Чита в период с 2008 по 2011 год. Средний возраст больных СД 1 типа составил 42,3±13,3 лет, а стаж заболевания - 9,9±4,5 лет. У больных СД 2 типа (средний возраст - 58,9±8,4 лет) стаж болезни был 10,8±6,5 лет, однако следует учитывать, что начало заболевания было постепенным и диагностировалось впервые после манифестации через 3-5 лет. У всех пациентов причиной настоящей госпитализации послужила декомпенсация углеводного обмена - 71 (91,2%) и только у 7 из них (8,8%) сахарный диабет 2 типа был выявлен впервые.

Критерии включения в клиническую группу: наличие сахарного диабета 1 типа; наличие сахарного диабета 2 типа.

Критерии исключения из клинической группы: злокачественные новообразования; беременность; острые воспалительные и хронические заболевания в стадии обострения; острый инфаркт миокарда, ОНМК; прием лекарственных препаратов, повышающих уровень гомоцистеина; курение; вегетарианство.

Лабораторные методы исследования

Общий анализ крови, подсчет ЛЭА и ЭТА. Исследование общего анализа крови проводили натощак на венозной крови с помощью автоматического гематологического анализатора (Pentra 120, Франция). Лейкоцитарно-эритроцитарные агрегаты (ЛЭА) и эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты (ЭТА) определяли в мазке крови по методу, разработанному Д.И. Бельченко (1990 г). Подсчитывали абсолютное и процентное содержание всех видов лейкоцитов (лейкоцитарная формула) с пометкой агрегированных и учетом состава взаимодействующих клеток.

Исследование спонтанной и индуцированной агрегации тромбоцитов проводили турбидиметрическим методом с использованием двухканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «Биола» (Россия). В качестве индукторов были использованы реактивы ООО «Технология - Стандарт»: раствор АДФ в конечной концентрации 10 мкг/мл; коллаген - 10 мг/мл; адреналин - 5 мкг/мл; ристомицин - 10 мг/мл. Запись агрегатограммы осуществлялась при 37°С в течение 15 минут.

Состояние коагуляционного гемостаза. Нами определялись следующие показатели: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ); протромбиновый индекс и международное нормализованное отношение (ПТИ/МНО); тромбиновое время; концентрация фибриногена, Д-Димеров, РФМК; активность антитромбина III, протеина С и антиплазмина на автоматическом анализаторе гемостаза STA Evolution-R («Roche», Франция).

Определение концентрации гомоцистеина проводилось на автоматическом анализаторе IMMULITE 1000 (США), предназначенном для проведения иммунологического анализа.

Инструментальные методы исследования. Израильская компания ELFI-TECH LTD (Rehovot, Israel) разработала и запатентовала методику, позволяющую при помощи оптической технологии, основанной на методах спекл-анализа, определять отдельные параметры, характеризующие процесс гемокоагуляции. Этот способ базируется на комбинации окклюзионной спектроскопии (ОС) и методики динамического рассеяния света (ДРС). Последняя связана с определением размеров дисперсных частиц, находящихся во взвесях и оценки их вязкости. У всех испытуемых прибором ELFI-3 параллельно были проведены измерения оптического спекл-сигнала отраженного света, которые сводятся к следующим действиям. Больной может находиться в положении сидя или лёжа. Сенсор прикрепляется к основанию среднего или указательного пальца. Оператор активирует начало измерения через компьютер и на пневматическое кольцо подаётся давление 280 мм рт. ст. В течение 0,1 с. происходит сдавление сосудов в месте измерения и оптическая система начинает освещать пережатый участок пальца. Измеренный сигнал сохраняется в памяти компьютера для дальнейшей обработки. По истечении 25 с давление сбрасывается до нуля. Через 15 с после перерыва выполняется повторное измерение. Всего производится 5 последовательных определений. Измерение проводилось у всех исследуемых (в клинической группе - в день поступления пациентов в стационар).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программ Microsoft Excel 2003, Statistica 6,0 (StatSoftInc, USA). Перед началом анализа вариационные ряды тестировались на нормальность, при помощи методов асимметрии и эксцессов. При проведении описательной статистики вычисляли среднюю, стандартное отклонение, медиану, 25 и 75 процентили. Для сравнения двух несвязанных групп использовался: при нормальном распределении признака - критерий Стьюдента (t-тест), при ненормальном распределении признака - критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Взаимосвязь между количественными признаками выявлялась с помощью корреляционного анализа с использованием коэффициента корреляции Пирсона.

