Применение азидных производных в консервации биологического материала

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Актуальность проблемы.

Известно, что после наступления биологической смерти начинаются естественные процессы постнатального изменения мягких тканей, которые протекают по типу ранних и поздних трупных изменений. Потребность сохранения формы, консистенции, цвета органов и тканей после смерти человека продиктована многими факторами. Основные - гигиенические, эстетические, социальные, психологические и религиозные (Ананьев А.В., 1994; Колосов А.Е., 1994; Автандилов Г.Г., 1994; Томилин В.В., 2006).

С целью сохранения анатомических, патологоанатомических препаратов и бальзамирование трупов выдающихся государственных и религиозных деятелей применялось с древних времен (Бекемайер Р., 2000). Рецепты приготовления большинства консервирующих растворов были засекречены и сведения о них не публиковались в открытой печати, что создавало определенные сложности в их широком применении, а конечный результат ранее используемых технологий прочитывался спустя десятки, сотни и даже тысячи лет (Кузнецов Л.Е. и соавт., 1999; Пальцев М.А. и соавт., 2002).

Актуальной проблемой в современном мире необходимо не только сохранение тел умерших, но и сохранение различных тканей, изъятых из трупа, для проведения дальнейших исследований. Применяемые в настоящее время растворы для фиксации в своем составе как правило имеют токсичный формалин в различных концентрациях (Бектемирова Р.М., Меркурьева Р.В., 1990; Малышев И.И., 1996; Колосов А.Е., Новичков Е.В., 2006; Зеленин Ю.В., 2006).

Одним их новых методов для сохранения биологических образцов, состоящих из мягких тканей, содержащих большое количество воды и быстро подвергающихся распаду (сердце, мозг, печень, легкие, почки, мышцы), является метод пластинации, в процессе которого тканевая вода и часть тканевого жира замещаются полимеризующей смолой - «БИОДАР» (Гедыгушев И.А., Фадеев С.П., 1997; Кузнецов Л.Е. и соавт., 1999).

Этот методический подход используется более чем в 70 институтах Германии и других стран, прост в техническом исполнении, дает всегда положительные результаты, но дорог, не исключает использование формалина и требует специального технического оборудования (Williams T.M., Levine R.J., Blunden P.B., 1984; Баринов Е.Х., Шигеев В.Б., 1998).

В последние годы XX века учеными Боливии и Чили был получен опытным путем тромболитик COMPLUCAD, применяемый для консервации тканей (Фадеев С.П., 1996, 1998; Томилин В.В., 1999). С помощью COMPLUCAD можно получить консервацию до 60 дней в зависимости от различных предлагаемых формул. В этом случае отсутствует формалин, повышается качество биологического материала, препарат является экологически чистым продуктом, но сроки сохранения биологического материала непродолжительны.

Учитывая технические сложности обеспечения процессов фиксации тканей, высокую степень токсичности бальзамирующих растворов, поиск оптимальных и менее опасных для здоровья человека консервантов и путей предотвращения распада тканей крупного биологического материала является чрезвычайно актуальным.

С нашей точки зрения, оптимальное сохранение трупного и операционного материала должен обеспечивать консервант, обладающий способностью ингибировать ферментную активность протеаз не только клеток консервируемых объектов для предотвращения аутолиза, но и ферментных систем микроорганизмов для предупреждения бактериальной инвазии. Оказалось такими консервантами являются солевые растворы азидных производных, неорганических соединений азота. Однако они до сих пор всесторонне не исследованы, что обусловливает перспективность разработок таких химических соединений и связано с требованиями профессиональной экологии.

Отсутствие данных по результатам применения азида натрия в качестве консерванта для крупного биологического материала позволяют считать данное исследование актуальной задачей, решение которой имеет как теоретическое, так и практическое значение (Мешандин А.Г. и соавт., 2006).

Цель исследования: изучить эффективность азидных производных в качестве консервирующего раствора для биологических объектов.

Задачи исследования:

1. Оценить степень сохранности макроскопического вида и микроскопической структуры биологической ткани в условиях фиксации растворами азидов.

2. Представить микробиологическую характеристику азидных производных в предотвращении процессов гниения биологических объектов.

3. Определить токсичность предлагаемого фиксирующего раствора на биологический организм в эксперименте.

4. Рассчитать экономическую составляющую применения азидов в современных условиях.

Научная новизна.

Впервые изучена консервирующая способность азида натрия для крупного биологического материала (получена приоритетная справка Федерального института по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам от 06.02. 2006 года по заявкам на изобретение «Фиксатор биологического материала» (заявка № 2006103522/15 - 003850).

Впервые выявлено, что использование 0,3% и 0,5% растворов азида натрия в солевом растворе позволяет сохранить прижизненную макроскопическую структуру органов, окраску, форму, консистенцию в течение длительного периода времени (до 1,5 лет) и микроструктуру до 60 суток без замены растворов.

Впервые отмечено, что солевой раствор 0,5% азида натрия не оказывает токсического действия через дыхательные пути на организм животных в эксперименте.

Практическая значимость.

Полученные данные о наличии консервирующих способностей азидных производных для биологических объектов позволили провести полную замену формалина и его производных, значительно улучшить качество консервации препаратов, увеличить время хранения учебного музейного материала на морфологических кафедрах Кировской государственной медицинской академии.

