Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

эндотелиопротективные свойства производных ГАМК при недостаточности половых гормонов

14.03.06. фармакология, клиническая фармакология

Робертус Александра Игоревна

Волгоград 2010



Работа выполнена на кафедре фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей, НИИ Фармакологии ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Дудченко Галина Петровна

доктор медицинских наук Решетько Ольга Вилоровна

Ведущая организация: НИИ Фармакологии имени В.В. Закусова РАМН

Защита состоится «_____»____________2010 г. в __________часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

Автореферат разослан «_____»_______________2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук,

профессор А.Р.Бабаева



ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Согласно демографическим данным всемирной организации здравоохранения, в XXI веке предполагается значительное увеличение численности пожилого населения. В связи с этим большинство женщин более трети своей жизни будут проводить, находясь в постменопаузе. Уже сейчас приблизительно 95% всех женщин в индустриально развитых странах доживают до этого периода [Casaclang-Verzosa et al, 2010]. Постменопауза характеризуется постепенным угасанием функции половых желез и снижением уровня женских половых гормонов. С другой стороны, в последние годы отмечается рост гинекологических заболеваний, таких как доброкачественные и злокачественные опухоли матки и ее придатков, эндометриоз и другие, требующих радикального оперативного вмешательства, что приводит к омоложению контингента женщин с недостаточностью половых гормонов (НПГ) [P. Collins 2007]. Снижение уровня половых гормонов в результате возрастного угасания функции яичников или вследствие овариоэктомии ведет к развитию климактерического синдрома, росту сердечно-сосудистых заболеваний, причем при хирургической менопаузе риск сердечно-сосудистых осложнений (ССО) наиболее высокий, так как нет физиологической адаптации организма к новым условиям [Salpeter SR et all. 2006, K. Denton 2007].

Наблюдаются различные нейроэндокринные и сосудистые нарушения : активация симпатической и ренин-ангиотензин-альдостероной системы [Wenzel R. R. et all. 2006], повышение уровня холестерина и липополипротеинов низкой плотности, активация перекисного окисления липидов (оксидативный стресс), возрастание уровня фибриногена, вязкости, свертываемости крови и ухудшение реологии крови [Miller V. M., 2009], понижение стрессоустойчивости, все это в конечном итоге ведет к развитию эндотелиальной дисфункции (ЭД) и сердечно-сосудистыми заболеваниями [Vitale C. et all, 2008, Сoylewright M., 2008, F. Gungor et all. 2009]. Взаимосвязь между НПГ, а также ЭД и ростом заболеваемости и смертности от ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии, хронической сердечной недостаточности в период менопаузы у женщин очевидна.

Для профилактики ЭД и ССО при НПГ представляется логичной заместительная гормональная терапия, но она себя оправдала в неполной мере, так как высок процент грозных осложнений. Поэтому поиск средств профилактики эндотелиальной дисфункции и сердечно-сосудистых осложнений продолжается [Minkin M. J., 2007, Сметник В. П., 2008]. Учитывая поливалентность действия производных гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и в частности, влияние на многие патогенетические механизмы, ведущие к нарушению функции эндотелия: симпатоингибирующее, антиишемическое, антистрессорное и антиоксидантое действие, а также, принимая во внимание спектр их психотропного, ноотропного действия, коррекции тревожно-депрессивной симптоматики - можно предположить, что данные соединения могут оказаться эффективными средствами профилактики и лечения сердечно-сосудистых осложнений, обусловленных НПГ и психо-эмоциональным состоянием. Исходя из вышеизложенного, представляется перспективным провести исследование эндотелиопротективных свойств производных ГАМК, в условиях недостаточности половых гормонов.

Целью исследования является экспериментальное обоснование применения производных ГАМК в качестве эндотелиопротекторов при НПГ.

Задачи исследования.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить влияние производных ГАМК и препаратов сравнения на вазодилатирующую функцию эндотелия при НПГ.

2. Изучить влияния производных ГАМК на антитромботическую функцию эндотелия в условиях НПГ.

3. Изучить влияние производных ГАМК на основные параметры гемостаза крови животных с НПГ.

4. Изучить противовоспалительную функцию эндотелия при НПГ и влияние на нее производных ГАМК.

5. Дать морфологическую оценку состояния эндотелия при НПГ и применении производных ГАМК.

Новизна исследования.

Впервые изучены эндотелиопротективные свойства у производных ГАМК (соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон) на фоне НПГ.

Впервые предложена комплексная методика, которая позволяет дать оценку вазодилатирующей функции эндотелия и косвенно оценить мощность и стабильность функционирования NO системы эндотелия.

Впервые изучены гендерные различия в развитии ЭД при экспериментально вызванной недостаточности половых гормонов (ЭНПГ).

Впервые показана способность производных ГАМК улучшать вазодилатирующую, антитромботическую, противовоспалительную функции эндотелия, положительное влияние на основные параметры гемостаза.

Научно-практическая ценность работы.

Полученные данные об эндотелиопротективном действии производных ГАМК (улучшении вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной функции) расширяют понимание возможных механизмов их кардиоваскулярного действия и свидетельствуют о перспективности разработки на основе соединения РГПУ-147 - кардиопротектора с эндотелиопротективным действием, а на основе соединения РГПУ-189 -средства, улучшающего мозговое кровообращение, а также эндотелийзависимую вазодилятацию и антитромботический потенциал эндотелия.

Полученные сведения об эндотелиальной дисфункции мозговых сосудов при недостаточности половых гормонов требуют ее коррекции, в том числе и исследуемыми ГАМК-ергическими средствами.

Разработанный комплексный подход для оценки эндотелийзависимой вазодилатации, позволяет косвенно оценить мощность функционирования NO системы, и оценить эндотелиотропные свойства исследуемых веществ, состояние эндотелиальной дисфункции (ЭЗВД, антитромботической, противовоспалительной функции).

Положения, выносимые на защиту:

1. НПГ приводит к развитию эндотелиальной дисфункции в большей мере у самок при хирургической кастрации, чем у самцов.

2. Производные ГАМК (соединение РГПУ-189, соединение РГПУ-147, фенибут, пикамилон) обладают эндотелиопротективными свойствами, что проявляется в улучшении его вазодилатирующей, антитромботической, противовоспалительной активности у животных на фоне НПГ.

3. Соединение РГПУ-189 обладает наибольшей эндотелиопротективной активностью, чем соединение РГПУ-147, фенибут и пикамилон, и является перспективным для дальнейшей разработки в качестве эндотелиопротективного средства.

