Заготовка клапанов

Изъятие овечьих митральных клапанов производилось в стерильных условиях по методике, основанной на способе заготовки, предложенном R. Baird в 1969 году. С целью уменьшения объема тканей, подвергающихся децеллюляризации, по сравнению с оригинальной методикой 1969 года, был существенно уменьшено количество миокарда на аллографте. Таким образом, митральный клапан иссекался полностью, со створками с каймой мышцы левого предсердия шириной 3-4 мм, хорд и головок папиллярных мышц высотой не более 5-7 мм. Процесс децеллюляризации начинался через 4-6 часов после забора материала. В течение этого времени клапаны находились в 0,1 М фосфатном буфере (PBS, Dulbecco) при температуре 4^oC.

Децеллюляризация

Децеллюляризация цельных аллографтов проводилась в стерильных условиях с использованием шейкера (GFL-3031, Gesellschaft fьr Labortechnik mbH, Германия) и оригинальных стеклянных емкостей с рельефными стенками, обеспечивающих высокую турбулентность. Перед началом обработки все клапаны подвергались стерилизации повидон-йодом (B. Braun, Германия). Разработка методики децеллюляризации проводилась в несколько этапов, представленных в таблице 2, и включала в себя сравнение 21 раствора. Из работы были исключены 6 клапанов по причине их инфицирования во время обработки.

Необходимо отметить, что в серии 5 в детергентный раствор был добавлен в-меркаптоэтанол (AppliChem GmbH, Германия) - восстанавливающий агент, увеличивающий растворимость белков, разрушая дисульфидные связи (Wong et al., 2011). После окончания собственно процесса децеллюляризации все клапаны отмывались от детергентов и клеточного детрита в течение 5 суток.

Гистологический анализ

Для оценки результатов децеллюляризации, а также для качественного анализа структуры МА и ДМА использовались следующие гистологические окраски: гематоксилин-эозин, пентахром по Мовату, окраска на эластин по Ван Гизону, окраска по фон Косса. Световая микроскопия выполнялась на аппарате Olympus BX40F (Olympus, Япония) с цветной камерой AxioCam MRс (Carl Zeiss, Германия).

Для более точного анализа структуры и результатов обработки клапанов, оценки степени репопуляции по окончании хронического эксперимента in vivo выполнялись иммунофлюоресцентные окраски на следующие антигены: коллаген I типа (клон COL-I, Sigma, США); коллаген IV типа (клон CI22, DAKO, Дания); DAPI 5mg/ml (Invitrogen, США); б-Gal: DyLight 594 (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Изолектин B4; CD31 (моноклональный мышиный IgG_2a, Serotec, США); фактор Von Willebrand (поликлональный кроличий IgG, DAKO, Дания); eNOS (моноклональный мышиный IgG₁ к eNOS/NOS III типа, BD Transduction Laboratories, США). ИФА выполнялась на аппарате Carl Zeiss Axio Observer A1 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Германия) с лампой LQ-HXP120-Z (Liestungenselektronik Jena GmbH, Германия) и камерой AxioCam MRm (Carl Zeiss, Германия). Для количественного анализа полученных микрофотографий использовалась программа SmartPiHiCo, разработанная в LEBAO). Принцип работы программы основан на подсчете пикселей определенного цвета и сравнении полученных цифр.

Цитотоксический тест

Для исключения токсичности децеллюляризированного митрального аллографта (ДМА) были использованы эндотелиальные клетки (EC, endothelial cells) - потомки эндотелиальных клеток-предшественников (ЕРС, endothelial progenitor cells), полученные из периферической крови взрослой овцы и помеченные белком, имеющим красную флюоресценцию (RFP, red fluorescent protein) с помощью VSV.G-псеводотипированных вирусных частиц.

