Новая технология получения (18F) флюмазенила, радиофармпрепарата для рецепторных исследований мозга методом ПЭТ (позитронной эмиссионной томографии)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Новая технология получения (18F) флюмазенила, радиофармпрепарата для рецепторных исследований мозга методом ПЭТ (позитронной эмиссионной томографии)

Насирзадех М.

Ваулина Д.Д.

Гомзина Н.А.

Аннотации

Впервые показана принципиальная возможность использования метода твердофазной экстракции (ТФЭ) для получения [18F] флюмазенила ([18F]ФМЗ), радиолиганда для визуализации ГАМКА рецепторов методом позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ). Проведено сравнение эффективности использования для выделения [18F]ФМЗ экспресс-метода ТФЭ на одноразовых картриджах и традиционной полупрепаративной ВЭЖХ. Разработана новая радиохимическая автоматизированная технология, которая позволяет получить в одном синтезе (53 мин) 2-5 клинических дозы [18F]ФМЗ с удельной активностью > 185 ГБк/мкмоль, с радиохимической чистотой >98 % и химическими примесями (нитромазенил)?4 мкг/мл. Полученный препарат отвечает всем требованиям, предъявляемым Фармакопеей, и может быть рекомендован для использования в клинических ПЭТ исследованиях.

Ключевые слова: позитронная эмиссионная томография, радиофармпрепараты, радиолиганды, ГАМКА рецепторы, фтор-18, автоматизированный модуль синтеза, [18F]флюмазенил ([18F]ФМЗ), твердофазная экстракция.

Nasirzadeh М.1, Vaulina D.D.2, Gomzina N.А.3

1ORCID: 0000-0003-3486-2787, Postgraduate Student, Saint-Petersburg State University, Institute of Chemistry, 2ORCID: 0000-0003-1088-2396, Junior researcher, 3ORCID: 0000-0002-4554-6125, PhD in Chemistry, Senior researcher, 2,3N. P. Bechtereva Institute of Human Brain, Russian Academy of Sciences, (IHB RAS)

A NOVEL TECHNOLOGY FOR PRODUCING OF [18F]FLUMAZENIL, RADIOPHARMACEUTICAL FOR BRAIN RECEPTORS STUDIES BY PET

For the first time an express method of solid phase extraction (SPE) was proposed for producing of [18F]flumazenil ([18F]FMZ), a radioligand for visualization GABAA receptors by positron emission tomography (PET). Efficiencies of [18F]FMZ extraction by SPE on commercially available cartridges and by traditional semi-preparative HPLC were compared. Application of novel radiochemical automated technology allowed to obtain 2-5 clinical doses of radioligand in one production run (53 minutes). [18F]FMZ was produced with specific activity >185 GBq/µM, radiochemical purity >98 % and ? 4 µg/ml of nitromazenil residual amounts. The obtained preparation meets all Pharmacopoeia requirements and can be recommended for PET clinical applications.

Keywords: positron emission tomography, radiopharmaceuticals, radioligands, GABA receptors, fluorine-18, automated synthesis module, [18F] flumazenil ([18F] FMZ), solid-phase extraction.