4. Разработанный комплексный подход изучения эндотелиальной функции может использоваться для оценки эндотелиозависимой вазодилатации, позволяет косвенно оценить мощность функционирования NO системы и выраженность эндотелиальной дисфункции, а также эндотелиотропное действие биологически активных веществ.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались и обсуждались на VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» ( Москва, 2006), III международной медико-фармацевтической конференции студентов и молодых ученых (Черновцы, 2006), VIII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке (РУДН, Москва,2007), III съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, 2007), 14-ом всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2008), международной научной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль,2009), 65-ой, 66-ой, 67-ой открытой итоговой конференции студентов и молодых ученых Волгоградского Государственного Медицинского Университета (2007-2009) (диплом I степени среди молодых ученых(2009)). По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа, в том числе 6 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 226 источников, из них 76 отечественных и 150 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит таблиц -12, рисунков -38, схем - 1.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование было выполнено на 266 крысах самках и самцах, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом, на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТР 50258-92), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях, а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу МЗ РФ №267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP). Животные были получены из питомников «Столбовая», «Рапполово». Эксперименты были одобрены комитетом по этической экспертизе доклинических исследований ВолГМУ (протокол № 23-2007 от 14.11.07). эндотелий гормон менопауза аминомасляный

Были изучены эндотелиопротективные свойства следующих соединений - РГПУ-147 (50мг/кг), РГПУ-189 (15мг/кг), фенибут - (25мг/кг), пикамилон (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА») - 100мг/кг. Использовались наиболее эффективные дозы, выявленные при изучении нейропротекторной, антистрессорной, антиишемической и кардиотропной активности данных соединений. Первые три вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена (Санкт-Петербург, Россия) .

В качестве препаратов сравнения были использованы: сулодексид - 30 ЕВЛ (единицы высвобождения липопротеинлипазы) (Аlfa Wassermann , Италия) - препарат с доказанным ЭПД; мексидол (ООО «НПК»- «Фармасофт», Россия)-100 мг/кг. Способ введения всех перечисленных веществ - per os, в течении месяца, в первую половину дня. В качестве растворителя использовали 0,9% раствор хлорида натрия. Контрольным группам животных: интактным, ложнооперированным (ЛО) и животным с НПГ вводился физиологический раствор в эквивалентном объеме.

Работа выполнена в 3 этапа:

На I этапе изучены гендерные различия развития ЭД при НПГ

На II этапе изучено влияние исследуемых соединений на ЭД при ЭНПГ;

На III этапе изучено влияние исследуемых соединений на ЭД при возрастном нарушении гормонального фона у самок (ВНПГ).

ЭНПГ как модель нарушения функции эндотелия воспроизводилась:

- у самок путем экстирпации матки с придатками; - у самцов удалением яичек. ЭД, связанная с возрастом изучалась на самках в возрасте старше 2 лет, с массой 270-300 г. Контроль эффективности кастрации производился с использованием цитологического метода определения стадии полового цикла. Для анализа разного уровня эндогенных эстрогенов после операции были выбраны три наиболее характерные фазы полового цикла: диэструс, проэструс и эструс (Розен, 1994), определение фаз проводили с помощью характерных морфологических признаков по влагалищным мазкам согласно описанию Я. Д. Киршенблата (1969).

Для исключения влияния эстрального цикла на активность различных звеньев регуляции кровообращения у групп ЛО и интактных самок исследование выполнялось только в фазу диэструса, когда колебания гормонального фона минимальны.

На I, II и III этапах нашей работы был использован комплексный морфо-функциональный подход оценки состояния эндотелия, включающий в себя:

Ш оценку вазодилатирующей функции эндотелия в условиях блокады и модификации синтеза эндогенного NO;

Ш исследование антитромботической функции эндотелия;

Ш анализ влияние на основные параметры гемостаза;

Ш изучение противовоспалительной функции эндотелия;

Ш исследование морфологического состояния эндотелия;

Известно, что проявление ЭД связывают в первую очередь с недостатком продукции или нарушением биодоступности NO. Принято считать, что продукцию NO эндотелием in vivo достоверно отражает состояние эндотелииозависимой вазомоторной функции. Так как система синтеза NO играет ключевую роль в функционировании эндотелия, и при этом, является наиболее уязвимой к действию повреждающих агентов - именно она и послужила объектом изучения при исследовании вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозга, отличающегося от других сосудистых областей более мощной NO- синтазной системой [Максимович Н.Е., 2005].

Вазодилатирующую функцию эндотелия оценивали в условиях модификации синтеза эндогенного NO при внутривенном введении анализаторов в следующей последовательности - ацетилхолин (АЦХ) (0,01 мг/кг, Acros organics, США); L-аргинин (300 мг/кг, Acros organics, США); нитроглицерин (0,007мг/кг, МТХ, Москва) и блокатор синтеза нитрооксида - нитро- L -аргинина (10 мг/кг, Acros organics, США). Регистрация изменений скорости мозгового кровотока (СМК) в проекции средней мозговой артерии в теменной области головного мозга крыс с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗОП-010-01 с рабочей частотой 25МГц и рабочей компьютерной программы ММ-Д-К-Minimax Doppler v.1.7. (Санкт - Петербург, Россия). Каждое введение анализатора осуществлялось после возвращения СМК до исходного уровня. Мы предполагаем, что один и тот же датчик, размещенный над тканью органа, регистрирует скорость кровотока в определенной, сопоставимой по массе ткани, а не во всем органе. Скорость кровотока фиксировали в ус. ед.. При введении анализатора, мы регистрировали изменение СМК, а затем, по увеличению/уменьшению СМК в процентах по отношению к исходному уровню судили о расширении/сужении сосудов и косвенно об участии системы NO в регуляции тонуса сосудов и кровообращения. В дополнении к этому анализировалась степень эластичности сосудистой стенки (индекс Гослинга- PI) и периферическое сопротивление (индекс RI) сосудов головного мозга. Программное обеспечение аппарата «Минимакс-Допплер-К» позволяет их вычислить, они являются относительными величинами и не имеют единиц измерения.

Для оценки мощности и стабильности эндотелиальной NO-синтазной системы был использован разработанный нами метод многократного введения АЦХ с применением двух методических приемов.

