Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Анализ молекулярно-генетических нарушений в генезе рака мочевого пузыря

БАБАЯН

Анна Юрьевна

Москва - 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении “Медико-генетический научный центр” Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Немцова Марина Вячеславовна

Официальные оппоненты:

Носиков Валерий Вячеславович, доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки “Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля” Российской академии наук, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-биологических исследований

Завалишина Лариса Эдуардовна, доктор биологических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение “Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена” Министерства здравоохранения Российской Федерации,

ведущий научный сотрудник патологоанатомического отделения

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится “08” апреля 2013 г. в 14-00 часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении “Медико-генетический научный центр” Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения “Медико-генетический научный центр” Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан “______”___________________ 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите диссертаций на соискание ученой

степени кандидата наук, на соискание

ученой степени доктора наук,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Рена Абульфазовна

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ежегодно в России регистрируется до 13 тысяч новых случаев рака мочевого пузыря (РМП) (Чиссов В.И. с соавт., 2010). Поверхностный рак мочевого пузыря (ПРМП) составляет 80% всех впервые выявленных случаев РМП, остальные 20% приходятся на инвазивный рак мочевого пузыря (ИРМП). К ПРМП относят неинвазивную папиллярную карциному (Та), карциному in situ (Tis) и опухоли с минимальной инвазией в пределах субэпителиальной соединительной ткани (Т1). К ИРМП относят опухоли, имеющие различную глубину поражения мышечных слоев стенки мочевого пузыря (МП) и прилежащих органов (Т2-Т4). По сравнению с ПРМП, ИРМП характеризуется более агрессивным течением и высокой смертностью (Pasin E. et al., 2008).

ПРМП характеризуется высокой частотой развития рецидивных и множественных опухолей. Частота рецидивирования после хирургического лечения ПРМП составляет до 85%, причем в 30% случаев развиваются диссеминированные и инвазивные формы РМП (Pasin E. et al., 2008). Прогнозирование клинического течения ПРМП и его трансформации в инвазивные формы является важной задачей клинической и молекулярной онкологии.

Клиническая и морфологическая гетерогенность опухолей МП обусловлена их генетической разнородностью. Предполагается существование двух независимых молекулярных путей развития ПРМП и ИРМП. На молекулярно-генетическом уровне ПРМП характеризуется мутациями в протоонкогенах H-RAS, FGFR3, PIK3CA, тогда как ИРМП, напротив, демонстрирует преимущественное повреждение основных генов-супрессоров опухолевого роста, таких как ТР53, RB1 и PTEN (Cordon-Cardo C. et al., 2008; Cheng L. et al., 2011). Данная схема молекулярного патогенеза РМП отражает лишь общие закономерности и оставляет открытыми некоторые вопросы. Остается неясным, развиваются ли ПРМП и ИРМП из общего опухолевого предшественника путем приобретения различных молекулярно-генетических повреждений на более поздних этапах канцерогенеза, или эти два типа РМП возникают и развиваются независимо друг от друга, а также являются ли минимально инвазивные Т1 опухоли самостоятельной группой или переходной стадией от ПРМП к ИРМП.

Решением проблемы клинической гетерогенности РМП может стать выявление характерных для каждого типа РМП высоко специфических маркеров, использование которых в клинике позволило бы отличать опухоли с высоким риском рецидивирования и прогрессии от менее агрессивных новообразований и персонифицировать лечебный подход.

В настоящее время еще недостаточно исследованы причины повышенной частоты рецидивирования и мультифокальности ПРМП. Основным объяснением этого феномена ранее являлось предположение о наличии невыявленных опухолевых узлов на момент постановки диагноза, а также возможности имплантации опухолевых клеток в процессе диагностического или оперативного вмешательства. Считалось, что опухоль развивается из единственной клетки-предшественницы, распространение же ее потомков дает начало множественным опухолям моноклонального происхождения (Simon R. et al., 2001). Исследования последних лет показали, что развитие рецидивных и мультифокальных опухолей может быть объяснено наличием в слизистой МП независимых “полей канцеризации”, каждое из которых способно дать начало новой опухоли (Paiss T. et al., 2002; Jones T.D. et al., 2005). Такие опухоли имеют различия, как в молекулярном патогенезе, так и в клиническом поведении. Существование “полей канцеризации” показано для многих видов опухолей человека. Вопрос о клональном происхождении опухолей РМП до сих пор до конца не решен. Его решение позволит оптимизировать медикаментозную и хирургическую тактики лечения РМП.

