Роль полиморфизма генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С592А, G1082A, C819T) и ФНО (G308A) в патогенезе коклюша у детей

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы. В структуре заболеваемости детей управляемыми инфекциями коклюш всегда занимал одно из ведущих мест (Озерецковский Н.А. и др., 2004, Панасенко Л.М и др., 2005). В странах Европы, Канаде, США, Австралии, как и в России, несмотря на высокий охват детей прививками, регистрируется подъем заболеваемости коклюшем (Шинкарев А.С. и др., 2007). Среди заболевших формируются очаги с большим количеством случаев, увеличивается число тяжелых и среднетяжелых форм заболеваний; растет заболеваемость взрослого населения (Озерецковский Н.А. и др., 2004; Тимченко В.Н. и др., 2005; Новости ВОЗ, 2008). Наибольшую опасность коклюш представляет на 1-м году жизни, когда заболевание наиболее часто протекает с осложнениями. В первую очередь, это присоединение вторичной бактериальной флоры с развитием пневмоний. В этом возрасте проявляется высокий риск развития резидуальных энцефалопатий (Петрова С., Крючкова Г.С., Келли Е.И., 2003; Харит С.М. и др., 2007; Mahon B.P., 1997). Относительно высокая смертность, пик летальности приходится на возраст 3-6 месяцев (Озерецковский Н.А. и др., 2004). Летальность от коклюша в развитых странах составляет 0,04%, в развивающихся - 1-2% (Тимченко В.Н., 2005).

В основе патогенеза коклюша, как и любого инфекционного заболевания, лежит не только действие бактерии и продуцируемых токсинов, но и особенности макроорганизма. В первую очередь это относится к иммунному ответу, в котором после взаимодействия токсических, ферментных факторов патогенности инфекционных возбудителей с иммуннокомпетентными клетками продуцируется ряд цитокинов, обеспечивающих их кооперацию и формирование реакций адаптации и дезадаптации (Игнатов П.Е., 2002, Gasser O. et al, 2004). Функция медиаторов иммунного ответа во многом зависит от аллельных вариантов генов цитокинов и рецепторов к ним (Симбирцев А.С., 2005, 2006, Bidwell J. et al., 1999). Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество полиморфных участков в одном гене может достигать нескольких десятков и располагаться они могут как в кодирующих экзонах, так и в интронах и, что особенно важно, в промоторных регуляторных зонах структуры гена (Bidwell J. et al., 1999). Полиморфные молекулы влияют на иммунный ответ и развитие воспалительных реакций. Однако, несмотря на широкомасштабные работы по генетическому полиморфизму регуляторных молекул при различных инфекционных заболеваниях, исследования почти не коснулись коклюшной инфекции, при которой патогенез осложнений имеет свои особенности.

В связи с этим, изучение полиморфизма цитокинов, принимающих участие в механизмах миграции клеток, регуляции межклеточных взаимодействий у больных при коклюше, а также поиски генетических и иммунологических маркеров развития осложнений представляется перспективным в теоретическом и практическом отношениях. Выявление ассоциации коклюша с определенным генотипом, в конечном итоге, может дать возможность для создания базы данных, позволяющей прогнозировать риск развития инфекционного заболевания и провести профилактику развития осложнений.

Цель исследования: изучить состояние иммунитета при коклюше у детей, выявить роль полиморфизма генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С592А, G1082A, C819T) и ФНОб (G308A) в развитии осложненных и неосложненных форм коклюшной инфекции.

В связи с этим нами решались следующие задачи:

1. Исследовать частоту полиморфных вариантов генов ФНО, ИЛ-4, ИЛ-10, ассоциации аллелей и генотипов у детей с коклюшной инфекцией, с осложненным и неосложненным его течением.

2. Определить концентрацию провоспалительных (ИЛ-1, RA ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО), противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10) цитокинов.

