Морфологическая характеристика гематоэнцефалического барьера при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ВОСПРОИЗВЕДЕНИИ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА

Шмидт Максим Вячеславович

Волгоград - 2006

Работа выполнена в Волгоградском научном центре РАМН и Администрации Волгоградской области и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Писарев Вячеслав Борисович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Туманов Владимир Павлович

доктор медицинских наук, профессор Даниленко Виталий Иванович

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Защита состоится « 30 » октября 2006 года в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор С.И.ЗАЙЧЕНКО

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Лихорадка Западного Нила (ЛЗН) - это природно-очаговая, трансмиссивная, летне-осенняя арбовирусная инфекция, которая протекает у человека в виде острого лихорадочного заболевания с симптомами общей интоксикации, головными и мышечными болями, часто с развитием серозного менингита и менингоэнцефалита. Как правило, эпидемические вспышки характеризуются массовостью с охватом в короткий срок значительных групп населения (Венгеров Ю.Я., соавт., 2000; Львов Д.К., 2000,2002; Брюханова Г.Д., соавт., 2001; Campbell G.L., et al., 2001; Fleischauer А.Т., et al., 2003). Масштабы распространения, возможность возникновения эпидемических вспышек, «агрессивность» болезни (большое количество неврологических осложнений, а также вероятность летальных исходов) делают это инфекционное заболевание одной из самых актуальных проблем здравоохранения (Бутенко A.M., соавт., 2001; Деконенко Е.П., соавт., 2002; Цинзерлинг А.В., Цинзерлинг В.А., 2002; Львов Д.К., соавт., 2004; Gubler D.J., 2001).

Несмотря на огромный фактический материал, накопленный по лихорадке Западного Нила, многие вопросы, касающиеся патогенеза данного заболевания, остаются открытыми. Большинство авторов считает, что инфекционный процесс при ЛЗН развивается вследствие внедрения вируса и взаимодействия его с организмом человека (Cantile C., et al., 2000; Shieh W.J., et al., 2000; Solomon Т., et al., 2003). Эти взаимоотношения определяются путем внедрения, свойствами и дозой возбудителя, а также резистентностью и реактивностью макроорганизма. Вирус Западного Нила (ВЗН) проникает в организм человека в естественных условиях через кожу при присасывании комара или клеща. Вирус может распространяться гематогенно, вызывая поражение эндотелия сосудов и микроциркуляторные расстройства. Кроме того, вирус Западного Нила тропен к клеткам центральной нервной системы (ЦНС). В некоторых случаях вирус проникает через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) в ЦНС, фиксируется здесь клетками, вызывая воспалительный процесс в ткани головного мозга и оболочках (Писарев В.Б., Григорьева Н.В., 2002; Григорьева Н.В., 2005; Anderson J.F., 1999; Chambers T.J., Diamond M.S., 2003). В связи с этим, ведущим в клинической практике является поражение оболочек и вещества мозга, приводящее к развитию менингеального, общемозгового синдромов, а также очаговой симптоматики. По-видимому, в развитии энцефалита Западного Нила большое значение принадлежит состоянию гематоэнцефалического барьера. Однако до настоящего времени остаётся до конца неразрешённой проблема морфо-функциональных преобразований гематоэнцефалического барьера при данном инфекционном заболевании, что и определило актуальность проведения исследований в этом направлении.

Цель исследования

Оценка морфофункционального состояния гематоэнцефалического барьера при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила.

Задачи исследования

1. Дать комплексную морфологическую характеристику гематоэнцефалического барьера различных отделов головного мозга мышей с учётом этапов инфицирования вирусом Западного Нила.

2. Охарактеризовать роль нейроглии в ходе развития инфекционного процесса у различных групп экспериментальных животных.

3. На основании полученных данных выявить отличия состояния гематоэнцефалического барьера: а) у животных на различных этапах инфицирования вирусом Западного Нила; б) у животных, зараженных различными штаммами вируса Западного Нила.

4. Определить особенности структурных изменений элементов гематоэнцефалического барьера в зависимости от исходов заражения вирусом Западного Нила.

Научная новизна исследования

Впервые изучены морфологические особенности гематоэнцефалического барьера различных отделов головного мозга экспериментальных животных при моделировании лихорадки Западного Нила. Даны морфостереометрическая, электронно-микроскопическая, иммуногистохимическая характеристики структурных преобразований элементов гематоэнцефалического барьера на разных сроках экспериментальной лихорадки Западного Нила.