Результаты экспериментальных исследований могут быть востребованы в патологоанатомических отделениях больниц и диспансеров, в бюро судебно-медицинской экспертизы для бальзамирования трупов, а также в практике таксидермистов и службами МЧС.

В результате внедрения новых технологий биоконсервантов произойдет оздоровление условий труда, резко снизится степень вредного возникновения последствий работы, как это бывает с формалином, особенно у девушек и женщин репродуктивного возраста. Кроме того, доказано, что растворы азидных производных по современному курсу валют экономически выгоднее в несколько раз формалина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Неорганические производные азота, в частности, растворы азида натрия являются высоко эффективными консервантами крупных биологических объектов.

2. Азидные производные слабой концентрации не обладают летучестью и раздражающим действием, что улучшит качество труда в медицинских учреждениях и повысит уровень усвоения базовых знаний студентами.

3. Низкие экономические затраты на растворы азидов позволяют провести замену формалина как основного биоконсерванта не только для музейных препаратов, но и при фиксации тканей биоптатов и операционного материала больных.

1. Материал и методы исследования

биологический тканевой азидный пластинация

Объектами исследования служили трупный секционный материал человеческих органов (печень, почка, сердце, легкое), фиксация которых осуществлялась не позднее суток после смерти; белые лабораторные мыши массой 19-21 г (5 - опытных, группа №1, 5 - опытных, группа №2, 5 - контрольных) и белые лабораторные крысы массой 150- 170 г (10 - опытных, 10 - контрольных). Забранные кусочки органов или целые органы в танатологическом отделении бюро судебно-медицинской экспертизы Кировской области после промывания под проточной холодной водой сразу помещались в консервирующие жидкости, состоящие из 0,05%, 0,1%, 0,3% и 0,5% растворов азида натрия в физиологическом разбавлении; в физиологический раствор с содержанием Cu+2; в физиологический раствор с содержанием Cr+3; в физиологический раствор с содержанием Hg+2; в 10% раствор формалина. Сроки фиксации в указанных растворах составили 15 месяцев без замены консервирующего состава, но с описанием изучаемых препаратов через каждые 30 дней. При анализе качества фиксации визуально учитывались макроскопические сведения: консистенция, форма, цвет органов на протяжении всего периода наблюдения за объектами (Жданов Д.А., 1955).

Также изучали сохранность гистологических структур (Пермяков А.В., 1994) в сроки до 60 дней и наличие или отсутствие роста микроорганизмов в консерванте и на образцах на протяжении всего времени фиксации (550 дней). Общая характеристика исследованного материала приведена в таблице 1.

Таблица 1. Общая характеристика исследованного материала

Тип материала	Количество (в абс. ед.)
1. Судебно-медицинский материал: -для макроскопических исследований- * почки; *печени; *легкие; *сердца; - для гистологических исследований - * почки; *печени; *легкие; *сердца. 2. Консервирующие растворы: - 0,05% раствор азида натрия; - 0,1% раствор азида натрия; - 0.3% раствор азида натрия; - 0,5% раствор азида натрия; - 10% раствор формалина; - физиологический раствор с содержанием Cu+2; - физиологический раствор с содержанием Cr+3; - физиологический раствор с содержанием Hg+2. 3. Экспериментальный материал: *мыши *крысы 4. Микробиологический материал: - стандартные культуры - *кишечная палочка *протей *стафилококк золотистый - питательные среды - *Эндо * Плоскирева *желчно-солевой агар * мясо-пептонный агар	360 360 360 360 Всего: 1440____ 576 576 576 576 Всего: 2304____ 5 5 5 5 5 5 5 5 Всего: 40_____ 15 20 Всего: 35_____ 4 серогруппы (1 серовар) 1 серовар 1 эковар Всего: 6____ 80 80 80 80 Всего: 320____

С целью объективной оценки результатов исследования о консервирующей способности различных фиксаторов использовали метод цифровой макросъемки фотоаппаратом марки «Niкon» (Согнев А.В., 2003).

Все перечисленные исследования проводились при комнатной температуре (22-24С) в защищенном от света помещении.

Для изготовления гистологических препаратов секционного и экспериментального материала пользовались следующей методикой: после промывки кусочков органов в проточной воде выполнялась проводка в спиртах возрастающей концентрации с 500 до 900 в течение 1,5 суток, затем эти препараты перекладывали в раствор ксилола и помещали в термостат с температурой 370С на 45 минут, далее их переносили в ксилоло - парафиновую смесь тоже помещали в термостат с температурой 370С на 1 час. После чего препараты заливались двумя растворами парафина при температуре 50С, по 1,5 часа в каждом, затем кусочки органов клали в чашки Петри, обрабатывали парафиново-восковой смесью и держали при комнатной температуре до полного застывания массы. Тонкие срезы изготавливали на санном микротоме Юнга и переносили на заранее обезжиренные предметные стекла с белково - тимоловой смесью. В таком виде с целью высушивания выполняли экспозицию препаратов в течение суток при температуре 37С. Депарафинизацию производили в двух растворах ксилола и в каждом в двух растворах 960 спирта, по 7 минут в каждом, и, наконец, в дистиллированной воде до полного удаления спиртовой жидкости с предметного стекла.

