Разработка способа получения и стандартизация экстракта жидкого противодиабетического

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Разработка способа получения и стандартизация экстракта жидкого противодиабетического

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

На правах рукописи

Смольникова Валентина Петровна

Пермь, 2012

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Степанова Татьяна Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации доктор фармацевтических наук, профессор Кудашкина Наталья Владимировна ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «19» июня 2012 г. в 13 часов
на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации « » __ 2012 г. и на сайте ГБОУ ВПО ПГФА Минздравсоцразвития России « » __ 2012 г.

Автореферат разослан «___» 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.068.01 кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

многокомпонентный экстракт жидкий противодиабетический

Актуальность темы. Одним из перспективных направлений применения лекарственных средств растительного происхождения является лечение хронических заболеваний, так как фитопрепараты обеспечивают безопасность терапии, а поливалентность химического состава позволяет использовать их для компенсации патологических процессов, сопутствующих основному заболеванию. Ряд вторичных метаболических и патофизиологических нарушений, возникающих при сахарном диабете, обосновывает актуальность использования лекарственных растений при данном заболевании.

Необходимость поиска новых фитопрепаратов для лечения сахарного диабета определяется уровнем заболеваемости и смертности в результате болезни, а также недостаточным ассортиментом гипогликемических лекарственных средств растительного происхождения. В связи с этим на кафедре фармакогнозии и ботаники ДВГМУ разработан состав сбора противодиабетического.

В последнее время все большее внимание уделяется разработке готовых к употреблению препаратов из растительного сырья. Создание таких препаратов позволяет увеличить выход биологически активных веществ (БАВ) из сырья и соответственно увеличить их процентную концентрацию в фитопрепарате, а также повысить терапевтический эффект за счет точности дозирования. Кроме того, при использовании готовых лекарственных форм обеспечивается удобство применения и хранения. К распространенным готовым лекарственным формам относятся жидкие экстракты, которые не потеряли актуальности и в современных условиях.

Разработка нового лекарственного препарата влечет за собой необходимость решения задач стандартизации. Наиболее сложной является стандартизация многокомпонентных средств, к которым относится разработанное в ДВГМУ оригинальное средство для лечения сахарного диабета. Современная система контроля качества лекарственных средств предъявляет к разработчикам все более жесткие требования по стандартизации, поэтому разработка подходов, позволяющих надежно оценить качество препарата, представляет научно-практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка способа получения и метода стандартизации оригинального экстракта жидкого противодиабетического.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить качественное и количественное содержание основных биологически активных веществ в экстракте и сравнить с выходом БАВ в настой;

- изучить влияние технологических факторов на качество получаемого экстракта и определить оптимальную концентрацию спирта этилового, размер частиц и способ закладки сырья в перколяторы;

- установить показатели подлинности и доброкачественности экстракта;

- разработать методику количественного определения флавоноидов в экстракте;

- обосновать нормативные показатели качества экстракта;

- изучить влияние продолжительности хранения на содержание БАВ в экстракте, обосновать сроки хранения экстракта;

- определить с помощью метода математического планирования оптимальный способ получения экстракта.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Дальневосточного государственного медицинского университета (№ государственной регистрации 01.200 309930). Тема работы утверждена на заседании научно-плановой комиссии ДВГМУ (Протокол № 11 от 19.11.2003 г.).

Научная новизна. Впервые разработан оптимальный способ получения оригинального противодиабетического фитопрепарата в форме жидкого экстракта. С использованием современных методов анализа изучен качественный состав и количественное содержание БАВ экстракта. Установлен элементный состав препарата. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения флавоноидов и ВЭТСХ методика (высокоэффективная тонкослойная хроматография) определения подлинности экстракта. Установлены нормативные показатели качества экстракта. Исследованы изменения в количественном содержании пяти групп БАВ в процессе хранения препарата. Показано влияние числа ступеней экстракции на показатель «сухой остаток» и продолжительности экстрагирования на себестоимость экстракта.

Практическая значимость работы. Разработан способ получения стандартного продукта при минимальных экономических затратах. Разработаны методики анализа для контроля качества препарата при его серийном производстве.

Обоснованы показатели подлинности и доброкачественности экстракта противодиабетического, а также сроки хранения, включенные в проект Фармакопейной статьи предприятия (ФСП).