В первом случае осуществлялось 10-кратное введение АЦХ, в дозе 0,01 мг/кг, каждое повторное после восстановления кровотока в ответ на предыдущее введение анализатора. Второй методический прием выполнялся следующим образом, АЦХ мы вводили трехкратно в дозах: 0,01 мг/кг; 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг. По проценту прирост СМК по отношению к исходу после каждого введения АЦХ оценивали влияние исследуемых соединений на мощности и стабильности NO-синтазной системы эндотелия.

Исследование антитромботической функции эндотелия.

Исследование антитромботической активности соединений проводили на модели артериального тромбоза у крыс, вызванного поверхностной аппликацией 50% раствора хлорида железа (III) (Kurz K.D., 1990).На наркотизированных крысах (небуталом 40 мг/кг), на участок предварительно выделенной сонной артерии длиной около 1 см накладывали ватный диск, смоченный 50% раствором хлорида железа (0,025 мл). Для изоляции окружающих тканей под сосуд подкладывали пленку Parafilm. Выше места аппликации устанавливался ультразвуковой датчик аппарата Допплера. Регистрацию кровотока вели до полной окклюзии сосуда. По увеличению/снижению времени до полного прекращения кровотока от момента наложения раствора хлорида железа оценивали влияние исследуемых соединений на антитромботическую функцию эндотелия.

Исследования системы функционального состояния гемостаза и влияния на него производных ГАМК.

После курсового введения исследуемых веществ животные всех экспериментальных групп в течение 18 часов до эксперимента находились на свободном питьевом режиме при полной пищевой депривации. Забор крови производился из брюшной аорты под легким эфирным наркозом. Вязкость крови определяли на анализаторе крови реологическом АКР-2 (Россия) при различных скоростях сдвига (от 300 до 10с^-1). Влияние веществ на агрегацию эритроцитов оценивали по индексу агрегации, рассчитываемому как отношение вязкости крови при скорости сдвига 10^с-1 к вязкости крови при 300 ^с-1 (Dintenfass L., 1989). Влияние веществ на агрегацию тромбоцитов исследовали на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель 220 LA) научно-произодственной фирмы «Биола» (г. Москва, Россия) по методу Born G. (1962) в модификации Габбасова З.А. и соавторов (Габбасов З.А., Попов Е.Г., Гаврилов И.Ю. и др., 1989). Исследования проводили на богатой тромбоцитами плазме (Люсов В.А., Белоусов Ю.Б., 1971). В качестве индуктора агрегации использовали динатриевую соль аденозин-5-дифосфорной кислоты (АДФ) (фирмы «Reanal», Венгрия) в концентрации 5 мкM . Определение фактора Виллебранда - как маркера дисфункции эндотелия - проводилось с помощью «Набора для определения фактора Виллебранда на агрегометре «Биола» (производство НПО РЕНАМ, Россия) на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов научно-произодственной фирмы «Биола» (г. Москва, Россия).

Определение показателей гемостаза осуществлялось на прогаммируемом оптико-механическом коагулометре - Минилаб 701 с использованием наборов для определения протромбинового времени, тромбин-теста, фибриноген - теста, активированного частичного тромбопластинового времени (производство НПО РЕНАМ, Россия). Исследование системы функционального состояния гемостаза при НПГ проводилось также с помощью нового инструментального метода с использованием анализатора реологических свойств крови АРП-01 «МЕДНОРД», который обеспечивал автоматическую регистрацию параметров процесса свертывания крови.

Дополнительно в каждой серии экспериментов как маркеров повреждения эндотелия регистрировалось количество десквамированных (циркулирующих) эндотелиоцитов(ЦЭ) в крови. Метод определения ЦЭ [Hladovec J. 1978] основан на изоляции клеток эндотелия вместе с тромбоцитами с последующим осаждением тромбоцитов с помощью аденозиндифосфата (АДФ) [Н.Н. Петрищев, Т.Д. Власов,2001].

Для оценки воспаления сосудистой стенки и изучения влияния исследуемых соединений на данный показатель определяли уровень С-реактивного белка (СРБ) с помощью набора реагентов для качественного и полуколичественного определения содержания СРБ в сыворотке крови методом латекс - агглютинации (СРБ-Ольвекс; Ольвекс дианостикум, Россия). Анализ содержания липидов у животных с НПГ проводился следующим образом: концентрации общего холестерина определяли в сыворотке крови, а липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) в супернатанте после преципитации липопротеидов, содержащих липопротеидов очень низкой плотности и липопротеидов низкой плотности с помощью наборов ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ Кат.No: 013.004 - 100 мл с калибратором (определение ЛПВП), ОЛЬВЕКС ДИАГНОСТИКУМ кат. №№013.002, 013.012 или 013.022 (определение общего холестерина).

После завершения каждой серии экспериментов осуществлялось морфологическое изучение сосудов головного мозга. Животных наркотизировали введением этаминала-натрия в дозе 40 мг/кг, внутрибрюшинно. Далее крыс декапитировали, извлекали головной мозг, который и служил дальнейшим материалом для исследования. Материал фиксировали в течение 24 часов в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4). Материал обезвоживали и заливали в парафиновые блоки по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике [Лилли Р., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой Canon (Japan, 5.0 мегапикселей) на базе микроскопа Axiostar plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х10; х40 и окуляра х10. Морфометрическую оценку осуществляли на базе компьютерной системы «ВидеоТестМорфо-4» (Россия, г. Санкт-Петербург) [Автандилов Г.Г. 2002].

Нами был предложен комплексный подход в оценке морфологического состояния эндотелия, включающий в себя следующие критерии: толщина стенок сосуда; соотношение интима/медиа; явления стаза, тромбоза или первых признаков образования тромбов; наличие их десквамации, некроза; увеличение проницаемости эндотелия; пролиферация эндотелия.

С целью оценки изменения уровня гормонов в исследуемых группах при моделировании НПГ был использован иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием автоматического ридера Elx800. Измерение проводилось с использованием наборов: Прогестерон ELISA EIA-1561, Пролактин ELISA EIA-1291, Фолликулостимулирующий гормон ELISA EIA-1288, Эстрадиол ELISA EIA-2693, ( DRG Instruments GmbH, Германия).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента, непараметрического U-критерия Манна-Уитни, критерия Ньюмена-Кейлса, критерия Уилкоксона, критерия Крускуола-Уоллиса. Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Excel XP, BioStat 2008 5.2.5.0. Статистически значимыми расценивались эффекты при p<0,05 [Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Изучение вазодилатирующей функции сосуда у животных обоего пола при ЭНПГ. Суммированные данные об изменении СМК у интактных, ЛО и животных с НПГ представлены в таблице 1.

