Влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на прокариотические клетки

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

03.02.03 - микробиология

ВЛИЯНИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЧАСТОТАХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ И ИЗЛУЧЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО КИСЛОРОДА И ОКСИДА АЗОТА НА ПРОКАРИОТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ

Пронина Елена Александровна

Саратов - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России»

Научный консультант

доктор медицинских наук, профессор

Шуб Геннадий Маркович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Миронов Андрей Юрьевич;

доктор медицинских наук, профессор

Крамарь Олег Григорьевич;

доктор медицинских наук

Антонов Валерий Алексеевич

Ведущая организация - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Росздрава».

Защита состоится «____»_________________ 2011 г. в _________ часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» по адресу: 400131, г. Волгоград, площадь Павших Борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России».

Автореферат разослан «_____» ________________ 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук,

доктор социологических наук, доцент М.Д. Ковалева

1. Общая характеристика диссертации

Актуальность проблемы

Важность исследований биологического действия электромагнитного излучения (ЭМИ) в настоящее время не вызывает сомнений у специалистов. С каждым годом растет число научных публикаций, посвященных данной проблеме и появляются все новые и новые идеи использования элекромагнитного излучения в медицинских и биотехнологических целях (Бецкий О.В., 2000; Бецкий О.В., Яременко Ю.Г., 2002; Бецкий О.В., Лебедева Н.Н., 2005; Ефремов Ю.И., Кревский М.А., 2007; Кряжев Д.В., Смирнов В.Ф., 2009).

Установлено, что ЭМИ способно оказывать воздействие практически на все известные типы клеток. В течение последних лет сформулирован ряд гипотез о возможных механизмах действия ЭМИ на биологические системы (Frohlich H., 1968; Девятков Н.Д. и соавт., 1991; Grundler W. et al., 1992; Ситько С.П., Ефимов А.С., 1993; Бецкий О.В., 2004; Kaiser N., Squires G., Broadhurst T., 1995; Афромеев В.И., Субботина Т.Н., Яшин А.А., 1997, 1998; Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., 1999; Гапеев А.Б. и соавт., 2007; Хадарцев А.А., 1999; Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Лебедева Н.Н. 2000; Борисенко Г.Г., Полников И.Г., Казаринов К.Д., 2007; Казаринов К.Д., 2008). Однако проблема изучения влияния нетеплового действия ЭМИ крайне высоких частот (КВЧ) на клетки и организм в целом пока остается открытой.

Одним из актуальных направлений современной электромагнитобиологии является исследование физико-химических механизмов действия электромагнитного излучения на биологические системы различного уровня организации. Некоторые ЭМИ хорошо известны и давно используются, например, ультравысокочастотное (УВЧ), сверхвысокочастотное (СВЧ), инфракрасное (ИК) и ультрафиолетовое (УФ) излучения. ЭМИ других частотных диапазонов, например, КВЧ, исследуются и применяются сравнительно недавно.

Менее всего оказался изучен диапазон частот 10¹¹-10¹⁴ Гц (терагерцовый диапазон), иногда его называют «черной дырой». Терагерцовые волны (ТГц-волны) лежат в диапазоне от сотен терагерц (длины волн более 3 мм) до сотен гигагерц (с длинами волн от 3 до 10 мкм), то есть между областью СВЧ-микроволн и инфракрасным диапазоном.

Освоение этой так называемой «терагерцовой щели» в спектре электромагнитных волн привлекает к себе большое внимание исследователей (McLaughlin C.V. et al., 2008; Takazato A., Kamakura M., Matsui T. et al., 2007; Sartorius B. et al., 2008; Carter S.G., Cerne J., Sherwin M.S., 2007; Nagai M., Tanaka K., Ohtake H. et al., 2004; Dexheimer S.L., 2007). Интерес к данному диапазону связан с перспективами широкого применения терагерцового излучения в фундаментальных и прикладных исследованиях.

Терагерцовый диапазон частот интересен прежде всего тем, что именно в нем находятся молекулярные спектры поглощения и излучения (МСПИ) различных клеточных метаболитов (NO, CO, активные формы кислорода и др.) (Башаринов А.Е. и соавт. 1968; Мериакри В.В., 2002; Бецкий О.В., Креницкий А.П., Майбородин А.В. и соавт., 2003; Rothman L.S., Barbe A., Chris Benner D. et. al., 2003; Betskyi O.V., 2005).

При электромагнитном облучении энергия излучения расходуется на переходы молекул из одного энергетического состояния в другое. Экзогенное воздействие ЭМИ приводит к изменению вращательной составляющей полной энергии молекул (Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Кислов В.В., 1998; Бецкий О.В., Лебедева Н.Н., 2001; Бецкий О.В., Кислов В.В., Лебедева Н.Н., 2004). При совпадении частоты проводимого облучения с частотой вращения полярных молекул возможна перекачка энергии излучения молекуле, сопровождающаяся увеличением вращательной кинетической энергии, что влияет на ее реакционную способность (Бецкий О.В., Девятков Н.Д., Кислов В.В., 1998).

Известно, что вращательные молекулярные спектры резонансного поглощения и излучения молекул важнейших клеточных метаболитов (NO, CO, O₂, СО₂) находятся именно в ТГЧ-диапазоне (Башаринов А.Е. и соавт., 1968; Креницкий А.П., Майбородин А.В., Бецкий О.В. и соавт. 2003; Киричук В.Ф., Креницкий А.П., Майбородин А.В. и соавт. 2006; Rothman L.S., Barbe A., Chris Benner D. et al, 2003).