Впервые установлены общие закономерности морфологических изменений гематоэнцефалического барьера при экспериментальном заражении вирусом Западного Нила. Обнаружены изменения в структурных элементах гематоэнцефалического барьера, имеющие компенсаторно-приспособительный характер и определяющие степень повреждения ткани ЦНС и исход инфицирования.

Научно-практическая значимость

Результаты проведенного исследования позволяют расширить имеющиеся представления по вопросам пато- и морфогенеза лихорадки Западного Нила. Полученные данные свидетельствуют о важном значении структурно-функциональных особенностей гематоэнцефалического барьера в развитии данного заболевания и могут быть использованы для разработки новых методов лечения, а также профилактики лихорадки Западного Нила и ряда других вирусных нейроинфекций.

Основные положения, выносимые на защиту

Характер и распространенность патогистологических изменений нервной ткани при моделировании энцефалита Западного Нила определяются не только особенностями нейротропизма вируса ЗН, но и состоянием гематоэнцефалического барьера.

Морфологические особенности капилляров в областях со слабо выраженными патогистологическими изменениями свидетельствуют об усилении защитной функции гематоэнцефалического барьера.

У заболевших и погибших животных в очагах наибольших патологических изменений наблюдается повреждение гематоэнцефалического барьера, повышение его проницаемости, что ведет к развитию значительных вторичных изменений во всех структурах головного мозга. нейроглия инфекционный вирус гематоэнцефалический

Клетки астроглии и микроглии активно вовлекаются в воспалительный процесс при лихорадке Западного Нила, определяя выраженность и распространенность патогистологических изменений в ЦНС.

Реализация и внедрение результатов исследования

Работа выполнена на кафедре патологической анатомии (заведующий - член - корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.Б. Писарев) ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» и Волгоградском научном центре РАМН и Администрации Волгоградской области.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах патологической анатомии, инфекционных болезней в Волгоградском государственном медицинском университете.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на ежегодных итоговых научных конференциях молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (2005-2006); на III конференции «Гомеостаз и эндоэкология», г. Хургада, Египет (2005); на Пироговской студенческой научной конференции, г. Москва (2006); на II Съезде Российского общества патологоанатомов», г. Москва (2006); на Всероссийской научно-практической конференции: «Арбовирусы и арбовирусные инфекции», г. Астрахань (2006).

Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр патологической анатомии, гистологии, цитологии и эмбриологии, анатомии человека, патологической физиологии, судебной медицины, проблемной комиссии по морфологии Волгоградского государственного медицинского университета и сотрудников отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области 5 июля 2006 года.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы (61 отечественных и 104 зарубежных источника). Работа иллюстрирована 47 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Патоморфологические изменения гематоэнцефалического барьера при лихорадке Западного Нила изучали на экспериментальном материале в ходе моделирования данного заболевания. Экспериментальные исследования проводили в условиях лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

В одной опытной группе 11 мышей, беспородных самцов массой 10 ± 2 г. в возрасте 1 месяца было заражено вирусом лихорадки Западного Нила (штаммом 901, африканской группы, по 0,3 мл внутрибрюшинно). В другой группе, экспериментальные животные (10 мышей того же веса, возраста и пола) заражались штаммом Ig 2266, относящегося к индийской группе. Также использовался внутрибрюшинный способ введения инокулята, в объеме 0,3 мл. После заражения мыши содержались в обычных лабораторных условиях, с обычным режимом кормления, движения, освещения. При уходе за животными, питании и проведении экспериментов руководствовались базисными нормативными документами: Приказом МЗ №750, Рекомендациями комитета по экспериментальной работе с использованием животных при Минздраве России, рекомендациями ВОЗ (Шалимов С.А., соавт., 1988; Березовская И.В., 1993; Абидов М.Т., 1996; Червонская Г.П., соавт., 1998; Zutphen L.F., 1993).

Животные выводились из эксперимента, начиная с 3 суток и до 16 суток после заражения. Учитывая клинические проявления, исследуемые животные были разделены на 4 группы. 1 группа - инкубационный период, 2 группа - заболевшие, но не погибшие животные, 3 группа - умершие в ходе эксперимента, 4 группа - животные без клинических признаков заболевания. Таким образом, при заражении астраханским штаммом, в 1 группе было 5 животных, во 2 группе - 6 , в 3 группе - 4 и в 4 группе - 6 животных. При заражении индийским штаммом, в 1 группе было 4 животных, во 2 группе - 5, в 3 группе - 3 и в 4 группе - 7 животных. Контрольной группой послужили 3 здоровые белые беспородные мыши, не зараженные вирусом ЛЗН, в возрасте 1 месяца, содержавшиеся в аналогичных условиях.

