Генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с перифрическими витреохориоретинальными дистрофиями

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с перифрическими витреохориоретинальными дистрофиями

03.03.01 - физиология

14.03.03 - патологическая физиология

Серебренникова Светлана Викторовна

Чита- 2013

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, професор Витковский Юрий Антонович.

Официальные оппоненты:

Корытов Леонид Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России, заведующий кафедрой нормальной физиологии.

Харинцева Светлана Владимировна, доктор медицинских наук, заведующая кафедрой офтальмологии с курсом отоларингологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера» Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г. Красноярск.

Защита состоится «24» декабря 2013 года в .00 часов на заседании диссертационного совета при ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (адрес 6720090, г. Чита, ул. Горького, 39-а).

Автореферат разослан «___»_ноября_2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.118.01

доктор медицинских наук, профессор И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

периферический витреохориоретинальный дистрофия ген

Актуальность исследования. Периферические витреохориоретинальные дистрофии (ПВХРД) - это группа заболеваний, которая характеризуется различными дегенеративными изменениями сетчатки крайних отделов глазного дна и встречается у пациентов с различными видами рефракции. ПВХРД обнаруживаются в общей популяции в 5-13% случаев [Азнабаев М.Т. и соавт., 2005; Щуко А.Г. и соавт., 2008].

Наличие прогностически опасных видов ПВХРД является основной причиной развития отслойки сетчатки и, как следствие этого, - снижения зрения. По данным литературы, ПВХРД встречаются в 90-96% у больных с отслойкой сетчатки [Щербакова С.Ю., 2009; Mitry D., 2009; Orozco-Gоmez L.P., 2008]. Отслойка сетчатки остается в настоящее время значимой медико-социальной проблемой. Частота регматогенной отслойки сетчатки в общей популяции достигает 10-15 случаев на 100 тыс. населения, в 10% случаев она двухсторонняя [Буткевич В.И. и соавт., 2005, Щуко А.Г. и соавт., 2008; Meier P., 2008; Mitry D., 2009]. Большинство пациентов с данной патологией - люди трудоспособного возраста. Слепота, возникающая на фоне отслойки сетчатки, занимает 6-7 место среди всех возможных причин потери трудоспособности [Терехович М.В. и соавт., 2009]. Возникновение дистрофий возможно в любом возрасте, с одинаковой вероятностью у мужчин и женщин [Батманов Ю.Е. и соавт., 2007, 2008; Зимина М.Г., 2009; Кудинова-Савченко Н.А. и соавт., 2009; Мироненко Л.В. и соавт., 2010].

Учитывая тот факт, что в ранней фазе ПВХРД протекает почти бессимптомно, выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями сетчатки. Сложившаяся ситуация ставит вопрос о необходимости поиска молекулярно-генетических предикторов ранней диагностики периферических витреохориоретинальных дистрофий. В настоящее время есть все основания относить ПВХРД к группе мультифакторных заболеваний, развивающихся на фоне нарушения сосудистой регуляции сетчатки. В то же время, вероятно, первичные генетические эффекты определяют особенности продукции молекул сосудистой регуляции и рецепторов к ним. К сожалению, в наши дни молекулярно-генетические исследования не коснулись проблемы ПВХРД. Эти обстоятельства объясняют актуальность исследования полиморфизмов генов сосудистой регуляции при ПВХРД.

Цель исследования - изучить генетический полиморфизм молекул сосудистой регуляции у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиями и оценить их клинико-прогностическое значение для развития заболевания в этническом аспекте.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Выявить и оценить частоту встречаемости аномальных аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) и их сочетаний среди больных с ПВХРД и относительно здоровых резидентов в русской и бурятской этнических группах.

2. Установить степень риска формирования ПВХРД у носителей аномальных аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) среди резидентов Забайкальского края.

3. Сравнить содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста в слезной жидкости и плазме крови у пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей с учетом генотипов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) и их комбинаций.

4. Оценить роль полиморфизма генов молекул сосудистой регуляции в развитии осложнений ПВХРД.

Научная новизна исследования. Впервые обнаружено, что аллельные варианты eNOS (C786T), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lys198Asn) предрасполагают к развитию ПВХРД, влияют на развитие осложнений заболевания в русской и бурятской этнических группах. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности.