Окрашивали срезы гематоксилином Караци в течение 5 секунд и после промывки под проточной водой помещали в эозин (5 секунд) и снова подставляли под проточную воду. На предпоследнем этапе приготовления гистологических препаратов срезы вновь помещали в два раствора 960 спирта, и два раствора ксилола по 2 минуты выдерживая в каждом. После чего на срезы капали канадский бальзам, разбавленный в ксилоле, и накрывали их покровными стеклами (Вайль С.С., 1947; Колосов А.Е. и соавт., 1981). Описание микропрепаратов осуществлялось через двое суток путем просмотра их в микроскопе типа ЛОМО, БИОЛАМ - 1 при увеличении 40Х100 с последующей цифровой микросъемкой гистологических срезов.

Наряду с макроскопическим и гистологическим исследованиями проводилась оценка антибактериальных свойств растворов азида натрия способом микробиологического посева раститрованных от 109 до 102 в контрольном и опытных растворах стандартных культур кишечной палочки, протея, стафилококка золотистого на среды Эндо, Плоскирева, ЖСА и МПА. В качестве жидкой фазы питательных сред использовали 0,3% и 0,5% солевые растворы азида натрия. Раститрованные культуры выдерживали 30 минут перед посевом, перемешивая каждые 10 минут, затем центрифугировали пробирки с опытным и контрольным раствором. Из каждого разведения соответствующего раствора по 0,1 мл высевали на 15 чашек со средой Эндо, на - 15 со средой Плоскирева, на 15 - с ЖСА и на 15 чашек с МПА, которые затем помещали в термостат при температуре 370С на 144 часа. Учет количества выросших колоний осуществляли ежедневно (Воробьев А.А., 2000). Всего предпринято 80 подобных опытов с неизменными результатами. В группе сравнения выявлены высокие антибактериальные свойства 10% формалина, что является известным фактом (Холщевский П.Н., 1893-1894; Крейндель, 1897).

Сравнительное испытание солевых растворов азида натрия и формалина на токсичность (летучесть) производили на здоровых мышах обоего пола массой 19-21 г и белых лабораторных крысах обоего пола массой 150-170 г согласно методике XI-ой Государственной Фармакопеи (1990). За 24 часа до испытаний и во время его проведения животные находились в помещении с постоянной температурой (20-210С). Каждую серию фиксаторов испытывали на 5 мышах: опытная группа животных №1, находящаяся под воздействием паров 10% формалина, другая опытная группа животных №2, находящаяся под воздействием раствора азида натрия с процентным содержанием 0,5% и контрольная группа животных, которая подвергалась воздействию дистиллированной воды.

В опыте на крысах - одна группа (10 особей) находилась под воздействием паров 10% формалина и вторая контрольная группа (10 особей) - под воздействием 0,5% азида натрия.

В опыте №1 - опытный раствор №1 - 10% формалин объемом 100 мл, опытный раствор №2 - солевой раствор 0,5% азида натрия объемом 100 мл, контрольный раствор - дистиллированная вода объемом 100 мл.

Срок наблюдения за животными после помещения их в замкнутое пространство составил 5 суток при комнатной температуре (опыт №1), 30 суток с экспозицией по 4 часа ежедневно (опыт №2), что примерно соответствует 120 - часовому временному интервалу пребывания студентов и персонала медицинских ВУЗов с парами формалина на морфологических кафедрах в течение учебного года.

В опытах на мышах и крысах ежедневно учитывались поведенческие реакции, наличие или отсутствие анорексии, цвет кожных покровов, лишенных волосяного покрова, выпадение и изменение цвета шерсти на протяжении всего опыта, колебания массы животных, гистологические изменения во внутренних органах (печень, почка, сердце, легкое) после забоя особей опытной и контрольной группы обоих экспериментов.

Растворы считались выдержавшими испытания на токсичность (летучесть), если в течение 5-дневного срока наблюдения отсутствовала гибель животных.

В целом, проведено 1269 экспериментов по изучению консервирующих свойств растворов азида натрия. Материалы исследования (всего 4145) обработаны методами параметрической статистики, результаты выражали в виде М+у, а различия оценивали по критерию Стьюдента (Гланц С., 1998); их считали достоверными при р<0,05.

2. Результаты собственных исследований и их обсуждение

Нами установлено, что при использовании азида натрия различной процентной концентрации (0,3%, 0,5%) в физиологическом растворе в качестве консерванта все испытуемые органы сохраняют прижизненный цвет, консистенцию, форму, прочность макроскопической структуры на протяжении всего срока фиксации - 15 месяцев. В то же время при низких концентрациях раствора 0,05% и 0,1% отмечается некоторое изменение цвета органов (Мешандин А.Г. и соавт., 2006).

Органы, фиксированные в 10% растворе формалина, приобретают выраженную плотную консистенцию, неприятный запах и грязно-бурый цвет в результате перехода гемоглобина крови в метгемоглобин уже через 6 часов от начала фиксации, что согласуется с данными литературы (Минаков П.А.,1897). Также зафиксировано заметное уменьшение размеров органов уже на 14 сутки от начала опыта. Такой дубящий эффект, исследователи связывают с изменением структуры белка (Шавловский И.Э.,1898). Сравнительная характеристика консервирующих способностей растворов азида натрия и формалина представлена в таблице 2.

