Определение качественного и количественного содержания биологически активных веществ сухого экстракта виноградных косточек

Размещено на http://www.allbest.ru/

Южно-Казахстанская государственная медицинская академия,

г. Шымкент

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ СУХОГО ЭКСТРАКТА ВИНОГРАДНЫХ КОСТОЧЕК

Б.А. Сагиндыкова проф.,

Р.М. Анарбаева доц.,

Д.С. Исабекова

АННОТАЦИЯ

сухой экстракт виноградный косточка

В результате экспериментального исследования подобраны оптимальные условия определения качественного и количественного определения биологически активных веществ сухого экстракта виноградных косточек.

Т?ЙІН

Эксперименталды зерттеу н?тижесінде ж?зім д?ндеріні? ??р?а? экстрактісіндегі биологиялы? белсенді заттарды? сапалы? ж?не санды? к?рсеткіштерін аны?тауды? оптималды жа?дайлары келтірілген.

ANNOTATION

During the experimental research optimal conditions of identifying qualitative and quantitative definition of biologically active substances of dry grapes pip extract were selected.

Гидрофильные биологически активные компоненты виноградных косточек представляют собой соединения фенольной природы, представленные большой группой производных кумариновой кислоты. В их состав входят простые фенолы, кумарины и их производные, лигнины, гидролизуемые танины, конденсированные танины, флавоны, флавоноиды, антицианиды и их производные. Наибольшей биологической активностью обладают конденсированные танины, называеваемые также олигомерами проантицианида или пикногенолами [1-5].

Целью данного исследования явилось определение качественного и количественного содержания биологически активных веществ сухого экстракта виноградных косточек.

Определение показателей качества сухого экстракта проводили по методикам ГФ XI издания на 5 сериях, полученных по разработанной нами технологической схеме. Для характеристики сухого экстракта предложены следующие показатели: внешний вид, подлинность, потеря в массе при высушивании, сульфатная зола, тяжелые металлы, остаточное количество спирта этилового, рН 1% раствора, содержание дубильных веществ и полифлаванов.

Качественный анализ сухого экстракта виноградных косточек.

0,1 г препарата растворяли в 10 мл 30% раствора спирта этилового, тщательно перемешивали. На фильтровальную бумагу наносили несколько капель полученного спиртового раствора препарата, подсушивали и опрыскивали 1% раствором железоаммониевых квасцов или 2% раствором железа окисного хлорида; появилось серое окрашивание (гидролизуемые дубильные вещества пирогаллоловой группы.

К 0,1 г препарата прибавляли 10 мл 6% раствора кислоты хлороводородной в спирте этиловом 96 % и нагревали в колбе с обратным холодильником в кипящей водяной бане в течение 20 минут. После охлаждения наблюдалось выпадение темно-коричневого осадка флобафена и образование красного красителя (проантоцианидины).

К 0,1 г препарата прибавляли 5 мл 1% раствора ванилина в концентрированной кислоте хлороводородной. Образовалось красно- малиновое окрашивание (катехины, производные флороглюцина и резорцина).

0,1 г препарата растворяли в 10 мл 30% раствора спирта этилового, тщательно перемешивали, добавляли 5-7 капель концентрированной кислоты хлороводородной и 10-15 мг металлического Mg или Zn, через 3-5 минут наблюдалось красное, оранжевое, розовое окрашивание. Для ускорения реакции и усиления окраски подогрели реакционную смесь 2-3 минуты на кипящей водяной бане (цианидиновая реакция).

Потеря в массе при высушивании.1 г препарата (т. н.) сушили при температуре 100-105 ⁰С в течение 5 часов. Потеря в массе не должна превышать 10 %.

рН 1 % раствора в 30 % этиловом спирте определяли потенциометрическим методом (ГФ ХI , 1 вып., С. 115). Значение рН раствора составляет от 4,5 до 6,5.

Сульфатная зола.Сульфатная зола из 1 г препарата (т. н.) должна быть не более 15%.

