Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика селезенки при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика селезенки при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе

Стресс запускает в организме цепь интегрированных реакций нервной, эндокринной и иммунной систем, обусловленных активацией гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и симпато-адреналовой осей, приводящих к сложным иммуномодуляционным изменениям, которые особенно легко провоцируются в раннем постнатальном онтогенезе из-за морфо-функциональной незрелости лимфоидных органов, отсутствия устойчивых связей между ними, их компартментами и субкомпартментами, иммуноцитами и их микроокружением. При этом стресс-ассоциированная иммуномодуляция является многофакторным явлением, и различные стрессоры и характеристики стресса могут оказывать различное действие на иммунный ответ, что необходимо учитывать при прогнозировании диапазона, амплитуды и направленности стресс-ассоциированных иммуномодуляционных сдвигов в растущем организме (М.Р. Сапин и Д.Б.Никитюк, 2000; И.Г. Акмаев, 2003; H.Takeuchi et al., 2001; K.B.Koh et al., 2006).

Селезенка является крупнейшим лимфоидным органом в организме человека и млекопитающих, вносящим весомый вклад в развитие и поддержание клеточного и гуморального иммунного ответа, врожденного и приобретенного иммунитета, количественный и качественный состав иммуноцитов крови, лимфы и других лимфоидных органов (Л.А. Прасолова и др., 2004; M.C.Karlsson et al., 2004; R.E.Mebius et al., 2004; P.Balogh et al., 2004). Ее развитие в раннем постнатальном онтогенезе сопровождается взаимодействием и установлением связей между гемопоэтическими и стромальными клеточными популяциями многочисленных микроанатомических зон на территории органа. Лимфодеструктивное, лимфодегенеративное и лимфопролиферативное действие стресса способно изменить эти взаимоотношения и привести к продолжительному нарушению иммунного ответа (Y.X. Fu et al., 1999; L. Dominguez-Gerpe et al., 2001; J.I.Ellyard et al., 2005; E.Satoh et al., 2006). Однако до сих пор не достигнуто полного понимания природы стромальных клеток селезенки, их происхождения, закономерностей распределения по субкомпартментам органа и механизмов влияния на лимфоидные клетки при стрессе: не определена природа фолликулярных дендритных клеток, существуют разногласия в понимании происхождения и дифференцировки дендритных интердигитирующих клеток, их взаимодействия с Т-клеточными популяциями и т.д., что связано с недостатком исследований лимфоидной и стромальной архитектоники органов иммуногенеза, особенно в детском возрасте, и затрудняет понимание закономерностей становления эффективного иммунного ответа и иммуномодуляционных процессов в раннем постнатальном онтогенезе (M.de la Mata et al., 2001; G. Martinez del Hoyo et al., 2002; M.Svensson et al., 2004; L.Alos et al., 2005; J.Diao et al., 2006, T.Kaneko et al., 2006, H.Karsunky et al., 2006).

Основным проявлением стресс-ассоциированных иммуносуппрессивных сдвигов в иммунных органах, в частности в селезенке как наиболее компартментализованном среди них, является гипоцеллюлярность лимфоидной ткани, среди причин которой указывают нарушение трафика иммуноцитов (как притока, так и оттока), избыточную гибель, заторможенную пролиферацию и нарушение сигнальных взаимодействий. При этом было неоднократно продемонстрировано, что по мере старения организма механизмы постстрессовой иммуномодуляции претерпевают определенную динамику, однако в раннем постнатальном онтогенезе она остается мало изученной (К.А. Гарунова и др., 2004; М.Ю.Капитонова и др., 2006; H.Aviles et al., 2004; V.P. Makarenkova et al., 2006; D.Yin et al., 2006; K.C. Zheng et al., 2007).

Ввиду выше изложенного, мы провели изучение действия различных видов хронического стресса на иммунный статус организма экспериментальных животных на уровне периферического звена иммунной системы и его крупнейшего органа - селезенки - на ранних этапах постнатального онтогенеза с использованием методов количественной иммуногистохимии.

Цель исследования. Целью настоящего исследования является выявление закономерностей адаптации селезенки при хроническом действии стресса в раннем постнатальном онтогенезе.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать возрастные иммуномодуляционные сдвиги в селезенке в раннем постнатальном онтогенезе.

2. Изучить динамику лимфоидных и стромальных клеточных популяций различных компартментов селезенки при хроническом действии физических и психологических стрессоров.

3. Определить механизмы постстрессовых иммуномодуляционных сдвигов на уровне периферического звена иммунной системы растущего организма.

Научная новизна исследования. Впервые с применением количественного иммуноцитохимического анализа выявлены иммуномодуляционные изменения в селезенке неполовозрелых крыс различных возрастных групп при хроническом стрессе, вызванном различными по природе стрессорами (физическими и психологическими) и определены их диапазон и амплитуда.

