Размещено на http://www.allbest.ru/

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории и на кафедре патологической физиологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук

Полина Владимировна Косарева

доктор медицинских наук, профессор

Евгений Иванович Самоделкин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Людмила Владимировна Кривохижина

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России, г. Москва

Защита диссертации состоится «3» февраля 2012 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д.64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д.64)

Автореферат разослан «___» __________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Наталья Викторовна Тишевская

1. Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. К настоящему времени описаны разнообразные изменения слизистой оболочки желудка, возникающие при воздействии различного рода повреждающих факторов: химического, физического, инфекционного; при этом морфологические изменения СОЖ при воздействии различного рода повреждающих агентов имеют свои особенности [Минушкин О.Н. и др., 2003; Каратеев А.Е., 2011]. Тем не менее, динамику структурных изменений слизистой оболочки желудка можно рассматривать как вариант типового патологического процесса (хронического воспаления), приобретающего ряд специфических черт, обусловленных конкретным этиологическим фактором [Шелехова К.В., 2004].

На сегодняшний день, согласно модифицированной Сиднейской классификации, по этиологическому принципу выделяют следующие типы хронических гастритов: атрофический (аутоиммунный тип А и мультифокальный), неатрофический или ассоциированный с H. pylori (тип В) и особые формы гастрита - химический (или реактивный рефлюкс-гастрит - тип С), радиационный, лимфоцитарный, неинфекционный гранулематозный и эозинофильный [Аруин Л.И., 2002; Кокшаров В.Н., 2007].

Морфологические изменения СОЖ и патогенез хронического гастрита заболевания имеет свои особенности для разных форм гастрита [Минушкин О.Н. и др., 2003]. Общепризнано, что наиболее часто встречается Helicobacter pylori - ассоциированный гастрит, однако не менее актуальной является и так называемая НПВП-гастропатия (одна из разновидностей химического гастрита, типа С) - повреждение слизистой оболочки желудка, вызванное приемом нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Нестероидные противовоспалительные препараты относятся к числу наиболее распространенных лекарственных средств, часто назначаемых врачами для лечения различных заболеваний у пациентов всех возрастных групп [Hawkey C.I. et al., 2001]. Известно, что во всем мире 300 миллионов людей используют нестероидные противовоспалительные препараты (NSAIDs) и 1,2% населения США принимает эти препараты ежедневно [Cavallini M.E. et al., 2006]. При этом НПВП относятся к безрецептурным средствам, и пациенты зачастую принимают их без предварительной консультации с врачом.

Важнейшей патологией, ассоциированной с НПВП, является НПВП-гастропатия [Каратеев А.Е., 2011]. В последнее время внимание исследователей все больше привлекают проблемы патогенеза, патоморфологии и поиск новых методов лечения НПВП-гастропатии. Это объясняется, прежде всего, тем, что многогранность патогенетических механизмов повреждения СОЖ при длительном приеме пациентом НПВП дает возможность коррекции различных звеньев патогенеза НПВП-гастропатии и служит обоснованием проведения комплексной терапии, учитывающей возможность сочетанного воздействия на общие механизмы патологического процесса. Тем не менее, вопросы патогенеза НПВП-гастропатии до настоящего времени остаются до конца не выясненными [Козлова И.В. и др., 2006; Mino-Kenudson M. et al., 2006; Bjarnason I., Takeuchi K., 2009; Feldman M., 2011].

В связи с этим, целью нашего исследования явилось изучение в экспериментальных условиях патогенетических механизмов повреждения слизистой оболочки желудка, сопровождающего длительное применение нестероидных противовоспалительных препаратов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: в экспериментальных условиях изучить патогенетические механизмы повреждения слизистой оболочки желудка при длительном применении нестероидных противовоспалительных препаратов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Разработать экспериментальную модель химического гастрита, вызванного длительным употреблением нестероидных противовоспалительных препаратов.

2. На экспериментальной модели исследовать изменения процессов апоптоза, клеточной пролиферации и секреции муцинов эпителиальными клетками СОЖ в условиях химического повреждения.

3. Изучить роль провоспалительных цитокинов в формировании патологических процессов в СОЖ при длительном применении НПВП.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Длительное использование в эксперименте нестероидных противовоспалительных препаратов в сочетании с 5%-ным раствором аскорбиновой кислоты, принимаемыми per os, позволяет воспроизвести морфологическую картину НПВП-гастропатии, что подтверждается результатами гематологических, гистологических и гистометрических исследований.

2. При экспериментальной НПВП-гастропатии наблюдается активация как процессов апоптоза, так и процессов пролиферации эпителиальных клеток СОЖ. Выявленные эффекты могут быть объяснены с позиции роли провоспалительных цитокинов в патогенезе НПВП-гастропатии.

3. При моделировании в эксперименте НПВП-гастропатии отмечается нарушение нормального зонального распределения муцинов в эпителии СОЖ, выявляемое гистохимическими и иммуногистохимическими методами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Установленные в процессе выполнения экспериментов морфометрические, гистохимические и иммуногистохимические константы позволяют расширить представление о гистологическом строении желудка интактных неинбредных белых крыс и использовать полученные данные в эксперименте.