Обработка данных, неинвазивного метода осуществлялась с помощью программы, реализующей быстрое преобразование Фурье (FFT) полученного сигнала таким образом, что конечный результат измерения превращается в вектор S (частота - f, время - t), описывающий изменение спектра плотности измеренного сигнала динамического рассеяния света (ДРС), как функцию времени. Для вычисления оптического эквивалента того или иного исследуемого параметра системы гемостаза была использована модель множественной линейной регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Содержание лейкоцитарно-эритроцитарных (ЛЭА) и эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов (ЭТА) в норме и у больных сахарным диабетом

Установлено, что в периферической крови у здоровых наблюдаемых отмечались единичные агрегаты, их образуют приблизительно 1,5% всех белых кровяных телец, гендерных различий не выявлено. С возрастом отмечается тенденция к увеличению содержание ЛЭА, так в группе до 30 лет количество агрегатов зарегистрировано в пределах 0,10±0,05Ч109 в литре крови, а количество присоединенных эритроцитов к одному лейкоциту - 1,1±0,68, у наблюдаемых старше 30 лет - 0,18±0,1Ч109/л и 1,8±0,98 соответственно (р>0,05). Примечательно, что в месте контакта клеток со стороны эритроцита зоны лизиса не отмечалось. Процентное содержание нейтрофильно-эритроцитарных агрегатов от общего количества ЛЭА составило 97,5%, тогда как лимфоцитарно-эритроцитарных агрегатов - 2,5%. Полученные данные обусловлены не только большим процентом нейтрофилов, но и тем, что эти клетки более активно взаимодействуют с эритроцитами. ЭТА в крови у здоровых людей практически не найдены.

Отмечаются слабые прямые корреляционные связи между количеством лейкоцитов и ЛЭА (+0,25, р=0,001), между содержанием эритроцитов и ЛЭА (+0,12, р=0,03), а также между средним объёмом эритроцитов, средним объёмом тромбоцитов и количеством ЛЭА (+0,14, р=0,004).

Установлено, что с возрастом повышается агрегационная активность тромбоцитов. У здоровых людей старше 30 лет отмечалась тенденция к увеличению спонтанной агрегации тромбоцитов (у женщин (1,16±0,30 опт.ед.) и мужчин (1,27±0,7 опт.ед.)), по сравнению с практически здоровыми людьми младше 30 лет (у женщин (1,08±0,44 опт.ед.) и мужчин (1,23±0,21 опт.ед.)) (р>0,05). Коллаген индуцированная агрегация тромбоцитов у практически здоровых женщин (6,4±1,54 опт.ед.) и мужчин (5,1±1,9 опт.ед.) моложе 30 лет была меньше (р<0,05), чем у женщин (6,5±1,31 опт.ед.) и мужчин (6,8±2,89 опт.ед.) старше 30 лет. Ристомицин индуцированная агрегация у мужчин моложе 30 лет (5,7±2,11 опт.ед.) была меньше, чем у тех же лиц старше 30 лет (6,44±2,44 опт.ед.) (р<0,05). Выявлены прямые корреляционные связи средней силы между количеством ЛЭА и спонтанной агрегационной активностью тромбоцитов (+0,38, р=0,001), а также при добавлении индукторов адреналина (+0,54, р=0,003) и ристомицина (+0,63, р=0,05).

У практически здоровых людей с возрастом наблюдается тенденция к увеличению концентрации фибриногена (р>0,05) и увеличение содержания Д-димеров (р<0,05). По другим показателям коагулограммы изменений по полу и возрасту не найдено. Отмечены слабые прямые корреляционные связи между содержанием ЛЭА и концентрацией фибриногена (+0,27, р=0,02), Д-димеров (+0,17, р=0,0001), РФМК (+0,19, р=0,003) и обратные - с активностью протеина С (-0,32, р=0,004) и антитромбина III (-0,21, р=0,002).

