Вплив цитрату цинку на антиоксидантний захист у печінці та підшлунковій залозі щурів за експериментального діабету

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив цитрату цинку на антиоксидантний захист у печінці та підшлунковій залозі щурів за експериментального діабету

Цинк бере участь у багатьох молекулярних внутрішньоклітинних процесах і характеризується регуляторним впливом на проліферацію, диференціацію та функціональну активність різних типів клітин. Тісний зв'язок цинку з гормонами і ферментами пояснює його вплив на вуглеводний, жировий і білковий обміни речовин, на окисно- відновні процеси, на синтетичну здатність печінки. Вважається, що у підтриманні гомеостазу цинку бере участь і підшлункова залоза [17], вивільняючи цинк у кишковий тракт, звідки відбувається реабсорбція мікроелемента в періоди його дефіциту [14]. Установлено, що за умов діабету порушується обмін цинку, особливо в p-клітинах панкреатичних острівців [13]. Розвиток діабету супроводжується дегрануляцією інсулоцитів і втратою цинку [10, 11]. Це явище слугувало підкріпленням положення про його роль в інкреторній функції підшлункової залози.

Однією з важливих функцій цинку є участь в системі антиоксидантного захисту організму [9, 18]. Цинк здатний активувати синтез у печінці Cu/Zn - залежної СОД [15]. Він може конкурувати з феру- мом і купрумом, як антагоністами, за зв'язки з мембранами клітин і зменшувати утворення вільних радикалів, тим самим здійснюючи пряму антиоксидантну дію [20].

Тому метою даних досліджень було з'ясувати вплив різних кількостей цинку на стан процесів пероксидного окислення ліпідів та активність ензимів антиоксидантного захисту у печінці та підшлунковій залозі щурів за експериментального цукрового діабету індукованого стрептозотоцином.

Дослідження проведені на білих лабораторних щурах, які перебували в умовах віварію Інституту біології тварин НААН. Робота виконана з дотриманням рекомендацій Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986) та «Біоетичної експертизи доклінічних та інших наукових досліджень, що виконуються на тваринах» (Київ, 2006).

Тварини масою тіла від 150 до 170 г були розділені на чотири групи: І група - контрольна, ІІ, ІІІ і IV - дослідні. Тварини І і ІІ груп споживали виключно основний раціон. Тваринам ІІІ і!V груп протягом місяця до основного раціону додавали розчин цитрату цинку в кількостях 20 і 50 мг Zn/кг маси тіла. У тварин ІІ, ІІІ і!V груп на тлі 24-ох годинного голодування був викликаний експериментальний цукровий діабет (ЕЦД) шляхом внутрішньоочере- винного введення стрептозотоцину (“Sigma”, США) з розрахунку 45 мг/кг маси тіла. Гіперглікемію виявляли шляхом вимірювання глюкози крові, зібраноїБіологічні науки з хвостової вени, за допомогою портативного глюкометра (“Gamma-M”).

На 30 добу тварин виводили з експерименту під легким ефірним наркозом. Матеріалом для дослідження були гомогенати тканин печінки та підшлункової залози щурів. Визначали вміст гідроперо- ксидів ліпідів (ГПЛ) за методом, принцип якого полягає в осадженні протеїну трихлороцтовою кислотою з наступним внесенням у середовище тіоці- анату амонію [1]. Концентрацію ТБК-активних продуктів вимірювали за допомогою кольорової реакції малонового діальдегіду з тіобарбітуровою кислотою [5]. Активність супероксиддисмутази (СОД, КФ 1.1.15.1.) визначали за методом, принцип якого полягає у відновленні нітротетразолію супероксид- ними радикалами [4]. Активність глутатіонперокси- дази (ГП, КФ 1.11.1.9) визначали за швидкістю оки- снення відновленого глутатіону [7]. Активність ка- талази (КТ, КФ 1.11.1.6) визначали за допомогою здатності пероксиду водню утворювати із солями молібдену стійкий кольоровий комплекс [6]. Активність глутатіонредуктази (ГР, КФ 1.6.4.2) визначали за швидкістю відновлення глутатіону в присутності NADPH [3]. Вміст відновленого глутатіону визначали за рівнем утворення тіонітрофенільного аніону в результаті взаємодії SH-груп глутатіону з 5,5-дитіобіс, 2-нітробензойною кислотою [3]. Одержані цифрові дані обробляли статистично за допомогою комп'ютерної програми «Statistika». Для визначення вірогідних відмінностей між середніми величинами використовували критерій Стьюдента.