Было подготовлено 8 клапанов - 6 были децеллюляризированы с помощью протокола 5-11, 2 - с помощью аналогичной методики, но без использования в-меркаптоэтанола. Из передней и задней створки каждого клапана было иссечены зоны А2 и Р2 и уложены в отдельную лунку 12-луночных панелей. В качестве положительного контроля использовались две лунки, покрытые желатином. В каждую лунку высевались 32.000 клеток на 1 см², в 2 мл среды EGM (Lonza, США). Клетки культивировались при температуре 39 ^оС, при содержании СО₂ в атмосфере 5%. Смена питательной среды и фотосъемка производилась ежесуточно (микроскоп Olympus BX40F, Olympus, Япония) с цветной камерой AxioCam MRс (Carl Zeiss, Германия). После окончания формирования монослоя из фрагментов створок приготавливались гистологические препараты, выполнялись окраски: гематоксилин-эозин, пентахром по Мовату, а также ИФА на CD31, vWF и eNOS для подтверждения эндотелиальной природы клеток.

Определение количества ДНК

Для определения количества ДНК было использовано по три фрагмента сворок пяти ДМА, в качестве контроля выступали два свежих клапана, приготовленные аналогично. Для выделения ДНК из ткани использовался набор DNeasy Blood&Tissue Kit (QIAGEN N.V., Нидерланды) в соответствии с рекомендациями производителя. Количество ДНК подсчитывалось на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США) с прилагающимся программным обеспечением.

Механические испытания

Для оценки механических свойств ДМА выполнялись испытания на одноосное растяжение на аппарате Zwick/Roell Z 0.5 (Zwick/Roell, Германия). Из каждого ДМА в радиальном направлении иссекался фрагмент зоны А2 с размерами испытываемой части 5х2,5 мм (соотношение сторон 2:1). Толщина рассчитывалась сенсором S246 (Sylvac SA, Швейцария) с прилагающимся программным обеспечением. Уровень преднагрузки был принят равным 0,005 Н, что соответствует порогу чувствительности прибора. Механические испытания заключались в растяжении до разрушения после прекондиционирования. Оценивались следующие значения: переходная деформация (е_тр, %) и соответствующее ей значение силы (у_тр, МПа), предельная деформация (е_UTS, %), предельное значение силы (у_UTS, МПа), модуль эластичности ткани в эластической и коллагеновой фазах кривой зависимости деформации от нагрузки. Значения силы были нормализованы относительно площади поперечного сечения. Модулями эластичности эластиновой и коллагеновой фаз кривой зависимости деформации от нагрузки принимались тангенсы углов наклона линий тренда (R²>0,9), проведенных для соответствующих отрезков графика.

Хирургическая имплантация.

Операции производились на овцах (n=4) с использованием комбинированного эндотрахеального наркоза и искусственного кровообращения через левостороннюю боковую торакотомию в 3-м межреберьи. АИК подключался по схеме «дуга аорты - ушко правого предсердия», выполнялась кардиоплегия раствором Бакберга. Сначала иссекался собственный митральный клапан. Размер имплантируемого ДМА выбирался так, чтобы он на 4-5 превышал диаметр фиброзного кольца реципиента. Затем головки папиллярные мышц реципиента и донора прошивались полипропиленовыми нитями 4-0 (Prolene, Ethicon Inc., США) с двумя прокладками из ПТФЭ, по два П-образных шва на каждую мышцу. После этого клапан опускался внутрь желудочка, швы завязывались. Далее, кольцо аллографта фиксировалось к фиброзному кольцу реципиента двумя швами Prolene 4-0 в области митрально-аортальных треугольников. После завязывания узлов, каждый шов продолжался в непрерывный обвивной до достижения противоположного. Отсутствие опорного кольца было принципиальным, чтобы изучить возможность имплантации аллографта детям, у которых наличие жесткого элемента приведет к стенозированию. Перед закрытием левого предсердия выполнялась гидравлическая проба, при возникновении пролапса митрального клапана вследствие избыточности створок (1 случай из 4) выполнялась пликация створок митрального клапана нитью пролен 5-0. Схема операции представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема операции. Ао - аорта.

