Размещено на http://www.allbest.ru/

Направленный поиск новых блокаторов 5-HT₃-рецепторов среди производных индола и бензимидазола и изучение их фармакологических свойств

Общая характеристика работы

индол бензимидазол противодиарейный

Актуальность проблемы. Важную роль в регуляции функций различных органов и систем выполняет серотонинергическая система [Сергеев П., Шимановский Н., Петров В., 1999; Мирзоян Р. и соавт., 2000; Monassier L. et al., 2010]. Большое значение отводится, в частности, третьему типу серотониновых рецепторов, которые принимают участие в запуске рвотного рефлекса и восприятии болевых ощущений, осуществлении когнитивных функций и реакций эмоционально-волевой сферы, а также опосредуют изменение частоты сердечных сокращений и модулируют висцеральную чувствительность, моторику и секрецию желудочно-кишечного тракта [Giordano J., Shultea T., 2004; Kovac A., 2006; Mцssner R. et al., 2007; Шульпекова Ю.О., 2011]. В связи с этим нарушение серотонинергической передачи в различных отделах ЦНС и на периферии является патогенетическим звеном таких заболеваний и патологических состояний, как острая тошнота и рвота, синдром раздраженного кишечника, неврозы, воспаление, болевые синдромы [Fдrber L. et al., 2004; Maleki-Dizaji N. et al., 2010].

Средства, блокирующие 5-HT₃-рецепторы, способны во многом устранять указанные нарушения. Однако препаратов с таким механизмом действия, разрешённых к использованию в практической медицине, в настоящее время существует немного, и они обладают целым рядом нежелательных эффектов, среди которых токсическое поражение печени, развитие аллергических реакций, нарушения зрения, расстройство функций нервной системы [Goodin S., Cunningham K., 2002]. С учётом этого, с целью разработки новых оригинальных отечественных лекарственных препаратов, лишённых этих недостатков, представляется актуальным поиск новых соединений с 5-HT₃-антагонистическим действием среди молекул, содержащих функционально-значимый фармакофор [Hibert M. et al., 1990]. К таким соединениям относятся производные индола и бензимидазола. О перспективности поиска внутри данных классов соединений свидетельствуют ранее проведенные в ВолгГМУ исследования [Киабия С., 2003; Спасов А. и соавт., 2006; Яковлев Д., 2007; Черников М., 2008].

Настоящее исследование является составной частью научно-исследовательской работы «Изучение рецепторной активности синтетических гетероциклических азотсодержащих соединений» (№ государственной регистрации 01200809579), входящей в план НИР ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» на 2008-2010 гг., и работы «Поиск и изучение фармакологической активности новых производных конденсированных гетероциклических систем» (№ государственной регистрации 01200609440), входящей в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета на 2007-2012 гг. Тема работы была утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол №8 от 15.04.2009 г.).

Цель исследования. Направленный поиск новых соединений, обладающих блокирующей активностью по отношению к 5_HT₃_рецепторам, среди производных индола и бензимидазола, а также изучение их фармакологических свойств.

Задачи исследования.

1. Провести прогнозирование in silico уровня 5-HT₃-блокирующей активности новых производных индола и бензимидазола методами 2D_QSAR анализа.

2. Изучить потенциально активные по результатам прогноза in silico соединения на предмет выявления у них 5-НТ₃-блокирующей активности в эксперименте.

3. Произвести анализ зависимости 5-HT₃-антагонистического действия соединений от их химической структуры и физико-химических свойств.

4. Определить для наиболее активных соединений показатели концентрационной зависимости 5-HT₃-блокирующего эффекта IC₅₀, pA₂, pA₁₀ и показатель острой токсичности LD₅₀, а также рассчитать условный терапевтический индекс.

5. Изучить эффективность наиболее активных соединений на модели цисплатин-индуцированной рвоты у собак.

6. Исследовать транквилизирующее действие наиболее активных соединений на конфликтных и неконфликтных моделях экспериментального анксиогенеза.

7. Изучить анальгезирующую активность наиболее активных веществ веществ на моделях центральной и периферической гиперальгезии.

8. Оценить противодиарейные свойства наиболее активных веществ на моделях серотонин-индуцированной диареи у мышей и стресс-индуцированной дефекации у крыс.

9. Исследовать взаимодействие наиболее активных соединений с 5-HT₂- и 5-HT₄-рецепторами, а также с веществами, модулирующими активность основных нейромедиаторных систем организма.

10. Изучить нейротоксические эффекты наиболее активных соединений.