Впервые установлено, что уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских, тогда как в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности их уровень ниже по сравнению с контрольной группой. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. По мере развития осложнений ПВХРД в виде разрывов и отслойки сетчатки уровень эндотелина-1 повышается, а метаболитов оксида азота снижается.

Впервые выявлено, что различные аллельные варианты и генотипы влияют на уровень молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lys198Asn) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных c ПВХРД не зависимо от национальности. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (C786T) у бурят в гомо- и гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. Носительство аллели G полиморфизма гена VEGFA (C634G) в гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и больных ПВХРД не зависимо от национальности. У больных - носителей генотипа С/С и С/G падает содержание VEGF в плазме крови.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые данные о патогенезе ПВХРД, демонстрирующие роль генов молекул сосудистой регуляции eNOS (C786T), EDN1 (Lys198Asn), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) в механизмах развития заболевания. Носительство патологических аллелей оказывает влияние на продукцию молекул сосудистой регуляции и развитие осложнений ПВХРД среди представителей русской и бурятской этнических групп Забайкальского края.

Выявленные факты позволяют оценить риск развития ПВХРД в этническом аспекте и разработать новые методы прогнозирования и ранней диагностики заболевания среди резидентов русской и бурятской национальностей. Полученные сведения о наличии полиморфизмов eNOS (C786T), EDN1 (Lys198Asn), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и использоваться для оценки риска развития ПВХРД.

Внедрение результатов работы. Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс на кафедрах нормальной физиологии и офтальмологии ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия».

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию Читинской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» 16 октября 2013 года.

Положения, выносимые на защиту:

1. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T) и EDN1(Lys198Asn) русской национальности и EDN1(Lys198Asn), VEGFA(C634G), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск развития ПВХРД. У пациентов с ПВХРД независимо от национальности встречаемость генотипа Asn/Asn гена EDN1 (Lys198Asn) выше при наличии осложнений. У бурят с отслойками сетчатки отсутствуют нормальные генотипы генов EDN1(Lys198Asn), VEGFA(C634G) и AGT (Met235Thr). Распределение полиморфизмов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) у резидентов Забайкальского края имеет этнические особенности.

2. В слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 увеличивался, а метаболитов оксида азота и сосудистого эндотелиального фактора роста снижался по сравнению с контрольной группой. Концентрация молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости зависит от клинических проявлений ПВХРД.

3. Содержание эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости у пациентов с ПВХРД зависит от полиморфизма генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) и VEGFA (C634G) и их сочетаний, присутствует этнический компонент. Влияние полиморфизмов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) и VEGFA (C634G) на развитие данной патологии носит этнический характер.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 32 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования и клинической характеристики больных, шести глав собственных результатов исследования, главы обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, состоящего из отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000 ред.).

Клиническая характеристика группы больных с ПВХРД. Методом сплошной выборки обследовано 213 пациентов с ПВХРД, проживающих на территории Забайкальского края. Средний возраст пациентов составил 34±6 лет. С целью изучения этнического компонента все больные были разделены на 2 группы:

- Первая группа - 131 пациент с ПВХРД (38 мужчин и 93 женщины) русской национальности;

- Вторая группа - 82 пациента с ПВХРД (17 мужчин и 65 женщин) бурятской национальности.

Данные об этнической принадлежности выясняли путем опроса, включая указания на национальную принадлежность предков до третьего поколения.

Критерии исключения из исследования: пациенты с наличием сопутствующих заболеваний, таких как гипертоническая болезнь, сахарный диабет, онкологические заболевания, а также больные с наличием глазной патологии (глаукома, возрастная макулярная дегенерация, катаракта, конъюнктивиты, кератиты, увеиты, вторичные отслойки сетчатки, дегенеративный ретиношизис). Исключены из исследования пациенты, пользующиеся контактными линзами, беременные, спортсмены, лица, перенесшие оперативные вмешательства в течение последних трех месяцев, в том числе лазерные и хирургические операции на глазах.

Контрольную группу составили 196 человек, проживающие на территории Забайкальского края, сходные по половым и возрастным характеристикам, не имеющие на момент исследования ПВХРД и соматической патологии.

Всем испытуемым проводилось офтальмологическое обследование, включающее определение остроты зрения (без коррекции, с коррекцией), биомикроскопию переднего отрезка глаза, биомикроофтальмоскопию (в условиях мидриаза) с помощью контактной трехзеркальной линзы Гольдмана, измерение внутриглазного давления - по показаниям.