В настоящее время одной из актуальных задач биологии является изучение процессов, в которых участвуют активные короткоживущие молекулы, являющиеся регуляторами на различных уровнях организации живых организмов (Шумаев К.Б., Космачевская О.В., Топунов А.В., 2008). К таким соединениям в первую очередь относятся оксид азота (NO) и его производные (Снайдер С.Х., Бредт Д.С., 1992; Марков Х.М., 1996; Moncada S., Palmer R.U., Higgs E.A., 1991; Moncada S., 1999; Ignarro L.G., Cirino G., Casini A., 1999; Murad F., 2003; Васильева С.В., 2007; Hemish J. et al., 2003 и др.). В последние годы появляется все больше данных о новых физиологических функциях оксида азота и его метаболитов (Stuart-Smith K., 2002; Roman L., Martasek P., 2002; Formoso G., Chen H., Kim J.A., 2006; Gladwin M.T., 2006). Кроме сигнальной роли NO (Дмитриев А.П., 2004; Глянько А.К., Митанова Н.Б., Степанов А.В., 2009 и др.), актуальной областью исследования являются реакции оксида азота с активными формами кислорода (АФК) (Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009). Возникающие в этих реакциях активные соединения - пероксинитрит, диоксид азота и др. - важные компоненты иммунного ответа в организме человека и животных, которые также участвуют и в процессах апоптоза. С другой стороны, изменение концентрации оксида азота под действием различных свободных радикалов и других высокореакционных интермедиатов служит важнейшим фактором, влияющим на физиологическую активность NO, в том числе на сигнальную функцию этой молекулы. Кроме того, активные формы кислорода и азота участвуют в развитии патологий, связанных с окислительным стрессом (Петрович Ю.А., Гуткин Д.В., 1986; Петрович Ю.А., 2001; Семенов В.Л., 1989; Дубинина Е.Е., 1998; Richter C., 1987; Pattison D.I. et al. 2002; Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В., 2009; Заббарова И.В., 2004; Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., 2006; Глянько А.К., Митанов Н.Б., Степанова А.В., 2009 и др.).

Вышеизложенное диктует необходимость изыскания неинвазивных физических регуляторов образования и секреции эндогенного оксида азота на основе естественных физиологических процессов. Перспективным с этой точки зрения является использование ЭМИ на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота (Киричук В.Ф., Антипова О.Н., Креницкий А.П., 2004; Киричук В.Ф., Иванов А.Н., Антипова О.Н. и соавт., 2004).

Важнейшим регулятором биологических процессов в клетках является также кислород в его реактивных формах (РФК). Именно РФК рассматриваются как одна из систем внутриклеточных и межклеточных мессенджеров (Khan A.U., Wilson T., 1995; Гамалей И.А., Клюбин И.В., 1996; Зенков Н.К., 2009 и др.).

Известно, что при облучении на частотах биологически активных молекул из кислорода образуется его реактивные формы (Майбородин А.В., Креницкий А.П., Тупикин В.Д. и соавт., 2001). Можно полагать, что при использовании частот МСПИ молекулярного кислорода (О₂) эти процессы будут активизироваться.

Число работ, посвященных исследованию воздействия электромагнитного излучения на микроорганизмы, сравнительно невелико, и они в основном проводились на клетках дрожжей (Grundler W., Kaiser F. et al., 1992; Grundler W., Jentzsch U. et al., 1988; Голант М.Б., Кузнецов А.Г., Божанова Т.П., 1994; Гамаюрова В.С., Крыницкая А.Ю., Астраханцева М.Н., 2003; Вызулина В.И., 2008), актиномицетов, цианобактерий (Гуляев Ю.В., Тамбиев А.Х., 2003; Webb S.J., Dodds D.D., 1969; Gandhi O.P., 1983; Belyaev I.Y. et al., 1992, 1993, 1994, 2000; Belyaev I.Y., 2005; Брюхова А.К., 1991; Курлаев П.П., Чернова О.Л., Киргизова С.Б., 2000; Иванова Ю.В., 2004, 2007). Единичные сообщения посвящены изучению действия электромагнитного излучения СВЧ-диапазона с частотами 2,45 ГГц и 10 ГГц на условно-патогенные бактерии (Иванова Ю.В., Гусак И.В., 2009).

В последние десятилетия в результате фундаментальных исследований в России было создано новое перспективное направление медицины - КВЧ-терапия (крайне высокочастотная терапия, микрорезонансная терапия, миллиметровая терапия). Использование этого метода в терапии ряда заболеваний человека является одним из активно развивающихся направлений современной клинической медицины.

Лечение гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений относится к наиболее актуальным проблемам современной медицины. Анализ отечественных и мировых проспективных исследований свидетельствует о том, что число этих заболеваний не имеет тенденции к снижению, особенно у лиц молодого и среднего возраста, что обусловливает социальную значимость проблемы. Рост числа больных с осложненным течением острых воспалительных заболеваний, полимикробное инфицирование, резистентность к антибактериальным препаратам, быстрое развитие септического шока и полиорганной недостаточности диктуют необходимость совершенствования известных и поиска новых методов лечения гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений.

Немедикоментозные методы лечения заболеваний не только альтернативны лекарственным, но в ряде случаев имеют значительные преимущества как методы функциональной регулирующей терапии. Предложено много средств и методов, ускоряющих репаративно-регенераторные процессы в ранах. Однако проблема в целом остается еще далекой от своего разрешения. Определенные надежды появились в связи с внедрением в гнойную хирургию физико-химических методов терапии.

В настоящее время наблюдается переход от традиционного представления о бактериях как строго одноклеточных организмах к представлению о микробных сообществах как целостных структурах, регулирующих свои поведенческие реакции в зависимости от изменения условий обитания. Накоплено достаточно данных о механизмах, посредством которых осуществляются внутрипопуляционные, межвидовые и межштаммовые контакты у микроорганизмов, а также их взаимодействие с организмом хозяина. Процесс внутрипопуляционного информационного обмена бактериальных клеток между собой получил название «кворум сенсинг» (quorum sensing) (Greenberg Е., Winans S., 1996; Bauer W.D., Robinson J.B., 2002). Одним из механизмов «кворум сенсинга» является формирование биопленок.