Таблица 2. Сохранность макроструктуры биологического материала в консервирующих растворах

Рас-ры	0,05% р-р азида натрия	0,1% р-р азида натрия	0,3% р-р азида натрия	0,5% р-р азида натрия	10% р-р формалина
Св-ва
Стр-ра органа	норма-я	норма-я	норма-я	норма-я	уменьш-е размеров
Цвет	Светлее обычного	Светлее обычного	обычный	обычный	грязно-бурый
Конси-стенция	норма-я	норма-я	норма-я	норма-я	очень плотная
Антибактериальные св-а	недостаточно	доста-точно	Сильно выражено	Сильно выражено	Сильно выражено
Форма органов	сохранена	сохранена	сохранена	сохранена	уменьшена

Из анализа данных таблицы 2 можно сделать заключение об оптимальной процентной концентрации растворов азида натрия для целей фиксации биологического материала. В частности, 0,05% и 0,1% растворы полностью не обеспечивают удовлетворительную сохранность цвета органов, как было описано ранее, хотя другие учитываемые параметры не изменялись.

В то же время 0,3% и 0,5% растворы азида натрия намного эффективнее сохраняют все наблюдаемые признаки органов на протяжении сроков фиксации 550 суток (Мешандин А.Г. и соавт., 2006).

Сравнительный анализ сохранности учитываемых параметров в фиксирующих растворах - 10% формалина и 0,5% азида натрия представлен в диаграмме 1.

Рис. 1. Сравнительный анализ сохранности цвета, формы и консистенции органов в фиксирующих растворах -10% формалине и 0,5% азиде натрия

Одновременно нами доказано (2304 наблюдения), что при консервации в солевых растворах азидных производных сохраняются тинкториальные свойства гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином: ядра прокрашиваются базофильно, цитоплазма оксифильно, четко выявляется плазмолемма на протяжении 60 суток фиксации (Зайцева О.О. и соавт., 2006).

Сохранность структуры и интенсивности окраски наблюдались в препаратах, приготовленных после фиксации в 10% формалине, на протяжении 60 суток наблюдения.

При проведении микробиологического анализа подтверждено, что антибактериальные свойства выражены в меньшей степени у 0,05% раствора азида натрия, в отличие от растворов с большим процентным содержанием фиксирующего вещества (Ашихмин С.П. и соавт., 2006).

Данные исследований представлены в таблицах 3, 4.

Таблица 3. Результаты количественного учета роста стандартной культуры кишечной палочки на опытном (0,05% азида натрия) и контрольном (стерильном физ-м) растворах, колонеобразующие элементы

Разведения культур	102	103	104	105	106	107	108	109
0,05% азид натрия	Отсутствие роста	3	19	104	478	БКМИКНС	СР	СР
Стерильный физр-р	3 *	43*	399*	БКМИКНС *	БКМИКНС *	СР	СР	СР

Примечание: * - различие в количестве выросших колоний на стерильном физрастворе от раствора 0,05% азида натрия достоверно (р<0,05).

Аналогичные данные присутствовали при посевах золотистого стафилококка на ЖСА и протея на среду Плоскирева и МПА, приготовленных на основе 0,3% и 0,5% растворов азида натрия.

Таблица 4. Результаты количественного учета роста стандартной культуры кишечной палочки на опытном (0,5% азида натрия) и контрольном (стерильном физ-м) растворах, колонеобразующие элементы

Разведения культур	102	103	104	105	106	107	108	109
0,5% азид натрия	Отсутствие роста	Отсутствие роста	Отсутствие роста	Отсутствие роста	Отсутствие роста	2	9	24
Стерильный физр-р	4 *	47 *	428 *	БКМИКНС*	БКМИКНС*	СР*	СР*	СР*

Примечание: * - различие в количестве выросших колоний на стерильном физрастворе от раствора 0,5% азида натрия достоверно (р<0,05).

Аналогичные данные присутствовали при посевах золотистого стафилококка на ЖСА и протея на среду Плоскирева и МПА, приготовленных на основе 0,3% и 0,5% растворов азида натрия.

Следовательно, среди применяемых нами фиксирующих растворов азида натрия наиболее оптимальными и достоверными рассматриваются лишь 0,3% и 0,5% растворы неорганических производных азота (Зайцева О.О. и соавт., 2006).

В ходе микробиологических исследований было установлено, что наблюдается тоже достоверный (р<0,05) рост микроорганизмов на контрольном стерильном физиологическом растворе в отличие от такового на опытных растворах азида натрия различной процентной концентрации (Платонов В.А. и соавт., 2006).

С целью выяснения консервирующей роли таких химических элементов как Cu+2, Cr+3 и Hg+2 мы подвергли испытанию 135 кусочков органов (45 - почек, 45 - легких, 45 - сердец, 45 - печени), изъятых в морге Кировского областного бюро СМЭ.

В результате проведенных экспериментальных исследований установлено, что органы в физиологическом растворе, содержащем 3% Cu+2, имели плотную консистенцию, грязно-серый цвет с голубым оттенком, умеренную прочность при механическом воздействии на ткань. Также наблюдали незначительное уменьшение органов в размерах в результате выраженного дубящего эффекта меди на протяжении 90 суток фиксации (Мешандин А.Г. и соавт., 2006). Опыт был прекращен из-за несоответствия данных по учитываемым макроскопическим параметрам.