3. Оценить состояние гуморального иммунитета по уровню иммуноглобулинов А, М, G с подклассами у больных коклюшем с неосложненным и осложненным пневмонией течением.

4. Изучить лимфоцитарно-тромбоцитарную адгезию у детей с неосложненным и осложненным течением коклюшной инфекции.

5. Выяснить связи полиморфных маркеров генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С592А, G1082A, C819T) и ФНОб (G308A) с лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезией, продукцией провоспалительных, противовоспалительных цитокинов и иммуноглобулинов у детей с неосложненным и осложненным течением коклюша.

Научная новизна. Установлено, что среди больных коклюшем, независимо от варианта течения заболевания, частота носителей генотипа Т/Т участка С589Т гена ИЛ-4 выше, чем в группе здоровых детей. При осложненном пневмонией течении повышено количество носителей аллелей А и генотипа А/А G1082A гена ИЛ-10.

Выявлено, что наличие полиморфных маркеров участка G1082A ИЛ-10 ассоциировано со сниженным образованием лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов у детей с коклюшной инфекцией.

Обнаружено, что носители Т/Т варианта С589Т гена ИЛ-4 и А/А варианта участка G1082A ИЛ-10 имеют более высокий уровень данных интерлейкинов и иммуноглобулинов (IgM, sIgA) в сравнении с нормальным гомозиготным и гетерозиготным вариантами. Носители генотипа А/А участка С592А гена ИЛ-10 отличаются гипопродукцией ИЛ-4, ИЛ-10, IgM.

Теоретическая и практическая значимость работы. В результате исследования получены новые сведения о роли полиморфизма генов ИЛ-4, ИЛ-10 в иммунопатогенезе коклюшной инфекции. Установлена взаимосвязь полиморфных маркеров с лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезией, продукцией ИЛ-1, ИЛ-1RA, ИЛ-8, ФНОб, ИЛ-4, ИЛ-10 и гуморальным иммунитетом.

Исследование распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С592А, G1082A), позволяет выявить наличие ассоциаций аллелей и генотипов с риском развития заболевания и его осложнений. Полученные сведения о наличии полиморфизма генов ИЛ-4, ИЛ-10 и ФНО могут быть включены в генетический паспорт индивидуумов и совместно с другими полиморфизмами использоваться для оценки риска развития осложнений коклюша.

Внедрение в практику. Результаты исследований внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, детских инфекций Читинской государственной медицинской академии.

Апробация диссертации. Основные результаты работы были представлены на научно-практической студенческой конференции «Медицина завтрашнего дня» (Чита, 2008), научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Современные аспекты инфекционной патологии» (Астрахань, 2009), 8 конгрессе детских инфекционистов России «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 2009), 9 общероссийском конгрессе детских инфекционистов «Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики» (Москва, 2010), научно-практической конференции с международным участием «Естественные науки: достижения нового века» (Шарджа, ОАЭ, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в т.ч. 3 статьи в научных рецензируемых журналах, определенных ВАК Минобрнауки РФ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Наличие аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ИЛ-4 и ИЛ-10 ассоциировано с развитием коклюша и бактериальных осложнений. Частота встречаемости генотипа Т/Т участка С589Т гена ИЛ-4 при коклюше выше. Осложненное пневмонией течение коклюша чаще наблюдается у обладателей гомозиготных вариантов А/А участка G1082A гена ИЛ-10, в отличие от здоровых и детей с неосложненным течением коклюша.

2. При коклюше отмечается высокий уровень лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии, провоспалительных цитокинов (ИЛ-1в, ФНОб, RA ИЛ-1, ИЛ-8) и низкая концентрация ИЛ-4, независимо от возраста и течения заболевания. У детей до года, на фоне коклюша, повышается продукция всех классов иммуноглобулинов, в то время как, среди детей старше года уровень IgA, IgM, IgG не превышает показателей здоровых детей, а продукция sIgA, подкласса G2 имеет тенденцию к снижению. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия коррелирует с уровнем цитокинов.