Досліджуючи вміст продуктів пероксидного окиснення ліпідів було виявлено зростання їх вмісту у печінці та підшлунковій залозі тварин ІІ групи порівняно з контрольною групою. Зокрема, у підшлунковій залозі вміст ГПЛ вірогідно зріс у 2 рази стосовно І групи (табл. 1). Можливо це пов'язано з активацією процесів ліпопероксидації за умов гіперглікемії. Проте за умов додавання цитрату цинку було відмічено вірогідне зниження вмісту ГПЛ в 1,2 рази у підшлунковій залозі щурів!V дослідної групи, однак зростання в 1,4 рази у ІІІ групі відносно ІІ.

При визначенні вмісту ТБК-активних продуктів було відмічено вірогідне їх зростання в тканинах печінки та підшлункової залози щурів ІІ дослідної групи відносно контрольної групи, відповідно в 1,4 і 1,9 раза. Високий вміст продуктів ПОЛ у тканинах щурів за експериментального цукрового діабету, очевидно, пов'язаний з послабленням зв'язування інсуліну з рецепторами на поверхні клітин. Це призводить до гіперболічної дії антагоніста інсуліну - кортизолу, який посилює процеси пероксидації ліпідів і пригнічує функціонування системи антиоксидантного захисту. Однак в тканинах щурів тварин ІІІ та!V груп спостерігалося зниження вмісту ТБК-активних продуктів. Зокрема, їх вміст знижувався у печінці тварин!V дослідної групи в 1,4 рази та підшлунковій залозі тварин ІІІ та!V груп, відповідно в 1,3 і 2,5 раза стосовно ІІ групи. Це може бути пов'язано з здатністю цинку стимулювати експресію металопротеїнів у тканині підшлункової залози, які, як відомо, акумулюють гідроокисні радикали та можуть потенційно запобігти деструкції бета- клітин.

Антиоксидантна система (АОС) організму захищає його тканини і клітини від ушкодження вільними радикалами, які безперервно утворюються в живому організмі, а також сприяє відновленню функціонування обмінних процесів. Процеси ПОЛ та функціонування АОС добре збалансовані та працюють за принципом зворотного зв'язку: збільшення рівня антиоксидантів призводить до гальмування вільнорадикального окиснення, а це, у свою чергу, змінює властивості самих ліпідів: у них з'являються легкоокисні фракції, що прискорює процес ПОЛ. При цьому витрачається багато ендогенних антиоксидантів і система повертається до вихідного рівня. Така динамічна рівновага ПОЛ та АОС у біологічних мембранах і рідинах притаманна всім рівням організації живих систем, і є одним із основних показників нормального гомеостазу.

Таблиця 1. Вміст продуктів ПОЛ у тканинах щурів з ЕЦД та за пливу цитрату цинку в кількостях 20 і 50 мг/кг маси тіла (М±т; n=7)

Гідропероксиди ліпідів, ОЕ/ г

ТБК-активні продукти, нмоль/ г

Таблиця 2. Активність супероксиддисмутази та каталази у тканинах щурів з ЕЦД та за пливу цитрату цинку в кількостях 20 і 50 мг/кг маси тіла (М±т; n=7)

Головна роль в антиоксидантному захисті клітин відводиться - супероксиддисмутазі, яка, дис- мутуючи супероксидний аніонрадикал, перетворює його в менш реакційноспроможний пероксид гідрогену. СОД безпосередньо забезпечує обрив віль- норадикальних реакцій у клітинах аеробних організмів на так званій «нульовій» стадії вільнорадика- льного окислення [8, 12]. Відомо, що активність антиоксидантних ензимів за умов хронічної гіперглікемії може знижуватися внаслідок їх неензимати- чного глікозилювання [8, 12].

Дані наших досліджень свідчать про вірогідне зниження активності СОД в 2,4 раза у підшлунковій залозі щурів \\ групи за ЕЦД та невірогідне зниження в тканині печінки. Активність ензиму вірогідно зростала у печінці тварин \\\ і \V груп та знижувалася у підшлунковій залозі тварин \\\ групи у порівнянні з показниками тварин \ групи. У порівнянні з показниками активності СОД у тварин \\ групи виявлено достовірне підвищення активності цього ензиму у тварин \\\ групи, зокрема у печінці - на 41%, підшлунковій залозі - на 87%, а в \V групі, відповідно на 65% і 116%. Дану закономірність можна пояснити тим, що СОД - ензим, який у своєму складі містить цинк, тому навіть за ЕЦД, але при додатковому випоюванні сполуки цинку встановлено підвищення його активності.