Научная новизна. Было впервые выявлено, что N¹_замещённые имидазо[1,2_б]бензимидазола, амиды 2-амино-3-индолилакриловых кислот и 1,2-аминоспирты ряда индола являются перспективными классами для поиска новых веществ с 5-HT₃-антагонистическим действием. Было установлено, что наибольший вклад в развитие данного вида активности N¹_замещённых имидазо[1,2_б]бензимидазола вносит наличие пирролидино- либо пиперидинопропильного заместителя в N¹-положении и 4_фторфенильного радикала у 2-го атома углерода гетероциклического ядра; высокие значения показателя липофильности ядра и радикала в N¹-положении и максимального положительного заряда на атомах этого же заместителя, а также низкое значение среднего заряда атомов радикала в С² положении. Для производных индола было показано, что наибольшее значение для развития их 5-HT₃-антисеротонинового действия имеет сочетание в структуре молекулы этильной группировки в качестве заместителя в положении N⁹ с наличием диэтиламиноэтильного остатка и фенильного кольца в составе радикала у 7-го углеродного атома. Для наиболее активного вещества под лабораторным шифром РУ-1276 было установлено, что оно в 1,6 раза превосходит препарат сравнения ондансетрон по условному терапевтическому индексу. На моделях экспериментальной патологии было выявлено, что вещество РУ-1276 обладает выраженными противорвотными, а также противодиарейными, анксиолитическими, анальгетическими свойствами, и было продемонстрировано, что наблюдаемые эффекты основаны на блокаде 5-HT₃-рецепторов. Было также показано, что в реализацию нейротропных эффектов соединения РУ-1276 вовлечён комплекс медиаторных систем, включая холинергическую и ГАМК-ергическую.

Научно-практическая ценность работы. Установлено, что прогнозирование in silico уровня 5-HT₃-антисеротониновой активности в программном комплексе «Микрокосм» 5.2 с последующей экспериментальной проверкой является эффективным средством оптимизации поиска новых 5-HT₃-антагонистов среди производных индола и бензимидазола. Выявленные закономерности между химической структурой, физико-химическими свойствами и уровнем 5-НТ₃-антагонистической активности соединений могут быть использованы при направленном синтезе новых соединений с высоким уровнем 5-НТ₃-блокирующего действия. Полученные данные о наличии у соединения РУ-1276 выраженного противорвотного и умеренно выраженного противодиарейного действия позволяют планировать расширенное доклиническое изучение данного вещества.

Реализация результатов исследования. Прогноз уровня 5-HT₃-антагонистической активности с помощью программного комплекса «Микрокосм» 5.2 используется на кафедре фармакологии и НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета, в лабораториях ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» как средство оптимизации поиска высокоактивных блокаторов 5_HT₃-рецепторов. Установленные закономерности между 5-HT₃-антагонистической активностью изученных соединений и их химической структурой и физико-химическими свойствами учитываются при синтезе новых соединений с предполагаемой высокой 5_HT₃-блокирующей активностью в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Воронежской государственной медицинской академии, кафедре общей и клинической фармакологии Ижевской государственной медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. N¹-замещённые имидазо[1,2-б]бензимидазола, амиды 2-амино-3-индолилакриловых кислот и 1,2-аминоспирты ряда индола являются перспективными классами соединений для поиска новых блокаторов 5-НТ₃-рецепторов.

2. Прогноз in silico уровня 5-HT₃-блокирующей активности в программном комплексе «Микрокосм» 5.2 с последующей экспериментальной проверкой позволяет оптимизировать поиск 5_HT₃_антагонистов среди производных индола и бензимидазола.

3. Наиболее высоким уровнем 5-HT₃-блокирующей активности из всех изученных веществ обладает соединение под лабораторным шифром РУ_1276, превосходящее препарат сравнения ондансетрон по условному терапевтическому индексу в 1,6 раза.

4. Соединение РУ-1276 обладает противорвотными, транквилизирующими и обезболивающими и противодиарейными свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XIII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2008 г.); 66-69-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2008-2011 гг.); 55-й и 56-й региональных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского коллектива Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2008-2009); VII всероссийской конференции с молодёжной научной школой «Химия и медицина. ОРХИМЕД-2009» (Уфа, 2009); IV-V международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2009-2010); XVI-XVII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2009-2010); 2-м международном конгрессе «ЕвразияБио-2010» (Москва, 2010 г.); 5-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010); 2_м всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2010); 3-м всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011); XVI всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2011 г.); XI региональном конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011); 17-й междисциплинарной международной конференции «Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 26 работ, из них 5 - в журналах, входящих в перечень ведущих периодических изданий, рекомендованных ВАКом, в том числе патент на изобретение №2438669 (зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.01.2012 г.)

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 191 странице машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 39 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2-8), обсуждения результатов (глава 9), выводов и списка литературы, включающего 31 отечественный и 192 зарубежных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Материалы. Объектами исследования являлись 36 новых производных индола и бензимидазола, среди них: N¹-замещенные имидазо(1,2-б)бензимидазола (9 соединений), N⁹-замещенные имидазо(1,2-б)бензимидазола (9 соединений), амиды 2-амино-3-индолилакриловых кислот (13 соединений), 1,2_аминоспирты ряда индола (5 соединений). Все вещества синтезированы в НИИ физико-органической химии Южного федерального университета^** Выражаем признательность зав. лабораторией синтеза биологически активных соединений, ведущему научному сотруднику к.х.н. В.А. Анисимовой и научному сотруднику отдела химии гетероциклических соединений, д.х.н. К.Ф. Суздалеву за синтез и предоставление субстанций веществ для настоящего исследования..