Теоретическое значение работы заключается в выяснении механизмов иммуносуппрессивных сдвигов на уровне периферического звена иммуногенеза с учетом их возрастной специфичности в раннем постнатальном онтогенезе.

Практическая значимость работы заключается в выделении критериев оценки глубины стресс-ассоциированной иммуносупрессии на уровне крупнейшего периферического органа иммунной системы - селезенки - для использования их при разработке новых терапевтических стратегий профилактики и лечения иммунодефицитных состояний.

Внедрение в практику: полученные научные данные используются в учебном процессе на кафедре анатомии человека и кафедре иммунологии и аллергологии ВолГМУ.

Публикации и апробация материалов диссертации. Материалы диссертации докладывались на VII конгрессе международной ассоциации морфологов, Казань, 16 сентября 2004 года; на юбилейной конференции с международным участием «Современные проблемы науки и образования», посвященной 10-летию Российской академии естесствознания, г. Москва, 5-6 декабря 2005 г.; на конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии», Дубай, ОАЭ, 13-20 октября 2006 г.; на конференции, посвященной 70-летию Тверской государственной медицинской академии и 100-летию со дня рождения основателя кафедры анатомии человека, проф. И.С.Кудрина, Тверь, сентябрь, 2006; на III конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине», 1-8 октября 2006 г., Лутраки (Греция), на заседании Волгоградского отделения Всероссийского научного общества анатомов, гистологов и эмбриологов, март, 2007.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Постстрессовая динамика клеточных популяций иммуноцитов в различных компартментах селезенки растущего организма имеет возрастную зависимость и определяется видом действующего стрессора.

2. Стресс-ассоциированные иммуномодуляционные сдвиги в селезенке экспериментальных животных в раннем постнатальном онтогенезе имеют как гемопоэтическое, так и стромальное происхождение, в соотношениях, опосредованных онтогенетически.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, части I - обзора литературы, излагающего современные представления о гистофизиологии селезенки как периферического органа иммуногенеза и об иммуномодулирующем действии стресса, и части II, содержащей 3 главы с описанием материалов и методов исследования, его результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 55 рисунками, среди них 45 - микрофотографии гистологических препаратов. Библиографический указатель содержит 240 источников, в том числе 23 отечественных и 217 зарубежных.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Экспериментальное исследование проведено на 90 неполовозрелых белых крысах породы Sprague Dawley в грудном, подсосном и преювенильном возрастном периоде (исходный возраст 14, 21 и 30 дней соответственно, И.П.Западнюк и др., 1974). В исследовании применялись модели хронического стресса ежедневно в течение 7 дней по одной 5-часовой сессии в день (S.Bhatnagar et al, 1998) с использованием психологического стрессора («ожидание стресса» в модели S.Jain et al., 1996, - 1-я экспериментальная группа) и преимущественно физического по природе стрессора (водная иммерсия в модели E.Freidin et al., 2004, - 2-я экспериментальная группа). В каждой возрастной группе было по 30 животных, из которых 10 составили группу возрастного контроля и по 10 крыс было в каждой из двух экспериментальных групп. По окончании эксперимента животные забивались под анестезией, селезенка извлекалась, взвешивалась и фиксировалась формалином. Парафиновые срезы селезенки окрашивались гематоксилин-эозином, по Ван Гизону и иммуногистохимически стрептавидин-биотин-пероксидазным методом. Помимо селезенки, извлекались и взвешивались тимус и правый надпочечник, а также оценивалось состояние слизистой оболочки желудка (для характеристики общей стресс-реакции).

Для иммуногистохимического исследования использовались моноклональные антитела фирмы “Serotec” (UK) против СD3 (клон 1F4), CD4 (клон W3/25), CD8a (клон MRC OX8); СD20 (клон RLN-9D3), CD90 (клон HIS51, “BD Pharmingen”,USA), CD45RC (клон MRC OX22), выявляющие различные фракции лимфоидных клеток; CD68 (клон ED1), ОХ62 (клон MRC OX62) и белка S100 (DAKO, Denmark) для выявления стромальных клеток, а также PCNA (клон РС10), и каспазы-3 (“Sigma”, USA) для характеристики уровня пролиферации и апоптоза спленоцитов соответственно. Иммуногистохимически окрашенные срезы оценивались количественно с помощью цифрового анализа в программе ImageProPlus с использованием программы Exсel для статистической обработки данных с вычислением средней арифметической, среднеквадратического отклонения, средней ошибки средней арифметической, коэффициента корреляции, необходимого числа исследований; различия средних по критерию Стьюдента.

Хронический стресс вызывал инволюцию тимуса, гипертрофию надпочечников и появление точечных кровоизлияний на слизистой оболочке желудка экспериментальных животных обеих групп всех возрастных подгрупп.