Образцы головного мозга фиксировали нейтральным 10% формалином с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996). С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4-6 мкм. Их окрашивали по стандартным методикам гематоксилином и эозином (Меркулов Г.А., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), тионином по методу Ниссля (Лилли Р., 1969; Меркулов Г.А., 1969). Использовали метод импрегнации парафиновых срезов азотнокислым серебром по Бильшовскому в модификации Ландау для парафиновых срезов (Ромейс Б., 1954).

Иммуногистохимическое исследование с целью выявления астроглии проводили пероксидазо-антипероксидазным методом (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2000) с использованием стрептавидин-биотинового комплекса («NovoCastra») и первичных моноклональных антител: к кислому глиальному фибриллярному протеину астроцитов (GFAP, DakoCytomation, Code N1506).

Иммуногистохимическое исследование с целью определения экспрессии антигенов вируса лихорадки Западного Нила проводили с помощью метода двойных антител по стандартной методике с докраской срезов гематоксилином. Реактивы (в том числе моноклональные антитела) и рекомендации по проведению иммуногистохимического исследования были любезно предоставлены лабораторией биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Микрофотосъемку гистологических препаратов производили на микроскопе MICROS AUSTRIA (Австрия) цифровой фотокамерой «Olympus» (Япония).

Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротоме LKB - 8800. Полутонкие эпон-аралдитовые срезы толщиной 1 мкм окрашивали метиленовой синью. Ультратонкие срезы монтировали на медные сетки. После контрастирования в 0,3% растворе цитрата свинца в течение 20 минут (Nasser Hajibagheri M.A., 1999) срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-540 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопленок «ФТ-40». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».

На фронтальных срезах головного мозга с помощью системы анализа изображений, программы «Видеотест-Морфо-4» (Россия) определяли следующие стереометрические показатели: удельная площадь или объем GFAP - позитивных астроцитов, а также капилляров и нейропиля. На электроннограммах рассчитывали удельную площадь или объем цитоплазматических структур эндотелиальных клеток: рибосом, полисом, элементов гранулярного ЭПР, митохондрий, везикул и вакуолей.

Вариационно-статистическую обработку данных (вычисление средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, доверительный интервал, асимметрию, эксцесс, коэффициент вариации, дисперсию, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, сравнение средних значений по критерию Стьюдента) проводили на ЭВМ IBM-Intel-Celeron-2400 с использованием пакета анализа данных в программе Excel Microsoft Office XP. Значимыми считали различия, если вероятность ошибки р была меньше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Среди гомеостатических приспособлений -- гисто-гематических барьеров, защищающих органы и ткани от чужеродных веществ и регулирующих состав тканевой или межклеточной жидкости, особое место занимает барьерный механизм в центральной нервной системе. Этот морфо-функциональный механизм, получивший название гемато-энцефалического барьера, сохраняет постоянство внутренней среды мозга, регулирует проникновение из крови в мозг биологически активных веществ, метаболитов, а также препятствует поступлению в мозг вирусов, микробов, токсинов, некоторых лекарственных препаратов (Cervos-Navarro J., 1988).

Известно, что большинство инфекций (в том числе и вирусных), вызывающих воспалительные изменения в головном и спинном мозге, сопровождается вовлечением в данный патологический процесс мозговых капилляров с повреждением структуры и функции гематоэнцефалического барьера (De Vries H.E. et al, 1997).

В нашем исследовании в полной мере подтверждаются данные о нейротропизме вируса Западного Нила (Lee E., Lobigs M., 2002; Pepperell C., et al., 2003). Согласно полученным результатам, наиболее «чувствительными» областями у мышей являются ствол головного мозга, серое вещество таламуса, перивентрикулярная область гипоталамуса. При этом характер, локализация и распространенность патогистологических изменений в головном мозге отличаются при инфицировании различными штаммами вируса ЗН, а также в различные периоды заболевания и напрямую зависят от морфо-функционального состояния гематоэнцефалического барьера.

Так, в инкубационном периоде заболевания у зараженных животных отмечаются слабо выраженные изменения в тканях головного мозга. При этом морфологическая картина существенно не различается у животных, зараженных Астраханским и Индийским штаммами вируса Западного Нила. Имеет место либо умеренное сморщивание нервных клеток, либо набухание. Данные изменения носят очаговый характер и наблюдаются преимущественно в париетальной коре, зрительном бугре, некоторых ядрах, локализованных в стволе головного мозга. Выявляется полнокровие в сосудах микроциркуляторного русла, а также незначительный отек вокруг отдельных капилляров.