Молекулярно-генетическое исследование для выявления полиморфизмов генов eNOS (C786T), EDN1 (Lys198Asn), AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G). Забор крови осуществляли утром натощак из кубитальной вены в вакутейнер с 3,8% цитратом в объеме 5,0 мл. Выделение ДНК осуществляли при помощи набора реагентов для биологических проб (НПФ «Литех», Россия, Москва). Выявление мутаций проводилось методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами (НПФ «Литех» - «SNP-экспресс», Россия, Москва). Детекция продуктов амплификации осуществляли электрофоретическим способом.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для определения содержания эндотелина-1, VEGF и метаболитов оксида азота использовалась слезная жидкость и плазма крови 213 пациентов с ПВХРД и 196 здоровых лиц. В группе пациентов с ПВХРД забор слезы производился на больном и парном глазу. Нестимулированную слезную жидкость собирали из нижнего конъюнктивального мешка с помощью стерильной одноразовой пластиковой насадки в объеме 20 мкл в стерильные пробирки типа «Эппендорф» и хранили при температуре -200С. Во время проведения исследования она разводилась в 10 раз буфером для цитокинов Cytokine Assay Buffer (Upstate-Millipore, Watford, UK). Концентрацию ЭТ-1 и VEGF определяли методом иммуноферментного анализа с применением тест-систем (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск; «Biomedica gruppe», Австрия). Уровень оксида азота изучали по конечным продуктам его метаболизма - нитроксида-нитрита (NO2) с использованием раствора Грисса.

Статистическая обработка результатов. Обработка результатов выполнена методами непараметрической и вариационной статистики с применением программы Statistiсa 6.0 (StatSoft Inc., США) и электронных таблиц Microsoft Excel, версия XP. При сравнении изучаемых клинических и лабораторных показателей использовались непараметрические методы в связи с ненормальным распределением значений в вариационных рядах. При сравнении групп использовался критерий Манна-Уитни. Различия между сравниваемыми вариационными рядами считали значимыми при p<0,05. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартального (25-й и 75-й персентили) интервала - указывали в скобках. Статистически значимые различия между группами по количественным признакам оценивались при помощи критерия Манна - Уитни (U-тест). Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий 2 (точный критерий Фишера). Для определения частот аллельных вариантов генов использовался закон Харди-Вайнберга. Вычислялась относительная вероятность события (ОР).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В основу нашего исследования мы положили гипотезу о ведущем значении нарушений региональной гемодинамики в патогенезе ПВХРД.

Как известно, в развитии ПВХРД и отслойки сетчатки важную патогенетическую роль играет нарушение кровообращения глаза [Поздеева О.Г., 2012; Саксонова Е.О., 2000]. Причины, приводящие к таким изменениям - различные. Однако, факторами, обуславливающими индивидуальное реагирование механизмов регуляции сосудистого тонуса в норме и патологии, являются генетические.

В первом блоке наблюдений мы изучили частоты аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr) среди пациентов с ПВХРД и здоровых лиц Забайкальского края с учетом этнических особенностей распределения. Мы исходили их того, что полиморфизмы генов при различных заболеваниях имеют разные уровни распространенности в регионах мира. Возможные положительные ассоциативные связи между полиморфизмами и заболеваниями сетчатки, установленные внутри одной популяции, необязательно будут таковыми в других популяциях.

Установлено, что у пациентов с ПВХРД бурятской национальности превалирует нормальная аллель С, а у русских - аномальная аллель Т полиморфизма гена еNOS (C786T) (табл. 1).

Таблица 1

Распределение генотипов и частоты аллельных вариантов гена еNOS (C786T) среди резидентов русской и бурятской национальностей

Показатель	Русские	Буряты
	Группа контроля	Пациенты с ПВХРД	Группа контроля	Пациенты с ПВХРД
Генотипы
С/C	41 (36,6%)	23 (17,5%) р=0,016	5 (5,9%) р1 =0,001	24 (29,3%) р = 0,002
C/T	46 (41,1%)	50 (38,2%)	26 (31,0%)	41 (50,,%)
T/T	25 (22,3%)	58 (44,5%) р=0,016	53 (63,1%) р1=0,001	17 (20,7%) p =0,001 р1=0,019
Всего	112	131	84	82
Аллели
С	128 (57,1%)	96 (36,6%) р=0,008	36 (21,4%) р1=0,001	89 (54,3%) p =0,001 р1=0,033
Т	96 (42,9%)	166 (63,4%) р=0,016	132 (78,6%) р1 =0,001	75 (45,7%) p=0,004
Всего	224	262	168	164

Примечание: р - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; р1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (2-тест).