Таблица 1. Масса тела животных (г) при хроническом стрессе, М+/-m.

Как следует из таблицы 1, хронический стресс вызывал отставание возрастной прибавки массы тела у животных обеих экспериментальных групп во всех возрастных подгруппах, которое было значимым только у животных 2-ой экспериментальной группы.

селезенка иммунный организм

Таблица 2. Масса селезенки животных (г) при хроническом стрессе, М+/-m.

Несколько иной была динамика массы селезенки: высоко достоверное ее уменьшение имело место во всех возрастных подгруппах 2-ой экспериментальной группы, в то время как в 1-ой группе это снижение достигало уровня значимости только в период перехода на самостоятельное питание. При этом во всех 3-х возрастных подгруппах различия в весе селезенки между двумя экспериментальными группами было также достоверным (p<0,05).

Таблица 3. Динамика веса надпочечника животных (мг) при хроническом стрессе, М+/-m.

Таблица 3 демонстрирует увеличение веса надпочечника при хроническом стрессе, которое достигало наибольшего уровня значимости в подсосном периоде в обеих экспериментальных группах. Между двумя экспериментальными группами различий по данному показателю не было ни в одной возрастной подгруппе.

Таким образом, степень стресс-ассоциированной гипотрофии селезенки и гипертрофии надпочечников, так же как относительное уменьшение массы тела при хроническом стрессе, были связаны с видом стрессора и исходным возрастом животного и достигали максимальных значений во 2-ой экспериментальной группе в исходном возрасте 21 день, что соответствует переходу на самостоятельное питание. Гипоцеллюлярность лимфоидных органов, прежде всего за счет Т-клеточных популяций, является характерным признаком стресс-индуцированной иммуносуппрессии. Косвенно о ней можно судить по весу органов иммуногенеза, так как между снижением числа Т-клеток в селезенке при иммуномодуляционных воздействиях и весом органа имеется определенный параллелизм (H.J.Hosea et al., 2003). Однако имеющиеся в арсенале нашего исследования количественные иммуногистохимические методы позволили нам провести более тонкий анализ показателей стресс-ассоциированной иммуносуппрессии в растущем организме и соотнести их с органометрическими параметрами.

На следующем этапе исследования - оценке микроструктуры селезенки на гистологических препаратах, окрашенных рутинными методами, отмечены возрастные и стресс-ассоциированные изменения, свидетельствующие о выраженных иммуномодуляционных сдвигах в организме на уровне периферического звена органов иммунной защиты, связанных с видом стрессорного воздействия и зависящих от исходного возраста экспериментальных животных.

В младшей возрастной группе, исходный возраст животных в которой соответствовал периоду грудного вскармливания, селезенка контрольных особей оставалась морфологически незрелой: с очагами миелопоэза в красной пульпе, с небольшим объемом белой пульпы, представленной главным образом периартериальными лимфоидными влагалищами (ПАЛВ), преимущественно мелкими и средними, и формирующимися лимфоидными узелками, окруженными ободками маргинальной зоны с недостаточно четкими границами. Иммуногистохимическое окрашивание на белок S100, выявляющий фолликулярные дендритные клетки (ФДК) (L.Alos et al., 2005), показал наличие большого количества формирующихся лимфоидных фолликулов, содержащих рыхлую мелкопетлистую иммунореактивную сеть. При окрашивании серийных срезов селезенки на CD20, выявляющем зрелые В-лимфоциты, видно гомогенное заполнение этой сети иммунореактивными клетками, а при окрашивании на OX-62, маркер дендритных клеток, выявлялась строма ПАЛВ, заполняемая Т-лимфоцитами с фенотипом CD3+ (маркер зрелых Т-клеток), CD4+ (маркер Т-хелперов и некоторой части макрофагов и дендритных клеток), CD8+ (маркер Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов, NK-клеток и части дендритных клеток), CD90+ (маркер недавних тимусных иммигрантов, НТИ). В средней возрастной группе, исходный возраст которой соответствовал периоду перехода на самостоятельное питание, объем белой пульпы значительно возрастал: увеличивался диаметр ПАЛВ за счет появления крупных лимфоидных влагалищ, в разрастающихся лимфоидных фолликулах появлялись центры размножения. В старшей возрастной группе белая пульпа достигала наибольшего объема, она четко отграничивалась от маргинальной зоны, а маргинальная зона - от окружающей красной пульпы, в которой происходило угасание миелопоэза. В ПАЛВ дифференцировались внутренная и наружная зона, а среди лимфоидных узелков появлялось все больше вторичных. Возрастал объем маргинальной зоны, которая, как показало окрашивание на CD20 и СD45RC, становилась крупнейшим В-клеточным компартментом.