3. У носителей полиморфных маркеров гена ИЛ-4 (С589Т) и гена ИЛ-10 (G1082A) продукция противовоспалительных цитокинов и IgМ, sIgA более высокая, в сравнении с носителями нормальных гомозигот и гетерозигот. Сниженное образование лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов ассоциировано с полиморфизмом гена ИЛ-10 (G1082A). Дети с полиморфным гомозиготным вариантом гена ИЛ-10 (С592А) отличаются гипопродукцией ИЛ-10, ИЛ-4 и IgM.

1. Материалы и методы исследования

коклюшный ген цитокин лимфоцитарный

Краткая клиническая характеристика больных. В работе с обследуемыми лицами соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2000 ред.)

Нами обследован 71 ребенок с коклюшем, находившихся на лечении в детском отделении воздушно-капельных инфекций Краевой инфекционной больницы г. Чита в 2008-2010 г.г. Наблюдалось 36 детей в возрасте от 1 мес. до 12 мес., из них с неосложненным течением коклюша - 18 чел., с осложненным пневмонией - 18 чел.; 35 детей старше 12 мес., из них с неосложненным течением - 28, осложненным - 7. Группу контроля составили здоровые дети от 1 мес. до 14 лет.

Методы исследования

Определение концентрации цитокинов ИЛ-1в, RA ИЛ-1, ИЛ-8,ФНОб, ИЛ-4, ИЛ-10 проводили иммуноферментным методом с использованием реактивов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Определение концентрации иммуноглобулинов IgА, IgМ, IgG с подклассами (G1, G2, G3, G4) осуществляли методом ИФА с использованием реактивов ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Оценку лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии (ЛТА) проводили по методу, предложенному Ю.А. Витковским и соавт. (1999).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Определение полиморфизма генов цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-4, ФНОб) осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО «Литех» (г. Москва).

Способы статистической обработки полученных результатов. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась при помощи электронных программ Microsoft Excel 2007, STATISTICA 6,0 (StatSoft Inc., США) с определением значимости различий при уровне р< 0,05. Для сравнения частот применялись: при нормальном распределении признака - критерий Стьюдента (t-тест), при альтернативном распределении признака - критерий Манна - Уитни (U-тест). Оценка распределения признаков проводилась с помощью критерия Шапиро-Уилка W. При расчете корреляционных связей использовали коэффициент Пирсона. Для сравнения групп по качественному бинарному признаку применялся критерий 2 (Пирсона). С целью вычисления оценки взаимосвязи качественных признаков использовали коэффициент Юла (Q - коэффициент) и сопряженности Пирсона (С-коэффициент) (Зайцев В.М. и др., 2003).

2. Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Частота встречаемости полиморфизма генов цитокинов при коклюше.

Мы изучили распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С592А, G1082А, С819Т) и ФНОб (G308A) у больных и здоровых детей.

Установлено, что среди больных детей с неосложненным течением коклюша соблюдалась равная частота встречаемости аллелей С и Т (0,5:0,5) в участке С589Т гена ИЛ-4. У них преобладал гетерозиготный вариант С/Т (0,5), тогда как гомозиготные варианты C/C и Т/Т выявлялись с одинаковой частотой. При осложненном течении коклюша превалировала частота носителей аллели Т (0,56). При этом встречаемость генотипа Т/Т составила 0,31 и оказалась выше, чем у детей при неосложненном коклюше и в группе контроля. Среди здоровых детей преобладают носители аллели С и соответственно частота генотипа С/С составила 0,46, гетерозиготного варианта С/Т - 0,44.