Резиденты бурятской национальности - обладатели «дикого» варианта гена eNOS (С-аллель) в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД, тогда как присутствие аномальной Т-аллели носит протективный характер. Встречаемость заболевания у носителей Т-аллели значительно меньше. Учитывая высокую частоту аномальной аллели (Т) в контрольной группе у резидентов бурятской национальности (78,6%), можно предположить, что ген eNOS имеет прямое отношение к патогенезу ПВХРД.

Обнаружено, что среди пациентов русской национальности, имеющих ПВХРД, 82,5%, а среди бурят - 92,7% носителей аномальной аллели гена EDN1Lys198Asn. Этнических различий встречаемости генотипов и аллельных вариантов гена EDN1Lys198Asn между резидентами русской и бурятской национальностей выявлено не было.

Среди бурят с ПВХРД аномальный генотип G/G гена VEGFA (C634G) встречался в 2,5 раза чаще по сравнению с контрольной группой. Таким образом, буряты с ПВХРД - обладатели аномальной аллели G и патологического генотипа G/G в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД. Этнических различий встречаемости генотипов и аллельных вариантов гена VEGFA (C634G) среди резидентов русской и бурятской национальности выявлено не было.

Выявлено, что 91,4% пациентов с ПВХРД бурятской национальности являлись носителями аномального варианта гена AGT Met235Thr. У всех бурят с отслойками сетчатки встречалась Thr-аллель, из них в 50% случаев в гомозиготном состоянии. В бурятской этнической группе у больных с разрывами сетчатки мутантная аллель Thr встречалась чаще, чем у русских с таким же типом ПВХРД. Выявлены этнические различия: у бурят с ПВХРД аномальная аллель Thr встречалась чаще, а нормальная аллель Met реже, чем у русских.

Мы не обнаружили изменений концентрации эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц. Однако мы выявили изменение уровня молекул сосудистой регуляции в слезной жидкости.

Обнаружено, что у русских в группе пациентов с ПВХРД содержание эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза выше по сравнению с контрольной группой. Такая же закономерность прослеживалась у пациентов бурятской национальности: содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у больных в 1,7 раза выше по сравнению со здоровыми (табл. 2).

Таблица 2

Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей; Me (25-й; 75-й персентили)

Русские	Буряты
Контрольная группа n=112	Глаза с ПВХРД n=196	Парные глаза n=66	Контрольная группа n=84	Глаза с ПВХРД n=117	Парные глаза n=47
0,87 (0,46; 1,36)	2,04 (1,22; 2,52) р=0,001	1,56 (0,87; 2,21)	0,84 (0,53; 1,13)	1,44 (1,14; 2,02) р=0,001 р1=0,001	1,02 (0,91; 1,44)

Примечание: n - количество глаз; p - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).

У пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости оказался в 4 и 4,8 раза ниже по сравнению с контрольными группами. У бурят с ПВХРД уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше по сравнению с русскими (табл. 3).

Таблица 3

Уровень метаболитов NO (мкг/мл) в слезной жидкости больных с ПВХРД русской и бурятской национальностей; Me (25-й; 75-й персентили)

Русские	Буряты
Контрольная группа n= 112	Глаза с ПВХРД n=196	Парные глаза n=66	Контрольная группа n=84	Глаза с ПВХРД n=117	Парные глаза n=47
4,35 (3,50; 5,29)	0,92 (0,46; 1,41) р=0,001	1,25 (0,84; 2,41) р=0,001	4,30 (3,91; 5,08)	1,07 (0,61; 3,89) р=0,001 р1 =0,049	1,75 (0,77; 2,49) р=0,001

Примечание: n - количество глаз; p - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).

Выявлено, что концентрация метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских.

В обеих этнических группах прослеживается увеличение содержания эндотелина-1 и уменьшение концентрации метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД по сравнению со здоровыми лицами. Причем максимальный уровень эндотелина-1 и минимальный уровень метаболитов NO был обнаружен в слезной жидкости пациентов с отслойками сетчатки.