Впервые выявлено, что пероральное введение неинбредным белым крысам в течение 21 дня нестероидных противовоспалительных препаратов (кетопрофен или нимесулид) в сочетании с 5%-ным раствором аскорбиновой кислоты вызывает у экспериментальных животных развитие НПВП-гастропатии, что проявляется в формировании в СОЖ сосудистых расстройств, дистрофических изменений ямочного эпителия, увеличении количества париетальных клеток в дне желез фундального и кардиального отделов, появлении в собственной пластинке слизистой оболочки большого количества гладких миоцитов, гипертрофии мышечной пластинки СОЖ. Морфометрическими исследованиями установлено, что у животных с экспериментальной НПВП-гастропатией отмечается достоверное увеличение средних показателей толщины СОЖ за счет увеличения ширины мышечной пластинки и статистически достоверное увеличение числа обкладочных клеток в эпителии желез. Выявлено, что при моделировании в эксперименте НПВП-гастропатии отмечается нарушение нормального зонального распределения муцинов, выявляемое гистохимическими и иммуногистохимическими методами. Продемонстрировано, что выявленные гистологические изменения в эпителии СОЖ сопровождаются изменениями в периферической крови животных.

Впервые установлено, что при экспериментальной НПВП-гастропатии наблюдается активация как процессов апоптоза, так и процессов пролиферации эпителиальных клеток СОЖ; при этом наиболее выраженная экспрессия маркеров и пролиферации (Ki-67), и апоптоза (FasL, TNF-б) отмечается в покровно-ямочном эпителии. Полученные данные свидетельствуют о важной роли в апоптозе эпителиоцитов желудка апоптоза, опосредованного провоспалительными цитокинами.

Впервые выявлено, что при моделировании НПВП-гастропатии наблюдается достоверное увеличение по сравнению с контролем количества NFkB-позитивных клеток (как с локализацией маркера в ядре, так и с локализацией в цитоплазме) в теле, шейках желез и желудочных ямках на фоне практически неизменного их количества в дне желез. На основании данных иммуногистохимических исследований впервые установлено, что активация NFkB-сигнального пути провоспалительным цитокином TNF-б при формировании патологических изменений, обусловленных длительным приемом НПВП, приводит не только к инициации апоптоза эпителиоцитов СОЖ, но и к его подавлению, что, возможно, определяет активацию пролиферативных процессов в эпителии СОЖ.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В диссертационной работе дана полная гистологическая, гистохимическая, иммуногистохимическая и гистометрическая характеристика слизистой оболочки желудка интактных неинбредных белых крыс. Полученные результаты могут быть использованы в исследовательской работе при проведении экспериментов на нелинейных белых крысах.

В эксперименте показана роль нестероидных противовоспалительных препаратов в развитии химического поражения слизистой оболочки желудка. Разработанная экспериментальная модель позволяет детально изучить вопросы патогенеза НПВП-гастропатии и может быть использована для доклинической апробации новых лекарственных препаратов.

Полученные результаты определяют целесообразность включения в комплексную программу обследования пациентов с хроническим гастритом исследование провоспалительных цитокинов как в сыворотке крови, так и в гастробиоптатах при помощи иммуногистохимических методов.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА И ПУБЛИКАЦИИ. Результаты исследований доложены и обсуждены на следующих конференциях: «Агрономия, агрохимия, агропочвоведение, агроэкология, общая химия, лесоведение, садово-парковое и садовое строительство, ветеринария и зооинженерия» Материалы LXX Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 80-летию Пермской ГСХА «Молодежная наука и инновация» (Пермь, ПГСХА, 2010); «Материалы научной сессии ПГМА 2010 года» (Пермь, 2010); «Инновации молодых ученых агропромышленному комплексу Сибири и Урала 14-15 апреля 2010» Сборник материалов региональной конференции молодых ученых (Тюмень, 2010); «Инновационному развитию АПК - научное обеспечение» Сборник научных статей Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ПГСХА (Пермь, 18 ноября 2010); «Современные наукоемкие технологии» №12 (Москва, 2010); «Материалы научной сессии 2011 года, посвященной 95-летию высшего медицинского образования на Урале и 80-летию ПГМА» (Пермь, 2011).

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент на изобретение и положительное решение о выдаче патента на изобретение.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Полученные в ходе экспериментальных и клинических исследований результаты используются в учебном процессе на кафедре нормальной, топографической и клинической анатомии и оперативной хирургии, кафедре патологической физиологии ГБОУ ВПО ПГМА имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ, на кафедре внутренних незаразных болезней ФГБОУ ВПО «ПГСХА имени академика Д.Н. Прянишникова»; внедрены в работу отдела морфологических и патофизиологических исследований ЦНИЛ ГБОУ ВПО «ПГМА имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ.

СВЯЗЬ РАБОТЫ С НАУЧНЫМИ ПРОГРАММАМИ. Работа выполнена в соответствие с планом НИР ГБОУ ВПО «ПГМА имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация включает следующие разделы и главы: содержание, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, три главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы. Материалы диссертации изложены на 162 печатных страницах, содержат 25 таблиц, 37 рисунков, включают 226 литературных источников, из которых 105 - отечественных и 121 - иностранных авторов.

2. Содержание работы

В качестве биологической модели использовано 75 неинбредных белых крыс четырехмесячного возраста мужского и женского пола с массой тела 196,4±8,2 г, содержащихся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники (вивария). Экспериментальным животным был обеспечен свободный доступ к пище и воде и 12-14-часовой световой день. Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г. в Центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ.