В качестве контроля был использован один БИКС Vascutek Aspire диаметром 21 мм (Vascutek Ltd, Великобритания), техника его имплантации была стандартной для клапанов такого типа: с сохранением задней створки нативного клапана и использованием 12-ти П-образных швов на прокладках из ПТФЭ. После окончания искусственного кровообращения всем животным выполнялась чреспищеводная эхокардиография (Philips CX50 с зондом Philips X7-2t 46Hz, Philips, Нидерланды). Оценивалась подвижность створок, градиент давлений на клапане (максимальный и средний) и наличие регургитации. На протяжении 14 суток животные получали профилактическую антикоагулянтную терапию фраксипарином (GlaxoSmithKline Inc., Канада) в дозе 1 мг/кг/сут.

Статистический анализ.

Данные подвергались статистическому анализу с помощью программного пакета STATISTICA 10.0. Для выявления различий между двумя сравниваемыми группами использовался парный критерий Стьюдента для малых выборок. Уровень статистической значимости был принят равным 0,05.

Результаты

Все митральные аллографты были заготовлены по модифицированной методике R. Baird с минимальным объемом иссеченного вместе с клапаном миокарда.

Результаты децеллюляризации

В процессе подбора наиболее эффективного способа децеллюляризации митрального клапана овцы была изучена эффективность 21 варианта раствора. Растворы 1-3 серий по результатам ИФА показали свою неэффективность в элиминации внутриклеточных (ДНК) и внеклеточных антигенов (б-GAL). В четвертой серии растворы 4-8 и 4-10 эффективно удаляли ДНК, но не влияли на содержание б-GAL в тканях клапана. Раствор 5-11, содержащий в-меркаптоэтанол, показал наилучший результат децеллюляризации: в створках и хордах митральных аллографтов, обработанных им, по результатам ИФА на ДНК и б-GAL с помощью программы SmartPiHiCo, флюоресценция окрашенных нуклеиновых кислот снизилась на 99,9%, а анти-GAL антител - на 99,6% (рис. 4). Гистологическая картина внеклеточного матрикса клапанов, децеллюляризированных с использованием протокола 5-11, не имела существенных отличий по сравнению с нативным клапаном: сохранялось выраженное разделение на слои, визуализировались структурированные волокна коллагена и эластина (рис. 2). При количественном подсчете ДНК без использования ДН-азы ее уровень в децеллюляризированных методом 5-11 клапанах снижался на 71,2% (82,9 ± 48,2 нг/мг против 287,8 ± 76,5 нг/мг, t<0.01), а после обработки ферментом - на 96,4% (10,4 ± 16,9 нг/мг, t<0.01), что свидетельствовало о полном разрушении клеток и ядерных элементов в ходе децеллюляризации. Волокна коллагена I типа по данным ИФА также не теряли структурной целостности и организации. Интенсивность сигнала антител к коллагену IV типа по данным программы SmartPiHiCo была снижена на 58-61%, однако флюоресценция базальной мембраны прослеживалась на всем протяжении створки митрального клапана с обеих сторон, а также на поверхности хорд и папиллярных мышц (Рис. 3).

Микрофотографии клеток, сделанные в 1-е сутки после посева клеток на поверхности створок клапана, показали, что клетки закрепились, распределившись по всей предоставленной площади. Первые хаотично расположенные колонии клеток обнаруживались уже на 3-й день культивации, и к 7-му дню все засеянные фрагменты клапанов были равномерно покрыты однорядным слоем клеток, имеющим вид булыжной мостовой, типичный для эндотелиальных клеток. Различий в скорости роста клеток и формирования монослоя на клапанах, приготовленных с использованием в-меркаптоэтанола и без него, выявлено не было. Окраски по Мовату и гематоксилином и эозином этих фрагментов створок показали, что клетки располагаются однорядным слоем по поверхности децелюлляризированной створки митрального клапана, не проникая в его толщу (рис. 5).

Рисунок 2. Гистологическая картина створок свежего и децеллюляризированного МА.

Рисунок 3. ИФА створок свежего и децеллюляризированного МА на коллаген IV и ДНК.