Тяжелые металлы.Сульфатная зола из 1 г препарата (т. н.) должна выдерживать испытания на тяжелые металлы (не более 0,001 % , ГФ ХI, вып. 1, С. 165).

Остаточное количество органических растворителей (спирта этилового). Для определения остаточного количества спирта этилового в экстракте виноградных косточек использовали метод «внутренней» стандартизации по спирту пропиловому с пламенно-ионизационной детекцией.

Для получения «внутреннего» стандарта 0,2 мл спирта пропилового растворяли в 200 мл воды очищенной.

0,1 мл спирта этилового растворяли в 100 мл раствора «внутреннего» стандарта - раствор модельной смеси анализируемых компонентов в растворе «внутреннего» стандарта, используемый для нахождения коэффициента пересчета.

1 мкл полученной смеси вводили в газовый хроматограф, получая не менее 3 хроматограмм.

Порядок выхода компонентов на хроматограмме: этиловый спирт, пропанол.

Хроматографирование проводили на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Колонка из нержавеющей стали 2400 х 3 мм, заполненная сорбентом 15 % Reoplex - 400 на хроматоне N-AW зернением 0,16-0,20 мм, температура термостата колонки 100⁰С, температура испарителя 110⁰С, температура детектора 110⁰С, давление газа-носителя азота 0,35·10⁵-0,40·10⁵Па, скорость водорода 40 мл/мин, воздуха 400 мл/мин, скорость ленты самописца 1,5 мм/мин.

По соотношению площадей пиков компонентов модельной смеси вычисляли калибровочный коэффициент (К) для спирта этилового (пересчет по отношению к спирту пропиловому):

К =

где S₀ - среднее значение площадей пиков спирта пропилового в мм²;

S₀ - среднее значение площадей пиков спирта этилового в мм²;

V₀ - объем спирта пропилового, израсходованного на приготовление раствора внутреннего стандарта, в мл (0,2 мл);

V_i - объем спирта этилового, израсходованного на приготовление модельной смеси, в мл (0,1 мл);

P₀ - плотность спирта пропилового в г/см³

P_i - плотность спирта этилового в г/см³.

0,5 г (т. н.) растертого препарата растворяли в 10 мл раствора внутреннего стандарта. 1 мкл полученного раствора вводили в газовый хроматрограф. Снимали хроматограмму в условиях хроматографирования модельной смеси.

По соотношению площадей пиков компонентов испытуемого раствора вычисляли содержание спирта этилового в препарате в процентах (Х):

Х =К

где К - калибровочный коэффициент определяемого компонента (спирта этилового);

S₀ - среднее значение площадей пиков спирта пропилового в миллиметрах квадратных;

S_i - среднее значение площадей пиков спирта этилового в мм²;

V₀ - объем спирта пропилового, израсходованного на

приготовление раствора внутреннего стандарта, в мл (0,2 мл);

P₀ - плотность спирта пропилового в г/см³

m - масса навески препарата в г.

Содержание спирта этилового в препарате должно быть не более 0,5%.

Данные показателей качества сухого экстракта семян винограда представлены в таблице 1.

Таблица 1. Показатели качества сухого экстракта семян винограда

Количественное определение дубильных веществ. В ГФ XI изд. (т.1)основным методом определения дубильных веществ является перманганатометрии (на все виды сырья, содержащие дубильные вещества). Но данная методика дает завышенные результаты, поскольку в сложной композиции биологически активных веществ в фитопрепаратах‚ наряду дубильными веществами‚ содержится обширная группа фенольных соединений‚ принимающих участие в окислительно-восстановительной реакций [6]. А.С.Бейсенбековым с соавторами проведены исследования по сравнению существующих методов количественного определения дубильных веществ: перманганатометрический‚ железо-тартратный и комплексонометрический. Полученные результаты позказывают‚ что содержание дубильных веществ‚ полученных перманганатометрическим методом‚ можно считать как содержание суммы фенольных соединений‚ вступающих в окислительно-восстановительные процессы. Результаты же комплексометрического метода‚ можно считать именно за истинное содержание дубильных веществ‚ так как данный метод более избирателен и точен. В расчете дубильных веществ учитывается только один коэффициент - гидролизуемых дубильных веществ‚ тогда как в лекарственных растениях присутствуют два типа вместе‚ т.е. и гидролизуемые‚ и конденцированные‚в разном количественном соотношении [7‚8]. Нами модифицирована эта методика для определения гидролизуемых дубильных веществ в сухом экстракте виноградных косточек и приведена в проекте ВФС «Сухой экстракт виноградных косточек».