Суммируя данные, полученные в результате изучения ультратонких срезов различных отделов головного мозга, можно сделать вывод о наличии умеренных изменений структур капиллярной стенки, а также других элементов гематоэнцефалического барьера. Данные изменения сводятся к появлению участков истончения базальной мембраны (БМ), умеренному набуханию перицитарных клеток, а также периферических отростков астроцитов. В отдельных случаях наблюдается повреждение ультраструктур эндотелиальных клеток. Несмотря на отсутствие экспрессии вирусного антигена в ткани головного мозга, очаговые повреждения нервных клеток, связанные с умеренными нарушениями микроциркуляции, свидетельствуют о начальных признаках развития инфекционного процесса.

Период разгара заболевания характеризуется появлением и прогрессированием дистрофических изменений нервных клеток. На этой стадии развития инфекционного процесса проявляется отчетливая разница между характером повреждений в различных отделах головного мозга животных, зараженных Астраханским и Индийским штаммами вируса Западного Нила. При заражении животных Астраханским штаммом вируса ЗН, более выраженные патогистологические изменения наблюдаются в стволе головного мозга, ядрах таламуса, гипоталамуса, в то время как в коре головного мозга, более значительные повреждения выявляются при использовании Индийского штамма. В этих же отделах, преимущественно в нейронах выявляется положительная реакция на вирусный антиген.

Сосудистые изменения носят однотипный характер у животных обеих групп. Отмечается выраженное полнокровие в сосудах практически всех отделов головного мозга, в том числе и сосудистых сплетений желудочков. Имеет место образование умеренных периваскулярных инфильтратов, представленных преимущественно клетками микроглии и лимфоцитами. Прослеживается обратная зависимость между выраженностью периваскулярной инфильтрации и тяжестью дегенеративных изменений нейронов.

В целом выраженность изменений нервных клеток напрямую коррелирует с состоянием ГЭБ. Наиболее серьезное повреждение сосудов МЦР наблюдается в продолговатом мозге, преимущественно, в вентральных отделах и выражается разволокнением и надрывом БМ, либо её утолщением и гомогенизацией; набуханием эндотелиальных клеток, их вакуолизацией и значительными изменениями ультраструктур цитоплазмы; отеком периваскулярных ножек астроцитов и других элементов нейропиля.

При заражении животных Астраханским штаммом вируса Западного Нила, значительные изменения ГЭБ наблюдаются в перивентрикулярной зоне III желудочка: тромбообразование в сосудах МЦР, внутриклеточный отек эндотелиальных и перицитарных клеток с распадом большей части ультраструктур и вакуолизацией цитоплазмы. Подобные процессы прослеживаются и в окружающих сосуд элементах нейропиля, в том числе и периферических ножках астроцитов. В единичных случаях отмечается разрыв межэндотелиальных контактов с расхождением мембран соседних клеток. У животных «индийской» группы обнаруживаются минимальные изменения структуры ГЭБ наряду с увеличением белковосинтетического аппарата эндотелиальных клеток в данной области головного мозга.

В таламических ядрах наблюдаются однотипные повреждения нейронов у животных обеих групп. В основном они сводятся к гидропическим изменениям различной степени выраженности. Причем более тяжелые патогистологические изменения фиксируются в латеральных отделах зрительного бугра, что находит отражение и в структуре ГЭБ в этих отделах. Имеет место отек периферических отростков астроцитов, окружающих капилляры (с распадом большинства органелл и формированием гигантских миелиноподобных структур в цитоплазме); утолщение и гомогенизация БМ в одних участках и разволокнение в других. Кроме того, у животных «индийской» группы в некоторых капиллярах наблюдается выраженный внутриклеточный отек эндотелиальных клеток.

В церебральной коре наиболее значительные изменения обнаруживаются у животных, зараженных Индийским штаммом вируса Западного Нила. При этом их тяжесть уменьшается в ряду: фронтальная кора - париетальная кора - окципитальная кора, что находит отражение и в структуре ГЭБ. Во фронтальном отделе имеет место значительное повреждение эндотелиальных клеток с патологией ультраструктур, образованием вакуолей и миелиноподобных структур. В париетальной коре отсутствуют выраженные изменения основных компонентов ГЭБ. Обращает на себя внимание увеличение синтетического аппарата эндотелиальных и перицитарных клеток, а также формирование мононуклеарных инфильтратов вокруг сосудов.