Моделирование НПВП-гастропатии осуществляли путем перорального введения неинбредным белым крысам в течение 21 дня за 1 ч до кормления 1 раз в сутки смеси 200 мкл 5% раствора аскорбиновой кислоты и нестероидного противовоспалительного препарата: кетопрофен из расчета 1 мг/кг или нимесулид из расчета 18 мг/кг массы тела. Для проведения исследований были сформированы следующие экспериментальные группы: I - интактные животные, в течение всего эксперимента находящиеся в стандартных условиях экспериментально-биологической клиники (вивария) и получавшие стандартный рацион, n=25; II - животные, получавшие в течение 21 дня per os смесь 5% раствора аскорбиновой кислоты с нестероидным противовоспалительным препаратом нимесулид, n=25; III - животные, получавшие в течение 21 дня per os смесь 5% раствора аскорбиновой кислоты с нестероидным противовоспалительным препаратом кетопрофен, n=25. Ежедневное наблюдение за животными включало регистрацию поведения, внешнего вида, физиологических функций. До начала и по окончании исследования у животных регистрировали показатели периферической крови рутинными лабораторными методиками. Определяли количество эритроцитов (10⁹ клеток в 1 мкл), лейкоцитов (10⁶ клеток в 1 мкл), концентрацию гемоглобина (г/л). Из нативной капли крови готовили мазок, фиксировали в смеси Никифорова и подвергали окрашиванию по Романовскому-Гимзе. Окрашенные мазки микроскопировали под иммерсией (Micros, Austria, х 1000), проводили подсчет лейкоцитарной формулы, определяя относительное содержание клеток в мазке и абсолютные значения (абс. колич. = абс. колич. лейкоцитов х относит. / 100).

По окончании исследований животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом, строго соблюдая правила эвтаназии, и осуществляли забор образцов исследуемого материала. Желудок забирали целиком, выдерживали в изотоническом растворе NaCl в течение 30 минут, затем фиксировали в 10% забуференном по Лилли формалине (рН-7,2) в расправленном состоянии и наколотым на пробку. Для проведения гистологического исследования забирали образцы стенки желудка в пищеводном, кардиальном, фундальном и пилорическом отделах. Гистологические образцы обезвоживали и обезжиривали в соответствие со стандартными гистологическими методиками, после чего осуществляли их заливку в гистамикс. С парафиновых блоков готовили серийные (5-10 шт.) срезы толщиной 3-5 мкм, которые депарафинировали по стандартным схемам. Для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей, приготовленные общепринятыми методами [Pearse A., 1968; Ромейс Б,, 1954; Лилли Р., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Методы окрашивания депарафинированных срезов для световой микроскопии, использованные в работе, приведены в табл. 1.

Для выявления муцинов использовали комплекс гистохимических методов, включающий аналитические и ферментативные обработки: нейтральные муцины выявляли Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция) [Pearse A., 1968]. Кислые несульфатированные гликозаминогликаны, не реагирующие с Шифф-йодной кислотой, выявляли при окрашивании гистологических препаратов альциановым синим при рН-2,5 [Приказ МЗ Челябинской области от 14.02.2007г. № 56]. Для селективной идентификации сульфомуцинов (сульфатированных ГАГ) использовали альциановый синий с рН-1,0 [Казимирова А.А., 2009]. С целью полуколичественной оценки результатов рассчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК), используя принцип Астальди и Берга, 1967 [Шубич М.Г. и др., 1982], основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски клеток.

Таблица 1. Гистологические и гистохимические методы, использованные в работе для светооптического исследования образцов стенки желудка неинбредных белых крыс

Количественный (морфометрический) анализ исследуемых образцов стенки желудка проводили при помощи окуляр-микрометра и с использованием программного пакета BioVision, version 4,0 (Австрия). Измерения гистологических объектов, осуществляемые при помощи окуляр-микрометра, проводили при увеличении микроскопа х 280. Цену деления окуляр-микрометра определяли, используя объект-микрометр (0,0042 мм). В каждом препарате проводили от 5 до 10 измерений. При использовании программного пакета BioVision захват изображений обеспечивался использованием цифровой камеры для микроскопа CAM V200, Vision (Австрия). Размеры гистологических объектов выражали в мкм. Морфометрический анализ включал измерение толщины слизистой оболочки и ее составляющих - эпителия, собственной и мышечной пластинок слизистой оболочки, толщины подслизистой и мышечной оболочек, измерение глубины желудочных ямок, подсчет количества париетальных (ПК) клеток на единицу фундальных желез слизистой оболочки [Аджисалиев Г.Р., Пикалюк В.С., 2008], а также измерение площади сечения (S) и диаметра (D) париетальных клеток, измерение площади сечения (Sn) и диаметра (Dn) ядер обкладочных клеток.

Иммуногистохимические исследования тканей органов проводили, используя антитела и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA), предназначенный для проведения экспериментальных исследований. Для выявления пролиферативной активности клеток слизистой оболочки желудка использовали моноклональные антитела к регуляторному протеину Ki-67, экспрессируемого клетками, находящимися в G1-, G2- и S-фазах митотического цикла и имеющего ядерную локализацию. Активность апоптоза изучали с помощью иммуногистохимического исследования экспрессии Fas Ligand (FasL) на поверхности эпителиальных клеток. Для идентификации муцинов использовали моноклональные антитела к муцину MUC 5АС (локализация - цитоплазма клетки). С целью изучения воспалительных процессов в СОЖ определяли экспрессию субъединицы р65 NFkB (нуклеарного фактора каппа бета) в клетках СОЖ экспериментальных животных (цитоплазма, клеточное ядро) и экспрессию провоспалительного цитокина TNF-б - фактора некроза опухоли альфа (поверхность цитолеммы, цитоплазма клетки). Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании, приведена в табл. 2.