Таблица 1.Изменение СМК интактных, ложнооперированных и животных с ЭНПГ обоего пола при введении анализаторов

Интакт самцы

Интакт самки

ЛО самцы

ЛО самки

ЭНПГ самцы

ЭНПГ самки

исход

мах

исход

мах

исход

мах

исход

мах

исход

мах

исход

Мах

АЦХ

19,64 ± 0,34

27,8 ± 0,31 41,54 %

17,69 ± 0,54

25,98 ± 0,69 46,8%

20,7 ± 0,2

30,25 ± 0,41 46,1%

18,3 ± 0,3

27,68 ± 0,55 51,25%

18,83 ± 0,06

24,56 ± 0,08 30,4% &

17 ± 0,22

20,22 ± 0,06 18,9% &,*

Lарг

20,4 ± 0,62

22,08 ± 0,26 8,2 %

18,39 ± 0,39

20,32 ± 0,44 10,2%

22,5 ± 0,8

23,94 ± 0,35 6,4 %

20,55 ± 1,05

21,98 ± 0,42 6,95%

18,83 ± 0,41

25,05 ± 0,09 33 %&

17,1 ± 0,3

24,22 ± 0,18 41,63% &,*

НТ Г

20,2 ± 0,14

32,4 ± 0,72 56,9%

18,95 ± 0,67

30,38 ± 0,64 59,9%

22 ± 1,4

33,82 ± 0,46 53,7%

20,55 ± 0,7

32,18 ± 0,59 56,6%

19,3 ± 1,1

30,61 ± 0,43 58,5%

17,7 ± 1,05

27,62 ± 0,19 56,04%

нLарг

19,94 ± 0,22

17,16 ± 0,36 -13,9%

18,92 ± 0,61

15,99 ± 0,24 -15,5%

21,98 ± 1,6

18,85 ± 0,82 -14,3%

19,4 ± 0,62

16,46 ± 0,39 -15,1%

18,83 ± 0,19

17,05 ± 0,49 -9,45%

17 ± 0,74

15,68 ± 0,59 -7,76%&

Примечание: исход - исходная СМК в ус.ед.(M±m); мах - максимальная СМК в ответ на введение анализатора в ус.ед.(M±m); ЛО - ложнооперированные животные, Ацх - ацетилхолина, Lарг - L-аргинина, нLарг - нитро-L-аргинина, НТГ- нитроглицерин. ^&- различия статистически значимы по сравнению с группами интактных и ЛО животных (p< 0,05, непараметрический U-критерий Манна-Уитни) ; *- различия статистически значимы по сравнению с группой животных ЭНПГ - самцы (p< 0,05, непараметрический U-критерий Манна-Уитни), % - процент изменения СМК при введении анализатора по сравнению с исходным уровнем.

В ходе исследования было выявлено, что нарушения ЭЗВД наблюдаются как у самцов, так и у самок, однако в большей мере проявляются у последних. Необходимо отметить, что изменение СМК на фоне модификации выработки эндогенного NO у интактных и ЛО крыс не зависит от пола животного и имеет одинаковую направленность и степень выраженности.

Увеличение СМК при введении ацетилхолина (АЦХ) составило в среднем 30,4% (у самцов с ЭНПГ) и 18,9% (у самок с ЭНПГ) от исходного уровня, что было значительно ниже по сравнению со скоростью церебрального кровотока животных без гормональной патологии, при этом наблюдается статистически значимая разница между приростом СМК у самок и самцов.

Введение L-аргинина самцам с ЭНПГ усиливало СМК на 33,05% и на 42,47% у самок с ЭНПГ. Полученные результаты на данном этапе эксперимента статистически значимо отличаются от результатов интактных (самцов и самок) и ЛО животных (самцов и самок) ( р 0,05) ( Таблица 1). Вероятнее всего, это можно объяснить с помощью теории «L-аргининового парадокса», согласно которой, при ЭД, вследствие накопления ADMA, происходит нарушении транспорта L-аргинина в клетку и угнетение eNOS. а введение экзогенного L-аргинина приводит к преодолению этих барьеров. При этом, у интактных животных введение экзогенного L-аргинина практически не вызывает вазодилатации. Также необходимо отметить, что сосудистый ответ на введение Л-аргинина у самок, статистически значимо отличается от прироста СМК у самцов (р 0,05).

Проба с нитроглицерином показала, что эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВД) у животных всех экспериментальных групп сохранена и практически сопоставима.

После введения нитро-L-аргинина отмечалось падение СМК у группы самцов и самок с ЭНПГ составила 9,45% и 7,76%, соответственно. В то время как у интактных и ЛО животных СМК снизилось в среднем на 14,1% (у самцов) и на 15,3% (у самок) по сравнению с исходным уровнем (Таблица 1).

В тесте с многократным введением АЦХ (0,01 мг/кг) как у самок, так и у самцов с ЭНПГ, начиная с третьего-пятого введения АЦХ, отмечалось прогрессирующее снижение прироста СМК, причем у самок в большей степени. Тогда как в группах ЛО животных повторяющиеся введения АЦХ вызывали практически равное увеличение СМК во всех десяти пробах.

Также у животных с ЭНПГ наблюдаются статистически значимые изменения индексов Гослинга и Пурсело. В группе самцов и самок с ЭНПГ регистрировалось статистически значимое повышение сосудистого сопротивления на 18 % и 35 % (p<0,05), и увеличение жесткости сосудов на 38,9 % ( p<0,05) и 64 % ( p<0,01), соответственно, по сравнению с контролем. Большее возрастание значений индексов у самок также свидетельствует о более выраженном нарушении эндотелия.

Оценка влияния производных ГАМК на вазодилатирующую функцию эндотелия при ЭНПГ. Результаты тестирования эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) свидетельствуют, что НПГ приводит к нарушению в системе синтеза и высвобождения NO (Рисунок 1).

При введении АЦХ животным, получавшим соединения РГПУ-189 и РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид было отмечено статистически значимое ( р <0,01) повышение СМК, соответственно, на 46,81%; 34,87%; 31,2 %; 35,8%; 50,5% и 67,5% от исходного уровня СМК. При этом прирост СМК у первых 4-х групп был меньше, чем в группе ЛО животных и получавших мексидол и сулодексид, но значительно больше аналогичного показателя у животных группы ЭНПГ без экспериментальной фармакотерапии (ЭФТ) (Рисунок 1).