При хроническом стрессе в селезенке отмечались структурные и иммуногистохимические изменения, указывающие на замедление развития и достижения функциональной зрелости органа при действии психологического стрессора, а также дегенерация и деструкция лимфоидной ткани селезенки, диапазон и выраженность которой были предопределены исходным возрастом животного. К изменениям, свидетельствующим об иммуносупрессивном характере хронического стресса, относились уменьшение объема белой пульпы и ширины маргинальной зоны, разрушение лимфоидных узелков и исчезновение в них герминативных центров, дезорганизация ПАЛВ, появление в лимфоидных узелках и ПАЛВ множества макрофагов с неокрашенной цитоплазмой, содержащей многочисленные апоптозные тельца, что свидетельствовало об усилении гибели спленоцитов апоптозом.

Количественное иммуногистохимическое исследование позволило выявить новые закономерности стресс-индуцированных иммуномодуляционных сдвигов в селезенке, зависящих от вида стресса и связанных с возрастом животных.

Рис.1. Динамика распределения СD8+клеток в селезенке препубертатных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

Результаты, представленные на рис.1, демонстрируют возрастную и стресс-ассоциированную динамику CD8+клеток, к которым относятся зрелые Т-суппрессоры, часть NK и дендритных клеток. Как следует из рисунка, имеет место увеличение удельной площади иммунореактивных клеток у контрольных животных с возрастом, что отражает общую в данном возрастном периоде тенденцию увеличения объема белой пульпы, где эти клетки главным образом сосредоточены. К 36-дневному возрасту это увеличение по сравнению с 20-дневной группой достигает уровня значимости (p<0,05). Имидж-анализ выявил также высоко достоверное уменьшение числа иммунореактивных клеток при действии физического стрессора во всех возрастных группах, в то время как при действии психологического стрессора это уменьшение было значимым лишь в старших возрастных группах. Между двумя экспериментальными группами различие по данному показателю было достоверным лишь в период перехода на самостоятельное питание (p<0,05). В целом отмечена большая степень деплеции CD8+спленоцитов в старших возрастных группах по сравнению с младшей группой.

Рис.2. Динамика распределения СD90+клеток в селезенке препубертатных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

Как следует из рис.2, доля CD90-иммунореактивных клеток, выявляющих популяцию НТИ, также возрастала с увеличением возраста контрольных животных (p<0,05 при сравнении средней с младшей и старшей со средней возрастных подгрупп; p<0,001 при сравнении младшей и старшей подгрупп), что свидетельствует о достаточно равномерном и очень динамичном нарастании интенсивности трафика Т-клеток из тимуса в периферическое звено иммунной системы в раннем постнатальном онтогенезе. Динамика распределения CD90-иммунореактивных клеток в эксперименте была несколько иной, чем у CD8+клеток: интенсивность трафика тимоцитов «на периферию» достоверно снижалась при обоих видах стресса во всех возрастных подгруппах. Наибольшее снижение доли иммунореактивных клеток относительно контроля отмечалось в младшей возрастной подгруппе в обеих экспериментальных группах и наименьшее - в старшей подгруппе, что демонстрирует отчетливые возрастные преференции стресс-ассоциированной динамики различных популяций Т-лимфоцитов. И CD90+, и CD8+клетки заполняют преимущественно Т-зоны селезенки, в связи с чем постстрессовая реакция стромальных элементов Т-клеточных субкомпартментов представляла особый интерес.