Таблица 2. Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании

* моноклональные антитела/поликлональные антитела

Иммуногистохимические исследования проводили по стандартным протоколам, использовали позитивные контроли согласно рекомендациям фирмы-производителя. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, заключали в канадский бальзам и исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении х 400.

При просмотре препаратов на светооптическом уровне антиген-позитивные клетки идентифицировали по появлению коричневого окрашивания. Полуколичественную оценку осуществляли в баллах по 6-тибалльной системе [Коган Е.А. и др., 2011]. Кроме того, проводили подсчет TNF-б-, FasL-, Ki-67-, MUC 5AC-, NFkB -позитивных клеток в дне, теле желудочных желез, а также шейках желез и желудочных ямках при увеличении х 1500 в 10-20 полях зрения. Для подсчета клеток использовали функцию программного обеспечения BioVision «сетка» в меню «просмотр изображений». С целью объективной оценки процессов клеточного обновления в СОЖ вычисляли индекс пролиферации (ИП - экспонирование клетками Ki-67-антигена), индекс апоптоза (IАПТ - экспонирование клетками Fas ligand). Оценку интенсивности пероксидазной метки и определение индекса пролиферации на основе экспрессии регуляторного протеина Ki-67 проводили полуколичественным методом - учитывали число позитивных на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 клеток) [Корсакова Н.А., 2007]. При определении экспрессии Ki-67 ядерная реакция любой интенсивности фиксировалась как позитивная [Раскин Г.А., 2007]. Гибель клеток в форме апоптоза в покровно-ямочном эпителии СОЖ определяли по индексу апоптоза (IАПТ) по формуле: IАПТ (%) = N (число апоптозных клеток, позитивных к Fas Ligand)/N1 (общее число клеток)Ч100 [Осадчук О.М. и др., 2004].

Результаты исследований подвергали статистической обработке с применением программного пакета «Biostat» и приложения Microsoft ® Excel полнофункционального офисного пакета Microsoft Office 2007. При проведении статистической обработки результатов вычисляли средние значения, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего. Сравнение между собой двух выборок проводили при помощи критерия Стьюдента, поскольку во всех изучаемых группах наблюдался нормальный тип распределения количественных переменных. Для оценки величины различий между несколькими случайными выборками в целях предотвращения эффекта множественных сравнений использовали метод однофакторного дисперсионного анализа [Гланц C., 1999]. Наличие связи между признаками определяли при помощи коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r_s). За критический уровень значимости выявленных различий принимали p<0,05.

В обеих экспериментальных группах, получавших в течение 21 дня перорально нестероидный противовоспалительный препарат (кетопрофен или нимесулид) в сочетании с 5%-ным раствором аскорбиновой кислоты, мы наблюдали развитие НПВП-гастропатии. При этом в слизистой оболочке желудка отмечались патоморфологические изменения, типичные для данной формы гастрита и идентичные гистологическим признакам поражения СОЖ, наблюдаемым в клинике: в слизистой и подслизистой оболочках желудка выявлялись сосудистые расстройства, в железистой части отмечались дистрофические изменения ямочного эпителия, увеличение количества париетальных клеток в дне желез фундального и кардиального отделов, появление в собственной пластинке слизистой оболочки большого количества гладких миоцитов, ее отек, краевое стояние лейкоцитов в просвете сосудов, гипертрофия мышечной пластинки СОЖ. При проведении морфометрических исследований установлено, что в данной экспериментальной группе отмечалось достоверное увеличение средних показателей толщины слизистой оболочки желудка за счет увеличения ширины мышечной пластинки СОЖ (табл. 3) и статистически достоверное увеличение числа обкладочных клеток в эпителии фундальных желез - 3,053±0,223 клеток в ячейке морфометрической сетки «5х5» при использовании кетопрофена и 2,684±0,203 при использовании препарата нимесулида (p1<0,05; p2<0,05 по сравнению с контролем - 1,625±0,272), что является морфологическим эквивалентом гиперацидного состояния. Средние размеры париетальных клеток и их ядер, определяемые по двум параметрам - диаметр клетки (ядра) и площадь поперечного сечения, у животных с НПВП-гастропатией как при использовании нимесулида, так и при использовании кетопрофена, не отличались от таковых размеров у интактных животных.

При проведении анализа показателей периферической крови животных установлено, что ни в одной экспериментальной группе на протяжении эксперимента не отмечалось статистически значимого изменения количества эритроцитов и концентрации гемоглобина. Тем не менее, в экспериментальных группах с НПВП-гастропатией к концу эксперимента выявлено статистически значимое увеличение количества лейкоцитов: как при использовании нимесулида - 8,050±453,2 х 10⁶/мкл (по сравнению с исходными показателями - 6,310±289,6 х 10⁶/мкл), так и при использовании кетопрофена - 8693,6±448,3 х 10⁶/мкл (по сравнению с исходными показателями - 7,510±682,8 х 10⁶/мкл). Кроме того, у животных, получавших с целью моделирования химического гастрита НПВП в сочетании с аскорбиновой кислотой, к концу эксперимента в периферической крови отмечался относительный и абсолютный лимфоцитоз.