Открытие и изучение биопленок является важным достижением микробиологии последних двадцати лет. Все представители нормальной микрофлоры в организме человека существуют в составе биопленок. С их образования также начинается развитие любой инфекции (Тец В.В., 1998; Тец В.В. и соавт., 2008; Tetz V.V., 1996, 2004; Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P., 1999; Costerton W., Veeh R., Shirtliff M. et al., 2003; O'Toolе G.A., Kaplan H.B., Kolter R., 2000).

Существование бактерий внутри биопленок обеспечивает им много преимуществ по сравнению с изолированными клетками. Для практической медицины особенно важно, что бактерии в биопленках имеют повышенную выживаемость в присутствии агрессивных веществ, факторов иммунной защиты и антибиотиков. Бактерии и грибы в биопленках выживают в присутствии антибиотиков, добавленных в количестве, в 500-1000 раз большем, чем их минимальная подавляющая концентрация (Donlan R.M., Costerton J.W., 2002; Davies D., 2003; Campanac C., Pineau L. et al., 2002; Hunt S.M., Philip S.S., 2006; Harrison J.J., Ceri H., Roper N.J. et al., 2005).

Представление о биопленках изменяет подходы к лечению ряда заболеваний. В настоящее время необходимы новые методы, которые смогут воздействовать на механизмы формирования и функционирования бактериальных сообществ в виде биопленок.

Создание генераторов, работающих на частотах спектров поглощения и излучения биологически активных молекул, позволило приступить к изучению влияния ЭМИ данных частотных диапазонов на различные биологические объекты и, возможно, откроет новые направления в практическом использовании электромагнитных волн.

В доступной литературе не обнаружено сведений, характеризующих влияние ЭМИ на частотах МСПИ оксида азота и атмосферного кислорода на прокариотические организмы.

Целью диссертационного исследования явилось изучение влияния электромагнитного излучения на частотах биологически активных молекул (молекулярного кислорода и оксида азота) на бактерии.

Достижение поставленной цели потребовало решения следующей группы задач, отражающих логическую последовательность предпринятого исследования.

Задачи исследования

1. Изучить влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на динамику развития бактериальных популяций.

2. Оценить влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на чувствительность бактерий к антибиотикам.

3. Исследовать активность ферментов антиоксидантной защиты бактериальных культур, подвергнутых воздействию ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂.

4. Определить показатели перекисного окисления липидов у бактериальных культур, подвергнутых воздействию ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂.

5. Охарактеризовать способность к образованию бактериальных биопленок у культур, подвергнутых воздействию ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂.

6. Изучить влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на течение экспериментальной раневой инфекции.

7. Оценить эффективность совместного действия ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ и антибиотиков на течение экспериментальной раневой инфекции.

Научная новизна работы

Впервые изучено влияние на прокариотические клетки ЭМИ терагерцового диапазона частот, в котором находятся молекулярные спектры поглощения и излучения различных клеточных метаболитов, в том числе NO и O₂.

В качестве источника электромагнитных волн использовался впервые разработанный в ОАО «ЦНИИИА» (г. Саратов) генератор, в котором возбуждались электромагнитные КВЧ-колебания, имитирующие структуру молекулярного спектра поглощения и излучения атмосферного кислорода на частоте 129±2 ГГц и оксида азота на частоте 150±2 ГГц.

Впервые изучено влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на динамику развития популяций микроорганизмов. Показано, что воздействие ЭМИ на частоте МСПИ O₂ в фазе логарифмического размножения в течение 30 минут стимулирует развитие популяции прокариотических клеток. В то же время воздействие ЭМИ на частоте МСПИ NO не оказывало существенного влияния на динамику развития популяции прокариот независимо от времени воздействия и фазы развития популяции.

Впервые установлено влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. Установлено, что облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO при 30-минутной экспозиции приводило к снижению уровня устойчивости как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий ко всем изученным антибиотикам, независимо от исходного уровня устойчивости и механизма действия антибиотиков, тогда как облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ существенно не влияло на уровень устойчивости бактерий к антибиотикам.

Проведенные исследования показали, что изученные частотные диапазоны угнетают экспрессию генов лекарственной устойчивости бактериальных клеток.

Впервые изучено влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на активность ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы прокариот. Выявлено, что облучение ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ повышает активность ферментов антиоксидантной защиты бактерий и не влияет на показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Впервые показано влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на течение экспериментальной раневой инфекции. Установлено, что использование ЭМИ на частоте МСПИ NO ускоряет заживление ран. Это касалось инфекции, вызванной как антибиотикочувствительными, так и антибиотикоустойчивыми штаммами микроорганизмов. Сочетанное применение ЭМИ на частоте МСПИ NO с антибиотиками при лечении экспериментальной раневой инфекции было более эффективно, чем применение только антибиотикотерапии или же только ЭМИ на частоте МСПИ NO.

Впервые выявлено влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ на образование биопленок микроорганизмов. Показано, что облучение культуры бактерий ЭМИ на частоте МСПИ O₂ повышает способность микроорганизмов к пленкообразованию, в то время как облучение культуры ЭМИ на частоте МСПИ NO снижает эту способность.

Практическая значимость

Полученные результаты по повышению скорости размножения культур прокариотических клеток под действием ЭМИ на частоте МСПИ O₂ могут быть использованы в биотехнологических процессах для повышения выхода биомассы при производстве различных продуктов микробиологического производства.

Данные о повышении активности метаболических ферментов под действием как ЭМИ на частоте МСПИ NO, так и ЭМИ на частоте МСПИ O₂ могут быть использованы в микробиологических производствах по получению продуктов микробного синтеза.

Полученные экспериментальные данные о снижении уровня антибиотикорезистентности, способности к формированию биопленки и положительном влиянии на течение экспериментальной раневой инфекции позволяют рекомендовать данный способ воздействия ЭМИ на частоте МСПИ NO для включения в комплексное лечение больных с гнойно-воспалительными заболеваниями.

Работа является фрагментом отраслевой научно-исследовательской программы: «Исследование влияния на сложные биологические системы электромагнитных колебаний на частотах молекулярных спектров излучения и поглощения веществ, участвующих в метаболических системах» (Договор № 005/037/ 002 от 25 сентября 2001 года с МЗ РФ).