Как следует из рис.3, при окраске на OX-62, выявляющей большую часть дендритных клеток ПАЛВ, а также небольшую часть гамма-дельта Т-лимфоцитов, отмечается значимое возрастное увеличение доли иммунореактивных клеток у контрольных животных: по сравнению с младшей возрастной группой она была достоверно выше у средней возрастной группы (р<0,05), и высоко достоверно - у старшей (р<0,001); между средней и старшей группой различия также были значимыми (p<0,05). Эти результаты свидетельствуют о продолжающихся в данном возрастном периоде процессах нарастающего поступления и дифференцировки дендритных клеток, в частности OX-62, преимущественно в Т-зоны селезенки, а также в ее маргинальную зону. Стресс вызывал некоторое уменьшение доли OX-62 иммунореактивных клеток в ПАЛВ во всех возрастных подгруппах при обоих видах стресса, однако лишь в старшей возрастной подгруппе при действии физического стрессора это снижение было достоверным. Оценивая полученные результаты по OX-62-иммунореактивности селезенки, мы учитывали то обстоятельство, что не все дендритные клетки Т-зон являются OX62-позитивными и не все OX-62-позитивные клетки являются дендритными (T.Kaneko et al., 2006). В частности, OX-62-иммунореактивными являются гамма-дельта Т-клетки, однако у крыс они чрезвычайно малочисленны (M.Brenan et al., 1992). Большая часть дендритных клеток у крыс OX-62-иммунореактивна, т.е. относится ко II типу дендритных клеток (M.de la Mata et al., 2001). В целом, по данным ряда авторов, OX-62 иммунореактивность позволяет судить о доле и динамике дендритных клеток в лимфоидных тканях (M.Brenan et al., 1992). Полученные нами результаты соответствуют представлениям некоторых авторов о том, что стресс, сопровождающийся повышенным выбросом кортикостероидов в кровь, влияет на дендритные клетки селезенки, однако не провоцирует их апоптоза, в отличие от других клеточных популяций, а вызывает изменение их дифференцировки, «запуская» ее в большей степени по миелоидному фенотипу, что можно рассматривать как адаптационное изменение, поскольку именно дендритные клетки миелоидного фенотипа обладают более высоким антиген-презентирующим потенциалом, что чрезвычайно важно в условиях формирующейся стресс-ассоциированной иммуносуппрессии (G.Martinez del Hoyo et al., 2002; A.D.McLennan et al., 2002; P.Martin et al., 20004; S.H.Naik et al., 2006). Корреляционный анализ также показал отсутствие параллелизма в деплеции лимфоидных клеток Т-зон (CD8+ и CD90+) и стромальных (дендритных OX-62+) клеток. Это наблюдение свидетельствует о том, что причиной лимфоидной гипоцеллюлярности Т-зон селезенки при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе является в меньшей степени нарушение стромально-паренхиматозных взаимоотношений и в большей степени другие механизмы, рассмотренные нами ниже (такие, как снижение притока, угнетение пролиферации и усиленный апоптоз Т-лимфоцитов, который даже сохраненные стромальные клетки ПАЛВ, в отличие от стромальных клеточных элементов В-зон, не в состоянии эффективно предотвратить) (J.Choe et al., 2000). Интересно, что у контрольных животных между содержанием дендритных клеток и CD90-иммунореактивных НТИ отмечалась достоверная средняя по силе или сильная корреляционная связь (r=0,59; 0,61 и 0,70 в младшей, средней и старшей возрастных подгруппах соответственно). При стрессе эта связь становилась слабой и недостоверной во всех возрастных подгруппах. Это обстоятельство позволяет судить о том, что в раннем постнатальном онтогенезе в процессе становления иммунологической зрелости селезенки в ходе нарастания объема Т-зон параллельно идет разрастание их стромы и усиление притока из тимуса Т-клеток, заполняющих петли этой стромы. При стрессе стромальные клеточные элементы Т-зон остаются достаточно стабильной клеточной популяцией, во всяком случае это справедливо в отношении OX-62-позитивных клеток, которые оказывают стимулирующее влияние на Т-клетки и запускают иммунный ответ (M. De la Mata et al., 2001). Полученные нами результаты противоречат данным других исследователей (M.B.Krummen et al., 2006) о том, что при повышении концентрации кортикостероидов происходит почти полная деплеция дендритных клеток в периферических органах иммуногенеза, что может быть связано с различными методическими подходами в этих экспериментальных исследованиях. В противоположность дендритным клеткам, Т-лимфоциты, включая НТИ, оказываются высоко чувствительными к действию стресса, и резкое снижение их содержания в Т-зонах селезенки говорит о негативных последствиях стресса для гетерогенности наивных Т-клеток в периферическом Т-клеточном пуле (H.Engler et al., 2003). Полученные нами результаты не согласуются с данными других авторов о том, что спленоциты как достаточно зрелые лимфоидные клетки отличаются стресс-устойчивостью (X.Zhang et al., 2005). Причиной данного несоответствия вероятно является ранний возраст экспериментальных животных в наших исследованиях, в котором селезенка и все ее компартменты и субкомпартменты остаются морфологически и функционально незрелыми, что предопределяет повышенную чувствительность спленоцитов к иммунокомпрометирующему действию стресса.

Рис.3. Динамика распределения ОХ62+клеток в селезенке препубертатных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

Как следует из рис.4, демонстрирующего динамику В-клеточного компартмента селезенки растущих крыс, он также претерпевает значительные возрастные изменения, связанные с увеличением удельной площади иммунореактивных клеток при переходе от младшей к старшей возрастной подгруппе (p<0,01) и от средней к старшей (p<0,05), что

Рис.4. Динамика распределения CD20+клеток в селезенке препубертатных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

соответствует общей тенденции роста В-клеточного компармента в раннем постнатальном онтогенезе. Стресс-ассоциированные изменения иммуносупрессивного характера при действии физического стрессора проявлялись высоко достоверным уменьшением доли иммунореактивных клеток (зрелых В-лимфоцитов) во всех возрастных подгруппах. При действии психологического стрессора это снижение также имело место, достигая при этом уровня значимости в младших возрастных подгруппах. Эти наблюдения подтверждают, что хронический стресс оказывает иммуносупрессивное действие, касающееся не только клеточного, но и гуморального иммунного ответа, причем к нему особенно чувствителен В-клеточный субкомпартмент крыс самых ранних стадий постнатального онтогенеза. Для выяснения роли в данном явлении стромальных элементов В-зон белой пульпы селезенки мы предприняли количественную оценку распределения белок S100-иммунореактивных клеток, выявляющих ФДК во вторичных иммунных органах (L.Alos et al., 2005).