Таблица 3. Морфометрические показатели СОЖ экспериментальных животных

* p<0,05 по отношению к интактным животным

Методы статистического анализа - критерий Стьюдента; однофакторный дисперсионный анализ

При исследовании экспрессии регуляторного протеина Ki-67 в СОЖ интактных крыс установлено, что у животных отмечался низкий уровень клеточной пролиферации (ИП=2,55±0,072%). При этом пролиферирующие клетки выявлялись, в основном, в эпителии шейки и перешейка желудочных желез. Индекс пролиферации в СОЖ у животных, получавших кетопрофен с целью моделирования НПВП-гастропатии, составил 29,54±2.46%, причем, большое количество пролиферирующих клеток выявлялось в ямочном эпителии; при определении индекса пролиферации в СОЖ животных, получавших нимесулид, также отмечалось его увеличение до 32,53±1,89%, главным образом, за счет пролиферации клеток ямочного эпителия (табл. 4). Известно, что повреждающее действие НПВП на слизистую желудка приводит к пролиферативным изменениям, что объясняется повышением уровня гастрина в крови [Leung W.K. et al., 2000; Kanda N. et al., 2006; Цодиков Г.В. и др., 2008].

Таблица 4. Количество Ki-67-позитивных клеток в СОЖ экспериментальных животных (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)

* - p<0,05 по отношению к количеству Ki-67-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ интактных животных

Методы статистического анализа - критерий Стьюдента; однофакторный дисперсионный анализ

При иммуногистохимическом исследовании экспрессии проапоптотического белка FasL у животных контрольной группы в эпителии желудочных ямок выявлена низкая экспрессия Fas Ligand (IАПТ=4,52±0,38%), что согласуется с литературными данными [Аскаров М.Б., 2009]. У животных, получавших кетопрофен, выявлена выраженная экспрессия FasL (IАПТ=15,86±2,58) в эпителии желудочных ямок, особенно в участках десквамации эпителиальных клеток с поверхности слизистой оболочки (табл. 5). В группе, получавшей нимесулид, также выявлена активация процессов апоптоза (IАПТ=18,52±1,76). Полученные данные свидетельствуют о важной роли в апоптозе эпителиоцитов желудка апоптоза, опосредованного взаимодействием FasL с Fas-рецепторами.

Таблица 5. Количество FasL-позитивных клеток в СОЖ экспериментальных животных (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)

* - p<0,05 по отношению к количеству FasL-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ интактных животных

Методы статистического анализа - критерий Стьюдента; однофакторный дисперсионный анализ

Методы статистического анализа - критерий Стьюдента; однофакторный дисперсионный анализ

При исследовании корреляционной связи между выраженностью экспрессии Ki-67 и выраженностью экспрессии FasL в клетках эпителия в соответствующих отделах СОЖ экспериментальных животных путем определения коэффициента ранговой корреляции Спирмена статистически значимых различий в экспрессии этих маркеров выявлено не было, что свидетельствует о том, что процессы апоптоза и пролиферации в СОЖ при НПВП-гастропатии выражены в равной степени.

Таблица 6. Количество NFkB-позитивных эпителиоцитов в СОЖ экспериментальных животных

* - p<0,05 по отношению к количеству NFkB-позитивных клеток в дне желудочных желез в соответствующей экспериментальной группе

# - p<0,05 по отношению к количеству NFkB-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ интактных животных

Установлено, что у интактных животных NFkB-позитивные клетки локализовались, главным образом, в дне желудочных желез. При моделировании НПВП-гастропатии мы наблюдали на фоне практически неизменного их количества в дне желез достоверное увеличение в теле, шейках желез и желудочных ямках. Эта тенденция была наиболее выражена в группе, получавшей с целью моделирования химического гастрита нимесулид. При этом выраженность экспрессии р65 NFkB в СОЖ интактных животных уменьшалась в направлении от дна желудочных желез к желудочным ямкам (табл. 6; рис. 1). Причем, эта тенденция была справедлива как для NFkB-позитивных клеток с локализацией маркера в ядре, так и для клеток с локализацией р65 NFkB в цитоплазме. Полученные данные согласуются с данными Kosone T. et al., 2006, свидетельствующими о том, что NFkB участвует в защите СОЖ от поражения ее повреждающими факторами в интеграции с другими цитопротекторными механизмами (синтез ЦОГ-2).

Известно, что NFkB регулирует экспрессию многих генов, вовлеченных в процесс воспаления, клеточной пролиферации и апоптоза [Guijarro C., Egido J., 2001; Wadle E.N., 2001] и может активироваться большим числом внутриклеточных путей, индуцируемых воспалительными цитокинами [Mackman N., 1997; Чеботарева Н. В. и др., 2006]. В частности, провоспалительный цитокин фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа) является одним из цитокинов, запускающих каскад NFkB-сигнального пути. К настоящему времени установлено, что при его взаимодействии с соответствующим ему рецептором на мембране судьба клетки может развиваться по нескольким сценариям; непосредственно с NFkB связан запуск экспрессии антиапоптотических/антинекрозных генов [Fan Y. et al., 2008; Mathew R. et al., 2009].

Таблица 7. Количество TNF-б-позитивных клеток в СОЖ экспериментальных животных (в поле зрения микроскопа при увеличении х 1500)

* - p<0,05 по отношению к количеству TNF-б-позитивных клеток в соответствующем отделе СОЖ интактных животных

Методы статистического анализа - критерий Стьюдента; однофакторный дисперсионный анализ

Рис. 1. Большое количество NFkB-позитивных ядер в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез животного, получавшего кетопрофен с целью моделирования НПВП-гастропатии х 600

В группе интактных животных выявлено небольшое количество TNF-б-позитивных клеток в дне желез. В теле желез и в области желудочных ямок TNF-б-позитивные эпителиоциты обнаруживались лишь в качестве единичных слабоокрашенных клеток. У животных с экспериментальной НПВП-гастропатией (как при применении кетопрофена, так и при применении нимесулида) мы наблюдали резкое увеличение количества TNF-б-позитивных эпителиоцитов во всех отделах СОЖ, но преимущественно в теле желудочных желез (табл. 7). То есть, опираясь на полученные данные, можно говорить о том, что при длительном пероральном приеме НПВП имеет место апоптоз эпителиоцитов СОЖ, обусловленный, вероятно, действием на клетки СОЖ провоспалительных цитокинов. Об этом говорит и выявленное ранее увеличение количества FasL-позитивных клеток.