В ходе скрининга по выявлению 5-НТ₃-антагонистической активности использовались серотонина гидрохлорид («Sigma», США), кетансерина тартрат («Sigma», США). Для исследования противорвотного действия были использованы цисплатин («Тева», Израиль), апоморфин («ICN Biomedical», США). При изучении противодиарейной активности применялись серотонина гидрохлорид («Sigma», США), ацетилхолин йодистый («Спектр-Хим», Россия). Для изучения анальгетических свойств использовались адъювант Фрейнда («Grand Island Biological Company», США), формалин («Биомед», Россия). Для изучения взаимодействия с модуляторами основных нейромедиаторных систем были использованы никотин («Sigma», США), ареколин («Фармакон», Россия), клофелин («Биомед», Россия), резерпин («Sigma», США), фенамин («Sigma», США), галоперидол («Мосхимфармпрепараты», Россия), 3,4-диокси-L-фенилаланин («Sigma», США), 5-гидрокси-L-триптофан («Sigma», США), пикротоксин («Sigma», США). При изучении 5-HT₄-серотонинергической активности применялись карбахол («Sigma», США), SDZ-205,557 гидрохлорид («Sigma», США). Контрольным группам животных во всех экспериментах вводили натрия хлорида раствор 0,9% («Эском», Россия). В качестве препаратов сравнения использовались ондансетрон («Лэнс-Фарм», Россия), лоперамид («Биоком», Россия), атропина сульфат («Sigma», США), диклофенак-натрий («Хемофарм А.Д.», Сербия), буторфанола тартрат («Московская фармацевтическая фабрика», Россия), диазепам (Реланиум, «Польфа», Польша), кетансерина тартрат («Sigma», США).

Исследование проведено на 25 нелинейных морских свинках обоего пола массой 300-450 г, 547 белых неинбредных крысах-самцах массой 170-300 г, 348 белых неинбредных мышах-самцах массой 20-30 г, 8 беспородных собаках-кобелях массой 7_15 кг, 5 кроликах-самцах породы «шиншилла» массой 3-3,5 кг.

Животные содержались в виварии кафедры фармакологии ВолгГМУ с естественным световым режимом, при относительной влажности воздуха 40-50% и температуре 22-24С на стандартной полнорационной диете для лабораторных животных (ГОСТ Р 50258-92) в соответствии с Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемыми при экспериментальных исследованиях (1997), а также правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96). Все исследования были одобрены к проведению Региональным независимым этическим комитетом при ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» (протокол №89-2009 от 04.02.2009 г.).

Методы исследования. Прогнозирование уровня 5-HT₃-блокирующей активности in silico проводилось с применением разработанной в ВолгГМУ оригинальной информационной технологии (ИТ) «Микрокосм» (версия 5.2, 2011 г.) [Васильев П.М., 2009]^*.

Изучение блокирующего влияния веществ на третий подтип серотониновых рецепторов проводилось в соответствии с методикой S.Yoshida на препаратах изолированной подвздошной кишки морских свинок [Yoshida S. et al., 2007]. Для наиболее активных соединений изучались концентрационные зависимости антисеротонинового эффекта с определением величин IC₅₀, рА₂, рА₁₀ [Комиссаров И.В., 1969].

Острая токсичность определялась на мышах-самцах при внутрибрюшинном введении соединений [Хабриев Р.У., 2005]. В качестве интегрального показателя условной широты терапевтического действия рассчитывался условный терапевтический индекс соединений (LD₅₀/ IC₅₀).

Для выявления зависимости уровня 5-HT₃-антисеротониновой активности соединений от их химической структуры и физико-химических свойств использовались два метода in silico: подструктурный анализ и частотный анализ физико-химических параметров соединений с определением показателей молекулярной рефракции (MR), липофильности (LogP), а также набора зарядовых параметров ароматического ядра, заместителей и всей молекулы в целом [Голендер В.Е., Розенблит А.Б., 1978; Васильев П.М., 1983; Arup K., Gordon M., 1987; Vellarkad N. et al., 1989; Кларк Т., 1990; Zefirov N.S., Palyulin V.A., 2002]^** Выражаем признательность старшему научному сотруднику лаборатории лекарственной безопасности НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета, д.б.н. П.М. Васильеву за помощь в проведении данных этапов исследования..

Противорвотные свойства веществ исследовались на модели цисплатин-индуцированной рвоты у собак [Fukui H. et al., 1992]. Для изучения возможного дофаминергического компонента действия были проведены тесты по оценке влияния соединений на эффекты малых и высоких доз апоморфина [Раевский К.С., Наркевич В.Б., 2005; Андреева Н.И., 2005].

Противодиарейное действие соединений изучалось на моделях серотонин-индуцированной диареи у мышей и стресс-индуцированной дефекации у крыс [Miyata K. et al., 1992; Miyata K. et al., 2001]. Для оценки возможного периферического М-холинергического действия использовался метод сокращения изолированной подвздошной кишки морской свинки [Gathers C. et al., 1993].