Установлено, что уровень гомоцистеина у здоровых мужчин больше, чем у женщин (р<0,05). Отмечается слабая прямая корреляционная связь между концентрацией гомоцистеина и содержанием ЛЭА (+0,16, р=0,0025).

В общем анализе крови у больных СД 1 типа по отношению к здоровым и больным СД 2 типа отмечается снижение числа эритроцитов, гематокрита и уровня гемоглобина (р<0,05). У больных СД 1 типа в отличие от здоровых и больных СД 2 типа выявлялось увеличение среднего объёма тромбоцитов (р<0,05), что может быть расценено как компенсаторная реакция на повышенное потребление кровяных пластинок в результате их спонтанной гиперагрегации.

У больных СД 1 и 2 типов в сравнении с данными, полученными у здоровых людей, общее количество лейкоцитов было больше (р<0,05). Содержание ЛЭА у больных СД оказалось в 6,5 раз больше (р<0,05), чем у здоровых и одновременно увеличивалось число присоединенных к одному лейкоциту эритроцитов. Кроме того, при СД около 50% присоединенных к лейкоциту эритроцитов имели в месте контакта зону лизиса. Процентное содержание нейтрофильно-эритроцитарных агрегатов в крови больных СД 1 типа составляет 88,2%, лимфоцитарно-эритроцитарных - 8,1%, моноцитарно-эритроцитарных агрегатов - 2,7%.

Процентное содержание нейтрофильно-эритроцитарных агрегатов в крови больных СД 2 типа от общего количества ЛЭА равнялось 86,2%, лимфоцитарно-эритроцитарных -8,4%, моноцитарно-эритроцитарных - 3,9%, эозинофильно-эритроцитарных - 0,4%, базофильно-эритроцитарных - 0,1%.

По всей видимости, у пациентов СД независимо от типа происходит активация моноцитов, благодаря чему они взаимодействуют с эритроцитами, образуя агрегаты. Последнее нельзя объяснить общим увеличением числа моноцитов, ибо их количество существенно не отличается от содержания у здоровых людей. Также у больных СД резко возрастает число лимфоцитарно-эритроцитарных агрегатов (почти в 4 раза), что свидетельствует об активации лимфоцитов.

В то же время в крови пациентов СД обнаружены эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты, абсолютное количество которых у больных СД 2 типа имело тенденцию к увеличению, чем у пациентов СД 1 типа (р>0,05). Установлены прямые, слабые корреляционные связи между содержанием ЛЭА и ЭТА как у больных СД 1 типа (+0,29, р=0,006), так и СД 2 типа (+0,20, р=0,008).

Сравнительная характеристика агрегационной активности тромбоцитов у больных СД -1 и СД- 2 типа

В результате исследования установлено, что у больных сахарным диабетом имеется явная тенденция к усилению агрегационной активности тромбоцитов [Балуда М.В. и др., 1995; Боровков И.Н. и др., 2002; Северин А.С. и др., 2004; Кузник Б.И. и др., 2007,2010]. Вместе с тем, мы не нашли работ, в которых детально были изучены сравнительные агрегационные свойства кровяных пластинок при сахарном диабете 1 и 2 типов.

Агрегационная активность тромбоцитов крови у больных СД 1 и 2 типа (MSD)

Таблица 1

Виды агрегации	Средний радиус агрегатов
	Контроль (n=61)	СД 1 тип (n=29)	CД 2тип (n=62)
	Степень агрегаци и опт.ед.	Скорость агрегации ЕД./мин	Степень агрегации опт.ед.	Скорость агрегации ЕД./мин	Степень агрегации опт.ед.	Скорость агрегации ЕД./мин
Спонтанная агрегация	1,17±0,4	0,28±0,15	2,11±0,24* **	1,05±0,53*	1,68±0,46*	1,16±0,30*
индуцированная агрегация
АДФ	6,17±2,6	14,2±4,5	6,07±1,24	12,7±7,75	6,63±2,39	24,06±9,4**
адреналин	5,10±1,9	16,4±5,7	4,94±2,48*	11,7±5,31*	7,35±2,59**	8,04±3,75**
коллаген	5,72±1,9	14,6±5,57	4,57±2,31*	8,69±3,18	6,58±2,12**	15,1±81**
ристомицин	5,7±2,03	14,1±5,6	6,26±1,67	17,54±6,65	7,35±2,58*	16,07±6,07*