Таким образом, при экспериментальной НПВП-гастропатии наблюдается активация как процессов апоптоза, так и процессов пролиферации эпителиальных клеток СОЖ. При этом наиболее выраженная экспрессия маркеров и пролиферации (Ki-67), и апоптоза (FasL, TNF-б) отмечается в покровно-ямочном эпителии, что свидетельствует о том, что для НПВП-гастропатии имеет значение не столько некротические изменения, сколько гибель клеток посредством апоптоза. Обнаружение высокого уровня экспрессии таких маркеров, как FasL и TNF-б говорит о том, что в данном случае апоптоз протекает по типу апоптоза, обусловленного действием провоспалительных цитокинов [Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2007]. Вместе с тем, опираясь на результаты, полученные при иммуногистохимическом исследовании экспрессии субъединицы р65 NFkB в клетках СОЖ, можно утверждать, что активация NFkB-сигнального пути провоспалительным цитокином TNF-б при формировании патологических изменений, обусловленных длительным приемом НПВП, приводит не только к инициации апоптоза эпителиоцитов СОЖ, но и к его подавлению, что, возможно, определяет активацию пролиферативных процессов в эпителии СОЖ. Поскольку продуцентами TNF-a являются моноциты, макрофаги, Т-лимфоцитарные клеточные линии, результаты иммуногистохимических исследований объясняют лимфоцитоз периферической крови, выявленный ранее.

Поставив перед собой цель исследовать характер повреждающего действия НПВП на СОЖ экспериментальных животных и протективное действие ее защитных механизмов, мы обратились к гистохимическому и иммуногистохимическому исследованию состава муцинов СОЖ. При окрашивании по методу ШИК в СОЖ интактных животных интенсивная реакция выявлялась в эпителиальных клетках в области желудочных ямок и шеек желудочных желез, причем, наиболее интенсивное окрашивание имели эпителиоциты ямок. Отношение ШИК-реакции к диастазе позволяло считать, что в состав секрета входят нейтральные муцины. Средний цитохимический коэффициент (СЦК) в СОЖ интактных животных составил 2,4 ± 0,082 в области желудочных ямок. В области желудочных желез нейтральные мукополисахариды не выявлялись. Полученные результаты согласуются с литературными данными [Лининг Д.А., 2006; Вусик М.В. и др., 2006].

При моделировании НПВП-гастропатии как при использовании нимесулида, так и при использовании кетопрофена в СОЖ экспериментальных животных мы наблюдали нарушение зонального распределения нейтральных мукополисахаридов, выражающееся в их преимущественной локализации в дне желудочных желез. При этом СЦК для железистых эпителиоцитов поверхностного эпителия составил - 0,88 ± 0,0012, СЦК для эпителиоцитов желез - 3,5 ± 0,93.

В процессе окрашивания гистологических препаратов альциановым синим установлено, что кислые мукополисахариды в эпителии СОЖ интактных животных выявлялись только в эпителиоцитах дна и частично тела желудочных желез (СЦК - 1,51 ± 0,057). Известно, что появление кислых гликозаминогликанов (ГАГ) в эпителиоцитах является компенсаторной реакцией слизистой оболочки на хроническое повреждение, так как кислые ГАГ обладают лучшими протективными свойствами [Вусик М.В. и др., 2006]. У животных с экспериментальной НПВП-гастропатией, вызванной приемом нимесулида и кетопрофена, кислые мукополисахариды определялись в большом количестве в области желудочных ямок, практически не выявляясь в эпителиоцитах собственных желез желудка (СЦК для альцианофильных мукоцитов поверхностного эпителия составил 1,98 ± 0,008, для эпителиоцитов желудочных желез - 0,018 ± 0,0025). При окрашивании альциановым синим с рН-1,0 сульфатированные гликозаминогликаны в эпителии СОЖ интактных животных выявлялись в эпителиоцитах дна и тела желудочных желез (СЦК - 0,96 ± 0,034). При моделировании НПВП-гастропатии также наблюдалось нарушение нормальной локализации сульфомуцинов: позитивная реакция наблюдалась преимущественно в эпителии желудочных ямок (СЦК для эпителиоцитов ямок в обеих экспериментальных группах составил 1,5 ± 0,096, для эпителиоцитов желез - 0,071 ± 0,0082).

Таким образом, при проведении гистохимических исследований выявлено нарушение зонального распределения нейтральных, кислых и сульфатированных мукополисахаридов в СОЖ животных, длительное время получавших НПВП. Выявленные нарушения могут быть объяснены с позиций адаптивных реакций СОЖ, направленных на сохранение ее целостности.