Результаты работы апробированы в ГУЗ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» Министерства здравоохранения Хабаровского края» и внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии и ботаники Дальневосточного государственного медицинского университета, а также кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии с курсом ФПК и ППС Владивостокского государственного медицинского университета.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на 60-й, 62-й и 63-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004; 2005; 2006 гг.); региональной научно-практической конференции «Организация лекарственного обеспечения рациональной фармакотерапии в условиях реализации национального проекта в Дальневосточном Федеральном округе» (Хабаровск, 2008 г), межкафедральной научной конференции (Хабаровск, 2009 г.); конференции, посвященной 45-летию фармацевтического факультета ДВГМУ «Дальневосточная фармация - основные тенденции развития» (Хабаровск, 10-11 сентября 2009 г); XIII краевом конкурсе молодых ученых и аспирантов (Хабаровск, 20 января 2011 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.

Личный вклад автора. Автором диссертационного исследования самостоятельно проведены представленные в работе эксперименты, включая подготовку исследуемых образцов к анализу, работу на аналитическом оборудовании, анализ полученных данных с использованием методов математической статистики. При непосредственном участии автора проведено сопоставительное изучение химического состава экстракта противодиабетического и изученных ранее лекарственных форм - сбора и настоя. Проведены эксперименты по определению оптимальных технологических параметров экстрагирования лекарственного растительного сырья. Разработан метод стандартизации экстракта. Определены нормативные показатели. Выполнен статистический анализ результатов. Проведена валидация методик стандартизации препарата. Разработан проект ФСП на экстракт. А также разработан и экономически обоснован способ получения нового фитопрепарата.

Основные положения, выносимые на защиту: результаты сравнительного изучения качественного состава и количественного содержания действующих веществ в экстракте и настое; результаты изучения влияния технологических факторов на выход БАВ в экстракт; обоснование методик определения подлинности экстракта и количественного содержания флавоноидов в препарате; обоснование норм качества экстракта; результаты изучения влияния сроков хранения экстракта на содержание действующих веществ; результаты оптимизации способа получения экстракта.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и 52 таблицами. Результаты экспериментов обработаны статистически.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной работы, общих выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает 243 источника из них 38 на иностранных языках.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В главе I (литературный обзор) приводятся сведения по изучению влияния технологических факторов на процессы массопередачи веществ при экстрагировании лекарственного растительного сырья (ЛРС). А также рассмотрено использование веществ-маркеров для разработки методов стандартизации многокомпонентных препаратов растительного происхождения.

В главе II охарактеризованы основные объекты исследования и приведены методы анализа, использованные в экспериментах.

В главе III приведены результаты фитохимического исследования экстракта и настоя, полученных по одной прописи.

Глава IV посвящена изучению факторов, интенсифицирующих процесс экстрагирования лекарственного растительного сырья.

В главе V описаны исследования по разработке методик подтверждения подлинности экстракта и количественного определения флавоноидов в препарате. Приведены нормативные показатели. Даны результаты исследования по изучению изменчивости содержания БАВ в экстракте в процессе хранения и результаты изучения микробиологической чистоты препарата.

Глава VI посвящена оптимизации способа получения экстракта противодиабетического.

Приложение 1 содержит проект ФСП на экстракт противодиабетический. В приложение 2 включены графические результаты по оптимизации способа получения экстракта. В приложение 3 включен отчет по изучению гипогликемической активности экстракта противодиабетического. В приложение 4 включены акты внедрения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Основной объект исследования - экстракт противодиабетический. Для его получения использовали сырье, собранное на Дальнем Востоке: черника обыкновенная, брусника, леспедеца двухцветная, крапива узколистная, шиповник даурский, калина Саржента. Экстракт получали методом реперколяции в соотношении растительного сырья и готового продукта 1:1. В качестве экстрагента использовали спирт этиловый. Измельчение лекарственного растительного сырья проводили на мельнице ножевой РМ-120.

Химический состав экстракта изучали с использованием современных методов фитохимического анализа. Высокоэффективную тонкослойную хроматографию (ВЭТСХ) проводили с помощью систем для тонкослойной хроматографии "Camag" и "Sorbfil" на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merk) и ПТСХ-П-В-УФ (Sorbfil). Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводили с использованием хроматографа "Agilent Technologies 1100 Series".

В качестве стандартных образцов веществ сравнения (COВС) использовали ГСО и РСО флавоноидов, фенольных соединений, сахаров, органических и оксикоричных кислот.

Определение элементного состава проводили с помощью масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой IСP-MS Elan DRC II PerkinElmer (США).

Количественное определение полисахаридов, дубильных веществ, органических кислот, суммы фенольных соединений, флавоноидов и арбутина проводили по фармакопейным и оригинальным методикам (спектрофотометрическим и хроматографическим). Спектрофотометрические исследования выполняли на спектрофотометре UV-1700 (Shimadzu).