Позитронная эмиссионная томография (ПЭТ) - метод ядерной медицины, позволяющий при использовании соответствующих радиофармпрепаратов (РФП) и фармакокинетических моделей их поведения в организме, количественно измерить параметры многих физиологических и биохимических процессов in vivo (перфузия, метаболизм, рецепторные и нейротрансмиттерные взаимодействия), обеспечивая тем самым точную диагностику онкологических, кардиологических, неврологических и психических заболеваний на ранних этапах. В качестве РФП используют биологически активные соединения, меченные короткоживущими радионуклидами с позитронным типом распада: 18F (Т Ѕ =109.7 мин),11C (Т Ѕ =20.4 мин) и др. При изучении нейрохимических процессов в центральной нервной системе (ЦНС) методом ПЭТ используют меченые соединения, специфично связывающиеся с отдельными типами рецепторов ЦНС (рецепторные радиолиганды). С помощью этих соединений получают ценную информацию о механизмах рецепторных взаимодействий и о плотности и распределении самих рецепторов в различных отделах мозга [1-4]. Большой интерес вызывают ПЭТ исследования ГАМК-эргической системы, реализующей биохимическое действие ГАМК (гамма-аминомасляной кислоты), основного тормозного нейромедиатора ЦНС [2,4]. Бензодиазепиновыми рецепторами (БЗР) называют участки (сайты) ГАМКА-рецепторов для связывания c бензодиазепинами. БЗР локализованы на мембранах нервных клеток и входят в состав ГАМКА-бензодиазепин-ионофорного комплекса, действие которого направлено на изменение устойчивости нервных клеток к возбуждающим сигналам. В частности, бензодиазепины, связываясь с БЗР, усиливают процессы торможения в ЦНС. Седативное действие бензодиазепинов нашло широкое применение в виде транквилизаторов, релаксантов, антиконвульсантов и снотворных препаратов. Центральные БЗР (цБЗР) играют ключевую роль в таких заболеваниях, как: эпилепсия, тревожные состояния, деменции, алкоголизм и др. томография радиофармпрепарат эмиссионный

В ПЭТ в качестве РФП для определения плотности цБЗР используют меченые аналоги лекарственного средства флюмазенил (8-фтор-имидазо[1,5-a][1,4]бензодиазепин-3-карбоксил этиловый эфир), (рис. 1а). Флюмазенил обладает высокой аффинностью к цБЗР (Kd<5nM), является их полным антагонистом и применяется для снятия наркоза, вызываемого действием препаратов на основе бензодиазепинов [4]. В ИМЧ РАН в 2005 г был разработан метод получения [18F]флюмазенила ([18F]ФМЗ) (2, рис. 1б), меченного фтором-18 в нативную позицию молекулы флюмазенила, путем замещения на [18F]фторид нитрогруппы в молекуле нитромазенила (этил-5,6-дигидро-5-метил-8-нитро-6-оксо-4H-имидазо[1,5a][1,4]бензодиазепин-3-карбоксилат) (1) в условиях межфазного катализа криптандом К 2.2.2 (4,7,13,16,21,24-гексаоксо-1,10-диазабицикло [8.8.8]гексакозан) [5].

Рис. 1 - Получение [18F]ФМЗ по методу [5]

Радионуклид фтор-18 получают в циклотроне по ядерной реакции 18O(p,n)18F при облучении протонами мишени, заполненной водой, обогащенной по изотопу кислород-18 ([18O]H2O). Полученный фтор-18 стабилизируется в химической форме 18F-фторид-иона, который выделяют из мишенного материала сорбцией на анион-обменной смоле с последующим элюированием раствором, содержащим комплекс К 2.2.2 со щелочным металлом ([К 2.2.2]К+), для перевода в апротонный растворитель ДМФА, где и происходит реакция нуклеофильного замещения.

По методу [5] [18F]ФМЗ получают без добавления носителя, т.е. с очень высокой удельной активностью (> 37 ГБк/мкМоль), которая является одним из обязательных параметров радиолиганда для рецепторных исследований мозга. Поскольку при связывании с активными центрами рецептора носитель конкурирует с радиолигандом, это сказывается на качестве ПЭТ томограмм, а насыщение рецепторов может привести к нежелательным фармакологическим и даже нейротоксическим эффектам. Например, для полного насыщения цБЗР достаточно 15 мкг флюмазенила на 1 кг массы тела [6]. В случае "безносительного" [18F]ФМЗ необходимо контролировать оставшееся количество нитромазенила (1), поскольку и радиолиганд и предшественник имеют близкие физико-химические свойства и сродство к цБЗР.