Апробация диссертации

Основные положения работы доложены и обсуждены на XIII, XIV, XV pоссийских cимпозиyмах с мeждyнaрoдным yчаcтиeм «Mиллимeтрoвыe вoлны в медицинe и биoлoгии» (Москва, 2003, 2007, 2009), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009), III Всемирном конгрессе по клинической патологии и реабилитации в медицине (Паттайя, Таиланд, 2005), симпозиуме «Магнитные поля и здоровье человека» (Курск, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Социальные проблемы медицины и экологии человека» (Саратов, 2009), V Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, в том числе 12 в реферируемых журналах, включенных в перечень периодических научных и научно-практических изданий, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент РФ № 2007129978/13 от 19.08.2008 на изобретение «Устройство для облучения клеток биокультуры».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, объектов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 317 отечественных и 217 зарубежных источников. Текст диссертации изложен на 265 страницах, содержит 13 таблиц и 47 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Воздействие ЭМИ на частоте МСПИ O₂ приводит к изменению динамики развития бактериальных популяций.

2. Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO снижает уровень устойчивости грамположительных и грамотрицательных бактерий к антибиотикам с различным механизмом действия.

3. Облучение ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ угнетает экспрессию генов лекарственной устойчивости.

4. Воздействие ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ изменяет уровень активности ферментов антиоксидантной защиты бактерий.

5. Применение ЭМИ на частоте МСПИ O₂ при лечении экспериментальной гнойной инфекции существенно не влияет на течение раневого процесса. Применение ЭМИ на частоте МСПИ NO при лечении экспериментальной гнойной инфекции положительно сказывается на течение раневой инфекции - стимулирует заживление и сокращает сроки эпитализации гнойных ран.

6. Сочетанное применение ЭМИ на частоте МСПИ NO с антибиотиками при лечении экспериментальной гнойной инфекции более эффективно, чем лечение каждым из них в отдельности.

7. Облучение ЭМИ на частоте МСПИ O₂ повышает способность бактерий к формированию биопленки, a облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO тормозит этот процесс.

2. Содержание диссертационного исследования

В работе были использованы стандартные штаммы E. coli АТСС 25922, S. aureus АТСС 6538-Р, P. aeruginosa АТСС 27853, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича; E. coli j 53 (RP-1) (плазмидная устойчивость к канамицину (Km), тетрациклину (Tc)) и E. coli j 53 (R 100.1) (плазмидная устойчивость к левомицетину (Cm) и стрептомицину (Sm)), полученные из музея живых культур Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»; 40 клинических штаммов E. coli, S. aureus и 50 штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных, находившихся на лечении во 2-й клинической больнице г. Саратова.

Питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (Махачкала, Россия), мясо-пептонный агар (Махачкала, Россия), бульон Мюллера-Хинтона («bioMerieux», Франция), агар Мюллера-Хинтона («bioMerieux», Франция), трипказо-соевый агар («bioMerieux», Франция), среда LB («Sigma», США).

Антибиотики: цефтазидим («Синтез», Россия), цефотаксим («Lek DD», Словения), стрептомицин сульфат («Агрофарм» Россия), канамицин («ICN», США), гентамицин («Lederle», США), амикацин («Биосинтез», Россия), левомицетин натрия сукцинат («Синтез» Россия), линкомицин («Lek DD», Словения).

Реактивы: фосфатный буферный раствор («ТехноСоюз», Россия), раствор хлорида натрия («ТехноСоюз», Россия), нитросиний тетразолий - НСТ («Sigma», США), НАДН («Sigma», США), трихлоруксусная кислота, соляная кислота, гептан («ТехноСоюз», Россия), изопропиловый спирт («ТехноСоюз», Россия), серная кислота («ТехноСоюз», Россия).

Экспериментальные животные: белые беспородные мыши, самцы, массой 18-20 г.

Эксперименты по изучению воздействия электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров излучения и поглощения оксида азота и атмосферного кислорода проводились на впервые разработанных в ОАО «ЦНИИИА» (г. Саратов) генераторах, в которых возбуждались электромагнитные КВЧ-колебания, имитирующие структуру молекулярного спектра поглощения и излучения атмосферного кислорода на частотах 129±2 ГГц и оксида азота 150±2 ГГц (Креницкий А.П., Майбородин А.В., Бецкий О.В. и соавт., 2003).

Точное значение заданной частоты определяли в соответствии с международной базой данных молекулярных спектров высокого разрешения HITRAN, созданной с участием космического агентства и с учетом поправок на атмосферное давление и температуру окружающей среды (Бецкий О.В. и соавт., 2007).

В работе использовались два типа генераторов: стационарный и малогабаритный.

Стационарный генератор: квазиоптический КВЧ-генератор детерминированных шумов, разработанный в ОАО «ЦНИИИА» (г. Саратов) (Креницкий А.П., Майбородин А.В., Бецкий О.В. и соавт., 2003).

Одним из важных условий культивирования прокариотических клеток является температура окружающей среды. В связи с этим при проведении исследований по воздействию электромагнитного излучения на прокариотические клетки необходимо было обеспечить условия термостабилизации в процессе облучения. Для этого была разработана установка, состоящая из суховоздушного термостата ТС-80М-22 и помещенного в него квазиоптического генератора. С помощью квазиоптического программируемого генератора обеспечивалось облучение объектов исследования на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода (129 ГГц) и оксида азота (150 ГГц) непосредственно в процессе термостатирования.

Малогабаритный генератор: генератор, работающий на частотах 129 ГГц и 150 ГГц, разработан в медико-технической ассоциации КВЧ (г. Москва) совместно с ФГУП «НПП-Исток» (г. Фрязино) и ОАО «ЦНИИИА» (г. Саратов).

Малогабаритный генератор использовался для облучения животных, при экспериментальной раневой инфекции; во всех остальных экспериментах использовался стационарный генератор.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли в жидкой питательной среде Мюллера-Хинтона методом серийных разведений (МУК 4.2.1890-04.).