У мышей, зараженных различными штаммами вируса Западного Нила и погибших на высоте развития клинических проявлений заболевания, патогистологические изменения в головном мозге имеют некоторые различия. У животных «астраханской» группы распространение, характер деструкции нервных клеток, а также патологических изменений ультраструктур ГЭБ, в целом, соответствуют таковым у больных, но не погибших животных.

При морфологическом исследовании головного мозга мышей, зараженных Индийским штаммом вируса, в местах патогистологических изменений обнаруживается большое количество нейронов в состоянии гиперхромного набухания, а также формирование периваскулярных, лимфо-гистиоцитарных инфильтратов различной степени выраженности, что не характерно для животных «астраханской» группы.

В обеих группах, в местах наиболее выраженных морфологических изменений (ствол головного мозга, ядра таламуса и гипоталамуса), наблюдается тяжелая деструкция элементов гематоэнцефалического барьера. Цитоплазма эндотелиальных клеток отечная, практически не содержит сохранных ультраструктур. Наблюдается разрыв межэндотелиальных контактов с расхождением цитолазматических мембран соседних клеток. Базальная мембрана местами разрыхлена и расплавлена. Вокруг капилляров имеет место значительный отек с образованием больших полостей, как внутри глиальных отростков, так и в межклеточных пространствах. Необходимо подчеркнуть, что вышеописанные капилляры контактируют с телами или отростками глиальных клеток с признаками выраженной деструкции (их цитоплазма почти не содержит органелл, заполнена крупными вакуолями и миелиноподобными структурами). В тех случаях, когда с капилляром контактирует сохранный астроцит, повреждения его стенки выражены в меньшей степени.

Комплексное патогистологическое исследование головного мозга животных, которые были заражены, но не имели клинических симптомов заболевания, показало наличие умеренных дистрофических изменений. Повреждения нервных клеток носят незначительный характер и проявляются в виде набухания клеточных тел, частичного хроматолиза, появления отдельных цитоплазматических вакуолей. Нейроны с подобными изменениями обнаруживаются в стволе головного мозга, таламических ядрах, перивентрикулярной области гипоталамуса. При исследовании сосудов МЦР обнаруживаются некоторые различия у животных, зараженных Астраханским и Индийским штаммами вируса Западного Нила. В то время как, у животных из «астраханской» группы отмечается формирование выраженных периваскулярных инфильтратов, у особей «индийской» группы периваскулярная инфильтрация не наблюдается или носит крайне скудный характер (1-2 слоя). Изучение ультраструктуры компонентов ГЭБ показало отсутствие значительных повреждений на всех уровнях. Обнаруживаются изменения БМ в виде утолщения и гомогенизации отдельных участков. Большинство эндотелиальных клеток (а также перицитарных) характеризуется повышенной осмиофилией цитоплазмы и выраженным развитием белковосинтетического аппарата. В местах наиболее тяжелых изменений нервных клеток имеет место просветление цитоплазматического матрикса и повреждение ультраструктур эндотелиоцитов. В периваскулярной ткани определяется умеренный отек (внутриклеточный) элементов нейропиля, в том числе, глиальных клеток.

Таким образом, несмотря на то, что иммуногистохимическая реакция, направленная на выявление вирусного антигена, давала либо отрицательный результат, либо имела место слабая экспрессия в единичных нейронах стволовой части головного мозга, с достаточной долей уверенности можно утверждать, что у данной группы животных развивался энцефалит, протекавший в большинстве случаев субклинически. Это же подтверждают данные иммуногистохимического исследования, свидетельствующие о значительном увеличении по сравнению с контролем объемной плотности GFAP - положительных астроцитов в очагах патоморфологических изменений.

В целом, прослеживается прямая зависимость между выраженностью патогистологических изменений и состоянием ГЭБ в очагах поражений при энцефалите Западного Нила. При этом изменения ультраструктуры капилляров носят неоднородный характер в различные периоды заболевания и в различных отделах головного мозга, что свидетельствует о вариабельной реактивности элементов гематоэнцефалического барьера в ходе развития инфекционного процесса.

Все многообразие и сложность ультраструктурных изменений элементов, формирующих морфологический субстрат гематоэнцефалического барьера при энцефалите Западного Нила, можно свести к следующему.

Эндотелиальные и перицитарные клетки. Как известно, эндотелий (в том числе, и капилляров головного мозга) представляет собой гетерогенную группу. Так, даже в нормальных капиллярах встречаются клетки, имеющие различную электронную плотность. Большинство исследователей полагает, что различие электронной плотности свидетельствует о различной функциональной активности эндотелиальных клеток (Чернух A.M., соавт., 1975).