При осложненном течении заболевания установлена повышенная частота носителей аллелей А в участках (С592А) и (G1082А) гена ИЛ-10 с преобладанием гетерозиготных генотипов. Частота генотипа С/А (С592А) составила 0,5, встречаемость гетерозиготного варианта G/А и гомозиготного А/А участка G1082А составили 0,46 и 0,41 соответственно. В группе контроля преобладала частота генотипа С/С участка (С592А) (0,49) и генотипа G/А участка (G1082А) (0,48) гена ИЛ-10.

При сравнении группы здоровых детей с исследуемыми выявлено повышение частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров гена ИЛ-4 у больных коклюшем, независимо от течения, и гена ИЛ-10, участков (С592А) и (G1082А), при осложненном пневмонией заболевании. На основании оценки взаимосвязи определена зависимость средней силы между наличием полиморфных участков гена ИЛ-4 в участке (С589Т) и заболеванием коклюшем как неосложненным (ч2 - 14,5, р<0,001), так и осложненным пневмонией (ч2 - 4,06, р<0,05). В случае осложненного пневмонией течения установлена связь средней силы с носительством полиморфных участков (1082А) гена ИЛ-10 (ч2 - 9,45, р<0,01). При использовании Q-критерия связь также установлена с полиморфизмом (592А) гена ИЛ-10. Ассоциации полиморфизма генов ФНОб (G308А) и ИЛ-10 (С819Т) с заболеванием коклюшем не установлено. Количество носителей полиморфных маркеров соответствует группе здоровых детей. Соответственно, дальнейший анализ мы проводили без учета полиморфизма данных генов. Таким образом, носительство полиморфных маркеров генов противовоспалительных цитокинов ассоциировано с развитием коклюша и бактериальных осложнений. Следовательно, изучение полиморфизма генов цитокинов может служить одним из критериев определения групп риска.

2. Особенности иммунитета у детей с неосложненным и осложненным течением коклюша.

Установлено, что у детей с коклюшем без осложнений и осложненного пневмонией независимо от возраста повышается лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия (ЛТА) (р1<0,001). При этом лимфоцитарно-тромбоцитарный индекс соответствует показателю контрольной группы (р > 0,05) (рис.1, 2).

Рис. 1. Уровень ЛТА и ЛТИ у детей до года

Рис. 2. Уровень ЛТА у детей старше года

Обнаружено, что при коклюше у детей до 1 года, независимо от наличия осложнений, концентрация ИЛ-4 не превышала значений здоровой группы (р > 0,05), тогда как у детей старше 1 года содержание ИЛ-4 оказалось пониженным (р < 0,01). Наоборот, во всех возрастных группах при коклюше уровень ИЛ-10 увеличен (р < 0,05), за исключением больных старше года с осложненным течением, в данной группе показатели ИЛ-10 соответствуют группе контроля (р > 0,05). Также отмечается значительное повышение (в 2-3 раза) продукции провоспалительных цитокинов во всех исследуемых группах в сравнении со здоровыми детьми (р1 < 0,001 - р < 0,05) (рис. 3, 4). Различий в зависимости от возраста не отмечено (р > 0,05).

Рис. 3. Уровень цитокинов в сыворотке крови у детей до года

Рис. 4. Уровень цитокинов в сыворотке крови у детей старше года

Обнаружена прямая связь ЛТА с ИЛ-1в, ФНОб при неосложненном течении и обратная при осложненном течении. Обратная связь разной силы определена с рецепторным антагонистом ИЛ-1 и противовоспалительными цитокинами ИЛ-4, ИЛ-10.

У здоровых детей до года отмечается низкий уровень продукции иммуноглобулинов, в первую очередь IgA, sIgA. При заболевании коклюшем в группе до года определяется повышение концентрации всех иммуноглобулинов - IgA, sIgA, IgM, IgG (р<0,001) (рис. 5), среди подклассов IgG значительнее всех повышаются IgG3 и IgG4 (в 5-6 раз) (р<0,001). В группе старше года, независимо от течения заболевания, прослеживается низкий уровень секреторного IgA (р<0,001), а продукция общего IgA, IgM, IgG не отличается от здоровых детей (р>0,05) (рис. 6). У них среди подклассов IgG наблюдается снижение IgG2 (р<0,001). Следовательно, низкая продукция ИЛ-4 и недостаточное повышение ИЛ-10 сказываются на работе гуморального иммунитета.