Проанализировав изменения уровня эндотелина-1, метаболитов оксида азота в слезной жидкости, мы предложили коэффициент риска развития осложнений ПВХРД (К), равный соотношению содержания эндотелина-1 и метаболитов оксида азота. Предварительно все данные были переведены в единую систему (фмоль/мл) (табл. 4).

Таблица 4

Уровень эндотелина-1, метаболитов NO в слезной жидкости пациентов русской национальности с различным течением ПВХРД; Me (25-й; 75-й персентили)

	Контрольная группа n=112	Неосложнен ные ПВХРД n=99	ПВХРД, осложненные разрывами сетчатки n=83	ПВХРД, осложненные отслойкой сетчатки n=14
ЭТ-1 (фмоль/мл)	0,87 (0,46; 1,36)	1,65 (0,71; 2,02)	1,96 (1,55; 2,33) p=0,035	2,35 (1,18; 3,53) р=0,001 p1=0,049
NOx (мкг/мл)	4,35 (3,50; 5,29)	1,07 (0,80; 1,60) р=0,001	0,92 (0,46; 1,53) р=0,001	0,53 (0,34; 0,92) р=0,001 р1=0,022
NOx (фмоль/мл)	94565,2 (76086,9; 115000,0)	23260,9 (17391; 34782,6)	20000,0 (10000,0; 33260,9)	11521,7 (7391,3; 20000,0)
К=ЭТ-1/NOx x 10-6	9,20 (6,05; 11,84)	70,93 (40,83; 58,08)	98,0 (70,05; 155,0)	203,96 (159,65; 176,5)

Примечание: n-количество глаз, p - уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем; p1- уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с неосложненным течением ПВХРД (Критерий Манна-Уитни).

Предложенный нами коэффициент отражает преобладание вазоконстрикторного или вазодилатирующего эффекта. У пациентов бурятской национальности мы получили аналогичные результаты. Среди пациентов с отслойками сетчатки обеих этнических групп этот коэффициент оказался максимальным и превышал норму на два порядка. В связи с этим, предложенный коэффициент может применяться в качестве предиктора осложнений ПВХРД.

Обнаружено, что в слезной жидкости здоровых лиц русской и бурятской национальностей увеличивался уровень VEGF по сравнению с больными. Также установлено, что у пациентов обеих национальностей заметно повышается содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД, что является свидетельством развития репаративных процессов (рис. 1).



* - уровень статистически значимых различий по сравнению с контролем;

** - уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с неосложненным течением ПВХРД;

***- уровень статистически значимых различий по сравнению с группой пациентов с ПВХРД, осложненных разрывами;

¦ - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими.

Рис. 1. Уровень VEGF в слезной жидкости у пациентов русской и бурятской национальностей с неосложненным и осложненным течением ПВХРД

Мы изучили зависимость концентрации вазоактивных веществ от генотипов, а также изменение содержания эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr).

На концентрацию эндотелина-1 в слезной жидкости оказывал влияние генотип EDN1 (Lys198Asn). Установлено, что в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальностей уровень эндотелина-1 среди носителей генотипов Asn/Asn и Lys/Asn выше по сравнению с гомозиготами по нормальной аллели Lys. У пациентов с ПВХРД обеих национальностей среди носителей генотипа Lys/Asn и Asn/Asn содержание эндотелина-1 в слезной жидкости было выше по сравнению со здоровыми резидентами, обладателями аналогичных генотипов в контрольных группах (табл. 5).

Таблица 5

Уровень эндотелина-1 (фмоль/мл) в слезной жидкости пациентов с ПВХРД и здоровых лиц русской и бурятской национальностей в зависимости от генотипов гена EDN1 (Lys198Asn); Ме (25-й; 75-й персентили)

	Генотип
	Lys/Lys	Lys/Asn	Asn/Asn
Русские	Контрольная группа n=112	1,39 (1,10; 1,95)	0,88 (0,53; 1,51)	0,87 (0,79; 3,23)
	Пациенты с ПВХРД n=196	1,12 (0,89; 1,17)	2,1 (1,99; 2,10) p=0,008 p1 =0,001	2,7 (2,19; 3,16) р1=0,001
Буряты	Контрольная группа n=84	0,92 (0,80; 1,04)	0,61 (0,44; 1,76)	1,35 (0,91; 1,73) р2=0,001
	Пациенты с ПВХРД n=117	0,65 (0,45; 0,94)	2,0 (1,44; 2,08) p =0,001 p1 =0,001	2,13 (1,76; 2,35) p =0,001 p1 =0,008 р2=0,001

Примечание: n - количество глаз; p - уровень статистически значимых различий по сравнению с контрольной группой; p1 - уровень статистически значимых различий с генотипом Lys/Lys; p2 - уровень статистически значимых различий по сравнению с русскими (Критерий Манна-Уитни).