Введение L-аргинина животным с ЭНПГ, получавшим соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид усиливало СМК, соответственно, на 19,6%; 40,2%; 43,3%; 39,7%; 37,3% и 12,96% от исходного уровня, что было меньше, соответственно, на 60,9%; 40,4%; 37,18%; 40,7%; 43,2% и 67,5%, по сравнению с аналогичным показателем у контрольной группы (Рисунок 1). Это так же свидетельствует о наличии у изучаемых соединений эндотелиопротективной активности. На введение нитроглицерина (ЭНЗВД) отмечается практически равное увеличение СМК у животных всех экспериментальных групп.

У животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид после введения нитро-L-аргинина отмечалось падение СМК на 28,82%; на 21,3%; на 24,4%; на 24,31%; на 28,5% и на 32,7% по сравнению с исходным уровнем, соответственно (Рисунок 1).

Рисунок 1. Влияние изучаемых соединений на процент изменения тонуса сосуда при модификации синтеза эндогенного оксида азота у животных с ЭНПГ.



Полученные результаты свидетельствуют о наиболее выраженном эндотелиопротективном действие среди производных ГАМК у соединения РГПУ-189.

Золотым стандартом при изучении эндотелийзависимой вазодилатации (ЭЗВД) является введение АЦХ. Маркером ЭД в таких исследованиях, является ослабление сосудорасширяющей реакции на введение АЦХ или ее извращение. Выявленные различия в выраженности сосудистого ответа между группами ЛО и животных с ЭНПГ без ЭФТ при введении АЦХ в нарастающих дозах, могут свидетельствовать о том, что НПГ приводит к сосудистой патологии с нарушением вазодилатарующей функции эндотелия (Рисунок 2).

Введение АЦХ в нарастающих дозах показало способность исследуемых веществ положительно влиять на функциональные резервы эндотелия. В особенности это проявилось у производных ГАМК соединений РГПУ-189 и РПУ-147, которые по данному виду активности превосходили фенибут, пикамилон были сопоставимы с препаратом сравнения мексидолом, но уступали сулодексиду (Рисунок 2).

Рисунок 2. Влияние исследуемых соединений на СМК кастрированных крыс при введении АЦХ в нарастающих дозах при ЭНПГ.



Предполагается, что многократное введение АЦХ через короткий интервал времени позволит оценить скорость восстановления NO-синтазной системы эндотелия, то есть стабильность и мощность её функционирования.

При многократном введении АЦХ (в одинаковой дозе 0,01 мг/кг) при-рост СМК в группе ЛО животных оставался на одном и том же уровне, а у животных с ЭНПГ уже с 3-го введения происходило снижение прироста СМК вплоть до его полного отсутствия при 8-10-ом введении. Это может свидетельствовать об истощении системы синтеза NO, снижении ее мощности у животных с гормональной недостаточностью.

В группах животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон введение 1-ой дозы АЦХ, увеличивало СМК на 47,8%; 37,9%; 32,7% и 40,8% по сравнению с исходным уровнем, соответственно. Наблюдаемая разница статистически значимо превышала прирост СМК в группе животных с ЭНПГ, не получающих исследуемые вещества. Введение последующих доз (начиная с пятой) приводило к незначительному снижению прироста СМК в группе животных с ЭНПГ, получавших соединение РГПУ-189 (44%) и к более выраженному снижению прироста СМК у животных с ЭНПГ, которым вводили соединение РГПУ-147 (31%); фенибут (28%) и пикамилон (38,6%).

Несмотря на дальнейшее снижение прироста СМК в исследуемых группах, в отличие от группы с ЭНПГ без ЭФТ, прирост СМК сохранился даже при 10-ом введении - у животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189 (39,5%) и РГПУ-141 (21%); фенибут (18%) и пикамилон (32,7%) (Рисунок 3). По влиянию на сохранность ЭЗВД соединение РГПУ-189 уступало сулодексиду, было сопоставимо с мексидолом, но превосходило соединение РГПУ-147, фенибут, пикамилон.



Рисунок 3. Влияние исследуемых соединений на прирост скорости мозгового кровотока у животных с ЭНПГ при многократном введении АЦХ при ЭНПГ.

Таким образом, у ЛО животных наблюдалось стабильное увеличение СМК при многократном введении АЦХ, тогда как у животных с ЭНПГ без ЭФТ отмечалось прогрессирующее снижение прироста СМК в тех же условиях эксперимента (как при 10-кратном, так и при введении в нарастающих дозах). Все исследуемые аналоги ГАМК, но в большей степени соединение РГПУ-189, давали в несколько раз большее увеличение СМК по сравнению с контрольной группой, сопоставимое с мексидолом, но уступали сулодексиду.

Рисунок 4. Влияние изучаемых соединений на процент прироста/падения СМК на фоне модификации синтеза эндогенного оксида азота у животных с ВНПГ.



Оценка эндотелиопротективного действия (ЭПД) производных ГАМК при активации и блокаде синтеза эндогенного оксида азота, у животных ВНПГ. При введении АЦХ соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, сулодексид увеличивают прирост СМК на 54%, на 48%, на 40,9% и на 65,6%, соответственно, по отношению к исходному уровню СМК(p< 0,05).

У животных с ВНПГ введение Л-аргинина вызывало прирост СМК на 63,3% по отношению к исходному уровню. В группах животных с ВНПГ, получавших производные ГАМК - РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут и сулодексид СМК при введении Л-аргинина, увеличилась на 22,7%; 30,3% и 38,6% и 6,9%, соответственно, по сравнению с исходом(p< 0,05), это свидетельствует о наличии ЭПД у изучаемых соединений (Рисунок 4). ЭНЗВД во всех исследуемых группах ЭНЗВД была сохранена.

Рисунок 5. Влияние исследуемых соединений на скорость церебрального кровотока у животных с ВНПГ при введении АЦХ в нарастающих дозах (А) и при многократном введении АЦХ (В).



При введении нитро-Л-аргинина падение СМК по отношению к исходному уровню наблюдалось в меньшей степени у животных с ВНПГ- 15,4%, а в большей степени у животных, которым вводили сулодексид - 36,7%. Снижение СМК в группах с ВНПГ, которым вводили производные ГАМК, составило 28,7% (соединение РГПУ-189); 24,2% (соединение РГПУ-147) и 21,6% (фенибут).

Введение АЦХ в нарастающих дозах и при многократном введении животным с ВНПГ, также подтвердило, что наиболее выраженное ЭПД выявлено у соединения РГПУ-189 в сравнении с другими производными ГАМК. По мере увеличения выраженности сосудистого ответа их можно распределить в следующем порядке фенибут < РГПУ-147 < РГПУ-189 < сулодексид (Рисунок 5).