Рис. 5. Уровень иммуноглобулинов у детей до года

Рис. 6. Уровень иммуноглобулинов у детей старше года

3. Влияние полиморфных участков генов ИЛ-4 (С589Т), ИЛ-10 (С819Т, С592А, G1082А) на патогенез коклюша

Немаловажную роль в синтезе цитокинов и их функциональной активности играет наличие полиморфных маркеров генов цитокинов. У носителей полиморфных гомозигот участка (С589Т) гена ИЛ-4 выявлено повышение продукции ИЛ-4 при благоприятном течении (1,52 [1,11-2], р<0,05), при осложненном (1,54 [1,24-2,1], р<0,05) и, как следствие, увеличение уровня IgM, sIgA (р<0,01). В данном случае лимфоциты продуцируют большее количество ИЛ-4, который, влияя на пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов, активирует гуморальный иммунитет, повышается продукция IgM и sIgA, и подавляет продукцию провоспалительных цитокинов. При осложненном течении носители С/Т генотипа отличались также повышением ИЛ-10 (2,42 [1,67-4,6], р<0,05) и снижением ФНОб (10,2 [9,4-14,2], р<0,05). Низкий уровень ФНОб, способствует распространению инфекции и активности процесса.

Наличие полиморфных маркеров участка (С592А) гена ИЛ-10 характеризуется, при гомозиготном варианте А/А, низким уровнем ИЛ-4 (1,28 [0,95-1,74] с неосложненным течением; 1,11 [0,94-1,64] - с осложненным, р<0,05), ИЛ-10 (1,43 [1,36-1,75] и 1,47 [1,4-1,8], р<0,01), IgM (1,4 [1,1-1,6] и 1,4 [1,1-1,8] соответственно, р<0,05). Это позволяет предположить, что аномальная аллель А обусловливает снижение синтеза иммуноглобулинов. Низкий уровень иммуноглобулинов, как основных факторов защиты при коклюше, способствует затяжному течению заболевания и повышается риск бактериальных осложнений.

При неосложненном течении коклюша выявлена гиперпродукция ИЛ-10 у больных с гетерозиготным G/A (2,8 [1,97-4,5], р<0,01) и гомозиготным A/A (2,4 [1,8-3,7], р<0,01) вариантами участка (G1082A) гена ИЛ-10 (табл. 1).

Таблица 1. Продукция цитокинов и иммуноглобулинов в зависимости от полиморфных маркеров генов ИЛ-4 и ИЛ-10 у детей с коклюшем

Установлено, что у пациентов с генотипом А/А участка (G1082A) гена ИЛ-10 снижается ЛТА до 21%[13%-24%] при осложненном течении, до 20,5% [13,5%-23%] при неосложненном течении, в сравнении с нормальным генотипом G/G ? 22% [19,25%-24,25%], (р<0,05). При данном полиморфизме отмечается гиперпродукция ИЛ-10 и, как следствие, ингибирующее действие на ЛТА. В результате повышается риск развития вторичной инфекции, распространения воспаления.

Исходя из полученных результатов, мы определили, что носители гомозиготы А/А участка (С592А) гена ИЛ-10 отличаются гипопродукцией ИЛ-10, ИЛ-4, Ig M, а носители полиморфных маркеров участка (G1082А) гена ИЛ-10 характеризуются гиперпродукцией противовоспалительных цитокинов. У детей с Т/Т вариантом участка (С589Т) гена ИЛ-4 высокий уровень ИЛ-4, Ig M, sIg A.