В ходе исследования оказалось, что у всех групп животных в областях со слабо выраженными патогистологическими изменениями преобладают капилляры, характеризующиеся повышением осмиофилии цитоплазмы эндотелиоцитов, а также увеличением объемной плотности ультраструктур: рибосом, полисом, цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, митохондрий с электронноплотным матриксом (табл. 1.).

Аналогичные изменения мы наблюдали и в перицитарных клетках, являющихся вторым (и последним) специальным элементом клеточной стенки.

Таблица 1 - Относительная объемная плотность рибосом, полисом, цистерн гранулярного ЭПР в цитоплазме эндотелиальных клеток капилляров различных отделов головного мозга экспериментальных животных в %.

Примечание: *- различия с контрольной группой статистически достоверны, p0,05

Уплотнение цитоплазмы за счет увеличения белковосинтетического аппарата мы склонны относить к своеобразным реактивным изменениям эндотелиальных и перицитарных клеток, что, по-видимому, сопровождается усилением защитной функции ГЭБ.

Появление и прогрессирование дистрофических изменений в ЦНС находит свое отражение и в динамике патоморфологических преобразований клеточных элементов сосудистой стенки. Появляются эндотелиоциты и перициты, которые также характеризуются повышенной осмиофилией цитоплазмы и хорошо развитым синтетическим аппаратом, имеющим, тем не менее, очаговые просветления матрикса и деструктивные изменения митохондрий. Вероятно, это свидетельствует о нарушении метаболизма клетки. В дальнейшем данные изменения прогрессируют, в результате чего цитоплазма увеличивается в объеме, количество органелл уменьшается. Как крайний вариант подобных изменений, обнаруживаются эндотелиоциты и перициты с выраженным внутриклеточным отеком, распадом большинства органелл, формированием крупных вакуолей и миелиноподобных структур. Такие клетки выявляются только в капиллярах, располагающихся в очагах максимальных патогистологических изменений. Важно подчеркнуть, что повреждение перицитарных клеток по сравнению с эндотелиальными зачастую носит более выраженный характер и фиксируется на более ранних этапах инфекционного процесса.

Можно предположить, что вышеописанные ультраструктурные изменения эндотелиальных и перицитарных клеток, наблюдаемые в очагах поражения, отражают последовательные стадии одного и того же патологического процесса, характеризующегося воспалительной реакцией эксудативно-пролиферативного типа (Серов В.В., 1995).

В единичных случаях нами обнаруживались еще более «темные» эндотелиоциты. При этом из-за высокой электронной плотности цитоплазматического матрикса затрудняется дифференцировка внутриклеточных структур. Кроме того, в цитоплазме появляется большое количество мелкогранулярного материала, а также единичные липидные гранулы. Мы склонны относить подобные клетки к «патологическим». Более высокая их плотность обусловлена спрессованностью цитоплазмы, так что границы между клеточными органеллами трудно выявляются, и создается впечатление наличия внутриклеточной агрегации, как органелл, так и матрикса.

Учитывая вышесказанное, можно заключить, что в основе одного и того же явления, а именно уплотнения цитоплазмы эндотелиальных и перицитарных клеток при вирусном процессе, могут лежать различные причины (Шахламов В.А., 1971; Чернух A.M., соавт., 1975).

Межклеточные контакты. Как известно, отличительной чертой эндотелия сосудов головного мозга является наличие между двумя соседними клетками специализированных участков контактов, так называемых зон облитерации (zonulae occludentes), которые являются частью морфологической основы гематоэнцефалического барьера (Tanobe K., Nishikawa K., 2003). Необходимо отметить, что в ходе исследования данные структуры претерпевают минимальные изменения. Даже в случае выраженных повреждений соседних эндотелиоцитов связь в области межклеточных контактов не прерывалась. В редких случаях мы наблюдали полный разрыв плотных контактов с расхождением мембран соседних клеток и формированием межэндотелиальных щелей. Подобные изменения прослеживались только в очагах выраженных патогистологических изменений, как правило, у погибших животных.

Базальная мембрана. Немаловажное значение в сохранении целостности ГЭБ в патологических условиях имеет БМ капилляров (Sixt M., et al., 2001). В ходе исследования фиксировались различные ультраструктурные изменения, затрагивающие всю мембрану или отдельные её фрагменты. В одних случаях наблюдается разрыхление и утолщение БМ, снижение её электронной плотности, в других - уплотнение, истончение и прерывание. При этом тяжесть и распространенность патологических изменений коррелируют с выраженностью повреждений других компонентов ГЭБ и окружающих элементов нейропиля.