Таким образом, наличие патологического аллельного триплета Asn полиморфизма EDN1 (Lys198Asn) обуславливают высокое содержание эндотелина-1 в слезной жидкости у гетерозигот Lys/Asn и гомозигот Asn/Asn.

Продукция оксида азота и содержание в слезной жидкости его метаболитов зависит от полиморфизма фермента eNOS (С786Т). Среди обладателей генотипа Т/Т русской национальности, у которых обнаружены периферические дистрофии сетчатки, уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости ниже, чем у генотипа С/С. И наоборот, у представителей бурятской национальности с ПВХРД содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости выше у гомозигот по аномальной аллели Т, чем у носителей С/С генотипа.

Снижение уровня метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД, возможно, связано с изменением активности эндотелиальной NO-синтазы - продукта полиморфного гена.

У пациентов с ПВХРД бурятской национальности концентрация VEGF в плазме крови и слезной жидкости у носителей генотипа G/G полиморфизма VEGFA (C634G) существенно выше, чем у гомозигот С/С.

В русской этнической группе обнаружено повышение уровня VEGF в плазме крови у носителей генотипа G/G по сравнению с гомозиготами по нормальной С-аллели.

Различия в генах, регулирующих сосудистый тонус, могут сказываться на уровне продукции кодируемых белков и, тем самым, на соотношении вазоконстрикторов и вазодилататоров. В связи с этим полиморфизм генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) представляет значительный интерес, т.к. именно эти белки вносят наибольший вклад в регуляцию сосудистого тонуса.

Мы оценили распространенность сочетания отдельных полиморфизмов генов сосудистой регуляции в норме и при ПВХРД. Под сочетанием полиморфных вариантов генов мы принимаем комбинацию гомозигот по аномальной аллели двух и более генов.

В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена eNOS-786 (C/C) и VEGFA-634 (G/G) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости выше, а метаболитов оксида азота - ниже. Подобные результаты получены при сочетании генотипов eNOS-786 (C/C) и EDN1-198 (Asn/Asn). А концентрация VEGF в слезной жидкости резко снижена при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (T/T) и VEGFA-634 (G/G).

При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости пациентов с ПВХРД бурятской национальности оказался выше, а метаболитов оксида азота - заметно ниже (табл. 6).

Таблица 6

Уровень эндотелина-1, метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости бурят с ПВХРД при сочетании полиморфных вариантов генов EDN1(Lys198Asn), AGT(Met235Thr) и VEGF (C634G)

	VEGFA-634 (C/C) + EDN1-198 (Lys/Lys)	VEGFA-634 (G/G) + EDN1-198 (Asn/Asn)	VEGFA-634 (C/C) + AGT-235 (Met/Met)	VEGFA-634 (G/G) + AGT-235 (Thr/Thr)
ЭТ-1 (фмоль/мл)	1,1 (0,8; 1,2)	1,6 (1,2; 1,6) p=0,023	0,8 (0,6; 1,1)	1,7 (1,2; 2,2) p=0,010
NO (мкг/мл)	1,75 (1,56; 1,95)	0,76 (0,69; 0,85) p=0,031	1,59 (0,97; 2,76)	0,79 (0,54; 1,01) p=0,047
VEGF (нг/мл)	22,0 (17,3; 60,5)	22,1 (19,9; 23,5)	25,2 (14,9; 26,8)	16,9 (11,2; 25,3) p=0,05

Примечание: р - уровень статистически значимых различий по сравнению с сочетанием генотипов по нормальным аллелям (Критерий Манна-Уитни).

Очевидно, уникальный ансамбль аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G), AGT (Met235Thr) может отчасти определять характер индивидуального реагирования в механизмах развития ПВХРД. В связи с этим нами был изучен уровень эндотелина-1 и метаболитов оксида азота и VEGF в слезной жидкости и плазме крови у здоровых лиц и пациентов с ПВХРД с учетом аллельных вариантов генов EDN1 (Lys198Asn), eNOS (C786T), VEGFA (C634G) и AGT (Met235Thr).