Органы в физиологическом растворе, содержащем Cr+3, имели очень плотную консистенцию, серо-буро-фиолетовую окраску. На поверхности раствора наблюдали мелкоочаговый рост плесени бледно-зеленой в центре, серо-белой - по периферии уже на 14 сутки от начала фиксации (Зайцева О.О. и соавт., 2006). Опыт был также остановлен из-за плохой сохранности биологического материала.

Органы в физиологическом растворе, содержащем Hg+2, имели плотную консистенцию, бледно-коричневую окраску с розовым оттенком. На поверхности раствора наблюдали очаговый рост плесени, грязно-зеленой в центре, серо-белой по периферии тоже на 14 сутки от начала фиксации (Зайцева О.О. и соавт., 2006). Опыт был прекращен из-за плохой сохранности биологического материала.

Экологию внешней среды за счет летучести консервирующих растворов мы изучили на 15 лабораторных мышах и 20 крысах.

Изучение токсичности (летучести) 0,5% раствора азида натрия.

В опыте №1 наблюдали здоровых мышей обоего пола массой 19-21 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний согласно методике XI-ой ГФ (1990). За 24 часа до эксперимента и во время его проведения животные находились в помещении с постоянной температурой (20-210С). Каждую серию препарата испытывали на 5 мышах: опытная группа животных №1 находилась под воздействием паров 10% формалина, другая опытная группа животных №2 - под воздействием 0, 5% солевого раствора азида натрия, а контрольная группа животных - под воздействием дистиллированной воды.

Опытный раствор №1 - 10% раствор формалина объемом 100 мл, опытный раствор №2 - 0,5% солевой раствор азида натрия объемом 100 мл, контрольный раствор - дистиллированная вода объемом 100 мл.

Срок наблюдения за животными после изоляции их в переносную камеру, площадью 100x60x20 см составил 5 суток, что примерно соответствует 120 - часовому временному интервалу взаимодействия студентов и персонала мед ВУЗов с парами формалина в течение учебного года.

Ежедневно оценивали поведенческие реакции, наличие или отсутствие анорексии, цвет кожи, лишенной волосяного покрова, выпадение и изменение цвета шерсти. По окончанию эксперимента проводили гистологическое описание органов (печень, почка, сердце, легкое) убитых животных (Колосов А.Е. и соавт., 1981).

В первые двое суток опыта №1 наблюдали анорексию у мышей, «дышавших» 10% формалином, замедленную реакцию на прикосновение, общую пассивность, максимальное удаление от чашки с формалином, иногда ступорозное состояние. Однако опытные животные, находившиеся вблизи с 0,5% раствором азида натрия, проявляли обычную двигательную активность, анорексия отсутствовала. В том и в другом опыте изменения цвета кожных покровов и выпадение шерсти не наблюдали.

На третий день в опытной группе мышей №1 в поведении отмечали агрессивность у особей мужского пола, с последующим развитием вторичной инфекции в ранах, которые возникли в результате драки между самцами, неустойчивый аппетит, цвет шерсти у всех особей имел желтую окраску. Животные опытной группы №2 по-прежнему сохраняли двигательную активность, адекватно реагировали на прикосновение, проявляли интерес к пище.

В течение четвертых и пятых суток у опытной группы животных №1 отмечали активность, сменяющуюся сонливостью или ступором, аппетит неустойчивый, открытые участки кожи бледные. Но в то же время опытная группа мышей №2 отличалась активной жизнедеятельностью на протяжении всего срока эксперимента.

По истечению 5 суток мы констатировали изменение массы тела у всех особей опытной группы №1 с 19-21 г до 17-19 г. Но у особей опытной группы №2 и контрольной масса тела не колебалась, были прежние показатели -19-21 г.

По окончанию эксперимента были проведены эвтаназия (парами эфира) и забор органов (печень, почка, сердце, легкое) для гистологического исследования. Причем шерсть и внутренние органы опытной группы животных №1 издавали резкий запах формалина, у всех особей печень и почки отличались более бледной окраской, чем прижизненная, и «дряблой» консистенции. Одновременно наблюдалось массивное выпадение пожелтевшей шерсти сразу после эвтаназии у мышей, находившихся под влиянием паров формалина.

Органы опытной группы животных №2 и контрольных особей имели первоначальный прижизненный цвет, выпадение шерсти у них не отмечали, при этом запах каким - либо химическим веществом отсутствовал.

Таким образом, данные, полученные при исследовании опытного раствора №1, свидетельствуют о том, что 10% раствор формалина оказывает токсическое воздействие на общее состояние животных, снижает иммунный ответ, что приводит к возникновению вторичной инфекции, вызывает анорексию с изменением массы тела.

Объем опытного раствора №1-10% формалина уменьшился со 100 до 60 мл (испарился), а объемы опытного раствора №2-0,5% азида натрия и контрольного - дистиллированной воды как и вначале эксперимента перманентными и составляли по 100 мл.

Как видно результаты исследования опытного раствора №2 позволяют судить о том, что 0,5% солевой раствор азида натрия не летуч и не оказывает какого-либо отрицательного воздействия через дыхательные пути на организм животных.