Изучение антиноцицептивной активности веществ проводилось с помощью следующих методов: «горячая пластина» [Kitchen I., Crowder M., 1985], электрическая стимуляция хвоста крыс [Carrol N.M., Lim P.K., 1960], гиперальгезия, вызванная адъювантом Фрейнда [Iadarola M.J., Brady L.S., 1988], формалиновая гиперальгезия [Dubuisson D., Dennis S.G., 1977], метод механического раздражения на фоне формалиновой гиперальгезии [Randall L.O., Selitto J.J., 1957].

Анксиолитический потенциал веществ изучался при однократном и субхроническом (в течение 14 дней) введении с использованием комплекса конфликтных и неконфликтных моделей, включающих методы «тёмная/светлая камера» [Costal B. et al., 1989], «приподнятый крестообразный лабиринт» [Воронина Т.А., Середенин С.Б, 2005], методику конфликтной ситуации по J. Vogel [Vogel J. R. et al., 1971].

Влияние на 5_HT_2А-рецепторы исследовалось с помощью метода регистрации серотонин-индуцированной активации тромбоцитов путём малоуглового светорассеяния [Деркачёв Э.Ф. и др., 1998, Сакаев М.Р., 2000], на 5_HT₄-рецепторы - методом серотонин-опосредованного расслабления изолированного пищевода крысы [Miyata K., et al., 1995].

В целях детального изучения механизма развития нейротропных эффектов соединения РУ-1276 был проведён многотестовый фармакологический анализ его взаимодействия с веществами-модуляторами состояния ряда нейромедиаторных систем организма in vivo, а именно никотином, ареколином, клофелином, резерпином, фенамином, галоперидолом, L-ДОФА, 5-ГТФ, пикротоксином [Андреева Н.И., 2005].

Нейротоксическое действие соединения РУ-1276 оценивалось по С. Ирвину [Irwin S., 1964].

Для статистической обработки результатов скрининга, данных по влиянию веществ на серотонин-индуцированную активацию тромбоцитов и результатов изучения периферического М-холинергического действия использовался критерий Вилкоксона, позволяющий оценивать различия в попарно сопряжённых выборках. О значимости результатов исследования 5_HT₄-серотонинергического действия веществ судили по сдвигу вправо кривой «доза-эффект» с расчётом коэффициента сдвига. Достоверность величин IC₅₀, pA₂, pA₁₀ оценивалась методом линейного регрессионного анализа. Сравнение частот бинарного признака в независимых группах при анализе выживаемости в ходе изучения острой токсичности, а также при оценке результатов теста серотонин-индуцированной диареи и теста с никотином проводилось с использованием точного критерия Фишера. Обработка данных, полученных в тестах, насчитывающих три и более независимых групп, проводилась с применением непараметрического критерия Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна. Результаты динамических наблюдений обсчитывались с помощью двухфакторного ANOVA метода. Обсчёт проводился в программах «GraphPad Prism 5.04» и «Microsoft Excel 2002».

Результаты исследований и их обсуждение.

По итогам проведённого прогноза 5-HT₃-блокирующей активности in silico было предсказано наличие 5_HT₃-антагонистических свойств у 34 веществ из 70. 18 из них, представляющих собой производные имидазо[1,2_б]бензимидазола, а также 18 соединений - производных индола были впоследствии изучены в экспериментальном скрининге.

По результатам проведённого скрининга в ряду N¹-замещенных имидазо[1,2-б]бензимидазола из девяти изученных соединений шесть обладали 5-HT₃-блокирующим действием, из них два превосходили по уровню активности препарат сравнения ондансетрон, четыре - проявили умеренный уровень активности. Восемь из 13 амидов 2-амино-3-индолилакриловых кислот и три из пяти 1,2-аминоспиртов индольного ряда обладали умеренно выраженными 5-HT₃-антисеротониновыми свойствами. Среди девяти изученных N⁹-замещенных имидазо[1,2-б]бензимидазола статистически значимый уровень 5-HT₃-антагонистического действия выявлен лишь для одного соединения (табл. 1).

Таблица 1 5-НТ₃-серотониноблокирующая активность производных индола и бензимидазола в концентрации 1Ч10^-6М на изолированном отрезке подвздошной кишки морской свинки (М±m)

Примечание: ? - изменение по отношению к контрольному показателю, * - статистически значимо по отношению к контролю (p?0,05, критерий Вилкоксона)

Дальнейшее исследование зависимости 5_HT₃_блокирующего эффекта от химической структуры и физико-химических свойств позволило установить, что наибольший вклад в развитие данного вида биологической активности вносит наличие пирролидино- либо пиперидинопропильного заместителя в N¹-положении и 4_фторфенильного радикала у 2-го атома углерода гетероциклического ядра; высокие значения показателя липофильности ядра и радикала в N¹-положении и максимального положительного заряда на атомах этого же заместителя, а также низкое значение среднего заряда атомов радикала в С² положении. Напротив, отрицательная взаимосвязь была выявлена для наличия при 1-м атоме азота морфолинопропильного/ морфолиноэтильного заместителей, равно как и метильного, и 4-бромфенила в положении C², а также положительного заряда ядра, низких значений липофильности и величины положительного заряда радикала при N¹, а также высоких значений положительного заряда атомов радикала у 2-го атома углерода. Для производных индола было показано, что наибольшее значение для развития их 5-HT₃-антисеротонинового действия имеет сочетание в структуре молекулы этильной группировки в качестве заместителя в положении N⁹ с наличием диэтиламиноэтильного остатка и фенильного кольца в составе радикала у 7-го углеродного атома.