Полученные результаты подтвердили, что ПВХРД является полигенным заболеванием. В результате мутаций структура гена или промотора участка может менять скорость транскрипции, стабильность мРНК или качество и активность продуцируемого белка. Это, в конечном итоге, сказывается на активности регуляторных молекул.

Решающее значение в регуляции сосудистого тонуса придается эндотелиальным факторам. Одно из направлений функционирования эндотелия - его участие в формировании адекватного кровотока, что обеспечивается согласованием агрегатного состояния крови и тонуса сосудов. Сочетание на эндотелии вазоконстрикторов и вазодилататоров в физиологических условиях является основой для адекватного кровотока, особенно в сосудах микроциркуляции [Кузник Б.И., 2012; Лупинская З.А., 2003]. Эндотелиальный слой регулирует местный сосудистый тонус и участвует в формировании системных гемодинамических реакций, являясь конечным звеном нейрогенной и гуморальной регуляции сосудистого тонуса, где эта реакция реализуется и моделирует различные внутриклеточные процессы.

Таким образом, получены новые сведения о роли полиморфизма генов молекул регуляции сосудистого тонуса в механизмах развития периферических витреохориоретинальных дистрофий и их осложнений. Концептуальная схема патогенеза ПВХРД представлена на рис. 2.



Рис. 2 Концептуальная схема включения отдельных звеньев патогенеза в развитие осложнений ПВХРД

Мы считаем, что исследование генов молекул сосудистой регуляции может оказаться востребованным для прогнозирования развития ПВХРД и его осложнений. Полученные сведения о наличии полиморфизма генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr), EDN1 (Lys198Asn) и VEGFA (C634G) могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития ПВХРД.

ВЫВОДЫ

1. Встречаемость полиморфизмов генов сосудистой регуляции у пациентов с ПВХРД зависит от этнической принадлежности. У лиц бурятской национальности с ПВХРД превалирует аллель С, а у русских - аллель Т полиморфизма гена еNOS (C786T). Среди здоровых лиц бурятской национальности чаще встречается генотип С/С, а с ПВХРД - G/G полиморфизма VEGFA (C634G). Наличие аллели G полиморфизма VEGFA (C634G) располагает их к развитию ПВХРД. Генотип Met/Met полиморфизма гена AGT Met235Thr среди русских с ПВХРД встречается в 4 раза чаще, чем среди бурят. В бурятской этнической группе обладатели аномальной аллели полиморфизма гена AGT Met235Thr в большей степени предрасположены к развитию ПВХРД. Носители неблагоприятных аллельных вариантов генов eNOS (C786T), AGT (Met235Thr) бурятской национальности имеют более высокий риск формирования ПВХРД по сравнению с таковыми русской национальности.

2. Уровень эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД обеих этнических групп увеличен по сравнению со здоровыми лицами. Среди пациентов с ПВХРД русской национальности содержание эндотелина-1 в слезной жидкости в 2,3 раза, а бурятской - в 1,7 раза выше, чем у здоровых. Содержание метаболитов оксида азота в плазме крови пациентов с ПВХРД и здоровых лиц бурятской национальности выше по сравнению с аналогичными группами у русских. Уровень метаболитов оксида азота в слезной жидкости пациентов с ПВХРД русской и бурятской национальности ниже по сравнению с контрольной группой. Уровень VEGF в слезной жидкости у больных ПВХРД русской и бурятской национальностей ниже, чем у здоровых лиц.

3. У пациентов обеих национальностей заметно увеличивалось содержание VEGF в слезной жидкости при развитии осложнений ПВХРД. У русских содержание VEGF в слезной жидкости контрольной группы и пациентов с ПВХРД, осложненными ретинальными разрывами, ниже в два раза по сравнению с резидентами бурятской национальности.

4. Коэффициент К, отражающий соотношение концентрации эндотелина-1 и метаболитов оксида азота существенно повышался по мере развития осложнений ПВХРД. У пациентов с ретинальными разрывами, предложенный коэффициент К увеличивался в 10 раз, а с отслойками сетчатки - в 23 раза по сравнению с неосложненным течением заболевания.