Оценка влияния производных ГАМК на антитромботическую функцию эндотелия при ЭНПГ. В норме интактный эндотелий выполняет роль атромбогенного барьера между стенкой сосуда и циркулирующей кровью, препятствует ее свертыванию и тромбообразованию [Балуда В.П.1992, Долгов В.В., Свирин П.В., 2005]. Однако, при повреждении эндотелия сосуда антитромботический потенциал эндотелия может меняться на тромбогенный.

Изучение антитромботической функции эндотелия (АФЭ) у животных обоего пола при ЭНПГ показало, что наибольшие изменения происходили у самок с ЭНПГ (большее увеличение индекса агрегации тромбоцитов(ИАТ), снижение индекса дезагрегации тромбоцитов(ИД), снижение индекса агрегации эритроцитов(ИАЭ) по сравнению с аналогичными показателями у самцов), поэтому дальнейшие исследования по изучению влияния производных ГАМК на АФЭ было проведено на самках.

Изучение влияния производных ГАМК на скорость тромбообразования у животных с ЭНПГ при аппликации 50% раствора хлорида железа(III) на адвентицию сосуда [Angelillo-Scherrer A., 2004] показало, что все исследуемые соединения обладают противотромбической активностью, однако в большей мере это проявляется у соединения РГПУ-189 и сулодексида. У животных с ЭНПГ, получавших соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут, пикамилон, мексидол и сулодексид время до полной окклюзии сосуда в 1,42; 1,3; 1,16; 1,33; 1,37 и 1,52 раза, соответственно, по сравнению с ЭНПГ (Рисунок 6).

При ЭД происходит изменение эндотелиального потенциала на прокоагулянтный, провоспалительный, тромбогенный, что в совокупности приводит к нарушениям в системе гемостаза. Поэтому при изучении АФЭ целесообразно дать оценку изменениям как сосудисто-тромбоцитарного, так и коагуляционного гемостаза.

Рисунок 6. Влияние изучаемых соединений на скорость образования тромба у животных с ЭНПГ.

Влияние исследуемых соединений на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз при ЭНПГ. У животных с ЭНПГ отмечается увеличение агрегации тромбоцитов, об этом свидетельствует статистически значимое увеличение индекса агрегации тромбоцитов (ИАТ) на 70,22%, увеличение скорости агрегации тромбоцитов на 102,22% по сравнению по сравнению с группой ЛО животных (р<0,05)(Рисунок 7).



А

В

Рисунок 7. Влияние изучаемых соединений на индекс агрегации (А), индекс дезагрегации (В), на скорость агрегации тромбоцитов (С) крови у животных с ЭНПГ.

Примечание: &- различия статистически значимы по сравнению с группой ложнооперированных животных,*-; **- различия статистически значимы по сравнению с группой ЭНПГ (р<0,05, р<0,01-непараметрический U-критерий Манна-Уитни).



Это также согласуется с данными об увеличении скорости тромбообразования, то есть ЭНПГ снижает тромборезистентность сосуда (Рисунок 7). Введение соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида животным с ЭНПГ приводило к снижению ИАТ на 27,74%; 13,9%; 8,96%; 26,45%; 25,4% и 34,8% по сравнению с группой ЭНПГ без ЭФТ, соответственно (р<0,05).

При введении соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида происходило увеличение индекса дезагрегации (ИД) на 21,83%; 11,94%; 5,53%; 18,67%; 22,6% и на 37,61% по сравнению с группой ЭНПГ без ЭФТ, соответственно ( р <0,05) (Рисунок 7).

Одним из специфических маркеров дисфункции эндотелия является изменение уровня фактора Виллебранда, который влияет на адгезию тромбоцитов к субэндотелию. В группе животных с ЭНПГ, уровень ФВ статистически значимо превышает уровень ФВ у ЛО животных на 58,62% ( р<0,05). Это, в определенной мере, объясняет увеличение процессов адгезии и агрегации тромбоцитов и увеличение скорости тромбообразования, характерных при повреждении эндотелия. Введение животным с ЭНПГ, производных ГАМК - соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида приводило к снижению уровня ФВ на 32,7%; 29,7%; 24,7%; 28,45%; 32% и на 51%, соответственно, по сравнению с контрольной группой.

Влияние исследуемых соединений на коагуляционный гемостаз при ЭНПГ. В коагуляционном гемостазе выделяют три последовательные стадии: 1)образование “протромбиназы”; 2)образование тромбина; 3) образование фибрина. На фоне ЭНПГ происходят нарушения в сторону гиперкоагуляции( укорочение показателя активированного частично тромбопластинового времени (АЧТВ) на 42,7 % по сравнению с группой ЛО животных). При этом введение животным с ЭНПГ исследуемых веществ, приводило к повышению данного показателя на 28,42% (пикамилон)< 29,38% (фенибут) <38% (РГПУ-147) < 55,4% (РГПУ-189) < 56,26% (мексидол) < 76,04% (сулодексид) по сравнению с результатами теста у контрольных животных, что может свидетельствовать об их антикоагулянтной активности, способности повышать антитромботический потенциал эндотелия.

Рисунок 8. Влияние исследуемых соединений и препаратов сравнения на АЧТВ при ЭНПГ

Примечание: ^& ,*- - различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ ( р<0,05, непараметрический U-критерий Манна-Уитни );

Протромбиновое время (ПВ) характеризует вторую фазу коагуляционного гемостаза, внешний путь свертывания крови, активность протромбинового комплекса (факторов V,VII, X). Значения показателя ПВ в группе ЛО животных статистически значимо отличается от показателя ПВ в группе животных с ЭНПГ, в сторону снижения последнего ( р<0,01, t-критерий Стьюдента), что свидетельствует о процессах гиперкоагуляции, происходящих на фоне моделируемой патологии. Введение животным с ЭНПГ, соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида повышало показатель ПВ в плазме на 44,2%, 33,09%, 20,8% 46,17%, 48,2% и 59,6%, соответственно, по сравнению с группой ЭНПГ без ЭФТ ( р<0,05, t-критерий Стьюдента)(Рисунок 9).



Рисунок 9. Влияние изучаемых соединений на протромбиновое время (МНО) при ЭНПГ.

Примечание: ^& ,*- - различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ( р<0,01, р<0,05 t-критерий Стьюдента).