Результаты влияния ЭМИ на уровень устойчивости к антибиотикам оценивали по коэффициенту ингибирования устойчивости (КИУ), равному отношению МПК антибиотиков до и после облучения бактериальных культур.

Антибиотикочувствительные мутанты выявлялись методом реплик (Lederberg J., Lederberg E.M., 1952) после воздействия на культуры кишечной палочки ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂.

Активность каталазы определяли колориметрическим методом (Королюк М.А., 1988).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по методике С. Чевари и соавт. (1981).

Для оценки активности пероксидазы использовали метод А.Н. Бояркина (Ермаков А.И., 1987).

Определение диеновых конъюгатов (ДК) проводили по методу И.Д. Стальной (1977), малонового диальдегида (МДА) - по методу И.Д. Стальной и Г.Г. Гаришвили (1977).

Гемолитическую активность бактерий оценивали по диаметру зоны гемолиза вокруг колоний исследуемых штаммов на кровяном агаре, содержащем 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов (Выгодчиков Г.В., 1963). Штаммы, для которых эта величина составила менее 3 мм, оценивались как обладающие низкой гемолитической активностью; зона гемолиза, равная 3-6 мм, свидетельствовала о средней степени гемолитической активности, более 6 мм - о высокой.

Протеолитическую активность штаммов определяли на среде, содержащей 2% LA и 30% молока (Citti I., 1963). О количественном значении данного признака судили по размерам диаметра зоны просветления. При диаметре зоны просветления до 3 мм штамм расценивался как обладающий низкой протеолитической активностью, 3-4 мм - средней, более 4 мм - высокой.

Вирулентность штаммов определяли при внутрибрюшинном заражении белых мышей взвесью суточной культуры бактерий. Вычисление LD₅₀ проводили по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина (1962).

Раневую инфекцию воспроизводили на белых беспородных мышах, самцах, массой 18-20 г в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и предписаниями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990). Животным под легким эфирным наркозом на предварительно выбритых участках кожи в области спины наносили кожные раны длиной и шириной 10,0 мм, глубиной 2,0 мм. Раневая инфекция воспроизводилась путем инфицирования поверхности раны взвесью суточной агаровой культуры в количества 0,1 мл микробной взвеси (10⁹ мк.т./мл). Раневая инфекция развивалась к третьим суткам.

Оценку результатов проводили по двум показателям: планиметрическое исследование раневой поверхности и сроки заживления ран (Попова Л.Н., 1942; Фенчин К.И., 1979). Лечение антибиотиками и электромагнитным излучением осуществляли ежедневно, начиная с третьих суток от момента инфицирования раны, в течение десяти дней. Срок наблюдения за животными составлял 30 дней.

Образование биопленок изучали на основании определения способности штаммов P. aeruginosa к адгезии на поверхности 96-луночной полистероловой планшеты (Штейн И.В., Арендс И.М., Сорокина Т.А и соавт., 1989; Тец Г.В., 2007). В лунки пластиковых планшетов (96-луночные планшеты Sarstedt, Германия) вносили по 0,1 мл бульонной культуры бактерий (5•10⁷ КОЕ), выращивали в течение 24 часов при 37С. В качестве контроля в лунки вносили 0,1 мл жидкой питательной среды. Для оценки состояния биопленок удаляли содержимое лунок, промывали трехкратно фосфатным буфером, высушивали, окрашивали раствором генцианвиолета (50 мкл/лунку) в течение десяти минут, промывали фосфатным буфером, затем добавляли 96^O-ный этиловый спирт (200 мкл/лунку) и учитывали результаты на ридере (iEMS-Reader фирмы «Thermo Labsystems», Финляндия) при длине волны 540 нм.

Для изучения влияния ЭМИ на динамику развития бактериальных популяций суточную агаровую культуру тест-штаммов кишечной палочки и стафилококка смывали физиологическим раствором. Концентрацию клеток по оптическому стандарту мутности доводили до 10⁵ микробных тел в 1 мл и по 0,1 мл этой взвеси засевали в мясо-пептонный бульон, разлитый по 100 мл в колбы Эрленмейера объемом 300 мл каждая. На спектрофотометре СФ-26 при длине волны 560 нм определяли оптическую плотность (ОП) полученных взвесей. Посевы помещали в термостат при 37С и выращивали в металлическом контейнере, экранировавшем бактериальные клетки от облучения. Для обеспечения одинаковых условий развития на протяжении 24 часов внутри контейнера и внутри рабочей камеры поддерживалась постоянная температура 37С. Одна из колб служила контролем, другие - опытные.

Через 1, 6, 12 часов роста одну из опытных колб извлекали из контейнера и в том же термостате подвергали облучению ЭМИ на частотах молекулярного спектра поглощения атмосферного кислорода и оксида азота (129±2 ГГц, 150±2 ГГц) в течение 15 и 30 минут при плотности мощности 0,3 мВт/см², после чего вновь помещали в контейнер и продолжали культивировать до конца суток. Измерение оптической плотности всех исследуемых образцов проводили на разных сроках развития популяции.

Для изучения влияния ЭМИ на активность ферментов и уровень устойчивости бактерий к антибиотикам суточные культуры испытуемых микроорганизмов, выращенные на мясо-пептонном агаре, смывали 0,14М NaCl. Концентрацию клеток по оптическому стандарту мутности доводили до 10⁹ микробных тел в 1 мл. Аликвоту этой взвеси в количестве 1,5 мл вносили в пробирки типа «Эппендорф», а на 6-м часу культивирования подвергали воздействию ЭМИ в течение 10, 30, 45 и 60 минут. Контролем служили необлученные культуры.