Рис.5. Динамика распределения белок S100+клеток в селезенке препубер-татных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

Исследование показало, что иммунореактивные клетки локализовались исключительно в лимфоидных фолликулах. Серийные срезы продемонстрировали, что все они были CD20-негативными. Как следует из рис.5, эта клеточная популяция отличалась самым динамичным ростом при переходе из одной возрастной подгруппы в другую (p<0,001 при сравнении младшей и средней возрастных подгрупп; р<0,05 при сравнении средней и старшей возрастных подгрупп). Во всех возрастных подгруппах имело место достоверное уменьшение доли иммунореактивных клеток во 2-ой экспериментальной группе. В 1-ой экспериментальной группе различия не достигали уровня значимости только в старшей возрастной подгруппе. Так же, как и при окраске на CD20, во второй экспериментальной группе имело место большее снижение доли иммунореактивных клеток, чем в первой, а в младших возрастных подгруппах большее по сравнению со старшей подгруппой. При этом корреляционный анализ показал наличие сильной достоверной корреляционной связи между удельной площадью белок S100+ клеток и В-лимфоцитов (r=0,72; 0,69; 0,76 при p<0,05 в исходном грудном, подсосном и преювенильном возрасте соответственно).

Известно, что ФДК и интердигитирующие дендритные клетки (ИДК) являются двумя разновидностями дендритных клеток, являющихся антиген-презентирующими, активирующими В- и Т-лимфоциты и располагающимися в В- и Т-компартментах соответственно (K.W.Tinsley et al., 2003). Как показало наше исследование, в противоположность Т-клеточным субкомпартментам белой пульпы, где параллелизм между лимфоидной и стромальной гипоцеллюлярностью отсутствовал, в В-клеточном субкомпартменте прослеживалась отчетливая связь между деплецией лимфоидных клеток и разрушением стромы лимфоидных фолликулов. Эти результаты согласуются с данными других авторов о том, что белок S-100+ иммунореактивные ФДК оказывают мощное стабилизирующее действие на иммуноархитектонику лимфоидных фолликулов (J.Choe et al., 2000; L.Li et al., 2002; L.Alos et al., 2005). Из литературных данных известно, что и ФДК, и ИДК гибнут апоптозом, который является преимущественно каспаза-3-медиированным. Столь различное поведение этих двух клеточных популяций дендритных клеток селезенки при хроническом стрессе, обнаруженное в наших экспериментах, представляется вполне объяснимым. Эти клетки имеют различное происхождение (большинство авторов считают, что ФДК, в противоположность ИДК, не являются клетками костномозгового происхождения), имеют различную продолжительность жизненного цикла (ФДК могут более года удерживать на поверхности антиген, в то время как ИДК гибнут апоптозом вскоре после презентации антигена Т-клеткам и имеют, в зависимости от фенотипа, период полужизни от 1,5 до 3 дней). Вопрос же о том, является ли утрата Т- или В-клеток причиной гибели ИДК и ФДК соответственно или, наоборот, происходит утрата ИДК и ФДК в связи с деплецией Т- и В-клеток соответственно, является до сих пор открытым (K.W.Tinsley et al., 2003).

Как следует из рис. 6, хронический стресс вызывал достоверное усиление апоптоза, распространенность которого оценивалась по иммунореактивности по каспазе-3 - ключевого фермента апоптоза, во всех возрастных подгруппах при действии физического стрессора, в то время при действии психологического стрессора в подгруппе грудного возраста это снижение не было значимым. В целом, отмечена относительно более высокая доля гибнущих апоптозом спленоцитов в старших возрастных подгруппах по сравнению с младшей.

Рис.6. Динамика распределения каспаза-3+клеток в селезенке препу-бертатных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

Полученные нами результаты противоречат данным других авторов, показавших, что спленоциты являются относительно устойчивыми к стрессу клетками, в сравнении, например, с тимоцитами, так как у первых меньше рецепторов к глюкокортикоидам, высок уровень экспрессии bcl-2 и в целом они в меньшей степени доступны действию эндогенных кортикостероидов, чем лимфоциты других иммунных органов (B.S.McEwen et al., 1997). Объяснением этого противоречия может быть то обстоятельство, что в раннем постнатальном онтогенезе селезенка еще продолжает формировать свои компартменты и субкомпартменты, которые отличаются относительной незрелостью своих клеток, в то время как устойчивыми к ГГНО-индуцированному апоптозу являются лишь зрелые спленоциты (T.Shimizu et al., 2000). Кроме того, ГГНО-зависимый путь является не единственным иммуномодулирующим средством при стрессе. Спленоциты содержат также рецепторы к опиоидам, стимулирование которых при стрессе также способно запускать избыточный апоптоз лимфоидных клеток, в том числе c использованием системы Fas(APO-1) - Fas(APO-1)-лиганд (D.Yin et al., 2000; 2006). Для подтверждения этих наблюдений и выявления дополнительных механизмов иммуносуппрессивных сдвигов в селезенке при стрессе мы провели сравнительное количественное исследование частоты обнаружения пролиферирующих клеток и клеток, гибнущих апоптозом.