При проведении иммуногистохимических исследований экспрессия муцина MUC5АС была выявлена в СОЖ интактных животных в цитоплазме клеток ямочного эпителия при отсутствии окрашивания цитоплазмы эпителиоцитов желез. При моделировании НПВП-гастропатии MUC5AC выявлялся, в основном, в эпителиоцитах желудочных желез и практически не выявлялся в ямочном эпителии. Полученные данные согласуются, таким образом, с результатами гистохимических исследований, приведенными ранее. Подобное перераспределение муцинов объясняется, по-видимому, тем, что в генезе НПВП-гастропатии задействованы механизмы регулирования экспрессии различных видов муцина, которые могут контролироваться нестероидными противовоспалительными препаратами [Mino-Kenudson M. et al., 2006; Giambartolomei S. et al., 1999; Gaemers I.C. et al., 2001].

Суммируя результаты экспериментальных исследований, полученные в процессе выполнения диссертационной работы, можно утверждать, что в настоящее время остается ряд нерешенных проблем, касающихся механизмов повреждения СОЖ при длительном приеме нестероидных противовоспалительных препаратов и, как следствие, ряд нерешенных вопросов патогенеза НПВП-гастропатии. В нашей работы мы попытались дать ответ на небольшую часть этих остро стоящих вопросов. Полученные, в ходе выполнения работы, данные наглядно демонстрируют необходимость привлечения внимания к проблеме НПВП-гастропатии, дальнейшего изучения ее патогенеза и поиска новых путей коррекции.

Выводы:

1. Пероральное введение неинбредным белым крысам в течение 21 дня нестероидных противовоспалительных препаратов (кетопрофен или нимесулид) в сочетании с 5%-ным раствором аскорбиновой кислоты, вызывает у экспериментальных животных развитие НПВП-гастропатии, что проявляется в формировании в СОЖ сосудистых расстройств, дистрофических изменений ямочного эпителия, появлении в собственной пластинке слизистой оболочки большого количества гладких миоцитов.

2. Морфометрическими исследованиями установлено, что у животных с экспериментальной НПВП-гастропатией отмечается достоверное увеличение средних показателей толщины СОЖ за счет увеличения ширины мышечной пластинки и статистически достоверное увеличение числа обкладочных клеток в эпителии желез фундального и кардиального отделов.

3. При экспериментальной НПВП-гастропатии наблюдается активация как процессов апоптоза, так и процессов пролиферации эпителиальных клеток СОЖ. При этом наиболее выраженная экспрессия маркеров и пролиферации (Ki-67), и апоптоза (FasL, TNF-б) отмечается в покровно-ямочном эпителии. Полученные данные свидетельствуют о важной роли в апоптозе эпителиоцитов желудка апоптоза, опосредованного провоспалительными цитокинами.

4. Активация NFkB-сигнального пути провоспалительным цитокином TNF-б при формировании патологических изменений, обусловленных длительным приемом НПВП, приводит не только к инициации апоптоза эпителиоцитов СОЖ, но также к его подавлению и активации пролиферативных процессов в эпителии СОЖ.

5. При моделировании в эксперименте НПВП-гастропатии отмечается нарушение нормального зонального распределения нейтральных, кислых и сульфатированных мукополисахаридов в СОЖ животных, длительное время получавших НПВП. Выявленные нарушения могут быть объяснены с позиций адаптивных реакций СОЖ, направленных на сохранение ее целостности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Установленные в процессе выполнения экспериментов морфометрические, гистохимические и иммуногистохимические константы позволяют расширить представление о гистологическом строении желудка интактных неинбредных белых крыс и использовать полученные данные в патофизиологических экспериментах.

2. Разработанная оригинальная экспериментальная модель НПВП-гастропатии предлагается к использованию для проведения доклинической апробации новых средств патогенетической терапии и изучения патогенеза НПВП-гастропатии.

3. Экспериментальная модель НПВП-гастропатии позволяет получить данные о патогенезе повреждения слизистой оболочки желудка при длительном применении нестероидных противовоспалительных препаратов.

4. Описанная в работе экспериментальная модель позволяет точно охарактеризовать гистологические, гистохимические и гистометрические критерии НПВП-гастропатии, которые могут быть использованы в эксперименте и клинике.

5. Полученные результаты определяют целесообразность включения в комплексную программу обследования пациентов с хроническим гастритом исследование провоспалительных цитокинов как в сыворотке крови, так и в гастробиоптатах при помощи иммуногистохимических методов.

клетка желудок цитокин пролиферация

Список сокращений, использованных в автореферате

1. ГАГ - гликозаминогликаны

2. ИП - индекс пролиферации

3. НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

4. СОЖ - слизистая оболочка желудка

5. СЦК - средний цитохимический коэффициент

6. ФНО-б (TNF-б) - фактор некроза опухоли-альфа

7. FasL (Fas Ligand) - Fas-лиганд

8. IАПТ - индекс апоптоза

9. Ki-67 - Регуляторный протеин Ki-67

10. MUC 5AC - Муцин 5 АС

11. NaCl - натрия хлорид

12. NFkB - нуклеарный фактор каппа-В

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Гистологическая и гистометрическая характеристики слизистой оболочки желудка интактных неинбредных белых крыс / Е.И. Самоделкин, П.В. Косарева, Л.А. Четвертных, О.В. Шинкарик, В.В. Неклюдова, С.В. Никитин, М.В. Черанева // Пермский медицинский журнал. - 2011. - Т. 28, № 2. - С. 108-113.

Моделирование НПВП-гастропатии в эксперименте на животных / Е.И. Самоделкин, Н.А. Татарникова, М.Н. Кульневская, В.В. Неклюдова, М.В. Черанева, П.В. Косарева, Л.А. Четвертных // Аграрный вестник Урала. - 2010. - № 11-1 (77). - С. 36-38.