Для изучения влияния ЭМИ на течение экспериментальной раневой инфекции облучение ЭМИ проводили локально - на область раневого дефекта. Излучение было направлено вертикально сверху вниз, на расстоянии 2 см от раневой поверхности. Мощность излучения генератора составляла 0,7 мВт, а плотность мощности, падающей на участок кожи, равнялась 0,3 мВт/см². Контрольные животные подвергались процедурам имитации воздействия, для чего мышей помещали в зону облучения при выключенном генераторе. Облучение животных и имитацию воздействия проводили в течение 10 минут.

Для изучения влияния ЭМИ на формирование бактериальной биопленки облучение ЭМИ культур испытуемых микроорганизмов, разлитых в 96-луночные полистероловые планшеты, осуществляли через 1, 6 и 12 часов с момента культивирования.

Методы статистической обработки. Статистическую обработку результатов и анализ данных проводили с помощью стандартных компьютерных программ Microsoft Excel (7.0 для Windows XP) и Statistica 6.0.

Влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2 на динамику развития популяций бактерий

В микробиологии успех любого исследования во многом зависит от того, настолько изучены характер роста данного микроорганизма и его питательные потребности. Характеристики роста отражают физиологические особенности микроорганизмов. Любое изменение внешней среды для растущих клеток можно рассматривать как стрессорные факторы. Первоначальный ответ микробных клеток на любой стресс направлен на то, чтобы нивелировать вызванные им сдвиги внутриклеточного равновесия и обеспечить свое выживание. Почти во всех случаях этот первый ответ основан на уже действующих биохимических механизмах. Во вторую очередь могут происходить изменения в экспрессии генов - для синтеза новых компонентов или для стимуляции имеющихся систем.

Объектом исследования были эталонные штаммы E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538-P(209P).

Установлено, что электромагнитное излучение на частотах МСПИ О₂ и МСПИ NO в течение 15 и 30 минут, проведенное через 1 час от начала культивирования, не влияет на развитие популяции.

Из представленных данных (рис. 1-4) видно, что 15 минутное воздействие ЭМИ на частотах МСПИ О₂ и МСПИ NO, проведенное на 6-м часу культивирования, также практически не влияло на развитие популяции. Оптическая плотность облученных культур как кишечной палочки, так и стафилококка незначительно возрастала, но разница с контрольной пробой статистически недостоверна (р>0,05).



Рис. 1. Кривые роста культур E. coli при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ O₂ через 6 часов от начала культивирования

После 30-минутного воздействия ЭМИ на частоте МСПИ О₂ на 6-м часу культивирования оптическая плотность облученных культур как кишечной палочки, так и стафилококка возрастала и составила для E. coli к 8-му часу - 1,0±0,03 ед., а к 12-му часу - 1,42±0,04 ед. В контрольной пробе показатель оптической плотности составлял 0,80±0,01 ед. и 1,12±0,01 ед. соответственно, для S. aureus к 8-му часу - 1,20±0,04 ед.; к 12-му часу - 1,75±0,04 ед., в контрольной пробе - 0,90±0,01 ед. и 1,27±0,04 ед. Таким образом, развитие популяции облученных культур по сравнению с контрольной культурой происходило более интенсивно.

Показатели оптической плотности культур E. coli и S. aureus, облученных ЭМИ на частоте МСПИ NO на 6-м часу культивирования в течение 30 минут, были немного ниже, чем контрольные, но эта разница статистически недостоверна (р>0,05).

Результаты экспериментов, в которых культуры E. coli и S. aureus облучали на 12-м часу развития популяции ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O₂ в течение 15 и 30 минут, свидетельствуют, что облучение, проведенное в это время, не влияет на развитие популяции. Показатели оптической плотности облученных и необлученных культур одинаковые.

Рис. 2. Кривые роста культур S. aureus при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ O₂ через 6 часов от начала культивирования

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что воздействие ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в фазе логарифмического размножения стимулирует развитие популяции. Известно, что в этой фазе культуры бактерий обладают наибольшей физиологической активностью и проявляют высокую чувствительность к действию различных экзогенных и эндогенных факторов, стимулирующих или подавляющих их рост (Рассудов С.М., 1954; Гаврилюк Б.К., 1955). Различия в скорости размножения культур, облученных в начальной и максимальной стационарных фазах, статистически недостоверны.



Рис. 3. Кривые роста культур E. coli при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ NO через 6 часов от начала культивирования

Тот факт, что скорость развития популяций, облученных в начальной или максимальной стационарной фазах, существенно не изменяется, позволяет предположить, что активация роста культур, облученных в логарифмической фазе развития, обусловлена в основном образованием кислорода в цитоплазме активно делящихся клеток.

С нашей точки зрения, облучение ЭМИ на частоте МСПИ O₂ не только и не столько активизирует кислород, содержащийся в питательной среде, но, главное, повышает реакционную способность не только кислорода, диффундируемого в биомассу, но и внутриклеточного кислорода за счет образования его реактивных форм.

Литературные данные указывают на то, что в зависимости от уровня концентрации в биообъектах оксида азота проявляется «двойственность» эффектов воздействия (Марков Х.М., 1996; Северина И.С., 1998; Снайдер С.Х., Бредт Д.С., 1992). С одной стороны, он является мессенджером при реализации значительного ряда физиологических функций. С другой стороны, при более высоком уровне концентрации оксида азота проявляется его цитотоксическое действие (Ванин А.Ф., 2000; Северина И.С., 1998).

Рис. 4. Кривые роста культур S. aureus при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ NO через 6 часов от начала культивирования

В наших опытах продемонстрировано, что облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO не оказывает влияния на развитие популяции, независимо от того, в какой фазе размножения производилось облучение электромагнитными волнами.

Влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2 на уровень устойчивости грамположительных и грамотрицательных бактерий к антибиотикам с различным механизмом действия

Помимо клинического, феномен лекарственной устойчивости представляет и общебиологический интерес, так как резистентность к потенциально повреждающим агентам свойственна клеткам самого разного происхождения. Выявление сущности и механизмов снижения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам способствует пониманию общих закономерностей изменчивости и наследственности, взаимодействия хромосомных и внехромосомных генов, а также решению целого ряда других биологических проблем.