Как следует из рис.7, демонстрирующего динамику клеток, имеющих пролиферативный потенциал, возрастные колебания уровня экспрессии PCNA незначительны. При стрессе происходит уменьшение удельной площади PCNA-иммунореактивных клеток, достоверное во всех возрастных подгруппах 2-ой экспериментальной группы и в старших возрастных подгруппах 1-ой экспериментальной группы. Таким образом, как показало это исследование, хронический стресс в раннем постнатальном онтогенезе не вызывал усиления пролиферации спленоцитов ни в одной возрастной подгруппе при действии как психологического, так и преимущественно физического стрессора. Как и при окрашивании на каспазу-3, отмечено более выраженное иммуносуппрессивное действие стресса на иммуноархитектонику селезенки в более старших возрастных группах.

Рис.7. Динамика распределения PCNA+клеток в селезенке препубертатных крыс при хроническом стрессе (удельная площадь, %, M+/-m)

Полученные нами данные относительно стресс-индуцированной динамики пролиферирующих клеток при стрессе противоречат данным других авторов, отмечающих усиление пролиферации лимфоцитов периферических иммунных органов при стрессе (А.Pazirandeh et al., 2004), что также может быть связано с разницей в возрасте экспериментальных животных и примененных моделях стресса.

Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало, что хронический стресс, с использованием как чисто психологического стрессора («ожидание» стресса), так и преимущественно физического стрессора (водной иммерсии) вызывает изменения иммуноархитектоники селезенки растущего организма, соответствующие иммунодепрессивным состояниям. При этом, как показало количественное иммуногистохимическое исследование, эти изменения являются отражением вида примененного стрессорного воздействия и исходного возраста животных. Так психологический стресс в большей степени влиял на микроархитектонику Т-зон селезенки, в то время как физический стресс подавлял развитие как Т- , так и В-зон белой пульпы селезенки, вызывая их дегенерацию. Имела место утрата клеточных популяций Т-зон, таких как СD3+ и CD8+ иммунореактивные клетки - в большей степени на более поздних стадиях раннего постнатального онтогенеза, а В-зон (CD20+клетки) - в более ранние возрастные периоды. Механизмы деплеции лимфоидных клеток при хроническом стрессе также имели возрастную зависимость: в младших подгруппах это был в большей степени нарушенный трафик НТИ из тимуса, а в более старших подгруппах - угнетение пролиферации спленоцитов и их избыточный апоптоз, что может быть связано с различной степенью функциональной зрелости ГГНО, симпато-адреналовой оси, опиоидного рецепторного аппарата на разных этапах раннего постнатального онтогенеза, регулирующих и рекрутирование НТИ в Т-зоны селезенки, и каспаза-3-медиированную гибель спленоцитов апоптозом, и функциональную зрелость как паренхиматозных, так и стромальных элементов Т- и В-зон селезенки, взаимодействие которых предотвращает избыточную гибель спленоцитов и регулирует процессы их селекции. Полученные данные позволяют оценивать иммунный статус организма, подвергшегося действию хронического стресса, и разрабатывать новые методы постстрессовой иммунокоррекции у иммунокомпрометированных детей.

Выводы

селезенка иммунный организм

1.Иммуномодуляционное действие хронического стресса на уровне периферического звена иммунной системы - селезенки - в раннем постнатальном онтогенезе у крыс проявляется изменениями иммуносупрессивного характера в Т- и В-клеточном компартментах белой пульпы, соотношение и выраженность которых связана с исходным возрастом животных и характером стрессорного воздействия.

2. При хроническом действии психологического стрессора снижение объема белой пульпы связано преимущественно с редукцией Т-клеточных компартментов вследствие уменьшения размеров ПАЛВ, снижения их клеточности, уменьшения удельной площади СD90+ и СD8+ лимфоцитов. Уменьшение объема белой пульпы при хроническом действии физического стрессора обусловлено дегенерацией как Т-клеточных, так и В-клеточных субкомпартментов: уменьшением размеров и числа лимфоидных узелков, редукцией ПАЛВ, сужением маргинальной зоны вокруг лимфоидных узелков и ПАЛВ, что наряду с уменьшением удельной площади СD90+и СD8+ клеток сопровождается сокращением популяций СD20+ и CD45RC+клеток и является проявлением зависимости топографии стресс-ассоциированных сдвигов в иммуноархитектонике селезенки в раннем постнатальном онтогенезе от вида примененного стрессора