Необходимость определения дополнительных возможностей в диагностике, прогнозе и лечении РМП, в результате выявления новых молекулярно-генетических маркеров и исследования роли молекулярно-генетических событий в развитии РМП послужили основанием для проведения настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярно-генетических изменений, происходящих в процессах возникновения, прогрессии и рецидивирования рака мочевого пузыря, для использования их в качестве дополнительных факторов диагностики и прогноза у пациентов с раком мочевого пузыря.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Определить наиболее значимые в патогенезе рака мочевого пузыря молекулярно-генетические события и их частоты, и сформировать панель молекулярно-генетических маркеров для дальнейшего исследования.

2. Выявить ассоциации между исследованными молекулярно-генетическими нарушениями в опухолевой ткани и клинико-морфологическими параметрами поверхностного рака мочевого пузыря (инвазивность, степень дифференцировки, количество узлов, метастазирование) для определения факторов, влияющих на клиническое течение заболевания. Использовать выявленные молекулярно-генетические маркеры для расширения панели прогностических факторов для поверхностного рака мочевого пузыря.

3. Выявить молекулярно-генетические нарушения в опухолевой ткани, определяющие различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.

4. Провести анализ клонального происхождения множественных и рецидивных опухолей при поверхностном раке мочевого пузыря.

5. Исследовать молекулярно-генетические повреждения, характерные для рака мочевого пузыря в материале условно нормальной ткани слизистой мочевого пузыря с целью оценки ее вовлеченности в процессы злокачественного перерождения.

Научная новизна. В результате проведенного комплексного исследования впервые на российской выборке больных изучены молекулярно-генетические изменения (мутации в гене FGFR3, делеции локусов 3p14, 9p21, 9q34, 17p13, метилирование генов RASSF1A, P16, P14, CDH1, RARв2, LAMC3, DAPK), происходящие в опухолевой ткани мочевого пузыря и охарактеризованы их частоты. В результате проведенного исследования показана связь молекулярной патологии с клиническим течением заболевания. На основании полученных данных предложены новые молекулярно-генетические маркеры для расширения системы прогноза течения рака мочевого пузыря.

С использованием предложенной панели маркеров, состоящей из структурных и эпигенетических нарушений в геноме опухолевых клеток, показаны различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.

Определено, что спектр молекулярной патологии в первичных и рецидивных опухолях, а также в мультифокальных опухолях не всегда является идентичным, что дает основание предположить независимое развитие опухолей мочевого пузыря из разных предшественников и подтверждает наличие “полей канцеризации” в слизистой мочевого пузыря. При исследовании паттернов молекулярно-генетических повреждений в образцах рецидивных и множественных опухолей мочевого пузыря показана практически равновероятная возможность развития этих опухолей как в результате моноклонального, так и поликлонального пути канцерогенеза.

Проведено исследование молекулярно-генетических изменений в образцах гистологически нормальной слизистой мочевого пузыря, пограничной с опухолевым очагом, что свидетельствует о вовлеченности пограничной, неопухолевой ткани в процессы канцерогенеза.

Практическая значимость. Проведено комплексное исследование широкого спектра молекулярно-генетических повреждений на материале от 163 пациентов с установленным диагнозом рак мочевого пузыря. Выявлены ассоциации молекулярно-генетических повреждений с такими клиническими характеристиками, как высокий рецидивный и инвазивный потенциал опухоли, низкая степень дифференцировки опухоли, что может позволить использовать анализ данных молекулярных изменений в качестве маркеров течения и прогноза рака мочевого пузыря.

В результате исследования определены дополнительные маркеры неблагоприятного прогноза течения рака мочевого пузыря. Делеции 3р14 и аномальное метилирование генов RARв2 и CDKN2A ассоциированы с низкой дифференцировкой опухолей, делеции локусов 17р13, 9q34 и метилирование гена CDKN2A у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря достоверно ассоциированы с высоким инвазивным потенциалом. Делеции 9р21 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря ассоциированы с высоким рецидивным потенциалом опухоли. Напротив, мутации в гене FGFR3 могут являться маркером более благоприятного течения заболевания, так как ассоциированы с поверхностными опухолями и не встречаются при инвазивном раке мочевого пузыря. Предложенные ДНК-маркеры позволяют расширить систему, используемую для прогноза течения рака мочевого пузыря и могут использоваться в дополнение к применяемым диагностическим методам - гистологическому и биохимическому.