Изучение влияния на фенотипическое проявление устойчивости E. сoli, S. aureus, P. aeruginosa к антибиотикам осуществлялось на 60 штаммах. В опыт взято по 20 культур каждого вида, обладающих различным уровнем устойчивости. Один антибиотик взят из группы ингибиторов синтеза пептидогликана, второй - ингибитор синтеза белка.

Нами показано, что облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ при экспозиции 10 и 30 минут практически не изменяло чувствительности изученных штаммов E. сoli как к цефотаксиму, так и гентамицину. Количество штаммов, для которых КИУ был равен или выше двух, составляло 20% как при 10-, так и при 30-минутной экспозиции.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ при экспозиции 10 и 30 минут ни в одном случае не изменяло уровень устойчивости изученных штаммов P. aeruginosa к амикацину и цефтазидиму.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ при экспозиции 10 и 30 минут изменяло чувствительность части изученных штаммов S. aureus как к линкомицину, так и к оксациллину. Количество штаммов, устойчивых к линкомицину, для которых КИУ был равен двум или выше двух, составляло 30% как при 10-, так и при 30-минутной экспозиции. Количество штаммов, устойчивых к оксациллину, для которых КИУ был равен или выше двух, составляло 20% при 10-минутной и 10% при 30-минутной экспозиции.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO изменяло чувствительность части изученных штаммов E. сoli к цефотаксиму и к гентамицину. Количество штаммов, устойчивых к цефотаксиму, для которых КИУ был равен двум, составляло 20% как при 10-, так и при 30-минутной экспозиции. Количество штаммов, для которых КИУ был выше двух, составляло 20% при экспозиции 10 минут и 40% при экспозиции 30 минут. Количество штаммов, устойчивых к гентамицину, для которых КИУ был равен двум, составляло 20% при экспозиции 10 и 30 минут. Количество штаммов, устойчивых к гентамицину, для которых КИУ был выше двух, составляло 10% при экспозиции 10 минут и 20% при экспозиции 30 минут.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO изменяло чувствительность части изученных штаммов P. aeruginosa к амикацину и цефтазидиму. Количество штаммов, устойчивых к амикацину, для которых КИУ был равен двум, составляло 20% при 10- и 30% при 30-минутной экспозиции. Количество штаммов, для которых КИУ был выше двух, составляло 0% при экспозиции 10 минут и 10% при экспозиции 30 минут. Количество штаммов, устойчивых к цефтазидиму, для которых КИУ был равен двум, составляло 10% при экспозиции 10 и 30 минут. Количество штаммов, устойчивых к цефтазидиму, для которых КИУ был выше двух, составляло 10% при экспозиции 10 минут и 20% при экспозиции 30 минут.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO изменяло чувствительность значительной части изученных штаммов S. aureus как к линкомицину, так и к оксациллину. Количество штаммов, устойчивых к оксациллину, для которых КИУ был равен двум, составляло 40% при 10-минутной и 30% при 30-минутной экспозиции. Количество штаммов, для которых КИУ был выше двух, составляло 20% при экспозиции 10 минут и 40% при экспозиции 30 минут. В 30% случаев наблюдалось снижение МПК антибиотика до уровня, характерного для чувствительных штаммов. Количество линкомицинрезистентных штаммов, для которых КИУ был равен двум, составляло 20% при экспозиции 10 и 30 минут. Количество штаммов, устойчивых к линкомицину, для которых КИУ был выше двух, составляло 20% при экспозиции 10 минут и 40% при экспозиции 30 минут. Выраженность эффекта в отношении различных штаммов была неоднозначной и определялась не только разными частотными характеристиками облучения, но была обусловлена и индивидуальными особенностями штаммов.

Таким образом, облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO при 30-минутной экспозиции приводило к снижению уровня устойчивости как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий к изученным антибиотикам, независимо от уровня резистентности бактерий к антибиотикам.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ при экспозиции 10 и 30 минут существенно не влияло на уровень устойчивости E. сoli, S. aureus, P. aeruginosa к антибиотикам с различным механизмом действия.

Влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2 на экспрессию генов лекарственной устойчивости

Прокариотическую клетку, как и любой живой организм, можно рассматривать как продукт ее генов. С этой точки зрения клеточный потенциал определяется совокупностью генов индивидуальной микробной клетки и тех генов, которые дополнительно присутствуют в «коллективном» видовом геноме.

По современным представлениям, хромосомы и плазмиды у прокариот равнозначны как носители генетической информации в том отношении, что экспрессируются под контролем одних и тех же регуляторных механизмов. Таким образом, пути регуляции, выявленные для одного типа этих генетических структур, должны относиться и к другим.

Изучение влияния ЭМИ на частотах МСПИ О₂ и МСПИ NO на экспрессию генов лекарственной устойчивости проведено на двух штаммах кишечной палочки: E. coli j 53 (RP-1), E. coli j 53 (R 100.1). Время экспозиции составляло 30 минут.

Как свидетельствуют представленные данные (рис. 5), спонтанное появление канамицинчувствительных вариантов наблюдалось у 9% клеток штамма E. coli j 53 (RP-1); стрептомицинчувствительных вариантов - у 4%, а левомицетинчувствительных вариантов - у 7% штамма E. coli j 53 (R 100-1).



Рис. 5. Влияние ЭМИ на частотах МСПИ O₂ и МСПИ NO на экспрессию генов плазмид лекарственной устойчивости

После воздействия ЭМИ на частотах МСПИ О₂ и МСПИ NO количество чувствительных клеток увеличивалось.

После воздействия электромагнитного излучения на частоте МСПИ О₂ появление канамицинчувствительных вариантов обнаруживалось у 18% клеток штамма E. coli j 53 (RP-1), стрептомицинчувствительных вариантов - у 5%, а левомицетинчувствительных вариантов штамма E. coli j 53 (R 100-1) - у 15%.