Методика определения.1 г препарата (т. н.) тщательно растертого препарата помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, при слабом нагревании (35-40 ⁰С) растворяли в спирте этиловом 30 % и доводили объем раствора в колбе тем же спиртом до метки.

10 мл полученного раствора помещали в пробирку для центрифугирования и прибавляли 10 мл реактива осаждения. Смесь центрифугировали в течение 30 минут с частотой вращения 3000 об/мин. Жидкость с осадка сливали, к осадку в пробирке прибавляли 25 мл 0,025 % раствора аммония гидроксида и центрифугировали при тех же условиях в течение 15 минут.

После центрифугирования промывную жидкость сливали, осадок в пробирке растворяли в 3 мл 30 % раствора кислоты уксусной, количественно с помощью 80-100 мл воды очищенной переносили в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 25 мл 5 % раствора натрия гидрокарбоната и титровали 0,01 М раствором трилона Б до желтого окрашивания (индикатор - 0,5 мл ксиленолового оранжевого).

Содержание дубильных веществ в пересчете на танин в сухом препарате в процентах, вычисляли по формуле:

Х =

где V - объем 0,01 М раствора трилона Б, израсходованного на титрование в мл;

К - поправочный коэффициент к молярности 0,01 М раствора трилона Б;

m - масса навески препарата в г;

W - потеря в массе при высушивании в процентах;

0,0013 - количество танина, соответствующего 1 мл 0,01 М раствора трилона Б, в г.

Содержание дубильных веществ в пересчете на танин в препарате должно быть не менее 20,0 % в пересчете на сухое вещество.

Результаты количественной оценки содержания дубильных веществ в различных образцах свидетельствуют, что в качестве нижнего предела можно рекомендовать показатель 20%.

Количественное определение полифлаванов (конденсированные дубильные вещества). Известен способ определения полифлавана (конденсированные дубильные вещества) из растительного сырья титрометрическим методом - перманганатом калия в присутствии индигосульфокислоты. Недостатком этой методики является не точность из-за того‚ что перманганат калия окисляет и другие органические вещества и результаты получается завышенными [9].

Известен также способ количественного определения полифлавана в растительном сырье‚ основанный на реакции взаимодействия полифлавана с ванилином. Недостатком приведенного метода является завышенные результаты‚ из-за того‚ что в качестве стандарта выбран танин‚ который не является конденсированным дубильным веществом [10]. Г.Ш. Бурашевой разработан новый спектрофотометрический способ количественного определения полифлавана‚ позволяющий сократить время определения конечного продукта и получить более точные результаты. В методике ею использована способность полифлаванов при действии минеральных кислот превращаться в красящие вещества. Этим свойством обладают димеры‚тримеры‚ полимерные проантоцианидины (полифлаваны) [11]. Нами количественное определение полифлаванов в сухом экстракте семян винограда проведено спектрофотометрическим методом.

Методика определение. 0,1 г препарата (т. н.) тщательно растертого препарата помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл 6 % кислоты хлороводородной в спирте этиловом 96 %, колбу присоединяли к обратному холодильнику, помещали в кипящую водяную баню и нагревали в течение 15 минут при тщательном помешивании.

