Технологический регламент получения культуры клеток ежовника обыкновенного - продуцента антитрихофитозного препарата "Антилишай"

Размещено на http://www.allbest.ru/

Технологический регламент получения культуры клеток ежовника обыкновенного - продуцента антитрихофитозного препарата "Антилишай"

Андреева А.П.

г. Караганда

На сегодняшний день лекарственные средства растительного происхождения являются наиболее востребованными, что объясняется как их высокой эффективностью, так и экологической безопасностью их применения и производства. Биотехнологическое направление разработки способов получения растительных БАВ является наиболее перспективным, что объясняется, помимо технологического аспекта, соображениями экологического плана - многие растения-продуценты БАВ являются редкими и эндемичными.

Методическая база биотехнологии лекарственных растений значительно обогатилась за последние годы за счет разработки таких методов, как использование иммобилизованных растительных клеток и ферментов. Однако традиционные методы поверхностного и глубинного культивирования растительных клеток остаются основой биотехнологии растений. Остаются нерешенными такие проблемы получения биологически активных веществ (БАВ) с помощью растений, как генетическая гетерогенность клеток in vitro, стабильность штаммов-продуцентов и высокая себестоимость биотехнологических производств. Достаточно редки примеры отсутствия зависимости продуктивности растительных штаммов от органного происхождения.

Отдельного упоминания заслуживает направление, связанное с использованием растительных клеток и бесклеточных систем для получения БАВ из веществ-предшественников. Классический пример - использование бесклеточного экстракта некоторых растений для получения фарнезола и бизаболена из мевалоновой кислоты, а также возможность взаимного перехода различных изомерных форм фарнезола.

Обеспечение расширенного производства остродефицитных лекарственных средств биотехнологическими методами требует разработки количественных подходов к выращиванию растительного сырья in vitro. Сформулированные в соответствии с утвержденными нормативными документами, определяющими порядок описания технологии, результаты подобных исследований могут быть представлены регламентами производства биотехнологических продуктов. При этом, необходимо отметить, что лимитирующим фактором ограничивающим продуктивность штаммов различной природы является узкая избирательность физико-химических факторов. Значение биотехнологической разработки получения растительных алкалоидов объясняется их высокой биологической активностью.

В выборе растительного объекта для использования в качестве экспериментальной модели, в процессе культивирования in vitro, и последующего получения штамма-продуцента БАВ, как правило, связано с информацией о его химическом составе и успехами выращивания в условиях in vivo. Растения семейства Chenopodiaceae Less. широко используются в прикладной медицине и являются стратегически важным материалом в биотехнологических лабораториях всего мира как источник БАВ (эфирные масла, пиперидиновые алкалоиды, сапонины, сальсолин, сальсолидин и др.).

Алкалоиды анабазин и лупинин синтезируются Anabasis aphylla L. (A. aphylla L.). Они являются главной частью оснований технического анабазин-сульфата, который вырабатывается Чимкентским химико-фармацевтическим заводом как средство борьбы с сельскохозяйственными вредителями. Анабазин и лупинин -- доступные исходные продукты для разнообразных синтезов. Неодревесневшие зеленые побеги (трава) A. aphylla содержат 2,0-4,0% (до 12,0%) алкалоидов: анабазин, афиллин, афиллидин, лупунин, оксиафиллин, оксиафиллидин и др. Главным из алкалоидов является анабазин - бесцветная густая жидкость; легко растворим в воде и обычных органических растворителях, дает кристаллические соли с минеральными и органическими кислотами. В растении находится преимущественно в виде щавелево-кислой соли. Содержание анабазина в сумме алкалоидов составляет 60,0%, варьируя от 5,0 до 95,0%. В сырье анабазина содержится 1,7-2,0%, иногда до 7,0%. К осени содержание анабазина по мере одревеснения черенков снижается, но остается еще довольно высоким вплоть до заморозков. Ядовитость растения обусловлена наличием в нем анабазина. Все алкалоиды A. aphylla хорошо растворимы в воде, органических растворителях. Кроме того, в анабазине содержатся органические кислоты (от 13 до 26%), в том числе щавелевая (7-17%), пектиновые вещества (17-20%). Растение богато золой (до 20%), в которой содержится 14% калия, 16% натрия, много редких элементов.