Обоснование возможности разработки готовой лекарственной формы на основе прописи сбора противодиабетического

Для обоснования перспективности разработки экстракта по противодиабетической прописи проводили изучение его химического состава и дальнейшее сопоставление биологически активных комплексов экстракта и настоя.

Были определены основные группы БАВ: флавоноиды, дубильные вещества, простые фенолы, сапонины, полисахариды. Дальнейший анализ химического состава экстракта проводили с помощью ВЭТСХ.

Применение хроматографических методов позволило подтвердить присутствие в экстракте веществ флавоноидной природы, простых фенольных соединений, органических кислот, моносахаров и идентифицировать некоторые индивидуальные вещества - рутин, гиперозид, кверцетин, кемпферол, хлорогеновую, кофейную и галловую кислоты, арбутин, гидрохинон, яблочную, аскорбиновую, янтарную, бензойную и салициловую кислоты, глюкозу, фруктозу, галактозу. Всего в экстракте идентифицировано 17 индивидуальных веществ.

Сопоставление хроматографических профилей сравниваемых лекарственных форм противодиабетического состава показало хорошее совпадение пиков доминирующих веществ. Коэффициент корреляции относительных величин, характеризующих площадь пиков в хроматограммах экстракта и настоя, равен 0,92.

Сравнение экстемпоральной и готовой лекарственных форм проводили также по количественному содержанию флавоноидов, дубильных и экстрактивных веществ (табл. 1).

Таблица 1. Содержание БАВ и экстрактивных веществ в настое (1:40) и экстракте противодиабетическом (1:1), %

Вещества	Показатели настоя	Показатели экстракта
	абс. содержание	отн. содержание (выход)	абс. содержание	отн. содержание (выход)
экстрактивные	0,56	60	25,90	71
флавоноиды	0,01	47	0,5	56
дубильные	0,11	59	6,09	71

Результаты анализа свидетельствуют о преимуществе экстракта по выходу указанных веществ.

Кроме суммы веществ, в настое и экстракте количественно оценивали содержание рутина и гиперозида. Определение проводилось методом ВЭЖХ. При сравнении выхода флавоноидов в настой и экстракт (табл. 2), было также отмечено преимущество экстракта перед настоем по выходу рутина и гиперозида почти в 2 раза.

Таблица 2. Содержание рутина и гиперозида в настое и экстракте

Лекарственная форма	БАВ	Содержание в сырье, мг/г	Содержание в препарате, мг/мл	Выход, %
настой	рутин	0,053	0,00051	15,47
	гиперозид	0,92	0,0071	13,04
экстракт	рутин	0,053	0,015	28,30
	гиперозид	0,92	0,26	28,26

Известно, что минеральный состав препарата играет важную терапевтическую роль в коррекции метаболических реакций патологического процесса. В частности, присутствие в препаратах таких элементов как цинк, хром, ванадий, никель, медь и др. обосновывает их применение при лечении сахарного диабета. В связи с этим был изучен минеральный состав экстракта. Всего было выявлено 32 элемента, в том числе терапевтически значимые при сахарном диабете (табл. 3), из которых содержание марганца соответствует адекватному уровню потребления, остальные компоненты восполняют суточную потребность организма в рационе питания.

Таблица 3

Содержание микроэлементов в суточных дозах препаратов и их выход

Микроэлементы	Экстракт	Настой
	содержание в суточной дозе, мг	выход, %	содержание в суточной дозе, мг	выход, %
Ванадий	0,00008	25	0,0001	100
Хром	0,005	48	0,0007	17
Марганец	4,92	25	2,24	25
Кобальт	0,0002	22	0,0001	31
Никель	0,03	66	0,007	37
Медь	0,01	11	0,02	40
Цинк	0,11	14	0,09	25

Проведенный сравнительный анализ выхода микроэлементов в экстракт и настой показал, что спиртом лучше извлекаются Cr и Ni, водой - V и Cu, на выход Mn, Co и Zn вид экстрагента не оказывает существенного влияния. Суточные дозы экстракта и настоя по содержанию V, Co, Cu и Zn сопоставимы, по содержанию Cr, Mn и Ni экстракт обладает преимуществом перед настоем.

В результате проведенных исследований была показана целесообразность создания готового к употреблению препарата на основе существующей прописи сбора противодиабетического.

Разработка способа получения многокомпонентного экстракта жидкого противодиабетического

Сырьевыми источниками разрабатываемого препарата являются растения, относящиеся к трем морфологическим группам, характеризующиеся разной гистологической структурой и химическим составом. В связи с этим при разработке оригинального экстракта мы решали как традиционные задачи (подбор рационального экстрагента и размера частиц ЛРС), так и специфические (выбор способа закладки сырья в перколяторы с учетом совместного экстрагирования).