Примечание: (t-тест) * - статистическая значимость различий между здоровыми и больными (р<0,05); ** - статистическая значимость различий между больными СД-1 и СД-2, (р<0,05).

У больных СД 1 типа по сравнению с пациентами, страдающими СД 2 типа, спонтанная агрегация тромбоцитов была более выражена (р<0,05) (таблица 1). Вместе с тем, у больных СД 1 при использовании индукторов АДФ, адреналина, коллагена отмечаются явления вторичной гипоагрегации (р<0,05), что обусловлено очень высокой спонтанной агрегацией кровяных пластинок. При этом наиболее активные тромбоциты образуют конгломераты, благодаря чему в плазме остаётся меньше кровяных пластинок, способных реагировать на действие перечисленных индукторов. В то же время при определении среднего радиуса агрегатов у больных СД 1 типа агрегация тромбоцитов на ристомицин оказалась в норме. При СД 2 типа в нашем исследовании агрегация тромбоцитов на все исследуемые индукторы была усиленной.

У пациентов СД 1 типа выявлена прямая корреляционная связь средней силы между содержанием ЛЭА и степенью спонтанной агрегации (+0,64, р=0,04), а также агрегацией, индуцированной адреналином (+0,54, р=0,06), ристомицином (+0,63, р=0,008) и слабая прямая (+0,18, р=0,0025) при использовании АДФ. У больных СД 2 типа отмечаются прямые корреляционные взаимосвязи средней силы между числом ЛЭА и спонтанной (+0,36, р=0,006) и индуцированной ристомицином агрегацией (+0,37, р=0,03) и слабая прямая - при использовании АДФ (+0,21, р=0,08) и адреналина (+0,22, р=0,05). У пациентов СД 1 и 2 типа отмечены прямые корреляционные связи средней интенсивности между содержанием ЭТА и агрегацией кровяных пластинок, индуцированной ристомицином (+0,57, р=0,04).

У больных СД независимо от типа по сравнению со здоровыми концентрация РФМК увеличена в 2 раза (р<0,05) и Д-димеров в 3 раза (р<0,05), одновременно отмечена тенденция к снижению концентрации антитромбина ЙЙЙ и протеина С. У больных СД 1 типа установлены прямые корреляционные связи средней силы между содержанием ЛЭА и концентрацией фибриногена (+0,37, р=0,005), РФМК (+0,22, р=0,01) и Д-димеров (+0,43, р=0,01) и обратные слабые - с активностью АТ ЙЙЙ (-0,14, р=0,0034) и протеина С (-0,11, р=0,001). У больных СД 2 типа выявлены прямые корреляционные связи средней силы между содержанием ЛЭА и концентрацией фибриногена (+0,39, р=0,001), РФМК (+0,40, р=0,01) и Д-димеров (+0,59, р=0,003), и обратные слабые с активностью АТ ЙЙЙ (-0,22, р=0,06) и средней силы с активностью протеина С (-0,37, р=0,005). У больных СД 1 типа установлены прямые корреляционные связи средней силы между содержанием ЭТА и количеством фибриногена (+0,53, р=0,002), а также Д-димеров (+0,47, р=0,0033). При СД 2 типа между указанными тестами отмечаются прямые слабые корреляционные связи (+0,21, р=0,0002 и +0,19, р=0,001 соответственно).