Рисунок 4. ИФА створок и хорд свежего и децеллюляризированного МА на эпитоп б-GAL и ДНК.

Рисунок 5. Результаты цитотоксического теста.

Эндотелиальная природа клеток на поверхности фрагментов клапанов была подтверждена при ИФА. Мембрана клеток фиксировала антитела, специфичные к антигену CD31, а в цитоплазме этих клеток обнаруживались гранулы, связывающие антитела к фактору фон Виллебрандта. Флюоресценция, отмечающая эндотелиальную NO-синтазу, обнаруживалась как на мембранах, так и во внутриклеточных гранулах (комплекс Гольджи).

Результаты исследования механических свойств децеллюляризированного митрального аллографта.

Толщина створок митрального клапана в результате децеллюляризации уменьшалась и составила, 0,24 ± 0,11 мм против 0,35 ± 0,06 мм у свежего МА; р=0,074.

Значения у_UTS для децеллюляризированных образцов оказались выше, чем для свежих - 1,23 ± 0,35 MPa против 2,16 ± 0,42 MPa (р<0.001), так же, как и модуль эластичности ткани в коллагеновой фазе кривой - 5,5 ± 1,26 против 8,29 ± 2,86 (p=0,04).

Рисунок 6. Сравнение механических свойств свежих и децеллюляризированных митральных аллографтов. у_UTS - предельное значение силы, МРа, у_Tr - переходное значение силы, МР, е_UTS - деформация при предельном значении силы, %, е_Tr - переходная деформация, %.

С другой стороны, изменения в остальных показателях не были статистически достоверны. Так, отмечалось некоторое увеличение показателей е_Tr (0,1 ± 0,05 против 0,18 ± 0,09; p=0,15) и у_Tr (0,12 ± 0,05 MPa против 0,24 ± 0,08 MPa; р=0,08), а так же е_UTS (0,3 ± 0,09 против 0,44 ± 0,1, p=0,09) и модуля эластичности в начальной (эластиновой) части кривой (0,39 ± 0,28 против 0,67 ± 0,55, p=0,46). Сравнительная характеристика свежих и децеллюля-ризированных митральных аллографтов представлена на рисунке 6.

Результаты хронического эксперимента in vivo

По окончании искусственного кровообращения всем животным была выполнена чреспищеводная эхокардиография. Ее результаты представлены в таблице 8.

Из таблицы видно, что в периоперационном периоде гемодинамические результаты протезирования митрального клапана децеллюляризированным митральным аллографтом были удовлетворительными. Только у одного животного была выявлена регургитация 2 степени.

Рисунок 7. Вид ДМА через 2 месяца после имплантации. Зеленая стрелка - линия шва, синяя стрелка - прокладки из ПТФЭ, черная стрелка - донорская часть папиллярной мышцы.

Рисунок 8. Вид ДМА через 4 месяца после имплантации. Зеленая стрелка - линия шва.

Два ДМА были эксплантированы по истечении 2 месяцев (животные №№ 12, 102), еще два - через 4 месяца (№№ 91, 97) после операции, Контрольный биологический клапанный протез (животное № 100) был также эксплантирован через 4 месяца. Макроскопически при эксплантации створки и хорды всех образцов сохранили исходное анатомическое строение, были мягкими, без признаков кальцификации или рубцевания. Папиллярные мышцы ДМА, напротив, с увеличением срока пребывания в организме реципиента замещались рубцом и срастались с головками папиллярных мышц реципиента. На предсердной и желудочковой поверхности створок ДМА №№12, 102 обнаруживались единичные участки микротромбозов размерами на более 2 мм в наибольшем измерении (рис. 7). Нить была полностью скрыта в тканях как со стороны предсердия, так и со стороны желудочка на образцах №№ 91, 97, хотя и через два месяца после имплантации линия шва была полностью эндотелизирована (рис. 8). В то же время, БИКС демонстрировал ярко выраженную склонность к кальцификации - в контрольном клапане, эксплантированном по истечении 4 месяцев, макроскопически определялись одиночные ядра кальцификации с тенденцией к локализации в области основания полулунных створок (рис. 9). Очаги кальцификации также являлись местом развития микротромбозов на поверхности створок.