По итогам экспериментального поиска было выявлено два высокоактивных соединения под лабораторными шифрами РУ-1275 и РУ-1276, относящихся к N¹-замещённым имидазо1,2-бензимидазола. Для данных веществ была изучена концентрационная зависимость 5-НТ₃-блокирующего эффекта и определены величины IC₅₀, pA_2., pA₁₀, показатель острой токсичности LD₅₀, а также рассчитан условный терапевтический индекс (табл. 2). При этом было выявлено, что соединение РУ-1276 в 1,6 раза превосходит по этому показателю препарат сравнения ондансетрон.

Таблица 2 Показатели IC₅₀, pA₂*, pA₁₀^**, LD₅₀ и условный терапевтический индекс для соединений РУ-1275, РУ_1276 и препарата сравнения ондансетрона

Примечание: ^* pA₂ - отрицательный десятичный логарифм такой концентрации антагониста, в присутствии которой агонист в удвоенной концентрации оказывает такое же действие, как и агонист в одинарной концентрации в отсутствие антагониста; ^** pA₁₀ - отрицательный десятичный логарифм такой концентрации антагониста, в присутствии которой агонист в удесятерённой концентрации оказывает такое же действие, как и агонист в одинарной концентрации в отсутствие антагониста.

На втором этапе работы были изучены различные виды активности соединения РУ-1276, связанные с блокадой 5-HT₃-рецепторов в условиях целостного организма.

Противорвотное действие 5-HT₃-блокаторов реализуется в условиях аномально повышенного высвобождения эндогенного серотонина в системный кровоток (как, например, при раздражении энтерохромаффинных клеток слизистой оболочкикишечника цитостатическими препаратами) и основывается на их способности препятствовать взаимодействию серотонина с 5-HT₃-рецепторами триггерной зоны мозга, а также окончаний n.vagus и нейронов подслизистого сплетения кишечника, тем самым предотвращая развитие рвотного акта [Roberts S. et al., 2012]. Исходя из механизма развития патологии, для оценки противорвотного потенциала соединения РУ-1276 была использована экспериментальная модель цисплатин-индуцированной рвоты у собак. В результате исследования было показано, что изучаемое вещество эффективно снижало интенсивность рвоты по сравнению с показателями контрольной группы животных, уменьшая число рвотных приступов за период наблюдения в 1,7 раза при введении в дозе 0,15 мг/кг и в 2 раза - в дозе 1,5 мг/кг, оказывая эффект, равный эффекту препарата сравнения ондансетрона в эквимолярной дозе (рис. 1).

Рис. 1. Влияние соединения РУ-1276 (1,5 мг/кг) и ондансетрона (1 мг/кг) на динамику цисплатин-индуцированной рвоты у собак. Обозначения: по круговой оси - время, мин; по радиальной оси - количество рвотных приступов.

При этом, учитывая, что серотонинергический механизм не является единственно возможным в запуске рвотного акта, для изучения возможного вклада дофаминергического компонента в развитие наблюдаемого антиеметического действия был проведён ряд тестов с агонистом дофаминовых рецепторов апоморфином. При введении вещества РУ-1276 в дозах 1,5 и 7,5 мг/кг число индуцированных апоморфином зевательных движений у крыс составило 6,81,2 и 6,70,9, соответственно, что не отличалось от показателя контрольной группы, составившего 6,71,1. В тесте апоморфиновой гипотермии соединение РУ-1276 в изученных дозах также не изменяло эффекты апоморфина (табл. 3).

Таблица 3 Влияние соединения РУ-1276 на гипотермический эффект апоморфина (M±m)

Примечание: * - достоверно по отношению к контрольной группе №1 (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

Таким образом, можно с большой долей уверенности считать, что выявленный противорвотный эффект изучаемого соединения обусловлен его взаимодействием с третьим типом серотониновых рецепторов.

Вторым специфическим видом фармакологического действия, характерным для некоторых 5-HT₃-блокирующих средств, является противодиарейное действие, что позволяет успешно применять препараты этой группы при диарейной форме синдрома раздражённого кишечника [Lee K. et al., 2011]. Блокируя 5-HT₃-рецепторы на окончаниях первичных афферентных волокон ЖКТ, они угнетают опосредованную ими секрецию ацетилхолина и, как следствие, устраняют основные симптомы заболевания, нормализуя ритм и амплитуду сокращений кишечника и улучшая всасывание жидкости [Heading R. et al., 2006].