Подобная тенденция наблюдалась и при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ NO: отмечалось появление 21% канамицинчувствительных вариантов, 9% - стрептомицинчувствительных и 18% - левомицитин-чувствительных клеток.

Полученные результаты дают основание предполагать, что облучение ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ О₂ при плотности мощности не более 0,3 мВт/см² угнетало экспрессию генов лекарственной устойчивости плазмиды E. coli RP-1, и плазмиды E. coli R100-1.

Влияние ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2 на активность ферментов антиоксидантной защиты бактерий и продукты перекисного окисления липидов

Ферменты антиоксидантной защиты: каталаза, супероксиддисмутаза, пероксидаза являются жизненеобходимыми компонентами метаболизма любых прокариотических клеток. Они обеспечивают баланс окислительно-восстановительных систем, необходимых для энергообеспечения жизненного цикла бактериальной клетки. Можно полагать, что различные воздействия, проявляющиеся в изменении развития бактериальных популяций, будут сопровождаться изменениями в активности этих ферментных систем.

Из представленных данных (рис. 6) видно, что при облучении ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 10 минут изменение активности каталазы было незначительным и оказалось достоверным только для клинических штаммов синегнойной палочки.

Уровень активности каталазы при облучении ЭМИ на частоте МСПИ O₂ в течение 30 минут возрастал на 9% у эталонного штамма S. aureus и на 5% у клинических штаммов этого вида; на 6% у эталонного штамм E. coli и на 8% - у клинических штаммов; на 5% - у эталонного штамма P. aeruginosa и на 13% - у клинических штаммов.

При облучении ЭМИ на частоте молекулярного кислорода в течение 45 минут активность каталазы также увеличивалась по сравнению с контролем и достигала максимального значения у всех штаммов. Уровень каталазы возрастал на 21% у эталонного штамма S. aureus и на 29% у клинических штаммов; на 32% у эталонного штамма E. coli и на 27% у клинических штаммов; на 17% у эталонного штамма P. aeruginosa и на 33% у клинических штаммов. Полученные данные статистически достоверны.



Рис. 6. Изменения активности каталазы при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ О₂.* - p<0,05; ** - p>0,05

При облучении в течение 60 минут уровень каталазы был несколько меньше показателей при 45-минутной экспозиции, но превышал контрольные значения на 12 и 15% у S. aureus; на 12% у E. coli и на 11 и 13% у P. aeruginosa.

При облучении ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 10 минут уровень активности СОД имел тенденцию к повышению в отличие от уровня активности каталазы и пероксидазы. Он превышал контрольные значения на 2 и 5% у S. aureus; на 8 и 10% у E. coli и на 14% у P. aeruginosa.

При изучении динамики изменения активности СОД (рис. 7) видно, что уровень активности данного фермента после облучении ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 30 минут возрастал на 2% у эталонного штамма S. aureus и на 5% - у клинических штаммов этого вида; на 10% - у эталонного штамма E. coli и на 21% - у клинических штаммов; на 19% - у эталонного и на 17% - у клинических штаммов P. aeruginosa.

При облучении ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 45 минут активность СОД также увеличивалась по сравнению с контролем у всех штаммов. Активность супероксиддисмутазы возрастала на 27% у эталонного штамма S. aureus и на 31% - у клинических штаммов; на 26% - у эталонного штамма E. coli и на 29% - у клинических штаммов; на 26% - у эталонного штамма P. aeruginosa и на 34% - у клинических штаммов.

Рис. 7. Изменения активности супероксиддисмутазы при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ O₂.* - p<0,05; ** - p>0,05

При облучении в течение 60 минут уровень активности СОД уменьшался. Данный показатель был меньше контрольных значений на 9 и 8% у S. aureus; на 1 и 6% у E. coli и на 4% у P. aeruginosa.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 10 минут не влияло на активность пероксидазы, уровень активности этого фермента практически не отличался от контрольных значений, но имел тенденцию к повышению. Он превышал контрольные значения на 1 и 5% у S. aureus, на 2 и 5% - у E. coli и на 2% - у P. aeruginosa.

При изучении динамики изменения активности пероксидазы (рис. 8) установлено, что уровень активности данного фермента после облучении ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 30 минут возрастал на 7% у эталонного штамма S. aureus и на 15% - у клинических штаммов этого вида; на 6% - у эталонного штамма E. coli и на 12% - у клинических штаммов; на 10% - у эталонного и на 12% - у клинических штаммов P. aeruginosa.

Рис. 8. Изменения активности пероксидазы при воздействии ЭМИ на частоте МСПИ O₂.* - p<0,05; ** - p>0,05

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ О₂ в течение 45 минут вело к повышению активности пероксидазы. Уровень активности пероксидазы увеличивался по сравнению с контролем у всех штаммов. Активность пероксидазы возрастала на 13% у эталонного штамма S. aureus и на 17% - у клинических штаммов; на 12% - у эталонного штамма E. coli и на 13% - у клинических штаммов; на 16% - у эталонного и клинических штаммов P. aeruginosa.

При облучении в течение 60 минут уровень активности пероксидазы также превышал контрольные значения. Данный показатель был больше контрольных значений на 17 и 16% у S. aureus; на 18 и 15% у E. coli и на 17 и 18% у P. aeruginosa.

Таким образом, облучение бактериальных взвесей стафилококка, кишечной и синегнойной палочек ЭМИ на частоте МСПИ О₂ приводило к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты. Данный процесс, при различном времени экспозиции от 10 до 60 минут, развивался постепенно и достигал максимума при 45-минутной экспозиции для каталазы и СОД и 60-минутной экспозиции - для пероксидазы.

Длительная 60-минутная экспозиция приводила к торможению активности и каталазы и супероксиддисмутазы, чего нельзя сказать об активности пероксидазы. Уровень активности пероксидазы был повышен при различном времени экспозиции облучения ЭМИ на частоте МСПИ О₂. Такая динамика характерна для всех трех изученных видов бактерий, хотя они и различаются между собой по уровню исходной активности ферментов антиоксидантной защиты.

...