Анализ УФ спектров извлечений, полученных с использованием спирта этилового 40 и 70 %, показал совпадение в положении экстремумов. Некоторые различия отмечены в интенсивности поглощения.

Для более объективного сравнения фенольных комплексов проводилось хроматографическое исследование 40 % и 70 % извлечений (рис. 1), в результате которого не было выявлено существенных различий в хроматографической картине экстрактов.

Рис. 1 Хроматограммы этилацетатных фракций извлечений на спирте 40 % (1) и 70 % (2)

Кроме качественного анализа определяли количественное содержание БАВ в извлечениях, полученных на спирте этиловом 40 % и 70 % (табл. 4).

Анализ показал, что по содержанию экстрактивных веществ и полисахаридов преимуществом обладает извлечение, полученное на спирте этиловом 40 %. Некоторые преимущества спирта этилового 40 % наблюдаются и по выходу суммы фенольных соединений и арбутина. По содержанию суммы флавоноидов, органических кислот и дубильных веществ извлечения достоверно не различаются.

Таблица 4. Содержание биологически активных веществ в извлечениях, полученных на спирте этиловом 40 % и 70 %

Группы анализируемых веществ	Концентрация экстрагента, %
	40	70
экстрактивные вещества, %	9,53	7,85
сумма флавоноидов, %	0,20	0,24
сумма фенолов, %	7,44	6,15
дубильные вещества, %	2,12	2,12
органические кислоты, %	0,25	0,27
полисахариды, %	1,72	0,28
арбутин, %	0,44	0,38

По совокупности полученных данных нами рекомендовано использовать в технологии экстракта противодиабетического в качестве экстрагента спирт этиловый 40 %.

Далее в серии экспериментов проводили выбор оптимального размера частиц ЛРС. Проведенное исследование в выбранном интервале варьирования измельченности (табл. 5) показало достоверное влияние размера частиц сырья на выход экстрактивных веществ при экстрагировании плодов шиповника, побегов черники и листьев брусники.

Таблица 5. Содержание экстрактивных веществ и флавоноидов в извлечениях из сырья в зависимости от размеров частиц

Сырьевой компонент	Содержание веществ, %
	экстрактивные вещества	флавоноиды
	диаметр отверстий сита, мм
	0,5	1	2	3	5	0,5	1	2	3	5
плоды калины	53,0	50,8	49,5	50,1	-	0,02	0,02	0,02	0,02	-
плоды шиповника*/**	40,2	43,0	42,8	27,8	-	0,07	0,06	0,03	0,04	-
побеги черники*	27,9	27,1	26,3	21,0	-	1,24	1,21	1,30	1,16	-
листья брусники*/**	50,9	45,5	42,5	42,6	-	1,00	0,97	0,89	0,84	-
побеги леспедецы**	20,9	20,7	-	19,3	18,7	1,20	0,93	0,92	0,92	0,84
листья крапивы**	18,7	18,1	-	18,2	18,5	0,96	0,79	0,84	0,69	0,70

Примечание: *Fэкп. Fкр. для экстрактивных веществ; ** Fэкп. Fкр. для флавоноидов

На выход этих же веществ из плодов калины, побегов леспедецы и листьев крапивы размер частиц влияния не оказывает.

На экстрагирование флавоноидов достоверно влияет размер частиц листьев крапивы, брусники, побегов леспедецы и плодов шиповника; для побегов черники и плодов калины это влияние не достоверно.

Для определения оптимального выхода действующих веществ из совместно экстрагируемого сырья разных морфологических групп, был проведен дополнительный эксперимент, в котором были учтены такие факторы как морфологическая группа сырья (листья, плоды, побеги) и размер частиц ЛРС. Проведенный анализ экспериментальных данных в указанном в таблице 5 диапазоне показал, что при совместном экстрагировании сырья влияние измельченности на выход экстрактивных веществ и БАВ нивелируется.

На основании полученных результатов выбраны оптимальные размеры частиц, приведенные ниже.

Изучение влияния способа закладки сырья в перколяторы проводили путем сравнения выхода веществ в экстракт при загрузке сырья в перколяторы слоями и в виде смеси растительных компонентов (табл. 6).