Активність каталази в підшлунковій залозі щурів дослідних груп вірогідно зростала, зокрема, спостерігалося вірогідне зростання активності КТ у тварин \\, \\\ і \V груп, відповідно в 1,3 1,5 і 2,1 раза у порівнянні з показниками контрольної групи. У тварин \\\ і \V груп спостерігалося зростання активності ензиму, відповідно в 1,2 і 1,6 раза у порівнянні з показниками \\ групи.

У печінці виявлено вірогідне зростання активності КТ лише в \V групі в 1,3 раза у порівнянні з показниками тварин І групи.

Функціонування різних компонентів АОС тісно пов'язане з окремими ланками клітинного метаболізму. Насамперед це стосується активності глута- тіонпероксидази, ключового ензиму АОС в організмі тварин. Так, у ІІ групі спостерігалося вірогідне зниження даного ензиму відносно І групи (контрольної) в тканині печінці - в 1,4 раза та у підшлунковій залозі - в 1,3 раза. Крім цього, у печінці тварин виявлено зниження активності цього ензиму в 1,3 раза - в \\\ групі та зростання в 1,2 раза - у \V групі, порівняно із контрольною групою.

Таблиця 3. Активність глутатіонної системи в тканинах щурів з ЕЦД та за пливу цитрату цинку в кількостях 20 і 50 мг/кг маси тіла (М±т; n=7)

Однак, стосовно тварин ІІ групи з ЕЦД виявлено зростання активності ГП у печінці тварин IV групи в 1,7 раза та підшлунковій залозі ІІІ і!V груп в 1,2 раза. Ці дані свідчать про пряму залежність між вмістом цинку в раціоні та активністю ГП у тканинах щурів.

Глутатіонредуктаза - широко поширений фла- вінових ензим, що підтримує високу внутрішньоклітинну концентрацію відновленої форми глутатіону. Для відновлення окисненого глутатіону ГР в якості донорів гідрогену використовує НАДФН, який утворюється в пентозофосфатному шляху у глюкозо-6- фосфатдегідрогеназній реакції [2].

При дослідженні активності ГР в тканині печінки цей ензим був вірогідно нижчий майже в 2 рази відносно контролю в ІІ та ІІІ групах (табл. 3). Проте, у тварин!V дослідної групи у тій же тканині активність ГР була вища у 2,2 раза порівняно з ІІ (діабетичною) групою.

Активність ГР у підшлунковій залозі вірогідно менша в ІІ групі на 29,3% та!V - на 12,7% відносно контрольної групи. Однак, порівняно з ІІ групою активність цього ензиму у!V групі більша в 1,2 раза.

Як відомо, цинк відіграє важливу роль у діяльності підшлункової залози, процесах зв'язування інсуліну з гепатоцитами, синтезі ліпопротеїнів. Внаслідок його нестачі порушується толерантність організму тварин до глюкози.

З джерел літератури відомо, що вміст відновленого глутатіону зменшується порівняно з нормою за умов стрептозотоцинового діабету [19]. Подібне зниження вмісту відновленого глутатіону ми спостерігали у печінці (в 2,6 рази) та підшлунковій залозі (в 2 рази) щурів ІІ групи порівняно з контрольною. У той час відмічено вірогідне зростання вмісту відновленого глутатіону у печінці тварин ІІІ групи - в 3,6 раза та в IV групи - у 3,1 раза, а також у підшлунковій залозі тварин ІІІ групи - в 1,2 раза та IV групи - в 1,5 раза порівняно до ІІ групи.

Отримані результати вказують, що цитрат цинку, який додавали до раціону щурів, зумовлює послаблення процесів пероксидації ліпідів у досліджуваних тканинах за рахунок активації системи антиоксидантного захисту. Завдяки його антиоксидантним властивостям він може використовуватися як компонент біологічно активних добавок з метою профілактики діабету, що і стане метою подальших досліджень.

Література

цитрат цинк антиоксидантний діабет

1. Patent 1084681 SSSR, MKI G 01N 33/48. Sposob opredeleniya gidroperekisey lipidov v biologicheskikh tkan- yakh / Mironchik VV (SSSR). № 3468369/2813; zayavl. 08.07.82; opubl. 07.04.84, byul. № 13. [Russian].