На следующем этапе мы предприняли гистологическое исследование и составили описание структуры органов после действия консервантов.

Органы животных опытной группы №1 (с формалином):

- почка - клубочки округлой формы, просвет капсулы Шумлянского - Боумена не определяется, пролиферация мезангия, в эпителии извитых канальцев тотальная белковая дистрофия, местами с явлениями очагового некробиоза; просвет канальцев иногда резко сужен, вплоть до их полного отсутствия; сосудов незначительное количество с истонченными стенками, периваскулярное диапедезное кровоизлияние вокруг них; в некоторых клубочках отсутствуют сосудистые петли;

- легкое - межальвеолярные перегородки утолщены, отмечаются явления интерстициального и очагового альвеолярного отека; в межальвеолярных перегородках встречается лимфогистиоцитарная инфильтрация (очаговая интерстициальная пневмония); в стенках отдельных бронхов диффузная лейкоцитарная инфильтрация (острый бронхит); сосуды полнокровны, с периваскулярной воспалительной инфильтрацией (васкулит);

- печень - в гепатоцитах желчные пигменты, холестаз, центральные вены расширены, полнокровны; в междольковой строме и в портальных трактах незначительная интерстициальная инфильтрация, с диапедезными кровоизлияниями в центральных отделах долек; желчные капилляры расширены; тотальная белковая дистрофия гепатоцитов периферии долек (гепатит), гепатоз;

- сердце - очаговый интерстициальный (стромальный) отек, истончение (атрофия) кардиомиоцитов, очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация; сосуды резко расширены, полнокровны, с периваскулярной воспалительной инфильтрацией.

Вместе с тем в органах животных опытной группы №2 (с азидом натрия) и контрольной (с дистиллированной водой) патологических процессов при гистологическом исследовании не обнаружено.

На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что 0,5% раствора азида натрия не оказывает токсического воздействия через дыхательные пути на биологический организм в эксперименте.

Еще две серии экспериментов нам удалось произвести на здоровых белых крысах обоего пола массой 150 - 170 г, на которых ранее не проводили никаких испытаний согласно методике ГФ XI (1990). За 24 часа до эксперимента и во время его проведения животные находились в помещении с постоянной температурой (20-210С). Каждую серию препарата испытывали на 10 крысах: опытная группа животных находилась под воздействием паров 10% формалина, контрольная группа животных - под влиянием нелетучего 0,5% солевого раствора азида натрия.

Опытный раствор - 10% раствор формалина объемом 250 мл, контрольный раствор - 0,5% солевой раствор азида натрия объемом тоже 250 мл.

Срок наблюдения за животными после изоляции их в переносную камеру, площадью 100x60x20 см составил 30 дней с экспозицией по 4 часа в сутки, что примерно соответствует 120 - часовому временному интервалу взаимодействия студентов и персонала медицинских ВУЗов с парами формалина в течение учебного года.

У всех крыс ежедневно оценивали по аналогии с мышами поведенческие реакции, наличие или отсутствие анорексии, цвет кожи, лишенной волосяного покрова, выпадение и изменение цвета шерсти. По окончанию эксперимента проводили также гистологическое описание органов (печень, почка, сердце, легкое) убитых животных.

В течение первых 5 суток обозначенного эксперимента у опытной группы животных после контакта с парами формалина наблюдали беспокойство, одышку, снижение аппетита, замедленную реакцию на прикосновение, максимальное удаление от чашки с формалином, изменение цвета шерсти у всех особей на желтый уже на 3-и сутки. Контрольные животные, находившиеся вблизи с 0,5% раствором азида натрия, проявляли обычную двигательную активность, анорексия отсутствовала, цвет шерсти не изменен.

С 6 - 10 сутки в опытной группе в поведении отмечали агрессивность у всех 10 особей, неустойчивый аппетит, цвет шерсти у них имел желтую окраску. Вместе с тем животные контрольной группы по-прежнему проявляли обычную двигательную активность, адекватно реагировали на прикосновение, показывали интерес к пище.

В течение последующих 5 суток (11-15 день) у опытной группы животных отмечали ступорозное состояние, сменяющееся беспричинным беспокойством, аппетит неустойчивый, открытые участки кожи - бледны. Хотя контрольная группа крыс отличалась активной жизнедеятельностью на протяжении всего срока эксперимента.

На 16 - 20 сутки животные опытной группы потребляли большее количество жидкости, чем в первые дни, аппетит по-прежнему снижен, у крыс - выраженная апатия к происходящему, шерсть приобрела цвет желтого кадмия. В контрольной группе изменений не наблюдали.

На протяжении 20 - 25 суток животные опытной группы выпивали в сутки до одного литра воды, пищевой рацион составлял 150 г зерна и семян на 10 особей. Учитываемые показатели не отличались разнообразием.

В следующие 5 суток эксперимента (25-30 день) животные опытной группы находились в явном заторможенном состоянии, слабо реагировали на звук, свет, бросалась в глаза бледность кожных покровов, не покрытых шерстью. Потребление жидкости оставалось на прежнем повышенном уровне.