Алкалоид анабазин обладает сильным инсектицидом контактного действия. В виде водных растворов (анабазин сульфата) или дуста он используется против различных насекомых вредителей сельскохозяйственных культур. Применение анабазина в быту ограничено, из-за его высокой токсичности и способности проникать через неповрежденную кожу и слизистые. По фармакологическим свойствам анабазин близок к никотину, цитизину и лобелину и относится к группе ганглионарных ядов. В малых дозах он возбуждает центральную нервную систему, рефлекторно усиливает дыхание, повышает артериальное давление, возбуждает ганглии вегетативной нервной системы. В больших дозах оказывает угнетающее и парализующее действие. В лечебных целях анабазин применяется, как действующее вещество для приготовления служит сырьем для получения никотиновой кислоты. Путем химической модификации молекулы анабазина получили новое его производное, которое проявило высокую активность против стригущего лишая. Лекарственная форма получила название линимент «Антилишай» регистрационное удостоверение № РК-ВП-0-4-0012-03.

Создание новых отечественных высокоэффективных лекарственных средств и сельскохозяйственных препаратов (ветеринарные средства, витаминные добавки, инсектицидные средства и т.д.) нового поколения требуют новых подходов в развитии технологии, поиска фундаментальных незамедлительных решений использования исходного сырья полученного биотехнологическим методом.

Лупинин в чистом виде не применяется, служит сырьем для получения хлористо-водородного лупикаина, применяющегося в качестве средства для местной анестезии. Анестезирующее действие хлористо-водородного лупикаина значительно превосходит действие кокаина и новокаина. Анабазин может служить сырьем для получения никотиновой кислоты.

Последовательность задач, изучения биосинтетических возможностей культуры тканей A. aphylla, предусматривала первичный отбор наиболее продуктивных линий по ростовому индексу (РИ) и содержанию анабазина. Для выбора оптимального донорного растения были отобраны семена 41 морфологически разных форм A. aphylla.

Для получения культуры клеток использовали, семенной материал с опытного поля РГП «Юго-Западного научно-производственного центра сельского хозяйства» г. Шымкент.

Использовались каллусы из эксплантов семядольных листьев, контролировали ростовой индекс (РИ) и анализировали количество анабазина на 30 сутки культивирования. Как видно из результатов эксперимента приведенных в таблице 1, наиболее продуктивными, как по приросту биомассы, так и по синтезу анабазина, формами донорных растений являются - 4, 11, 95, 129, 131. Хотя формы 3, 27, 38 имеют хороший ростовой индекс, однако уровень содержания анабазина в них очень низкий. Формы 17, 34, 34(а), 378 имеют, напротив высокий уровень анабазина, но низкий ростовой индекс.

Отмечено, что способность к биосинтезу анабазина каллусных тканей напрямую зависит от продуктивности донорных растений. Это, скорее всего, свидетельствует о том, что уровень биосинтеза анабазина у A. aphylla является генетически детерминированным признаком и факторы, способствующие каллусообразованию, незначительно влияют на экспрессию генов ответственных за синтез веществ пиперидинового ряда, и в данном случае, на синтез алкалоида анабазин.

Таким образом, на основе полученных данных отобрана форма № 95 с оптимальными ростовыми и продукционными показателями для дальнейших работ по изучению возможности получения анабазина биотехнологическими методами.

Таблица 1. Способность к росту каллусной ткани и синтезу анабазина морфологически различных форм A. aphylla

Анализ степени накопления анабазина тканевыми линиями различного происхождения с различными морфогенетическими возможностями показал, что наиболее высоким уровнем биосинтеза анабазина обладают эмбриогенные линии полученные из листовых протопластов. Также достаточно высокий уровень синтеза имеют линии семядольного происхождения, как из протопластов, так и в случае использования самих семядольных листьев, в качестве эксплантов (рис. 1).

Поскольку в интактном растении не наблюдается формирования специальных хранилищ высокого порядка, и пиперидиновые алкалоиды, в состав которых входят и афиллин, накапливаются в A. aphylla в основном в межклеточниках, можно объяснить способность накапливать анабазин активно пролиферирующими слабо дифференцированными тканями. И поскольку большее количество лизина, который является предшественником пиперидиновых оснований, накапливается при более высокой дифференциации, можно предположить, что увеличивается и синтез анабазина в таких эмбриогенных каллусах.