Таким образом, полиморфизм интерлейкинов оказывает влияние на иммунологическое звено патогенеза коклюшной инфекции, обусловливая продукцию цитокинов, иммуноглобулинов и взаимодействие иммунокомпетентных клеток, что в свою очередь сказывается на клиническом течении заболевания и развитии осложнений.

Заключение

1. При неосложненном течении коклюша частота встречаемости генотипа Т/Т гена ИЛ-4 (С589Т) составляет 25%, при осложнённом - 31%. У больных с коклюшем, осложненным пневмонией, частота встречаемости полиморфного гомозиготного варианта А/А гена ИЛ-10 (G1082A) составляет 41%.

2. В группе детей, болеющих коклюшем, в возрасте до 1 года повышается концентрация провоспалительных цитокинов и ИЛ-10. Среди больных детей старше 1 года увеличивается продукция ИЛ-1в, RA ИЛ-1, ИЛ-8 и ФНО-б в 2-3 раза, при этом снижается уровень ИЛ-4 и ИЛ-10.

3. У детей, болеющих коклюшем, в возрасте до 1 года, повышается в плазме концентрация IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, sIgA, а старше 1 года - уменьшается содержание секреторного IgA и IgG2.

4. У детей с коклюшем, независимо от возраста и течения заболевания усиливается образование лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. При этом показатель ЛТА имеет отрицательную корреляцию с содержанием ИЛ-1RA, ИЛ-4 и ИЛ-10. При осложненном течении заболевания проявляется обратная, а при неосложненном - прямая связь с концентрацией ИЛ-1в и ФНОб.

5. Больные коклюшем - носители гомозиготного генотипа T/T гена ИЛ-4 (С589Т) и A/A ИЛ-10 (G1082A), по сравнению с другими вариантами генотипа этих цитокинов, - характеризуются гиперпродукцией ИЛ-4 и ИЛ-10, повышением концентрации IgM, sIgA и снижением лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии.

6. При коклюше у детей с генотипом А/А полиморфизма гена ИЛ-10 (С592А) наблюдается низкий уровень противовоспалительных цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10 и концентрации Ig M.

Литература

1. Епифанцева Н.В. Коклюш: полиморфизм генов противовоспалительных цитокинов / Н.В. Епифанцева // Врач-аспирант. - 2011. - № 4.3 (47). - С. 454 - 458.

2. Епифанцева Н.В. Взаимосвязь лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии с цитокинами у детей при коклюшной инфекции.

3. Епифанцева Н.В. Уровень цитокинов при коклюше у детей Забайкалья.

4. Епифанцева Н.В. Клинико-эпидемиологические особенности коклюшной инфекции у детей Забайкалья / Н.В. Епифанцева, Н.И. Карпова, Н.А. Мироманова // Материалы научно-практической конференции «Медицина завтрашнего дня». - Чита, 2008. - С. 114.

5. Епифанцева Н.В. Изменения гемостаза и лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии при коклюше у детей / Н.В. Епифанцева, Н.А. Мироманова, Н.И. Карпова // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Современные аспекты инфекционной патологии». - Астрахань, 2009. - С. 42.

6. Епифанцева Н.В. Лимфоцитарно-тромбоцитарная адгезия как критерий осложненного течения коклюшной инфекции у детей / Н.В. Епифанцева, Ю.А. Витковский // Материалы восьмого конгресса детских инфекционистов России. - М., 2009. - С. 45.

7. Епифанцева Н.В. Некоторые патогенетические аспекты коклюшной инфекции у детей / Н.В. Епифанцева // Материалы девятого Общероссийского конгресса детских инфекционистов. - М., 2010. - С. 32.

8. Епифанцева Н.В. Полиморфизм генов противовоспалительных цитокинов при коклюше у детей / Н.В. Епифанцева // Материалы научно-практической конференции с международным участием «Естественные науки: достижения нового века». - Шарджа (ОАЭ). - 2011. - С. 17.

Размещено на Allbest.ru