Способность соединения РУ-1276 модулировать функциональное состояние кишечника была изучена на ряде моделей [Miyata K. et al., 1992; Miyata K. et al., 2001]. В результате экспериментов было показано, что изучаемое вещество в 2,5 раза снижало интенсивность стресс-индуцированной дефекации у крыс по сравнению с контрольной группой животных, не уступая по эффективности традиционному противодиарейному средству лоперамиду (табл. 4). На модели серотонин-индуцированной диареи у мышей также было выявлено положительное влияние вещества РУ-1276 по устранению симптомов экспериментальной патологии. При этом расширенное изучение возможного механизма, посредством которого реализуется противодиарейный эффект, позволило установить, что соединение РУ-1276 в концентрациях, наиболее характерных для специфического рецепторного действия веществ, не обладало влиянием на М-холинорецепторы, которым, наравне с серотониновыми, отводится ключевая роль в регуляции моторики ЖКТ. Это даёт основания считать, что в основе противодиарейного действия вещества РУ-1276 лежат его 5-HT₃-блокирующие свойства.

Таблица 4 Влияние соединения РУ-1276, ондансетрона и лоперамида на стресс_индуцированную дефекацию у крыс, вызванную ограничением жизненного пространства (M±m)

Примечание: * - достоверно по отношению к контролю (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

На основании литературных данных об участии 5-HT₃-рецепторов головного мозга в процессах обучения, запоминания и регуляции эмоционального статуса [Jones B. et al., 1988; Preston G., 1994; Johnson B. et al., 2000], а также с учётом экспериментально выявленного анксиолитического потенциала некоторых 5-HT₃-антагонистов [Roychoudhury M., Kulkarni S., 1997; Яковлев Д. и соавт., 2011] на следующем этапе исследования было предпринято изучение транквилизирующих свойств соединения РУ_1276 на ряде моделей экспериментального анксиогенеза при остром и хроническом введении. В результате было показано, что изучаемое вещество при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 1,5 мг/кг проявило эффект на моделях анксиогенеза, основанных на противоречии между природной ориентировочно-исследовательской реакцией животных и врождённым страхом. Так, в тесте «тёмная/светлая камера» изучаемое соединение уменьшало боязнь животных перед ярко освещённым пространством, снижая латентный период выглядывания в светлый отсек установки до 25,2±2,0 с, практически не уступая препарату сравнения диазепаму, показатель которого составил 19,7±5,1 с, а также превосходя его по числу выглядываний и выходов в светлый отсек, а в тесте с использованием приподнятого крестообразного лабиринта вещество РУ-1276 увеличивало количество выходов животных в открытые рукава с удлинением суммарного времени пребывания в них, c эффективностью, равной таковой у диазепама, а также повышало общее число переходов между рукавами (табл. 5,6).

Следует заметить, что с повышением дозы вещества до 7,5 мг/кг, а также при субхроническом введении, его анксиолитическое действие практически исчезало. При моделировании анксиогенеза посредством наказуемого поведения у соединения

Таблица 5 Влияние соединения РУ-1276, ондансетрона и диазепама при в/брюшинном введении на поведение животных в тесте «Тёмная/светлая камера» (M±m)

Примечание: * - достоверно по отношению к контролю (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

Таблица 6 Влияние соединения РУ-1276, ондансетрона и диазепама при в/брюшинном введении на поведение животных тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» (M±m)

Примечание: * - достоверно по отношению к контролю (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

РУ_1276 также не было выявлено анксиолитических свойств ни при однократном, ни при длительном введении, что согласуется с данными Castejуn и Cubeddu [1998] о том, что наказуемое поведение менее подвержено коррекции 5_HT₃-антагонистами по сравнению с ненаказуемыми ситуациями.

Ещё одним перспективным направлением в изучении свойств 5-HT₃-блокаторов является оценка их анальгетического профиля [Crowell M., 2001; Stratz T., Mьller W., 2003; Spдth M. et al., 2004]. Оценка обезболивающего действия изучаемого соединения РУ-1276 проводилась на различных моделях гиперальгезии, позволяющих оценить вклад разных механизмов обезболивания в развитие изучаемых эффектов.

На модели спинальной гиперальгезии при электрическом раздражении хвоста крыс, а также в тесте «горячая пластина» изучаемое вещество практически не проявило эффекта, что свидетельствует об отсутствии у соединения РУ-1276 способности влиять на передачу болевого импульса в пределах ЦНС, в частности, спинного мозга, ствола и таламуса. При дальнейшем изучение на модели аъювантного артрита было показано, что исследуемое вещество в средней (1,5 мг/кг) и высшей (7,5 мг/кг) терапевтических дозах в среднем на 40% повышало болевой порог животных по сравнению с животными, у которых была сформирована гиперальгезия (табл. 7).