3.В раннем постнатальном онтогенезе хронический стресс оказывает влияние как на лимфоидные, так и стромальные элементы Т- и В-клеточных субкомпартментов белой пульпы селезенки в соотношениях и диапазоне, имеющих возрастную зависимость и соответствующих виду стресса. При этом, по данным иммуногистохимического имидж-анализа, ОХ-62+ дендритные клетки ПАЛВ оказываются в целом менее чувствительными к действию стресса, чем белок S100+ фолликулярные дендритные клетки лимфоидных узелков, а Т-лимфоциты ПАЛВ - менее зависимыми от стабилизирующего действия стромальных клеток, чем В-лимфоциты лимфоидных узелков.

4.Возрастное увеличение доли недавних тимусных иммигрантов коррелирует с нарастанием плотности дендритных клеток в Т-зонах, в то время как уменьшение числа дендритных клеток ПАЛВ при хроническом стрессе не обнаруживает значимой корреляции со снижением числа недавних тимусных иммигрантов (Thy 1.1+клеток), а также CD8+иммунореактивных клеток.

5.При хроническом психо-эмоциональном стрессе в исходном грудном возрасте преобладающим механизмом гипоплазии белой пульпы является уменьшение интенсивности трафика лимфоцитов из тимуса в Т-клеточные субкомпартменты, о чем свидетельствует достоверное снижение числа CD90+клеток в ПАЛВ, в то время как в более старших возрастных группах - усиление апоптоза (наибольшее - в В-зонах) и торможение пролиферации (наибольшее - в Т-зонах) лимфоцитов.

6.Наибольшая степень иммуносуппрессивных сдвигов в микроструктуре В-зон селезенки отмечается в более ранние периоды, в то время как Т-зон - на более поздних этапах развития, что свидетельствует о возрастной зависимости изменений иммуноархитектоники селезенки при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе.

Практические рекомендации

1.Для оценки степени иммуносупрессии при стрессе высокой информативностью отличаются показатели содержания в селезенке популяций лимфоидных и стромальных клеточных элементов, иммунореактивных по CD8+, СD90+, белок S100+, СD20+, в связи с чем их можно использовать при разработке новых терапевтических стратегий борьбы с иммуносуппрессивными состояниями.

2.Для характеристики гипоцеллюлярности Т-клеточных субкомпартментов целесообразно использовать иммуногистохимическое окрашивание на PCNA, в то время как для оценки состояния В-клеточных - окрашивание на каспазу-3.

Список публикаций

1. Особенности реакции гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы на действие хронического стресса в период грудного вскармливания // В сб.: Морфология процессов индивидуального развития, адаптации и компенсации. Труды ВолГМУ, Волгоград: 2005.- Т.62.- Вып.1.- С.32-35 (соавтры: Капитонова М.Ю., Клаучек С.В., Верстакова О.Е.,. Морозова З.Ч, Мураева Н.А., Смирнова Т.С., Федорова О.В., Тхабит Худа С.А.).

2. Возрастные особенности соотношения изменений иммунных параметров в центральных и периферических органах иммуногенеза при хроническом стрессе // Фундаментальные исследования.- 2006.- N11.- С.61-62 (соавторы М.Ю.Капитонова, Н.А.Мураева, Д.А.Чернов В.В.Хлебников).

3. Влияние хронического психо-эмоционального стресса на параметры врожденного иммунного ответа в раннем постнатальном онтогенезе // Фундаментальные исследования.- 2006.- N11.- С.51-52 (соавторы: Н.А.Мураева, В.В.Хлебников, Д.А.Чернов, М.Ю.Капитонова).

4. Распределение S100-позитивных клеток в белой пульпе селезенки крыс в возрастном аспекте // Успехи современного естествознания.- 2006.- N1.- C.83-84 (соавторы: Капитонова М.Ю., Морозова З.Ч., Сидоркина А.В., Нестерова А.А., Мураева Н.А., Фомина Н.Г., Демидович И.Л.).

5. Возрастная динамика распределения гранзим Б-содержащих клеток в периферических иммунных органах крыс при хроническом стрессе в раннем постнатальном онтогенезе // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета.- 2006.- N3.- C.28-32 (соавторы: Капитонова М.Ю., Краюшкин А.И., Мураева Н.А., Федорова О.В.).*

6. Соотношение иммуномодуляционных сдвигов в центральных и периферических органах иммунной защиты при хроническом стрессе // Морфология.-2006- N5.- C.49-50 (соавторы: Капитонова М.Ю., Мураева Н.А., Краюшкин А.И., Хлебников В.В., Чернов Д.А., Смирнова Т.С.).

Размещено на Allbest.ru