На основании полученных результатов разработана и зарегистрирована медицинская ДНК-технология “Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря” ФС№2009/311 от 04.09.2009. Данная медицинская технология предназначена для анализа молекулярно-генетических нарушений при раке мочевого пузыря и позволяет проводить скрининг и оценивать прогноз заболевания на ранних этапах его возникновения, определять риск рецидивирования в период лечения и корректировать тактику терапии в случае инактивации определенных генов.

Возможность олигоклонального происхождения опухолей мочевого пузыря и вовлеченность нормальной слизистой позволяют рассматривать рак мочевого пузыря как комплексное заболевание слизистой мочевого пузыря и обосновывают необходимость разработки новых способов комплексной терапии рака мочевого пузыря.

Апробация работы. Материалы исследования докладывались на ежегодных конференциях Европейского общества генетики человека в 2008 г. (г. Барселона, Испания), в 2009 г. (г. Вена, Австрия), в 2010 г. (г. Гетеборг, Швеция), в 2012 г. (г. Нюрнберг, Германия); на Европейской мультидисциплинарной конференции по урологическим ракам в 2009 г. (г. Барселона, Испания); на конференции “Биомедицина и биобезопасность” в 2008 г. (г. Москва, Россия); на V Конференции молодых ученых России с международным участием в 2008 г. (г. Москва, Россия); на российских онкоурологических конгрессах в 2008-2011 г. (г. Москва, Россия); на Пироговской студенческой научной медицинской конференции в 2008-2009 г.г. (г. Москва, Россия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ: одна медицинская технология, 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ, 9 работ в материалах конгрессов и конференций в РФ и 6 зарубежом.

Внедрение результатов исследования в клиническую практику. Результаты проведенных научных исследований внедрены в практическую работу лаборатории эпигенетики Федерального государственного бюджетного учреждения “Медико-генетический научный центр” Российской академии медицинских наук. Использование основных положений диссертации позволило дополнить и расширить общепринятую систему клинико-морфологических факторов прогноза течения рака мочевого пузыря молекулярно-генетическими маркерами.

По результатам диссертационной работы разработана и зарегистрирована медицинская ДНК-технология “Молекулярно-генетическая методика оценки риска неблагоприятного течения заболевания у больных поверхностным раком мочевого пузыря”. ФС№2009/311 от 04.09.2009.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста, состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 162 ссылки. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками.

Личный вклад соискателя. Автор принимал непосредственное участие в проведении молекулярно-генетический исследований, анализе клинических и лабораторных данных, статистической обработке полученных результатов, также участвовал в разработке дизайна исследования. Написание глав собственных исследований, обсуждение результатов и формулировка выводов выполнены автором самостоятельно.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации в гене FGFR3, делеции локусов 9p21, 9q34, 3p14, 17p13, и аберрантное метилирование промоторных районов генов RASSF1A, CDKN2A, p14ARF, CDH1, RARв2, LAMC3, DAPK являются значимыми событиями для патогенеза опухолей мочевого пузыря, и легли в основу системы молекулярно-генетических маркеров для исследования рака мочевого пузыря.

2. Высокая прогностическая значимость в качестве маркеров течения поверхностного рака мочевого пузыря показана для мутаций гена FGFR3, делеций локусов 3р14, 9р21 и метилирования генов RARв2 и Р16: делеция локуса 9р21 в клетках первичной уротелиальной карциномы является маркером высокого рецидивного потенциала, делеции локуса 3р14 и метилирование генов RARв2 и P16 ассоциированы со снижением степени опухолевой дифференцировки, мутации гена FGFR3 являются благоприятным прогностическим признаком.

3. Использование панели молекулярно-генетических маркеров для характеристики поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря позволяет предположить различный молекулярный патогенез этих типов рака мочевого пузыря: делеции локусов 17р13 (ген ТР53) и 9q34 и метилирования гена Р16 у пациентов с поверхностным раком мочевого пузыря свидетельствует о высоком инвазивном потенциале опухоли и является маркером негативного течения заболевания; индекс метилирования, при использовании его в качестве маркера инвазии, обладает высокой прогностической значимостью.

4. Исследование панели молекулярно-генетических маркеров в рецидивных и первично-множественных опухолях мочевого пузыря выявляет различие спектров молекулярных повреждений в них и подтверждает возможность развития рака мочевого пузыря, как по моноклональному, так и по поликлональному типу.