Глия. Многие авторы отмечают важную роль клеток глии в осуществлении барьерной функции в мозге (De Vries H.E., et al., 1997). Неоспорим тот факт, что клетки глии активно вовлекаются в патологический процесс при арбовирусных энцефалитах. Отмечается диффузная и очаговая пролиферация микроглии и астроцитов, частично подвергающихся деструктивным изменениям (Серов В.В., 1995). Проведенное в рамках данной работы электронно-микроскопическое исследование периваскулярных астроцитов показало, что изменения в периваскулярных астроцитарных ножках появляются уже в инкубационном периоде и прогрессируют по мере развития заболевания. У заболевших и погибших животных в патологических очагах наблюдаются тяжелые повреждения астроцитов: выраженный внутриклеточный отек, вакуолизация, повреждение органелл. На всех стадиях инфицирования выявляется следующая закономерность: чем больше тяжесть изменений в капиллярной стенке, тем значительнее повреждение окружающей капилляр астроглии.

При изучении астроцитарной глии с помощью иммуногистохимического метода (определение глиального фибриллярного белка астроцитов) было выявлено, что все случаи внутрибрюшинного инфицирования животных различными штаммами вируса Западного Нила сопровождались активацией астроглии, выражающейся увеличением объемной плотности иммунопозитивных астроцитов. Наибольшая динамика по данному показателю наблюдалась в гиппокампе, перивентрикулярной области III желудочка и стволе головного мозга (табл. 2.).

Таблица 2 - Относительная объемная плотность GFAP астроцитов в различных отделах головного мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки западного Нила в %.

Примечание: *- различия с контрольной группой статистически достоверны, p0,05

Известно, что вовлечение астроцитарной глии в механизмы ответных реакций при инфекционном процессе может играть двоякую роль при поражениях головного мозга, так как, являясь частью ГЭБ, астроциты, с одной стороны, способствуют поддержанию его целостности, с другой - способны к продукции цитокинов (ФНО, интерлейкин-6), являющихся мощными стимуляторами сосудистой проницаемости (Dallasta L.M., et al., 1999). В проведенном нами исследовании в полной мере проявляется двойственная роль астроцитарной глии в развитии вирусного поражения ЦНС. Увеличение объемной плотности астроглии в очагах дистрофических изменений в период разгара клинических проявлений заболевания свидетельствует о вовлечении астроцитов в воспалительный процесс. Однако иммуногистохимическое выявление астроцитов в ткани головного мозга умерших животных показало гораздо более низкий уровень экспрессии иммунопозитивного материала по сравнению с заболевшими, но не умершими особями (но более высокий по сравнению с контролем). Причем, основная часть астроцитов характеризовалась выраженными дегенеративными изменениями. Это указывает на то, что с одной стороны активация периваскулярной астроглии, по-видимому, усиливает защитные функции ГЭБ и препятствует нарастанию деструктивных изменений нейронов. Причем нередко реакция астроглии наблюдается без значительных изменений в нейронах, что может свидетельствовать о ее первичном характере. Однако в ряде случаев, по мере развития инфекционного процесса, астроциты, являющиеся источниками множества медиаторов воспаления, усиливают повреждение барьера, тем самым, способствуя развитию вторичных патогистологических изменений.

Результаты нашего исследования показывают, что неоднородный характер патогистологических изменений в различных отделах головного мозга определяется не только особенностями нейротропизма вируса, но и состоянием ГЭБ в данных областях. Этот же факт подтверждают различия в патогистологической картине у заболевших и не заболевших животных. В частности, увеличение реактивности эндотелиальных и перицитарных клеток, а также клеток глии (астроглии, микроглии) усиливает протекторные функции ГЭБ и препятствует развитию тяжелых изменений нейронов. Отсутствие явных признаков репликации вируса в клеточных элементах сосудистой стенки, а также глиальных клетках, может свидетельствовать о том, что данные изменения, вероятно, носят иммунологически обусловленный характер в ответ на антигенную стимуляцию. Эти данные подтверждают мысль о том, что развитие воспалительной реакции при ЛЗН является результатом не прямого действия вируса, а следствием взаимодействия факторов иммунитета с вирусом (Григорьева Н.В., 2005).

В то же время, выраженные деструктивные изменения в головном мозге при энцефалите Западного Нила возникают не только вследствие репродукции вируса в нервных клетках, но и в результате серьезных преобразований гематоэнцефалического барьера, что приводит к вторичным тяжелым изменениям во всех морфологических структурах головного мозга.