5. Наличие аллели Asn полиморфизма гена EDN1 (Lys198Asn) обуславливает повышенное содержание эндотелина-1 в слезной жидкости больных с ПВХРД не зависимо от национальности. У обладателей генотипа Asn/Asn выявлялся наиболее высокий уровень, генотипа Lys/Asn - средний и генотипа Lys/Lys - низкий уровень эндотелина-1 в слезной жидкости. Концентрация эндотелина-1 у пациентов ПВХРД больше относительно здоровых лиц.

6. У пациентов с ПВХРД бурятской национальности - носителей Т/Т-генотипа полиморфизма гена eNOS (C786T) уровень метаболитов оксида азота в плазме крови выше по сравнению с С/С генотипом. Носительство аллели С у русских и аллели Т гена eNOS (C786T) у бурят в гомо- и гетерозиготоном состоянии определяет более высокое содержание метаболитов оксида азота в слезной жидкости здоровых и больных ПВХРД. При ПВХРД содержание метаболитов NO в слезной жидкости у бурят, которые являются носителями аномальной аллели Т в гомозиготном и гетерозиготном состоянии, в 6 раз выше по сравнению с пациентами русской национальности.

7. Носительство аллели G полиморфизма гена VEGFA (C634G) в гомо- и гетерозиготном состоянии способствует более высокой продукции ростового фактора у здоровых и пациентов с ПВХРД не зависимо от национальности. У больных-носителей генотипа С/С и С/G падает содержание VEGF в плазме крови. У пациентов с ПВХРД русской этнической группы, обладателей генотипа G/G, концентрация VEGF в слезной жидкости в 5,5 раз выше по сравнению с аналогичной группой бурятской национальности.

8. В плазме крови пациентов бурятской национальности уровень VEGF увеличивался при сочетании аномальных генотипов генов EDN1 (Lys198Asn) и VEGF (C634G). При сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена VEGFA-634 (G/G) и EDN1-198 (Asn/Asn), генотипов VEGFA-634 (G/G) и AGT-235 (Thr/Thr) уровень эндотелина-1 в слезной жидкости наиболее сильно повышался, а метаболитов оксида азота - снижался. В русской этнической группе при сочетании гомозиготных генотипов по аномальной аллели гена eNOS-786 (C/C) и VEGFA-634 (G/G), eNOS-786 (C/C) и EDN1-198 (Asn/Asn) концентрация эндотелина-1 в слезной жидкости росла, а метаболитов оксида азота - падала. Содержание VEGF в слезной жидкости резко снижено при сочетании аномальных генотипов eNOS-786 (T/T) и VEGFA-634 (G/G).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России:

1. Серебренникова С.В. Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы (C786T) у больных с периферическими витреохориоретинальными дистрофиями в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / С.В. Серебренникова, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. - 2012. - №1. - С. 17-21. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 01.12.2012).

2. Серебренникова С.В. Содержание эндотелина-1 в плазме крови и слезной жидкости у больных с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае [Электронный ресурс] / С.В. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А. Витковский // Забайкальский медицинский вестник. - 2012. - №2. - С. 17-19. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 15.03.2013).

3. Серебренникова С.В. Полиморфизм гена эндотелина-1 (Lys198Asn) у больных с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае / С.В. Серебренникова, Л.А. Голубина, Ю.А. Витковский // Дальневосточный медицинский журнал. - 2012. - №4. - С. 76-78.

4. Серебренникова С.В. Генетический полиморфизм эндотелина-1 (Lys198Asn) у пациентов с периферической витреохориоретинальной дистрофией в Забайкальском крае / С.В. Серебренникова, А.А. Петров, Ю.А. Витковский // Молекулярная медицина. - 2013. - №2. - С. 54-56.

Работы, опубликованные в других изданиях:

5. Serebrennikova S.V. The levels of endothelin-1 in the plasma of patients with peripheral vitreoretinal degeneration / S.V. Serebrennikova, Yu.A. Vitkovsky // Trombosis research: Abstracts and proceedings of the 22nd Internashional Congress on Thrombosis. Nice, France, 6 - 9 October, 2012. - Vol.130. - P. 140.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ген AGT - ген ангиотензиногена

Ген EDN1 - ген эндотелина-1

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПВХРД - периферические витреохориоретинальные дистрофии

ЭТ-1 - эндотелин-1

NO - оксид азота

NOx - суммарное количество метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов)

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

HIF-1 - фактор, индуцируемый гипоксией

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста

Размещено на Allbest.ru

...