Повышение значение ПВ на фоне введения исследуемых веществ у животных с ЭНПГ может говорить о наличии у них антикоагулянтной активности. Так как главным инициатором внешнего пути свертывания (характеризуется ПВ) является тканевой фактор (ТФ), который увеличивает прокоагулянтную активность эндотелия, то способность исследуемых веществ повышать ПВ может косвенно свидетельствовать об их влиянии на ТФ.

При введении животным с ЭНПГ соединений РГПУ-189, РГПУ-147, мексидола и сулодексида было отмечено увеличение значения временных показателей протромбиновой активности (r) в 2,2; 2,35; 2,1 и 3,1 раза по сравнению с контрольной группой, соответственно. Значение показателя k (временной показатель тромбиновой активности) у животных с ЭНПГ, получавших соединение РГПУ-189 и соединение РГПУ-147 увеличивалось по сравнению с k группы ЭНПГ без ЭФТ в 2,8 и 2,1 раза, соответственно.

Нарушение функции эндотелия, как правило, приводит к увеличению вязкости, что оказывает влияние на реологию крови и ведет к снижению скорости кровотока. В ходе проведенного исследования было обнаружено статистически значимое увеличение показателей вязкости крови, в группе с ЭНПГ по отношению к ЛО животным во всем диапазоне скоростей сдвига.

Введение животным с ЭНПГ, соединения РГПУ - 189 приводило к снижению вязкости крови на 12,71% при низких скоростях сдвига (10с-1). Во всем остальном диапазоне скоростей сдвига введение вещества РГПУ-189 практически не влияло на снижение вязкости крови. Введение сулодексида приводило к статистически значимому снижению вязкости крови при скорости сдвига 100 с-1 (на 12%) и при скорости сдвига 10 с-1 (16,5%), по сравнению с показателями вязкости у животных с ЭНПГ без ЭФТ. Полученные результаты подтверждаются и значениями индекса агрегации эритроцитов (ИАЭ). Так введение животным с ЭНПГ, соединения РГПУ-189 и Сулодексид статистически значимо снижало ИАЭ на 8,1% и 16,57%, соответственно, по сравнению с группой животных с ЭНПГ. Другие производные ГАМК статистически значимо не влияли на данный показатель .

Рисунок 10. Содержание фибриногена у животных под влиянием исследуемых соединений.

Примечание: ^&-, * -различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ (р<0,05, t-критерий Стьюдента)

Одним из биохимических маркеров нарушения функции эндотелия является содержание фибриногена в плазме крови. Увеличение данного показателя приводит к увеличению вязкости крови, усилению процессов тромбообразования. У животных в группе с ЭНПГ содержание фибриногена в плазме увеличивалось на 66,02% по сравнению с группой ЛО животных (р<0,01). При введении животным с ЭНПГ соединений РГПУ-189, РГПУ-147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида наблюдалось снижение содержание фибриногена в плазме на 19,4 %; 7,18%;11,47%;11,77%; 16,4% и 20,48%, соответственно, по сравнению с показателем контрольной группы(Рисунок 10).

Одной из характеристик процесса фибринообразования, наряду с содержанием фибриногена в плазме (г/л) может служить фибрин - тромбоцитарная константа сгустка (АМ) и константа тотального свертывания крови (Т). Соединения РГПУ-189 и РГПУ-147 снижали значение АМ на 9,9% и 10,8%, соответственно, и увеличивали время тотального свертывания крови на 52,0% (РГПУ-189) и на 57,3% (РГПУ-147) по сравнению с показателем группы ЭНПГ без ЭФТ ( р < 0,05), что также свидетельствует об их антикоагулянтной активности.

Показатель тромбинового времени (ТВ) характеризует течение конечного этапа свертывания крови - скорость превращения фибриногена в фибрин. При ЭНПГ происходит снижение антикоагуляционной активности плазмы (ТВ сократилось на 25,7% , по сравнению с ЛО животными ( р <0,05). Введение животным с ЭНПГ, соединения РГПУ-189, мексидола и сулодексида, приводило к удлинению ТВ на 29,6%, на 31% и 43,3%, соответственно, по сравнению с показателем в контрольной группе ( р <0,05).

Известно, что женские половые гормоны играют важную роль в защите эндотелия [Адашева Т.В., 2007]. При угасании репродуктивной функции, то есть при снижении продукции женских половых гормонов возрастают риски тромбоэмболических осложнений. Так в группе животных с ВНПГ без ЭФТ, образование тромба происходило к 17 минуте. А в группах животных с ВНПГ, которым вводили соединения РГПУ-189, РГПУ-147, фенибут и сулодексид время полной окклюзии сосуда равнялось 26; 24; 22,5 и 28 минутам, соответственно (Рисунок 11). Это может свидетельствовать о нормализации антитромботических свойств эндотелия на фоне введения изучаемых соединений при ВНПГ.



Рисунок 11. Влияние изучаемых соединений на процесс тромбообразования при возрастной недостаточности половых гормонов

Примечание:*- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ ( р<0,05, р<0,01

Усиление процессов тромбообразования на уровне гемостаза при ВНПГ можно проиллюстрировать изучением процесса агрегации тромбоцитов. Антиагрегантную активность в большей степени оказали соединение РГПУ-189 и сулодексид, введение, которых привело снижению скорости агрегации тромбоцитов и ИАТ (на 35,25% и 36,63%), увеличению ИД (на 22,09% и 41,97 %) у животных на фоне возрастной менопаузы (Рисунок 12).



Рисунок 12. Влияние изучаемых соединений на агрегацию тромбоцитов у животных с возрастной недостаточностью половых гормонов.

Примечание: *-; **- различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ВНПГ ( р<0,05, р<0,01 непараметрический U-критерий Манна-Уитни).

Нарушения функции эндотелия прежде всего затрагивают NO- синтазную систему, что приводит к уменьшению продукции NO и как следствие снижению противоспалительной функции эндотелия. Уровень СРБ является маркером воспаления и дисфункции эндотелия [M. Jarvisalo et all, 2007] и коррелирует с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний [Карпов Ю.А., 2003; Демихова Н.В., 2009]. В группе животных с ЭНПГ содержание С - реактивного белка (СРБ) в плазме увеличивалось в 3,3 раза по сравнению с группой ЛО животных (р<0,05), что может свидетельствовать о наличии воспалительного процесса на фоне моделируемой патологии (Рисунок 13).