ВЫВОДЫ

Наиболее выраженные морфологические изменения при энцефалите Западного Нила наблюдаются в стволовой части головного мозга, таламических ядрах, перивентрикулярной области III желудочка независимо от периода и исхода инфекционного процесса. Локализация повреждений обусловлена преимущественно особенностями нейротропизма различных штаммов вируса Западного Нила, однако выраженность и распространенность патогистологических изменений определяется состоянием гематоэнцефалического барьера.

У всех исследуемых групп животных в областях со слабо выраженными патогистологическими изменениями преобладают капилляры, характеризующиеся повышенной осмиофилией цитоплазмы эндотелиальных и перицитарных клеток, увеличением синтетического аппарата, уплотнением базальной мембраны. Данные морфологические изменения свидетельствуют об увеличении реактивности клеточных элементов гематоэнцефалического барьера и усилении его защитной функции.

В период разгара клинических проявлений заболевания, а также у погибших животных, в капиллярах, располагающихся в очагах выраженных патологических изменений, наблюдаются внутриклеточный отек эндотелиальных и перицитарных клеток, повреждение органелл, формирование в цитоплазме вакуолей и миелиноподобных структур; отечность, разрыхление или гомогенизация базальной мембраны; формирование вокруг капилляров значительного отека, как внутри отростков глиальных клеток, так и межклеточных пространствах. Данные ультраструктурные изменения указывают на повреждение гематоэнцефалического барьера, увеличение его проницаемости, ведущие к вторичным изменениям во всех структурах головного мозга.

Глиальные клетки играют двоякую роль в развитии повреждения головного мозга при энцефалите Западного Нила. Активация астроглии и микроглии препятствует нарастанию деструктивных изменений нейронов, в том числе и за счет усиления защитных функций гематоэнцефалического барьера. Однако, в ряде случаев, по мере развития инфекционного процесса, глиальные клетки, являющиеся источниками множества медиаторов воспаления, усиливают повреждение барьера, тем самым, способствуя развитию патогистологических изменений в нервной ткани.

Полученные данные позволили выявить морфо-функциональные особенности элементов гематоэнцефалического барьера: базальной мембраны, эндотелиальных и перицитарных клеток (электронная плотность цитоплазмы, состояние митохондрий и синтетического и аппарата), а также клеток глии, окружающих сосуды микроциркуляторного русла, влияющие на развитие и исход данного патологического процесса.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфологическая характеристика нейронов и сосудов микроциркуляторного русла некоторых отделов продолговатого мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила // Материалы 63-й итоговой науч. конф.студентов и мол. ученых ВолГМУ.- Волгоград, 2005. -С. 126-128. (соавт. В.А. Глухов).

2. Морфологическая характеристика заднего ядра блуждающего нерва при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила // Фундаментальные исследования. - М., 2005, - №2. - С. 32.

3. (соавт. В.Б. Писарев, В.А. Глухов)

4. Морфологические изменения сосудов микроциркуляторного русла некоторых отделов продолговатого мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила // Морфология процессов индивидуального развития, адаптации и компенсации: Сб. науч. ст.- Волгоград, 2005.- Т.62,- вып.1.- С. 84 - 88.

5. Ультраструктурная характеристика капилляров продолговатого мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила // Вестн. Рос. гос. мед. ун-та. - М., 2006. - № 2 (49). - С. 444-445.

6. Клинико-анатомическое изучение лихорадки Западного Нила: состояние проблемы и перспективы // Тр. II Съезда Рос. о-ва патологоанатомов. - М., 2006. - Т.1. - С.331-334. (соавт. В.Б. Писарев, Н.В. Григорьева, А.В. Поройская, Т.А. Белик, В.А. Глухов, В.А. Толокольников).

7. Ультраструктурные изменения сосудов микроциркуляторного русла на уровне продолговатого мозга при экспериментальном воспроизведении лихорадки Западного Нила // Материалы II заочной электронной конф. «Морфогенез и регенерация». - Курск: КГМУ, 2006. - С. 7-8. (соавт. А.Я. Почепцов).

8. Ультраструктурная характеристика нейронов и элементов гематоэнцефалического барьера продолговатого мозга при моделировании вирусного энцефалита // Бюллетень Волгогр. науч. центра РАМН. - 2006. - № 4 - С. 18-20. (соавт. В.Б. Писарев, А.В. Смирнов, А.Я. Почепцов, В.А. Глухов).

Размещено на Allbest.ru