Таблица 6. Содержание биологически активных и экстрактивных веществ в экстрактах, полученных при закладке сырья в перколяторы разными способами

Группа анализируемых веществ	Смесь сырьевых компонентов	Сырьевые компоненты заложены слоями
экстрактивные вещества, %	22,48	28,26
флавоноиды, %	0,48	0,50
сумма фенолов, %	17,22	23,88
дубильные вещества, %	5,90	7,65
органические кислоты, %	0,32	1,04
полисахариды, %	4,65	5,14

Проведенный эксперимент показал статистически достоверное (при вероятности 95 %) преимущество послойной закладки сырья по содержанию экстрактивных веществ (tэкс. = 3,89; tкр. = 2,45), дубильных веществ (tэкс. = 4,13; tкр. = 2,45), фенольных соединений (tэкс. = 3,87; tкр. = 2,78) и органических кислот (tэкс. = 15,67; tкр. = 3,18).

Таким образом, при разработке способа получения экстракта противодиабетического были выбраны следующие условия экстрагирования: в качестве экстрагента - спирт этиловый 40 %, размер частиц сырья для шиповника и черники - 2 мм, калины, брусники, леспедецы - 3 мм, крапивы - 5 мм, вариант загрузки сырья - послойный.

Выбранные условия экстрагирования были положены в основу получения серий опытных образцов экстракта. Эти экстракты были использованы при разработке метода стандартизации и для проверки фармакологической активности препарата.

Разработка метода стандартизации экстракта жидкого противодиабетического

Разработку метода стандартизации препарата проводили в соответствии с действующими нормативными положениями по разделам описание, подлинность, тяжелые металлы, количественное определение, содержание спирта, сухой остаток, срок годности, микробиологическая чистота.

Для разработки методики определения подлинности экстракта на 6 сериях препарата были апробированы качественные реакции на флавоноиды и дубильные вещества. На следующем этапе разработки критериев подлинности экстракта нами были определены спектральные характеристики препарата. Фактические данные и статистическая обработка показали, что в УФ спектре должны наблюдаться минимум в интервале 259-263 нм, максимум II полосы в интервале 279-283 нм и максимум I полосы (плечо) - 313-323 нм. При хроматографическом определении подлинности экстракта в качестве приоритетных маркеров предложено использовать кверцетин и арбутин. Арбутин определяется в системе этилацетат: метанол: вода (100:17:13), кверцетин - в системе толуол: этилацетат: муравьиная кислота (2:2:1). Для подтверждения присутствия в препарате всех сырьевых компонентов определены специфические маркеры, получена стандартная хроматограмма, включенная в проект ФСП (рис. 2).

Рис. 2 Стандартная хроматограмма экстракта противодиабетического: I - ГСО кверцетина; II - очищенный экстракт; 1, 2 -маркеры черники; 3, 4 - маркеры брусники; 5 - маркер крапивы, 6 - маркер калины; 7 - маркер шиповника, 8 - маркер леспедецы

Валидация хроматографических методик по показателям подвижность (Rf), коэффициент разделения (Rs), число теоретических тарелок (N), высота эквивалентной теоретической тарелки (H) показала их пригодность для решения задач стандартизации экстракта.

Для количественного определения содержания флавоноидов с целью контроля качества серийной продукции экстракта была разработана спектрофотометрическая методика, основанная на реакции комплексообразования с алюминия хлоридом. В ходе разработки методики был обоснован выбор стандарта и определены условия комплексообразования (количество алюминия хлорида, влияние подкислителя, продолжительность реакции комплексообразования и стабильность комплекса).

В качестве аналитической длины волны была выбрана 413±2 нм, что соответствует максимуму дифференциального спектра рутина в тех же условиях. В качестве подкислителя была выбрана хлористоводородная кислота. Добавление 1 капли хлористоводородной кислоты разведенной в раствор сравнения приводит к выравниванию значений рН исследуемого раствора и раствора сравнения.

Количество алюминия хлорида, достаточное для образования стабильного комплекса, эквивалентно 2 мл 2 % раствора. Динамическое равновесие реакции комплексообразования наступает через 30 минут от начала реакции и продолжается в течение следующего часа наблюдения.

Относительная средняя погрешность методики ( ) составляет 1,29 % (табл. 7).

Таблица 7. Метрологическая характеристика методики определения суммы флавоноидов в экстракте противодиабетическом

n	f	x,%	s2	sx	P,%	x	1,%	,%
6	5	0,505	3,8510-5	0,002534	95	0,007	3,17	1,29

Валидационную оценку методики, проводили в соответствии с проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов» по показателям сходимость, воспроизводимость, правильность, специфичность, линейность, надежность, предел обнаружения и предел количественного определения.

В качестве примера в таблице 8 даны результаты по воспроизводимости методики. Остальные параметры приведены в таблице 9.