Введение животным с ЭНПГ соединения РГПУ - 189, РГПУ - 147, фенибута, пикамилона, мексидола и сулодексида статистически значимо снижало содержание СРБ на 41,37%; 34,48%; 27,58%; 47,58%; 41,2% и на 58,62%, соответственно, по сравнению с показателем животных с ЭНПГ без ЭФТ (р<0,05) (Рисунок 13).

Рисунок 13. Влияние изучаемых соединений на уровень С - реактивного белка у животных с НПГ.

Примечание: ^&-, * -различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО животных, с группой животных с ЭНПГ (р<0,05, непараметрический U-критерий Манна-Уитни)

В настоящее время повышение в крови количества циркулирующих эндотелиоцитов (ЦЭ) рассматривается как индикатор ЭД, который отражает степень повреждения эндотелия [Петрищев Н.Н., 2001; Хорева М.А. 2008]. В группе ЛО животных количество ЦЭ в крови находилось в пределах нормы (3,0±0,9). В то же время, у всех животных с ЭНПГ было выявлено статистически значимое повышение уровня ЦЭ в 2,9 раза (8,7±0,83, p<0,01), что свидетельствует об усиление десквамации эндотелиоцитов (Таблица 2).

Группа	ЦЭ /100 мкл	Таблица 2. Влияние исследуемых соединений на количество циркулирующих эндотелиоцитов при ЭНПГ Причемание: ЦЭ - циркулирующие эндотелиоциты; ** - р<0,01 - различия статистически значимы по отношению к группе ЛО животных; # - р<0,05; ## - р<0,01 - различия статистически значимы по отношению к группе животных с ЭНПГ (U-критерий Манна-Уитни)
ЛО животные	3,0±0,9
ЭНПГ	8,7±0,83* *
РГПУ-147	6,0±0,71 #
РГПУ-189	5,3±0,81 #
Фенибут	7,2±1,01
Сулодексид	4,3±1,01# #



Введение животным с ЭНПГ соединений РГПУ - 189, РГПУ - 147, фенибута снижало количество ЦЭ в плазме в 0,64; 0,45 и 0,17 раза (p<0,05), соответственно, при этом, уступая сулодексиду ( ЦЭ снижалось вдвое).

Данные морфологического и морфометрического исследований свидетельствуют о развитии сосудистой патологии с воспалительными изменениями и повреждением эндотелиальной выстилки церебральных сосудов у животных с ЭНПГ, при этом большие патологические изменения наблюдались в группе самок с ЭНПГ. Введение животным с ЭНПГ исследуемых соединений приводило к снижению степени отека стенки сосуда, тромбозов, признаков воспаления и пролиферации эндотелия, уменьшению деструкции эндотелиоцитов. По степени уменьшения влияния ЭНПГ, как повреждающего фактора эндотелия, исследуемые соединения следует расположить следующим образом: сулодексид > РГПУ - 189 ? РГПУ - 147 > фенибут (Таблица 3) . Оценка влияния соединения РГПУ-189 на уровень половых гормонов. ЭНПГ приводит к статистически значимому снижению концентрации эстрадиола (в 3,27 раза) и увеличению концентрации ФСГ в сравнении с группой ЛО животных. Введение соединения РГПУ - 189 не оказало влияния на уровень концентрации эстрадиола, пролактина, однако повлияло на снижение концентрации ФСГ (в 0,81 раза) в сыворотке крови животных с ЭНПГ.

Таблица 3. Морфологические признаки состояния эндотелия сосудов головного мозга при световой микроскопии у интактных, ЛО и животных с ЭНПГ, получавших изучаемые соединения

	интакт	ЛО	ЭНПГ	РГПУ-189	РГПУ-147	С	Ф
1.Толщина интимы сосуда	1,6± 0,07	1,632± 0,09	1,24± 0,11#	1,54± 0,09**	1,4± 0,08*	1,47± 0,07**	1,32±0,08
2.Соотношение интима/медиа	0,43± 0,1	0,44± 0,11	0,64±0,06#	0,52±0,03*	0,54± 0,01*	0,47± 0,05**	0,60±0,04
3.Отек,плазморрагия стенки сосуда	нет	нет	++	+	+	+	+
4.Признаки воспаления	нет	нет	+++	+	+	+	+
5. Стаз, тромбоз	нет	нет	+++	+	+	+	++
6 Десквамация, некроз эндотелиоцитов	нет	нет	+++	+	+	+	++
7.Увеличение проницаемости эндотелия	нет	нет	+++	+	нет	нет	++
8. Пролиферация эндотелия	нет	нет	+++	+	+	+	++
9. Величина ЯЦО эндотелиоцитов	0,56± 0,01	0,58± 0,02	0,21± 0,03##	0,50± 0,01**	0,44± 0,05**	0,41± 0,03**	0,31±0,04
10. Размер ядер	3,21± 0,16	3,44± 0,19	1,77± 0,13##	2,21± 0,16*	2,42± 0,17**	2,32± 0,15**	1,92±0,14

Примечания: ЯЦО - ядерно-цитоплазматическое отношение; интакт - группа интактных животных; ЛО - группа ложнооперированных животных; ЭНПГ - животные с экспериментально вызванной недостаточностью половых гормонов, С-животные с ЭНПГ, получавшие сулодексид; Ф- животные с ЭНПГ, получавшие фенибут. ^*-;** - различия статистически значимы по сравнению с группой животных с ЭНПГ ( p<0,05; p<0,01, t - критерий Стьюдента ); ^{#-; ##-} различия статистически значимы по сравнению с группой ЛО и интактных животных ( p<0,05; p<0,01, t - критерий Стьюдента)

Снижение уровня эстрогенов приводит к увеличению количества атерогенных липопротеинов, которые являются потенциально провоспалительными факторами, агентами, уменьшающими образование эндотелиальной NO-синтазы [Лутай М.И., 2004]. Комплексно изменения липидного спектра крови отражает индекс атерогенности (ИА). Введение животным с ЭНПГ соединений РГПУ-189 и РГПУ-147, пикамилона, мексидола и сулодексида приводило к статистически значимому снижению уровня ИА на 23% и 26% , 31,03%, 42,44% и на 48,74% по сравнению с ИА животных с ЭНПГ без ЭФТ, соответственно (р <0,05).



ВЫВОДЫ

1. Недостаточность половых гормонов как возрастного, так и хирургического генеза приводит к нарушению эндотелийзависимой вазодилатации, снижению антитромботической функции эндотелия, развитию воспаления и структурных нарушений эндотелия, то есть к формированию эндотелиальной дисфункции в большей мере выраженной у самок, чем у самцов.

...