Таблица 7 Влияние соединения РУ-1276, ондансетрона и диклофенака натрия при в/брюшинном введении на величину болевого порога при механическом давлении в тесте адъювантной гипералгезии (M±m)

Примечания: * - достоверно по отношению к интактному контролю (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна), ** - достоверно по отношению к адъювантной гипералгезии (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

С этими данными согласуются результаты формалинового теста, в котором изучаемое вещество проявило активность во второй фазе эксперимента, отражающей влияние на болевую чувствительность в ходе развивающегося воспалительного процесса в периферических тканях, снижая выраженность вызванной формалином реакции на 77% в дозе 1,5 мг/кг и на 46% в дозе 7,5 мг/кг (табл. 8). При этом в первой фазе, отражающей активацию чувствительных С/Ад-волокон и возникновение первичного потока болевой импульсации в ответ на химическое раздражение, эффекта РУ-1276 не наблюдалось, равно как и на модели механического раздражения, приложенного через 2 минуты после введения формалина.

Так, наличие у вещества РУ-1276 анальгетической активности на модели адъювантного артрита и во второй фазе формалинового теста в совокупности с отсутствием влияния на проведение болевых импульсов в структурах ЦНС, позволяет сделать вывод о том, что механизм анальгетического действия изучаемого соединения является периферическим и в основе его лежит блокирование 5-HT₃-рецепторов и последующее устранение эффектов серотонина как медиатора ноцицептивной реакции, особенно в условиях воспаления.

Таблица 8Влияние соединения РУ-1276, ондансетрона и диклофенака натрия при в/брюшинном введении на выраженность формалиновой гипералгезии (M±m)

Примечания: * - достоверно по отношению к интактному контролю (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна), ** - достоверно по отношению к формалиновой гипералгезии (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

Известно, что серотониновая нейропередача находится в кооперативном взаимодействии с другими нейромедиаторными системами организма, и изменение состояния одной из них неизбежно влечёт за собой изменения в функционировании других [Fдrber L. et al., 2004; Song Z. et al., 2011]. Это явилось предпосылкой для детального фармакологического анализа эффектов соединения РУ_1276 с целью уточнения возможных аспектов механизма его действия.

В серии экспериментов in vitro, позволяющих оценить влияние на 5_HT₄-рецепторы, изучаемое вещество не проявило способности к взаимодействию с данным рецепторным типом. Оно оказалось неактивно и при изучении 5-HT_2А-серотонинергической активности на модели серотонин-индуцированной активации тромбоцитов, что подтверждается также результатами поведенческого теста с введением 5_гидрокси-L-триптофана, в котором вещество РУ-1276 не продемонстрировало влияния на специфический, вызванный 5_ГТФ, гиперкинез у мышей. В совокупности полученные данные убедительно свидетельствуют о высокой степени селективности действия вещества РУ-1276 в отношении третьего типа рецепторов серотонина по сравнению с другими типами 5-HT-чувствительных клеточных структур.

При изучении влияния на холинергическую нейропередачу было показано, что для исследуемого соединения нехарактерно изменение никотинового тремора. Однако в тесте с М-холиномиметиком ареколином вещество РУ-1276 в дозе 7,5 мг/кг сокращало длительность тремора на 24,1%, что позволяет сделать вывод о способности у него влиять на передачу импульсов в структурах М_холинергической нервной системы. В опытах с модуляторами функционального состояния адренергической системы было выявлено, что изучаемое соединение не оказывает влияния на эффекты клофелина и резерпина, что является косвенным показателем отсутствия у него действия на центральную адренергическую нейромедиацию. При дальнейшем изучении выяснилось, что вещество РУ-1276 не изменяет эффекты D₂-антагониста галоперидола, что свидетельствует об отсутствии у него дофаминергического влияния. Эти данные согласуются с обсуждавшимися ранее результатами тестов с апоморфином.

В то же время, была обнаружена способность соединения РУ-1276 усиливать эффекты низких доз L-ДОФА. Так, показатель интенсивности стереотипии на фоне соединения РУ-1276 в дозе 7,5 мг/кг составил 1,2-1,3 балла. Эти данные, возможно, указывают на наличие РУ-1276 некоторого МАО-ингибирующего действия.

При оценке влияния на ГАМК-ергическую нейропередачу вещество РУ-1276 в дозе 7,5 мг/кг приводило к статистически значимому повышению числа судорожных приступов у экспериментальных животных в 2,1 раза по сравнению с контрольным значением (табл. 9), что говорит об усилении в его присутствии эффектов ГАМК_А-антагониста пикротоксина.

Таблица 9Влияние соединения РУ-1276 на эффекты пикротоксина (M±m)

Примечание: * - данные достоверны по отношению к контролю (p?0,05, критерий Краскела-Уоллиса с постобработкой критерием Данна)

Таким образом, было установлено, что в реализации нейротропных эффектов соединения РУ-1276 участвует ряд медиаторных систем, включющий, как минимум, холинергическую и ГАМК-ергическую системы. Эти результаты во многом согласуются с имеющимися на сегодня в литературе данными о взаимном влиянии и кооперации между собой нейромедиаторных систем ЦНС [Song Z. et al., 2011; Tozzi A. et al., 2011; Ortega J. et al., 2012].