Эксперименты по воспроизводимости проводили в разных условиях: в условиях одной лаборатории, разных лабораторий, на разных приборах (в лаборатории ГУЗ «ЦККиСЛС» на спектрофотометре СФ-46, в лаборатории кафедры фармацевтической и аналитической химии (СФ-46) и в фитохимической лаборатории кафедры фармакогнозии и ботаники ДВГМУ на спектрофотометре UV-1700 Shimadzu). Относительная величина среднеквадратичного отклонения (Sэк.) не превышает допустимый интервал варьирования (Sкр.) для каждого вида воспроизводимости, что подтверждает высокую точность методики.

Таблица 8. Статистическая обработка результатов по воспроизводимости методики количественного определения флавоноидов в экстракте противодиабетическом

Статистические параметры	Воспроизводимость
	лабораторная	инструментальная	межлабораторная
n	3	2	3
P,%	95	95	95
,%	0,449	0,441	0,459
S2	0,000043	0,0000045	0,000052
S	0,00656	0,000212	0,0072
	0,016	0,019	0,018
Sэк, %	1,55	0,74	1,32
Sкр, %	2	1	3

Таблица 9. Валидационная оценка методики количественного определения содержания флавоноидов в экстракте противодиабетическом

Исследованные показатели	Определяемый параметр	Рассчитанное значение	Критическое значение
правильность	допустимый отклик, %	9,32	10
сходимость	среднеквадратическое отклонение, %	0,39-0,76	1
линейность	коэффициент корреляции	0,998	1
предел обнаружения	минимальное количество суммы флавоноидов, измеряемое с установленной точностью, %	0,228	0,298 (P=97 %)
предел количественного определения	максимальное количество суммы флавоноидов, измеряемое с установленной точностью, %	0,698	0,710 (P=97 %)
специфичность	отклонение от фактического содержания флавоноидов при добавлении фенолкарбоновых кислот, %	0,004	0,007

Проведенная валидационная оценка методики подтвердила ее пригодность для решения вопросов стандартизации. Разработанная методика апробирована на 6 образцах препарата.

В ходе стандартизации были определены нормативные показатели содержания флавоноидов, дубильных веществ, спирта, плотности и сухого остатка (табл. 10).

Таблица 10. Статистические параметры и нормативные показатели экстракта противодиабетического

Статистические параметры по выборке n = 6	Показатели содержания, %	Плотность, г/см3	Сухой остаток, %
	флавоноиды	дубильные вещества	спирт
X	0,504	6,1	29,3	1,057	26,3
	0,072	0,6	0,7	0,005	1,2
Xmax	0,599	7,3	30,7	1,066	30,0
Xmin	0,402	5,5	28,6	1,051	24,8
	0,0686	0,61	0,76	0,005	1,56
S2	0,00471	0,3733	0,5828	0,00003	2,45
Предлагаемый норматив	не менее 0,3	не менее 4,5	28-31	1,05 - 1,07	не менее 22

Для изучения влияния процесса хранения на содержание БАВ в экстракте противодиабетическом было использовано шесть опытных образцов. Эксперимент проводили в течение 33 месяцев. Каждые три месяца оценивали количественное содержание 5 групп БАВ, приведенных в табл. 11. Для интерпретациии результатов был проведен однофакторный дисперсионный анализ, парное сравнение данных проводили по критериям Стьюдента и Шеффе. Однофакторный дисперсионный анализ показал, что изменения, происходящие в процессе хранения в содержании флавоноидов, фенолов, полисахаридов и органических кислот, статистически незначимы (при P=95 %). Изменения в содержании дубильных веществ хотя и незначительны, но достоверны.

Таблица 11

Изменение содержания БАВ в экстракте в процессе хранения, %

Группа веществ	Сроки хранения, месяцы	Vвыб	Vхр.
	0	3	6	9	12	15	18	21	24
флавоноиды	0,51	0,51	0,50	0,51	0,50	0,48	0,47	0,46	0,46	14	6
фенолы	24,3	24,5	24,7	24,5	24,8	24,7	24,9	25,0	25,0	3	2
органические кислоты	0,93	0,93	0,95	0,96	0,94	0,93	0,93	0,93	0,94	9	1
дубильные вещества	6,1	6,1	6,3	6,2	6,3	6,3	6,3	6,4	7,1	7	5
полисахариды	4,8	4,8	4,9	5,0	5,0	4,9	4,9	5,1	5,0	7	2

Учитывая колебания в содержании основных действующих веществ в образцах экстрактов разных серий, мы определили коэффициенты вариации содержания БАВ по серийной выборке образцов (Vвыб.) и по срокам хранения (Vхр.).Сопоставление коэффициентов вариации подтверждает незначимость изменений, происходящих в процессе двух лет хранения экстракта с точки зрения фармацевтической практики.