Полученный раствор фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора 6% раствором кислоты хлороводородной в спирте этиловом 96 %, до метки и перемешивали. 1 мл полученного раствора разбавляли спиртом этиловым 96 % до 10 мл.

Измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 550 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 96 %.

Содержание полифлаванов в препарате в процентах (Х) вычисляли по формуле:

Х =

где С - содержание полифлаванов в препарате, найденное по калибровочному графику, в мг/мл;

m - масса навески препарата в г;

W - потеря в массе при высушивании в процентах.

Содержание полифлаванов в препарате должно быть не менее 15,0% в пересчете на сухое вещество.

В качестве нижнего предела содержания полифлаванов в сухом экстракте виноградных косточек рекомендован показатель 15%.

Результаты определения дубильных веществ и полифлаванов сухого экстракта виноградных косточек представлены в таблице 2.

Таблица 2. Метрологические характеристики количественного определения дубильных веществ и полифлаванов сухого экстракта виноградных косточек

Метрологические характеристики разработанных методик анализа свидетельствуют, что ошибка единичного определения в сухом экстракте семян винограда составляет ±1,13 и ±1,41 %.

ВЫВОД

1. Разработана методика качественного анализа сухого экстракта семян винограда, основанная на обнаружении дубильных веществ, проантоцианидинов, производных катехинов, сульфатной золы, тяжелых металлов, остаточного количества органических растворителей и т.д..

2. Оценка единичного определения содержания дубильных веществ и полифлаванов в сухом экстракте семян винограда с помощью разработанных методик с доверительной вероятностью 95% составляет ±1,13 и ±1,41 % соответственно. В качестве нижнего предела содержания дубильных веществ и полифлаванов в сухом экстракте семян винограда рекомендованы показатели 20 и 15% соответственно.

3. Разработанные методики анализа качественного и количественного определения биологически активных веществ сухого экстракта семян винограда могут быть рекомендованы как основные показатели качества для включения в нормативный документ.

ЛИТЕРАТУРА

1.М.С. Дудкин «Физико-механическая и технологическая характеристика виноградных семян и жмыхов виноградных семян», Одесский технологический институт пищевой промышленности.- Одесса,. 1989 г

2.Алтымышев А.А. Природные целебные средства. - М.: Профиздат, 1991.- С. 81-83.

3.Завражанов В.И., Хмелев К.Ф. Лекарственные растения: лечебное и профилактическое использование. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. - 480 с.

4.Липкан Г.Н. Применение плодово-ягодных растений в медицине. К.: Наукова думка, 1985. - С. 43.

5..S.S. Joshi, C.A. Kuszynski and D. Bagchi The Celluar and Molecular Basis of Health Benefits of Grape Seed Proanthocyanidin Extract. //Current Pharmaceutical Biotechnology- 2001, 2.- 187-200.

6. Н.А.Данилова, Д.М.Попов. Количественное определение дубильных веществ в корнях щавеля конского методом спектрофотометрии в спавнении с методом перманганатометрии // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация.- 2004, №2.- С. 179-182.

7. А.С.Бейсенбеков‚ С.И.Алпысбаева. Разработка метода количественного определения дубильных веществ в «Настойке АБС» // Фармацевтический бюллетень.- 2001‚ №12.- С.28.

8. Р.А. Музычкина‚ Г.М. Саякова‚ Д.Ю. Корулькин‚ Ж.А. Абилов. Методы определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах // Фармацевтический бюллетень.- 2004‚ №3.- С.15-16.

9. Государственная Фармакопея XI. -Медицина.- М. 1989 г.- Вып.2.-С. 86-287.

10. Валуйко Г.Г. «Биохимия и технология красных вин» - М. Пищевая промышленность.- 1979.-С.164.

11. Г.Ш. Бурашева. Количественное определение полифлавана в субстанции и в лекарственных формах // Фармацевтический бюллетень.- 2001‚ №11.- С.16-17.

Размещено на Allbest.ru