Наши наблюдения показали, что у пациентов СД 1 (Ме:14,6[12,9;15,0]) и СД 2 типа (Ме:11,6[9,6;13,6]) с тяжелыми осложнениями содержание гомоцистеина выше (р<0,05) чем у больных СД 1 типа (Ме:6,4[5,7;7,8]) и СД 2 типа (Ме:6,9[6,55;8,95]) средней степени тяжести и у здоровых людей (Ме:9,68 [7,97;11,13]).

Установлено наличие прямой корреляционной связи средней силы между числом ЛЭА и содержанием гомоцистеина, как у больных СД 1 типа (+0,5, р=0,001), так и СД 2 типа (+0,7, р=0,003 ). Отмечено наличие слабых прямых корреляций между содержанием гомоцистеина и ЭТА при СД 1 типа (+0,23, р=0,003), а при СД 2 типа (+0,20, р=0,05)).

Определение агрегационной активности форменных элементов крови неинвазивным методом

Установлено, что с помощью предлагаемого неинвазивного метода исследования можно судить об абсолютном содержании лейкоцитарно-эритроцитарных и тромбоцитарно-эритроцитарных агрегатов, а также о спонтанной агрегации кровяных пластинок, определяемой по радиусу агрегатов. Об этом говорят довольно высокие коэффициенты корреляции и высокая значимость полученных результатов. В меньшей степени точности с помощью неинвазивного метода можно судить о числе тромбоцитов, АДФ- , адреналин- коллаген- и ристомицин-индуцированной агрегации (таблица 2).

лейкоцитарный эритроцитарный сахарный диабет

Таблица 2

Сравнительный анализ исследования агрегационной активности форменных элементов крови у больных СД 1 и 2 типа инвазивным и неинвазивным методами (Me; 25-й; 75-й процентили)

Параметры	СД 1 тип	R (p)	СД 2 тип	R (p)
ЛЭА, %	8,8 (5,6;13,0)	0,34(0,01)	8,76 (5,4;12,8)	0,36(0,01)
ЛЭА, абс./л	0,76 (0,42;0,80)	0,42(0,001)	0,73 (0,45;0,78)	0,4(0,0002)
ЭТА, абс./л	0,03 (0,02;0,04)	0,6(0,001)	0,04 (0,02;0,06)	0,66(0,001)
Тромбоциты Ч109/л	307,9 (266;348)	0,32(0,01)	285 (198;372)	0,3 (0,01)
Спонтанная агрегация тромбоцитов, опт.ед.	2,14 (1,26;2,32)	0,6(0,001)	1,66 (1,20;2,13)	0,5(0,0001)
АДФ-индуцированная агрегация, опт.ед.	6,30 (4,42;7,31)	0,44(0,001)	6,89 (5,67;8,08)	0,4 (0,001)
Коллаген-индуцирован ная агрегация, опт.ед.,	4,42 (3,66;6,32)	0,26(0,025)	6,30 (5,15;7,30)	0,3(0,005)
Адреналин-индуцирован ная агрегация, опт.ед.	4,72 (4,42;6,76)	0,26(0,005)	5,66 (4,77;6,93)	0,3 (0,005)
Ристомицин-индуциро ванная агрегация, опт.ед.	6,17 (6,04;7,09)	0,2(0,0001)	6,80 (4,75;8,36)	0,3 (0,003)

где R - коэффициент корреляции со значением SKF.

Таким образом, в крови здоровых людей содержание ЛЭА невелико, в крови у больных сахарным диабетом независимо от типа, число ЛЭА значительно возрастает, при этом увеличивается содержание лейкоцитов, присоединивших к себе 3-6 и более эритроцитов. Кроме того, при образовании ЛЭА нередко происходит экзоцитарный лизис эритроцитов, ведущий к отрыву клеточных мембран с образованием микровезикул, несущих отрицательно заряженные фосфолипиды, на которых развёртываются процессы образования фибриновых сгустков. В свою очередь высвобождение из разрушающихся эритроцитов АДФ и появление осколков клеточных мембран (микровезикуляция), обладающих свойствами парциального тромбопластина, замыкает порочный круг, способствующий агрегации тромбоцитов формированию фибриновых сгустков и, как следствие, ухудшение течения патологического процесса.