Определение физических показателей качества экстракта (содержание спирта, сухого остатка, плотность) и его микробиологической чистоты показало, что на протяжении всего периода хранения эти показатели остаются стабильными.

В целом, по экспериментальным данным и результатам статистического анализа следует сделать заключение о возможном сроке годности экстракта противодиабетического в течение двух лет.

Таким образом, в результате проведенного исследования разработаны методики подтверждения подлинности и доброкачественности препарата, нормативы качества экстракта. Определены срок годности и показатели микробиологической чистоты. На основании проведенных исследований подготовлен проект ФСП.

Оптимизация способа получения экстракта жидкого противодиабетического

Как известно, на себестоимость продукта оказывает влияние ряд технологических факторов, подлежащих регулированию: в частности длительность настаивания, соотношение твердой и жидкой фаз, число ступеней экстракции. Перечисленные факторы могут быть изменены при этом качество продукта должно соответствовать требованиям НД. Для достижения баланса между себестоимостью и качеством препарата нами была проведена оптимизация способа получения экстракта противодиабетического.

Оптимизацию технологии экстракта проводили с использованием метода математического планирования эксперимента, при этом определяли влияние трех основных факторов (соотношение твердой и жидкой фаз, число ступеней экстракции и продолжительность экстрагирования). Диапазоны изменений и уровни градаций факторов выбирали с учетом опыта производства жидких экстрактов, получаемых методом реперколяции.

Экстракты, полученные в каждом из 9 опытов, анализировали по параметрам содержания флавоноидов, фенолов, дубильных веществ, показателей спирта, плотности и сухого остатка.

Однофакторный дисперсионный анализ полученных результатов показал, что при P = 95 % на содержание сухого остатка значимое влияние оказывает количество перколяторов в батарее, на себестоимость готового продукта значимо влияет фактор продолжительности настаивания. Влияние факторов в выбранных интервалах варьирования на экстрагирование флавоноидов оказалось на уровне ошибки определения.

Корреляционный анализ экспериментальных данных показал тесную взаимосвязь при экстрагировании суммы фенольных соединений, флавоноидов и дубильных веществ. Коэффициент корреляции находится в диапазоне от 0,96 до 0,98. Относительно невысокий коэффициент корреляции между содержанием флавоноидов и сухим остатком в экстрактах подтверждает целесообразность стандартизации препарата по обоим показателям. Эти показатели, а также себестоимость единицы готового продукта послужили критерием оптимизации технологии экстракта.

Множественный регрессионный анализ, проведенный с использованием программы Statgraphic Plus for Windows 2.1, позволил выбрать следующие функции отклика для показателя «сухой остаток» (F), для показателя «содержание флавоноидов» (E) и для показателя «себестоимость» (H):

F = 10,7792 - 7,27333 y + 9,43833 z - 0,68916 z2

E = 0,377958 - 0,112y + 0,0855z - 0,00345833z2

H = 378,473-33,0203x+3,04167x2-14,6969xz-

40,0357y2+117,151z+28,6667z2

Где x - продолжительность настаивания,

y - соотношение сырье: готовый продукт,

z - число перколяторов.

Проверка статистических гипотез показала, что между экспериментально полученными и расчетными значениями статистически значимых различий не наблюдается (табл. 12).

Таблица 12. Результаты статистической обработки результатов, полученных экспериментальным и теоретическим способом

Исходные данные	Сухой остаток, %	Доверительный интервал	Дисперсия, S2	Критерий Стьюдента, t	Критическое значение, t0,05
экспериментальные данные	29,82	3,97	26,69	0,004	2,31
рассчитанные результаты	29,81	3,75	23,85

Расчет оптимальной схемы производства показал, что наименьшие значения себестоимости при полном соответствии препарата стандартным показателям ожидаются при соотношении сырье: готовый продукт - 1:1,5, количество перколяторов - 6, продолжительности настаивания - 12 ч.

Общие выводы

1. Показано присутствие в препарате флавоноидов, простых фенолов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, сапонинов, кумаринов, моносахаров и полисахаридов; хроматографически идентифицировано 17 индивидуальных веществ. Установлен минеральный состав препарата: в экстракте обнаружено 32 элемента, в том числе терапевтически значимых при сахарном диабете - V, Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn.

2. Установлено сходство комплекса БАВ экстракта и настоя из сбора противодиабетического, обоснована возможность создания готовой лекарственной формы - экстракта жидкого.