По истечению 30 суток замечалось снижение массы тела у всех особей опытной группы с 150-170 г до 135-150 г, а особи контрольной группы имели прежнюю массу - 150-170 г.

По окончанию предпринятого эксперимента были проведены эвтаназия (парами эфира) и забор органов (печень, почка, сердце, легкое) для гистологического исследования.

Шерсть и внутренние органы опытной группы животных имели резкий запах формалина, у всех особей печень и почки имели окраску бледнее прижизненной и «дряблую» консистенцию. Наблюдалось массивное выпадение пожелтевшей шерсти сразу после эвтаназии крыс, находившихся под влиянием паров формалина.

Органы контрольной группы особей никак не реагировали на присутствие 0,5% раствора азида натрия, они имели прижизненный цвет, у крыс выпадение шести не происходило, запах каким - либо химическим веществом отсутствовал.

Таким образом, есть достаточно оснований подтвердить токсическое воздействие 10% раствора формалина на общее состояние животных опытной группы. Выраженные явления анорексии и изменение окраски шерсти и агрессивность поведения свидетельствуют о развитии токсичности у лабораторных животных в эксперименте.

Существенным фактом служит еще и то, что объем опытного 10% раствора формалина за период эксперимента уменьшился со 250 до 100 мл (испарился), а объем контрольного 0,5% раствора азида натрия остался прежним (250 мл). Далее при гистологическом исследовании структуры органов животных мы диагностировали следующие патологические процессы (табл. 5).

Таблица 5. Перечень патологических процессов в органах крыс, установленный при микроскопическом исследовании после 30-дневного воздействия животных с растворами 10% формалина и 0,5% азида натрия

Группа	Органы	Патологические изменения
Опытная	Почка	Тотальная белковая дистрофия, очаговый некробиоз эпителия канальцев
	Легкое	Очаговая интерстициальная пневмония, острый бронхит, васкулит
	Печень	Холестаз, гепатит, очаговый гапатоз
	Сердце	Атрофия кардиомиоцитов и отек межмышечных пространств
Контрольная	Почка	Отсутствуют
	Легкое	Отсутствуют
	Печень	Отсутствуют
	Сердце	Отсутствуют

В органах особей контрольной группы (с азидом натрия) патологические процессы не развивались, что подтверждается гистологическим исследованием.

Итак, на основании комплексного изучения влияния растворов азидных производных и паров формалина на биологический организм в эксперименте на животных нами достоверно доказано, что предлагаемый солевой раствор азида натрия не оказывает токсического респираторного воздействия на животных, так как является не летучим, в отличие от сильно токсичного раствора формальдегида (формалина).

Для оценки экономической составляющей нами проведено сравнительное исследование существующих растворов для консервации на кафедрах нормальной анатомии человека. Как известно, теперь широко используется глицерин-спиртово-формоловая смесь для хранения трупного материала. Однако отрицательной стороной признается то, что одномоментно данной смеси требуется 110 литров для фиксации имеющихся учебных препаратов (без учета музейных препаратов), причем регулярно должна производиться полная замена вышеуказанных растворов с периодичностью 2 раза в месяц. Как было показано выше, консервирующая способность растворов азида натрия сохраняется при отсутствии замены их в течение 15 месяцев (Зайцева О.О. и соавт., 2006). По имеющимся последним валютным сведениям, 1 литр 37% раствора формальдегида стоит 32 рубля, 1 литр 700 спирта - 50 рублей, 1 литр глицерина - 180 рублей. Соотношения между растворами таковы, что на 10 литров воды берется 5 литров глицерина, 5 литров спирта, 400 мл формальдегида, 50 г салициловой кислоты и 1 кг поваренной соли., то есть общая цена равняется 12 тысячам 791 рублю. В год затраты составят 306 тысяч 984 рубля. Все знают, что в РФ 46 медицинских ВУЗов и 24 ВУЗа ближнего зарубежья с примерно такими же потребностями по консервантам. Следовательно, расходы по спиртово-формалиновым смесям в сумме становятся огромными - 18 млн. 419 тыс. 40 рублей в год. С учетом кафедр судебной медицины, гистологии, биологии тех же ВУЗов, потребность по формальдегидному консерванту однозначно увеличивается аж до 36 млн. 840 тыс. рублей. Примерно в 50 млн. рублей может быть оценена потребность по такому консерванту для бюро судебно-медицинских экспертиз в целом по РФ; МЧС нуждается в этих консервантах в величинах такого же порядка.

Таким образом, использование формальдегидных консервантов в структурах Минздрава и подразделений МЧС составляет 105 млн. 567 тыс. рублей в год. В то же время один литр солевого раствора 0,3% азида натрия стоит всего 2 рубля 40 копеек, а 110 л - 264 рубля. Так как замена консервирующих растворов азида натрия в течение года не требуется, то затраты в одном медицинском ВУЗе только на кафедре анатомии человека не превысят 264 рубля. С учетом увеличения этой цифры на все медицинские ВУЗы, расходы по предлагаемому варианту составят всего 15 тысяч 840 рублей, поскольку стоимость одного килограмма сухого вещества лишь 800 рублей. При сравнительном анализе экономической выгоды нами установлено, что 1 литр 0,3% азида натрия дешевле в 13 раз 1 литра 37% раствора формальдегида, в 21 раз дешевле 1 литра 700 спирта и в 75 раз дешевле 1 литра глицерина. К тому же намного дешевле транспортировка азидного химического препарата в сухом виде, в пластиковой, полиэтиленовой или стеклянной таре без температурных ограничений (его температура плавления 2750С). Единственным условием, которое необходимо соблюдать при его хранении и транспортировке в сухом виде, является недопустимость нахождения вблизи азида натрия растворов сильнодействующих кислот (соляной, серной) во избежание образования взрывчатого компонента (Неницеску К., 1968). Сами по себе солевые растворы азида натрия безопасны, абсолютно не летучи, в чем их огромное преимущество.