Тромбоциты, как важный связующий элемент сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, играют у больных СД ведущую роль в развитии сосудистых осложнений. Спонтанная агрегация тромбоцитов у больных СД 1 типа по сравнению с СД 2 типа выражена сильнее, что во многом связана с большим содержанием иммунных комплексов, являющихся активаторами кровяных пластинок [Бышевский А.Ш. 2003, Кузник Б.И. 2010]. В то же время, у больных СД-1 типа при действии индукторов в большинстве случаев выявляется вторичная гипоагрегация, тогда как при СД-2 типа - гиперагрегация.

При использовании неинвазивного метода исследования можно косвенно оценить состояние агрегационной активности форменных элементов.

Проведенные исследования позволили оценить некоторые особенности изменений агрегационной активности форменных элементов крови у здоровых людей и больных сахарным диабетом 1 и 2 типа, а также дали возможность раскрыть и уточнить значение микроциркуляторных расстройств в формировании сосудистых осложнений у больных СД 1 и 2 типа.

ВЫВОДЫ

1. У здоровых людей в крови содержание лейкоцитарно-эритроцитарных агрегатов (ЛЭА) с возрастом имеет тенденцию к увеличению, но не имеет гендерных различий. В норме преобладают нейтрофильно-эритроцитарные агрегаты. Эритроциты, присоединенные к лейкоцитам (в среднем 1,5±0,82), не имеют в месте контакта зону лизиса. Эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты (ЭТА) у здоровых людей практически не выявлены.

2. У больных СД 1 и 2 типов наблюдается увеличение числа лейкоцитов, способных образовывать агрегаты с эритроцитами, и эритроцитов с тромбоцитами (ЭТА). Чем тяжелее протекает заболевание, тем большее количество ЛЭА и ЭТА находится в крови у больных СД 1 и 2 типа. У больных СД независимо от типа значительно возрастает число лимфоцитов и моноцитов, образующих агрегаты с эритроцитами, а у пациентов СД-2 типа, кроме того, появляются эозинофильно- и базофильно-эритроцитарные агрегаты.

3. У здоровых и больных СД 1 и 2 типов отмечаются прямые корреляционные связи от слабых до средней силы между содержанием ЛЭА с количеством лейкоцитов, эритроцитов, средним объемом эритроцитов и тромбоцитов, агрегацией тромбоцитов, концентрацией фибриногена, РФМК, Д-димеров, гомоцистеина и обратные - с активностью протеина С и антитромбина ІІІ.

4. У здоровых с возрастом повышается агрегационная активность тромбоцитов. У больных СД 1 типа, по сравнению с СД 2 типа в большей степени выражена спонтанная агрегация тромбоцитов. В то же время у больных СД 1 при индукции АДФ, адреналином и коллагеном превалирует вторичная гипоагрегация кровяных пластинок, тогда как при СД 2 типа агрегация на эти лиганды усилена.

5. С помощью предлагаемого неинвазивного метода исследования можно ориентировочно судить о содержании лейкоцитарно-эритроцитарных и эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов, а также о спонтанной и индуцированной агрегации кровяных пластинок, как в норме, так и при патологии, в частности, при сахарном диабете.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные позволяют предложить дополнительные объективные лабораторные критерии риска развития осложнений диабета и прогнозировать исход осложнений, что даст возможность способствовать снижению уровня смертности от этой патологии.

2. С помощью предлагаемого неинвазивного метода исследования можно косвенно судить об абсолютном содержании лейкоцитарно-эритроцитарных и эритроцитарно-тромбоцитарных агрегатов, а также о спонтанной и индуцированной агрегации кровяных пластинок.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, определенных ВАК Минобрнауки России:

1. Агрегационная активность форменных элементов крови у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа / Б.И. Кузник, Ю.А. Витковский, М.Ю. Захарова, Н.Н. Ключарева, О.С. Роднина // Сахарный диабет - 2012.- № 2 - С. 49-53.

2. Неинвазивный метод изучения агрегационной активности тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов / Б.И. Кузник, Е.М. Кустовская, О.Г. Максимова, Е.М. Кустовская, Ю.В. Богданова, Н.Г. Жданович, О.С. Роднина // Клиническая лабораторная диагностика - 2013. - № 4 - С. 20-23.