3. Определен оптимальный экстрагент для получения препарата - спирт этиловый 40 %, и установлен оптимальный размер частиц ЛРС: для плодов калины 3 мм, плодов шиповника - 2 мм, листьев брусники - 3 мм, побегов черники - 2 мм, побегов леспедецы - 3 мм, листьев крапивы - 5 мм. Разработан оптимальный способ закладки сырья в перколяторы: послойная загрузка с ранжированием по содержанию экстрактивных веществ.

4. Установлены показатели подлинности экстракта: в УФ спектре должны обнаруживаться экстремумы - минимум в интервале 259-263 нм, максимум II полосы в интервале 279-283 нм и максимум I полосы (плечо) - 313-323 нм; разработана ВЭТСХ методика, получены стандартные хроматограммы, включенные в проект ФСП.

5. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения флавоноидов в экстракте и обоснован норматив их содержания - не менее 0,3 %.

6. Установлены нормы содержания дубильных веществ - не менее 4,5 %, спирта - 28-31 %, показатели сухого остатка - не менее 22 %, плотности - 0,050-0,070 г/см3. Разработан проект ФСП на экстракт.

7. Обоснован срок годности препарата - 2 года. Установлено, что в течение указанного срока содержание флавоноидов, фенолов, органических кислот и полисахаридов изменяется не достоверно.

8. С помощью метода математического планирования проведена оптимизация технологии и предложен способ получения экстракта противодиабетического по минимальной себестоимости.

Список опубликованных работ

Фогт, В. П. Исследование возможности получения экстракта из сбора сахароснижающего /В. П. Фогт // Актуальные вопросы современной медицины: материалы 60-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. Хабаровск, апрель 2003. - Хабаровск: Издательство ДВГМУ, 2003. - С. 132-133.

Фогт, В. П. К вопросу разработки количественного определения флавоноидов в экстракте жидком гипогликемическом /В. П. Фогт // Актуальные вопросы современной медицины: материалы 62-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. Хабаровск, апрель 2005. Хабаровск: Издательство ДВГМУ, 2003. - С. 123-125.

Фогт, В. П. Обоснование возможности разработки готовой лекарственной формы на основе прописи сахароснижающего сбора / В. П. Фогт, Н. А. Цимбалист, А. С. Степанов, Т. А. Степанова // Дальневосточный медицинский журнал. - 2006. - № 1. - С. 88-90.

Фогт, В. П. Оптимизация способа получения противодиабетического экстракта жидкого / В. П. Фогт, Т. А. Степанова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. трудов. - Пятигорск, 2006. - Вып. 61. - С. 144-145.

Кононова, А. В. Влияние измельченности компонентов экстракта противодиабетического на извлечение флавоноидов / А. В. Кононова, В. П. Фогт // Актуальные вопросы современной медицины: материалы 63-й итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. Хабаровск, апрель 2006. - Хабаровск: Издательство ДВГМУ, 2006. - С. 93-95.

Фогт, В. П. Количественное определение флавоноидов в экстракте противодиабетическом / В. П. Фогт, Т. А. Степанова // Фармация. - 2007. - № 4. - С. 24-25.

Фогт, В. П. Микроэлементный состав экстракта противодиабетического / В. П. Фогт, Т. А. Степанова, Л. С. Боковенко // Дальневосточный медицинский журнал. - 2007. - № 3. - С. 96-99.

Фогт, В. П. Основные этапы разработки экстракта жидкого противодиабетического / В. П. Фогт, Т. А. Степанова // Организация лекарственного обеспечения рациональной фармакотерапии в условиях реализации национального проекта в дальневосточном федеральном округе: сб. науч. трудов Дальневосточной региональной научно-практической конференции (27-28 марта 2008 г.). - Хабаровск, 2008. - С. 104-106.

Фогт, В. П. Использование методов ВЭТСХ и ВЭЖХ в разработке экстракта противодиабетического / В. П. Фогт, А. С. Степанов, Т. А. Степанова // Химия растительного сырья. - 2008. - № 4. - С. 75-78.

Фогт, В. П. Стандартизация экстракта жидкого противодиабетического В. П. Фогт, Т. А. Степанова // Дальневосточная фармация - основные тенденции развития: сб. науч. трудов Дальневосточной региональной научно-практической конференции (10-11 сентября 2009 г.). - Хабаровск, 2009. - С. 108-110.

Фогт, В. П. Разработка способа получения и стандартизация экстракта жидкого противодиабетического / В. П. Фогт // Молодые ученые - Хабаровскому краю: материалы XIII краевого конкурса молодых ученых и аспирантов, Хабаровск, 14-25 января 2011 г.: в 2 т. - Хабаровск: Изд-во Тихоокеанского гос. Ун-та, 2011. - Т. 2. - С. 274-279.

Размещено на Allbest.ur

...