До настоящего времени для выделения из реакционной смеси и последующей очистки [18F]ФМЗ для клинических исследований использовали метод полупрепаративной радио-ВЭЖХ. Длительная (30--40 мин) и трудоемкая ВЭЖХ процедура сопряжена с большими потерями радиоактивного продукта, радиохимический выход (РХВ) [18F]ФМЗ, выделенного из реакционной смеси с помощью ВЭЖХ, варьировал от 10 [7] до 0.4--1.1% [8] (с поправкой на распад). Столкнувшись с этой проблемой при разработке новой технологии получения [18F]ФМЗ, мы предложили использовать для ее решения альтернативный метод твердофазной экстракции (ТФЭ). В основу нового подхода была положена сорбция [18F]ФМЗ и 1 на микроколонке Oasis HLB 6cc ("Waters"), заполненной сополимером N-винилпирролидона и дивинилбензола, с последующим разделением радиолиганда и более липофильного 1 путем фракционного элюирования водно-этанольными растворами возрастающей концентрации. Результаты показали, что неоптимизированный РХВ радиолиганда составил 8% (с поправкой на распад) при сокращении времени процедуры (по сравнению с ВЭЖХ) в 1.5 раза. [18F]ФМЗ был получен с удельной активностью > 37 ГБк/мкмоль, радиохимической чистотой > 97% и содержанием 1 ~ 1мкг/мл [9]. Эти исследования были выполнены на полуавтоматической экспериментальной системе синтеза (модуле), сконструированном в ИМЧ РАН, с начальной активностью [18F]фторида < 3.7 ГБк (100 мКи), поэтому активности препарата было недостаточно даже для одного рецепторного исследования мозга (0.2 ГБк). Для того чтобы добиться воспроизводимого выхода продукта, стандартизировать все этапы синтеза и полностью автоматизировать всю процедуру, а также избежать облучения персонала при работе с высокими уровнями активности фтора-18, необходимо было выбранный метод интегрировать в современные модули для получения РФП для ПЭТ. Одним из них является Tracerlab FX N Pro (GE Healthcare) - модуль для получения РФП путем нуклеофильного радиофторирования.

Для того, чтобы сравнить эффективность методов ВЭЖХ и ТФЭ в технологии получения [18F]ФМЗ, мы проводили на Tracerlab FX N Pro синтезы препарата с двумя разными схемами очистки (рис. 2), начиная при этом с одинаковой активности [18F]фторида (~ 30 ГБк). Значения параметров радиолиганда, полученного с использованием этих схем, представлены в таблице 1, значения, регламентированные Фармакопеей [10], приведены в скобках.

Таблица 1 - Сравнение методов выделения [18F]ФМЗ

*- Контроль качества [18F]ФМЗ выполняли методом ВЭЖХ хроматографии: Dionex ВЭЖХ система с детекторами по радиоактивности (гамма-счетчик) и УФ (л=254 nm), колонка ACE C-18 HL (250Ч4.6 мм) (Aberdeen). Элюент: 0.01 M H3PO4/MeCN (v/v=3/1), скорость подачи: 1.5 мл/мин.

Как видно из рисунка 2, перед введением реакционной смеси в петлю ВЭЖХ-колонки проводили предварительную очистку на картридже с кремнийорганическим сорбентом (С 18) для удаления гидрофильных радиоактивных примесей.

Рис. 2 - Технологическая схема получения [18F]ФМЗ с выделением и очисткой методами а) ВЭЖХ и б) ТФЭ

После ВЭЖХ процедуры для удаления органического растворителя (ацетонитрила) из фракции, содержащей продукт, использовали сорбцию [18F]ФМЗ на втором картридже С 18 с последующим элюированием этанолом. Видно, что метод ВЭЖХ является трехступенчатой длительной процедурой, с большими потерями активности на ВЭЖХ-колонке; РХВ [18F]ФМЗ составил ~ 3% с поправкой на распад, общее время синтеза - 80 мин (таблица 1). Активность продукта была невысока - около 370 MБк, но вполне достаточна для одной клинической дозы (180 МБк). При этом продукт был получен с высокой удельной активностью, с радиохимической чистотой ~100% и с ничтожно малым содержанием 1. В синтезах с ТФЭ методом выделения целевого продукта РХВ составил 8-10 % (с поправкой на распад), а активности радиолиганда (750-1100 МБк) хватило для получения 2-5 клинических доз. Значения параметров качества радиолиганда при этом отвечали фармакопейным требованиям.