Продуктивность донорных растений A. aphylla определяет способность к синтезу анабазина у каллусных тканей и на этой основе отобрана линия №95, отличающаяся удовлетворительным уровнем накопления анабазина и ростовым индексом. Также для увеличения биосинтетических возможностей необходимо отобрать эмбриогенную автотрофную ткань, которая получается при использовании в качестве эксплантов протопластов, семядольных и настоящих листьев на среде, где в качестве фитогормонов используют 2,4-Д - 2 мг/л и кинетин - 0,2 мг/л. Тем не менее следует отметить, что использование в качестве исходного материала изолированных протопластов невыгодно из-за усложнения технологического процесса.

Для выбора оптимального состава среды культивирования была использована, в качестве основы, стандартная среда Мурасиге - Скуга. При планировании и анализе процесса оптимизации состава питательной среды использовали оригинальную методику построения многомерных моделей на ЭВМ по программе ANETR21.

анабазин растительный тканевой биологический

Рисунок 1

На выходе программа, кроме аналитического характера частных связей, дает их графики, оценку надежности, ранжирует факторы по силе воздействия на результат, позволяет выделить существенно влияющие факторы. Графики частных связей позволяют проводить оптимизацию процесса без применения специального математического аппарата.

Анализ изменения среднеквадратичного отклонения (СКО) исследуемых факторов показал, что его средние показатели лежат в рамках допустимых изменений. Полученные данные указывают на то, что созданная модель может считаться удовлетворительной и факторы 1,2,3 соответственно KH₂РO₄, NH₄NO₃, KNO₃ влияют более сильно на рост и синтез анабазина в культуре клеток A. aphylla. В то же время нельзя утверждать, что СaCl₂ и MgSO₄ вообще не влияют или слабо влияют на рост каллусной ткани. Данные анализа указывают только на более сильное влияние азотного, фосфорного и калийного питания.

По результатам эксперимента, мы можем с высокой достоверностью утверждать, что максимального ростового индекса можно достигнуть при содержании KNO₃ - 3800 мг\л, NH₄NO₃ - 1600 мг\л и KH₂PO₄ - 340 мг\л, MgSO₄ -370мг/л и СaCl₂ - 440 мг/л.

По результатам проведенного анализа отмечено также, что снижение в среде концентраций азот- и фосфорсодержащих элементов приводит к подавлению роста и к увеличению синтеза анабазина в культуре каллусной ткани A. aphylla. Увеличение содержания сульфата магния в культивационной среде приводит к увеличению синтеза анабазина.

Таким образом, выявленные особенности минерального питания каллусной ткани A. aphylla показывают, что активный прирост биомассы в основном зависит от соотношения нитратного и аммонийного азота. При этом более предпочтительно преобладание нитрата и увеличение общего уровня фосфатов и ионов калия. Увеличение уровня накопления анабазина, которое наблюдается при ощутимом снижении основных минеральных компонентов среды, вероятно, связано со стрессовым характером дефицита минерального питания.

Изучение влияния витаминов на рост культуры каллусной ткани A. aphylla и синтез анабазина показал, что отсутствие их в составе среды не вызывает кардинального изменения роста каллусной массы. Влияние глицина на увеличение синтеза анабазина показывает, что данная аминокислота является одним из факторов активизирующих биосинтез анабазина. Вероятно, необходимо дальнейшее, более детальное изучение путей ассимиляции глицина на предмет включения его в состав анабазина, что является одной из задач наших дальнейших исследований.

При исследовании влияния углеводного питания выявлено, что в качестве источника углерода наиболее приемлема сахароза, и ее оптимальной концентрацией в среде для максимального роста можно считать 3 %, а снижение уровня сахарозы до 0.75 % приводит к увеличению содержания анабазина.

На основе полученных данных определен оптимальный состав среды культивирования для роста каллусной ткани A. aphylla и синтеза анабазина (табл. 2).

Таблица 2. Оптимальный состав питательной среды Мурасиге-Скуга для культуры ткани A. aphylla

Размещено на Allbest.ru