3. Неинвазивные методы оценки агрегационной активности тромбоцитов, лейкоцитов, эритроцитов и состояния коагуляционного гемостаза / Б.И. Кузник, И.А. Файн, А.В. Каминский, О.Г. Максимова, Е.М. Кустовская, Е.Н. Мартынова, О.С. Роднина // Клиническая медицина - 2013. - № 8 - С. 57-60.

Работы, опубликованные в других изданиях:

4. Иммунитет, гемостаз и лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарные взаимодействия / Б.И. Кузник, Ю.А. Витковский, О.В. Гвоздева, О.С. Роднина // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), № 2-3. - С. 179.

5. Лейкоцитарно-эритроцитарные взаимоотношения при заболеваниях, сопровождающихся развитием гиперкоагуляции и ДВС-синдрома / О.С. Роднина [и др.] // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины : материалы Всерос. науч. -практ. конф., посвящ. 55-летию ЧГМА (Чита, 1-2 окт. 2008г.). - Чита, 2008. - С. 33-34.

6. Подвижность эритроцитов как показатель состояния системы гемостаза в опытах in vivo и in vitro / Б.И. Кузник, Е.М. Кустовская, О.Г. Максимова, О.С. Роднина // Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению: материалы Всерос. конф. (Москва, 4-6 февр. 2011г.). - М., 2011. - С. 56-57.

7. Эритроцитарно-лейкоцитарно-тромбоцитарные отношения при различных заболеваниях у взрослых и детей / О.С. Роднина [и др.] // Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии: материалы VІ Всерос. конф. (Москва, 31 янв.-2 февр. 2013г.). - М., 2013. - С. 345-346.

8. Лейкоцитарно-эритроцитарные взаимоотношения у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа / О.С. Роднина [и др.] // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины : материалы Всерос. науч. -практ. конф., посвящ. 60-летию ЧГМА (Чита, 17-18 окт. 2013г.). - Чита, 2013. - С. 129-133.

9. Уровень гомоцистеина у больных сахарным диабетом 1 и 2 типа в зависимости от наличия или отсутствия осложнений / О.С. Роднина [и др.] // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины : материалы Всерос. науч. - практ. конф., посвящ. 60-летию ЧГМА (Чита, 17-18 окт. 2013г.). - Чита, 2013. - С. 145.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДФ аденозиндифосфат

АИК аппарат искусственного кровообращения

АСК ацетилсалициловая кислота

АТФ аденозинтрифосфат

AТ-III антитромбин III

АП активатор плазминогена

АЧТВ активированное частичное тромбопластиновое время

ГЦ гомоцистеин

ГГЦ гипергомоцистеинемия

ДРС динамическое рассеяние света

ЕД единицы

ИАП ингибитор активатора плазминогена

ИБС ишемическая болезнь сердца

ИК иммунный комплекс

КПГ конечные продукты гликирования

ЛЭА лейкоцитарно-эритроцитарные агрегаты

МНО международное нормализованное отношение

ОИМ острый инфаркт миокарда

ОНМК острое нарушение мозгового кровообращения

ОС окклюзионная спектроскопия

ПВ протромбиновое время

ПДФ продукты деградации фибрина

ПОЛ перекисное окисление липидов

РФМК растворимые фибринмономерные комплексы

СД 1 сахарный диабет 1 типа

СД 2 сахарный диабет 2 типа

СОЭ скорость оседания эритроцитов

ТАП тканевой активатор плазминогена

ФАТ фактор активации тромбоцитов

ЭТА эритроцитарно-тромбоцитарные агрегаты

ICAM внутриклеточные молекулы адгезии

HbA1C гликозилированный гемоглобин

Hb гемоглобин

HLA лейкоцитарные антигены человека

Ht гематокрит или гематокритное число

ТхА2 тромбоксан А2

TF тканевой фактор

PAF фактор активации тромбоцитов

vWF фактор фон Виллебранда

Размещено на Allbest.ru

...