В практическом аспекте полученные нами результаты исследований различных фиксаторов биологических объектов позволяют широко использовать солевые растворы азида натрия в качестве консервантов как музейных и учебных препаратов, так и операционного и секционного материала прозекторских и отделений судебно-медицинской экспертизы, служб МЧС.

Также возможна полная замена летучих растворов формальдегида, дорогостоящих компонентов фиксирующих смесей и решение проблемы конверсии данного вещества в мирное время в оборонной промышленности, где азиды широко применяются.

Заключение

1. Экологически идеальным фиксирующими жидкостями с наилучшей консервирующей способностью биологического материала среди применяемых нами неорганических производных азота являются 0,3% и 0,5% растворы азида натрия. Оптимальный период сохранения анатомических органов и мягких тканей, находящихся в этих растворах, длительный - полтора года.

2. Установленный в результате исследования срок сохранения для гистологического изучения биопсий и операционного материала, фиксированных 0,3% и 0,5% растворами азида натрия, 60 суток вполне достаточный в условиях клиники для верификации патологического процесса.

3. В отличие от формалина 0,3% и 0,5% растворы азида натрия с течением времени не выпадают в осадки, не изменяют естественную окраску органов и тканей, не образуют черных артефактов в гистологических препаратах.

4. Солевые составы 0,3% и 0,5% растворов азида натрия обладают выраженными антибактериальными свойствами, предупреждая гниение и распад анатомических композиций.

5. Растворы неорганических производных азота в представленных концентрациях в профессиональном отношении при контакте с ними медицинского персонала наименее токсичны, поскольку без запаха, не летучи, не раздражают слизистые дыхательных путей, глаз, а также не вызывают аллергию и не действуют угнетающе на центральную нервную систему.

6. Финансовые затраты на приобретение фиксирующих биологический материал жидкостей, состоящих из 0,3% и 0,5% растворов азида натрия, в сравнении с используемыми ныне формалином и спиртом, незначительные, экономический эффект выигрышный.

Литература

1. Способ консервации крупных биологических объектов // Информационный листок №24-018-06. - Киров: ЦНТИ, 2006. (с соавт.)

2. Обзор методов консервации органов и тканей от древности до новейших технологий // - Киров: ЦНТИ, 2006. - 30 с.

3. Приоритетная справка на патент №2006103522/15 (003850) от 06.02.2006 г. Фиксатор биологического материала (с соавт.).

4. К вопросу о консервации биологического материала // Актуальные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии: Материалы научно-практич. конф. с междунар. участ. - Белгород, 2006, - С. 108 (с соавт.).

5. К вопросу о консервации биологического материала // Морфологические ведомости, приложение №1, - №1-2. - Москва - Берлин, 2006, - С. 98-100 (с соавт.).

6. К вопросу о разработке и применении новых менее опасных для здоровья человека бальзамирующих растворов // Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения: Мат-лы IV Росс. науч. конф. - Уфа - Тюлюк, 2006, - С. 19 - 20 (с соавт.).

7. Новый подход к консервации биоматериала // Выставочный модуль. - Киров: ЦНТИ, 2006. (с соавт.).

8. Новые технологии консервации биологического материала // Перспективные направления и новые технологии в здравоохранении: Мат-лы IV Республ. научно-практической конф. - Йошкар-Ола, 2006, - С. 57-58 (с соавт.).

9. Возможность использования азида натрия в консервации биологического материала для отработки новых хирургических технологий в эксперименте // Вятский медицинский вестник. Мат-лы науч. конф. - Киров, №2, 2006, - С. 140-141 (с соавт.).

10. Новейший способ консервации биоматериала // Студенческая наука и медицина 21 века: традиции, инновации и приоритеты: Мат-лы I Всеросс. (75-й итоговой) студенч. науч. конф. - Самара, 2007, - С. 35-36 (с соавт.).

11. Новый фиксатор анатомического материала // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Мат-лы Межрегиональной науч.- практ. конф. с междун. участ. - Саратов, 2006, - С. 56-57 (с соавт.).

12. Новый фиксатор анатомического материала // Успехи современного естествознания. - №1. - Москва, 2007, - С. 65 (с соавт.).

13. Внедрение новых биотехнологий в высшей медицинской школе на современном этапе // Вятский медицинский вестник. Мат-лы науч. конф. - Киров, №1, 2007, - С. 189 (с соавт.).

14. Экспериментальные возможности использования азида натрия для консервации биологического материала // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных веществ: Мат-лы 3-ей Всероссийской науч.-метод. конф. - Воронеж, 2007, -С. 64-65 (с соавт.).

Размещено на Allbest.ru

...