Во всех образцах ДМА, независимо от сроков их эксплантации, была сохранена структура хорд и четырехслойное строение створок (рис. 10). Была выявлена разная степень репопуляции разных слоев створок ДМА. Так, поверхность створок ДМА №№ 12 и 102 была эндотелизирована на протяжении проксимальной трети, при этом над областью шва, преимущественно со стороны предсердия, определялась отчетливая зона гиперплазии интимы толщиной до 0,6 мм. В то же время, репопуляция pars spongiosa была меньшей по протяженности примерно наполовину, а в pars fibrosa вообще не было клеточных ядер. В образцах №№ 91, 97 эндотелий выстилал приблизительно Ѕ створки, дистальнее обнаруживались только одиночные клетки. Репопуляция pars spongiosa так же отставала примерно наполовину от поверхности, и в проксимальной части pars fibrosa уже обнаруживались одиночные клеточные ядра, преимущественно около ее внешних границ (рис.10). Хорды практически полностью эндотелизировались уже к концу 2-го месяца, и в их толще выявлялись клеточные ядра, располагавшиеся преимущественно ближе к поверхности. В образцах № 91, 97 эндотелиальная выстилка хорд была сплошной, а количество ядер в толще хорд было выше.

Рисунок 10. Гистологическая картина створок ДМА через 2 и 4 месяца, и БИКС через 4 месяца после имплантации.

Децеллюляризирован-ные папиллярные мышцы, по мере увеличения срока пребывания в организме реципиента, уменьшались в объеме, замещаясь коллаге-ном - в образцах №№12, 102 в донорсих папиллярных мышцах выявлялась только рубцовая ткань.

Рисунок 9. Вид БИКС Vascutek Aspire через 4 месяца после имплантации. Желтые стрелки - очаги кальцификации.

При окраске по фон Косса в створках и хордах ДМА не было выявлено ядер кальцификации, в то время как в свином биологическом протезе определялись одиночные крупные, 200-800 мкм в диаметре, и множество мелких, 5-10 мкм, кальцинатов. При этом крупные очаги кальцификации локализовались в проксимальной части створок ближе к их желудочковой поверхности, а мелкие располагались равномерно по всей и толщине и на всем протяжении. В то же время, замещенные рубцом донорские части папиллярных мышц имели отдельные очаги кальцификации размером до 600 мкм (рис. 10).

При ИФА децеллюляризированных МА после эксплантации на всем протяжении створки, а также на хордах был выявлен коллаген IV. Примечательно, что он обнаруживался не только в проксимальной части, заселенной эндотелиальными клетками реципиента, но и в дистальных отделах створки, где еще клеток не было. Этот факт говорит о значительной стабильности базальной мембраны ДМА, сохраняющейся на поверхности створок в течение 4-х месяцев даже при отсутствии синтезирующего его эндотелия. Клетки, находившиеся на поверхности створок, при ИФА содержали антигены эндотелиальных клеток, CD31, фактор фон Виллебрандта и eNOS. В pars fibrosa определялись волокна коллагена I, неизменные по сравнению с таковым в створке свежего митрального клапана.

Контрольный биологический клапан, созданный с использованием свиных аортальных створок, также сохранил дифференциацию на слои, но был значительно менее восприимчив к репопуляции. Только на его предсердной поверхности определялись эндотелиальные клетки (CD31+, vWF+, eNOS+), имеющие тенденцию к образованию однорядного слоя на проксимальной Ѕ поверхности створки. На желудочковой поверхности клеточные элементы не определялись. Отдельные скопления клеток в толще створки были так обнаружены вокруг очагов кальцификации. При световой микроскопии препаратов БИКС, приготовленных по Мовату, во всех слоях определялись округлые образования, окрашивающиеся, как цитоплазма клеток, но при ИФА в этой зоне не были обнаружены клеточные ядра, что не позволяет говорить о наличии там живых клеток (рис. 10).