Однако содержание 1 (2-4 мкг/мл) было в несколько раз больше, чем в опытах с использованием ВЭЖХ процедуры (<0.5 мкг/мл). Поскольку фармакопейных норм для остаточного количества 1 в препарате [18F]ФМЗ нет, то для доказательства допустимой нормы нитромазенила ?4мкг/мл мы воспользовались результатами доклинических исследований на безопасность РФП [18F]ФМЗ для ПЭТ, проведенными вместе с Научно-исследовательским Институтом гриппа МЗ РФ на группах аутбредных крыс (30 самок и 30 самцов). Исследования показали, что однократное введение [18F]ФМЗ в дозе эквивалентной человеческой и в 30 раз её превышающей, не вызвало изменений в состоянии опытных животных в течение 14 дней. Структура поведенческого паттерна "открытое поле" у животных из всех экспериментальных групп соответствовала таковой у здоровых белых крыс. У всех опытных животных отмечалась положительная динамика массы тела, значения температуры тела не выходили за пределы физиологической нормы. Достоверные различия в величине внутренних органов и головного мозга опытных и контрольных животных не были выявлены. Гистологические исследования также не выявили признаков изменений во внутренних органах крыс самцов и самок, получавших как плацебо, так и препарат.

Метод твердофазной экстракции был положен в основу создания новой технологии получения флюмазенила, меченного 18F, первого в России радиолиганда для рецепторных исследований мозга методом ПЭТ.

Список литературы

1. Ametamey, S.M. Molecular imaging with PET/ S. M. Ametamey, M. Honer, P.A. Schubiger // Chem.Rev. - 2008. - V. 108. - P.1501-1516.

2. Sigel, E. Structure, function and modulation of GABAAreceptors / E. Sigel, M.E. Steinmann // J. Biol. Chem. - 2012. - V.287. - P.40224-40231.

3. Chakravarty, R. Positronemissiontomographyimage-guideddrugdelivery: current statusand future perspectives / R. Chakravarty, H. Hong, W. Cai // Mol. Pharmaceutics. - 2014. - V. 11. - P. 3777?3797.

4. Andersson, J.D. PET radioligands targeting the brain GABAA/benzodiazepine receptor complex / J. D. Andersson, C. Halldin//J. Label Compd. Radiopharm. - 2013. - V. 56 -P.196-206.

5. Ryzhikov, N. Preparation of high specific radioactivity [18F]flumazenil and its evaluation in cynomolgus monkey by positron emission tomography / N.N. Ryzhikov, N. Seneca, R.N. Krasikova [et al.] // Nucl. Med. Biol. - 2005. -V. 32. -P. 109-116.

6. Delforge, J. Quantitation of Benzodiazepine Receptors in Human Brain Using the Partial Saturation Method / J. Delforge, L. Spelle, B. Bendriem [et al.] // J. Nucl. Med. - 1996. - V. 37. - P. 5-11.

7. Odano, I. [18F]Flumazenil binding to central benzodiazepine receptor studies by PET - Quantitative analysis and comparisons with [11C]flumazenil/ I. Odano, C. Halldin, P. Karlsson [et al.] // Neuroimage. - 2009.- V. 45. - P. 891-902.

8. Moon, B. S. Facile aromatic radiofluorination of [18F]flumazenil from diaryliodonium salts with evaluation of their stability and selectivity / B. S. Moon, H. S. Kil, J. H. Park [et al.] // Org. Biomol. Chem. - 2011. - V. 9. - P. 8346-8355.

9. Nasirzadeh, M. A novel approach to the synthesis of [18F]flumazenil, a radioligand for PET imaging of central benzodiazepine receptors / M. Nasirzadeh, D. D. Vaulina, O. F. Kuznetsova, N. A. Gomzina // Russ. Chem. Bull. Int. Ed.- 2016 - V. 65. - P. 794-800.

10. Radiopharmaceutical preparation, in: European Pharmacopoeia. 8.0, European Directorate for the Quality of the Medicines; Strasbourg, 2014, pp. 759-763.

Размещено на Allbest.ru