Фармакологическая регуляция активности кислотно-пептического фактора при длительном приеме нестероидных противовоспалительных препаратов / Е.И. Самоделкин, Н.А. Татарникова, М.Н. Кульневская, В.В. Неклюдова, М.В. Черанева, П.В. Косарева, С.В. Никитин // Аграрный вестник Урала. - 2011. - №4(83). - С.22-24.

Моделирование НПВП-гастропатии в эксперименте / В.В. Неклюдова, М.В. Черанева, Е.И. Самоделкин, [и др.] // Инновационному развитию АПК - научное обеспечение: сб. науч. статей Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию Пермской гос. с.-х. акад. им. акад. Д.Н. Прянишникова (Пермь, 18 нояб. 2010). - Пермь: ФГОУ ВПО «Пермская ГСХА», 2010. - Ч. 3. - С. 37-41.

Неклюдова, В.В. Моделирование гастропатии / В.В. Неклюдова, М.В. Черанева // Агрономия, агрохимия, агропочвоведение, агроэкология, общая химия, лесоведение, садово-парковое и садовое строительство, ветеринария и зооинженерия: материалы LXX Всероссийской науч.- практ. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов, посвящ. 80-летию Пермской ГСХА «Молодежная наука 2010: технологии, инновации» (Пермь, 30-31 марта 2010 года) / Федер. гос. образоват. учреждение высш. профессион. образования «Пермская гос. с.-х. акад. им. акад. Д.Н.Прянишникова». - Пермь: ФГОУ ВПО «Пермская ГСХА», 2010. - С. 260-262.

Черанева, М.В. Коррекция гастропатии / М.В. Черанева, В.В. Неклюдова // Агрономия, агрохимия, агропочвоведение, агроэкология, общая химия, лесоведение, садово-парковое и садовое строительство, ветеринария и зооинженения: материалы LXX Всероссийской науч.- практ. конф. молодых ученых, аспирантов и студентов, посвящ. 80-летию Пермской ГСХА «Молодежная наука 2010: технологии, инновации» (Пермь, 30-31 марта 2010 года) / Федер. гос. образоват. учреждение высш. профессион. образования «Пермская гос. с.-х. акад. им. акад. Д.Н.Прянишникова». - Пермь: ФГОУ ВПО «Пермская ГСХА», 2010. - С. 302-304.

Модель химического гастрита и его экспериментальная терапия / В.В. Неклюдова, Е.И. Самоделки, П.В. Косарева, [и др.] // Материалы науч. сессии 2010 года / Гос. образоват. учреждение высш. профессион. образования «Пермская гос. мед. акад. им. акад. Е.А. Вагнера федер. агентства по здравоохранению и социальному развитию». - Пермь, 2010. - С. 120-122.

Черанева, М.В. Моделирование НПВП-гастропатии в эксперименте на животных с использованием неинбредных белых крыс / М.В. Черанева, В.В. Неклюдова // Инновации молодых ученых агропромышленному комплексу Сибири и Урала (14-15 апреля 2010 г.): посвящается 420-летию земледелия в Западной Сибири с элементами школ молодых ученых: сб. материалов регион. конф. молодых ученых / ФГОУ ВПО «Тюменская ГСХА», Департамент АПК Тюменской обл., Департамент образования и науки Тюменской обл.- Тюмень: Тюменская гос. с.-х. акад., 2010. - С. 130-133.

Воспроизведение и терапия химического гастрита, индуцированного приемом НПВП в эксперименте / М.В. Черанева, Е.И. Самоделкин, В.В. Неклюдова, [и др.] // Инновационному развитию АПК - научное обеспечение: сб. науч. статей Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию Пермской гос. с.-х. акад. им. Д.Н. Прянишникова (Пермь, 18 нояб. 2010). - Пермь: ФГОУ ВПО «Пермская ГСХА», 2010. - Ч. 3. - С. 59-63.

Моделирование и терапия НПВП-гастрита / П.В. Косарева, М.В. Черанева, В.В. Неклюдова, Е.И. Самоделкин // Современные наукоемкие технологии. - 2010. - № 12. - С. 40-41.

Моделирование и экспериментальная терапия омепразолом НПВП-гастропатии / В.В. Неклюдова, М.В. Черанева, С.В. Никитин, [и др.] // Материалы науч. сессии 2011 года, посвящ. 95-летию высш. мед. образ. на Урале и 80-летию Пермской гос. мед. акад. им. акад. Е.А. Вагнера / Гос. образоват. учреждение высш. профессион. образования «Пермская гос. мед. акад. им. акад. Е.А. Вагнера федер. агентства по здравоохранению и соц. развитию». - Пермь, 2011. - С.- 113-115.

Патент на изобретение № 2424578 Российская Федерация МПК G09B 23/28 Способ моделирования гастропатии / Кульневская М.Н., Неклюдова В.В., Черанева М.В., и [др.]; заявитель и патентообладатель Федеральное гос. образоват. учреждение высш. профессион. образования «Пермская гос. с.-х. акад. ИМ. Д.Н. Прянишникова». - № 2009145268/14; заявл. 07.12.2009; опубл. 20.07.2011, Бюл. N 20. - 4 с.

Представлены в печать:

1. Способ моделирования химического гастрита / М.Н. Кульневская, П.В. Косарева, В.В. Неклюдова, Е.И. Самоделкин, В.А. Черешнев, М.В. Черанева // Решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2010116943/14 (024097) от 19.07.2011 г.

Размещено на Allbest.ru