2. Ataullakhanov FI, Zhabotinskiy AM, Pichugin AB. Zavisimost skorosti funktsionirovaniya pentoznogo puti v eritrotsi- takh ot stepeni vosstanovlennogo glutationa. Biokhimiya. 1981; 46 (3): 530-40. [Russian].

3. Vlizlo VV, Fedoruk RS, Makar IA, ta in. Dovidnik: Fiziologo-biokhimichni metodi doslidzhen u biologiyi, tvarinnitstvi ta veterinarniy meditsini. Lviv: Vidavnitstvo «VMS», 2004. 399 s. [Ukrainian].

4. Dubinina EE, Salnikova LA, Efimova LF. Aktivnost i izofermentnyy spektr superoksiddismutazy eritrotsitov i plazmy krovi cheloveka. Laboratornoe delo. 1983; 10: 30-3. [Russian].

5. Korobeynikova EN. Modifikatsiya opredeleniya POL v reaktsii s TBK. Laboratornoe delo. 1989; 7: 8-10. [Russian].

6. Korolyuk MA, Ivanova LI, Mayorova IG, Tokarev VE. Metod opredeleniya aktivnosti katalazy. Laboratornoe delo. 1988; 1: 16-8. [Russian].

7. Moin VM. Prostoy i spetsificheskiy metod opredeleniya aktivnosti glutationperoksidazy v eritrotsitakh. Laboratornoe delo. 1986; 12: 724-7. [Russian].

8. Stefanov AV, Derimedved LV, Churilova IV, i dr. Klinikoeksperimentalnoe obosnovanie primeneniya preparatov superoksiddismutazy v meditsine. Kharkov: Izd-vo NFaU «Zolotye stranitsy», 2004. 288 s. [Russian].

9. Bun SD, Guo YM, Guo FC, Ji FJ, Cao H. Influence of organic zinc supplementation on the antioxidant status and immune responses of broilers challenged with Eimeria tenella Poultry Science. 2011; 90 (6): 1220-6. DOI: 10.3382/ ps.2010-01308.

10. Eizirik DL, Darville MI. Beta-cell apoptosis and defence mechanisms: lesions from type 1 diabetes. Diabetes. 2001; 50 (Suppl 1): 64-9.

11. Greenblatt HM, Feinberg H, Tucker PA, Shoham G. Carboxipeptidase A: native, zinc-removed and mercury- replaced forms. Acta CrystallogrD Biol Crystallogr. 1998; 54 (Pt 3): 289-305.

12. Recent Advances and Clinical Application. Abstracts. International conference on Superoxide Dismutase. Institut Pasteur. Paris, May 1-15, 1998. 125 р.

13. Kambe T, Yamaguchi-Iwai Y, Sasaki R, Nagao M. Overview of mammalian zinc transporters. Cell Mol Life Sci. 2004; 61: 49-68. DOI: 10.1007/s00018-003-3148-y.

14. Krebs NF. Overview of zinc absorption and excretion in the human gastrointestinal tract. J Nutr. 2000; 130: 1374-7.

15. Kulikowska-Karpinska E, Moniuszko-Jakoniuk J. Lead and Zinc Influence on Antioxidant Enzyme Activity and Malondialdehyde Concentrations. Polish Journal of Environmental Studies. 2001; 10 (3): 161-5.

16. Marcellini F, Giuli C, Papa R, et al. Zinc status, psychological and nutritional assessment in old people recruited in five European countries: Zincage study. Biogerontology. 2006; 7 (5-6): 339-45.

17. McClain CJ, The pancreas and zinc homeostasis. J Lab Clin Med. 1990; 116: 275-6.

18. Powell SR. The Antioxidant properties of zinc. J Nutr. 2000; 130: 1447S-54S.

19. Raza H, Prabu SK, John A, Avadhani NG. Impaired mitochondrial respiratory functions and oxidative stress in strepto- zotocin-induced diabetic rats. International Journal of Molecular Sciences. 2011; 12 (5): 3133-47. doi: 10.3390/ ijms12053133

20. Tate DJ, Miceli MV, Newsome DA. Zinc protects against oxidative damage in cultured human retinal pigment epithelial cells. Free Radic Biol Med. 1999; 26: 704-13.

Размещено на Allbest.ru