На заключительном этапе исследований изучался нейротоксический профиль вещества РУ-1276. Было установлено, что в однократной средней терапевтической дозе (1,5 мг/кг), равно как и при увеличении её в два с половиной раза, соединение не оказывало нежелательного действия. Первые побочные эффекты в виде некоторого уменьшения двигательной активности животных были отмечены при введении дозы, пятикратно превышающей среднюю терапевтическую и соответствующей 7,5 мг/кг. Выраженный характер отклонений неврологического статуса животных от нормы наблюдался у соединения РУ-1276 лишь в максимальной вводимой дозе (26 мг/кг), в 17 раз превышающей среднюю терапевтическую дозу, и выражался в появлении шаткой либо расползающейся походки, значительном угнетении различных видов активности (показатель горизонтальной активности в «открытом поле» был снижен на 73,7% относительно контрольного значения; практически отсутствовали вертикальные стойки; показатель поисковой активности составил от 17,5% до 7,5% от контрольных значений; было уменьшено количество актов груминга, а также полностью отсутствовали выходы животных в центр площадки), выраженном снижении мышечного тонуса (0 баллов по 4х-балльной шкале при удержании на проволочном стержне; 2,3 балла по 4х-балльной шкале при удержании на сетке; 9,0 из 30 секунд при удержании на вращающемся стержне; полном угнетении ипселатерального сгибательного рефлекса), снижении слухового рефлекса на 30% и снижении частоты дыхания на 18,5% по сравнению с контрольными значениями.

Таким образом, по результатам экспериментального поиска 5_HT₃_блокаторов среди новых производных индола и бензимидазола с предшествующим прогнозом уровня активности средствами ИТ «Микрокосм» v.5.2 было установлено, что наиболее выраженными 5_HT₃_антагонистическими свойствами обладают N¹-замещённые имидазо[1,2-б]бензимидазола. Максимально выраженное действие обусловливается наличием пирролидино-/пиперидинопропильного заместителя у 1-го атома азота и 4_фторфенильного заместителя у 2-го атома углерода гетероциклического ядра, а также показатели липофильности целой молекулы и заместителя в N¹-положении и зарядовые характеристики атомов в составе радикалов в N¹ и C² положениях.

В ходе работы было найдено соединение под лабораторным шифром РУ-1276, демонстрировавшее высокий уровень антагонистической активности в отношении третьего типа серотониновых рецепторов. В дальнейшем были изучены его противорвотные, противодиарейные, анксиолитические и анальгетические свойства, а также токсикологические параметры. Кроме того, для изучаемого вещества с использованием комплекса моделей in vivo и in vitro был проведён анализ возможных аспектов механизма действия.

Наличие у изучаемого соединения РУ-1276 выраженных антиеметических, а также противодиарейных, транквилизирующих и анальгетических эффектов позволяет рассматривать его как перспективное вещество для дальнейших расширенных доклинических фармакологических исследований.

Выводы

1. N¹-замещённые имидазо[1,2-б]бензимидазола, амиды 2-амино-3-индолилакриловых кислот и 1,2-аминоспирты ряда индола являются перспективными классами веществ для поиска 5-HT₃-антагонистов. Три из пяти изученных 1,2-аминоспиртов индольного ряда и 8 из 13 изученных амидов 2-амино-3-индолилакриловых кислот обладали умеренно выраженным 5-HT₃-блокирующим действием. Среди 9 изученных N¹-замещённых имидазо[1,2-б]бензимидазола 5_HT₃-антисеротониновые свойства были выявлены у 6 соединений, из них 2 превосходили по уровню активности препарат сравнения ондансетрон. Среди 9 изученных N⁹-замещённых имидазо[1,2-б]бензимидазола лишь одно соединений проявило статистически значимый уровень 5-HT₃-блокирующего действия.

2. Прогноз in silico уровня 5-HT₃-блокирующей активности производных индола и бензимидазола с применением методов 2D-QSAR анализа является эффективным средством оптимизации направленного поиска новых 5-HT₃-антагонистов.

3. Высокий уровень 5-HT₃-блокирующего эффекта N¹_замещённых имидазо[1,2_б]бензимидазола определяется наличием пирролидино- либо пиперидинопропильного заместителя в N¹-положении и 4_фторфенильного радикала у 2-го атома углерода гетероциклического ядра; высокими значениями показателя липофильности ядра и радикала в N¹-положении и максимального положительного заряда на атомах этого же заместителя, а также низким значением среднего заряда атомов радикала в С² положении. Для производных индола наибольший вклад в развитие 5-HT₃-антисеротонинового действия вносит сочетание в структуре молекулы этильной группировки в качестве заместителя в положении N⁹ с наличием диэтиламиноэтильного остатка и фенильного кольца в составе радикала у 7-го углеродного атома.

4. Наиболее выраженная 5-НТ₃-антагонистическая активность выявлена у вещества под лабораторным шифром РУ_1276, превосходящего препарат сравнения ондансетрон по условному терапевтическому индексу в 1,6 раза.

5. Вещество РУ-1276 в дозах 0,1 и 1 мг/кг на модели цисплатин-индуцированной рвоты у собак обладает противорвотной активностью, по степени выраженности равной активности препарата сравнения ондансетрона.

6. Вещество РУ-1276 при однократном внутрибр...