5. В морфологически нормальной ткани, пограничной с опухолевым очагом, происходит накопление молекулярных изменений, подобных изменениям в опухолевой ткани, что может свидетельствовать о вовлеченности пограничной неопухолевой ткани в процессы канцерогенеза и формирования “поля канцеризации” в слизистой мочевого пузыря.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проанализированы истории болезни и исследованы образцы условно нормальной ткани МП, первичных и рецидивных опухолей, периферической крови 163 пациентов с установленным диагнозом РМП, всего 454 образца. Все случаи РМП классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989г.). Материал любезно предоставлен отделением лучевого и хирургического лечения урологических заболеваний Федерального государственного бюджетного учреждения “Медицинский радиологический научный центр” Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, и отделением онкоурологии Федерального государственного учреждения “Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена” Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Геномную ДНК из лимфоцитов периферической крови, тканей опухоли и условно нормальной ткани выделяли с помощью протеиназы К и последующей фенол-хлороформенной экстракции. При выделении геномной ДНК из архивного материала срезы парафиновых блоков предварительно депарафинизировали в ксилоле.

Потерю гетерозиготности (ПГ) хромосомных районов 3p14, 17р13.1, 9p21, 9q34.13 идентифицировали с использованием высокополиморфных маркеров D3S1300, D3S1234 (3p14); D17S1353, IVS1 (17p13); D9S169, D9S942, D9S2136 (9p21); D9S313, D9S148 (9q34). Контролем служила ДНК лейкоцитов крови. Продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР) разделяли в 8%-ном полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра.

Мутации в 7 экзоне гена FGFR3 выявляли методами SSCP анализа (Single-Stranded Conformation Polymorphism) и прямого секвенирования.

Анализ метилирования CpG-островков исследуемых генов проводили при помощи метил-чувствительной ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР использовали гидролизованную метилчувствительной рестриктазой HpaII геномную ДНК опухолевой и условно нормальной ткани. Продукты ПЦР разделяли в 8%-ном полиакриламидном геле, окрашивали нитратом серебра.

Компьютерный анализ: выявление микросателлитных районов и подбор маркеров проводили с использованием баз данных UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), Ensembl Genome Databases (http://www.ensembl.org), BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), NCBI UniSTS (http://ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=unists); поиск полноразмерной нуклеотидной последовательности генов - с использованием программ Blast и Fasta; анализ ДНК на наличие сайтов ферментов рестрикции - при помощи программ Genebank Pustell, Genepro, WIN-SUN; компьютерное конструирование олигонуклеотидных праймеров - с использованием программы Oligo 4.0 и PrimerBlast; анализ хроматограмм секвенированных последовательностей - с помощью программы Chromas.

Статистический анализ результатов проведен при помощи программы STATISTICA v. 6.0 и включал сравнение групп с помощью двустороннего точного критерия Фишера (уровень значимости б=0.05) с поправкой на множественное сравнение, вычисление показателя отношения шансов, соответствующих 95% доверительных интервалов; проведение дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса (при сравнении групп пациентов с разной степенью дифференцировки опухоли); проведение анализа соответствий; расчет индекса метилирования и сравнение полученных средних значений с помощью критерия Манна-Уитни, проведение ROC-анализа, расчет чувствительности, специфичности и диагностической эффективности.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Молекулярно-генетические повреждения и их ассоциация с клинико-морфологическими характеристиками опухолей поверхностного рака мочевого пузыря.

С целью поиска дополнительных молекулярных маркеров, ассоциированных с клиническим прогнозом РМП, исследованы частоты встречаемости выбранных молекулярно-генетических событий, а также их связь с клинико-патологическими характеристиками опухолей МП и возможная роль в развитии РМП. Предложенная панель включала исследование мутации в гене FGFR3, делеций локусов 3p14, 9p21, 9q34, 17p13, аберрантного метилирования генов RASSF1A, RARв2, CDH1, P16, P14, LAMC3, DAPK.

Среди всех проанализированных образцов наличие изменений в ткани опухоли зарегистрировано в 73,0% случаев. Ни одного молекулярно-генетического изменения не было детектировано в 27,0% случаев. Только структурные изменения обнаружены в 20,5% случаев. Только эпигенетические изменения (гиперметилирование) обнаружены в 26,2% случаев.

Результаты исследования частот молекулярно-генетических повреждений в образцах ПРМП и зависимость этих частот от клинических характеристик опухолей, таких как скорость рецидивирования, глубина инвазии, степень гистопатологической дифференцировки, размер и количество опухолей МП приведены в таблице 1.

Показано, что делеция локуса 9р21 достоверно чаще определяется в группе ПРМП с ранним появлением рецидивов (в течение 1 года после ТУР), чем в группе с безрецидивным течением за год (р=0.049), тогда как метилирование гена RARв2 достоверно чаще выявляется в группе опухолей, не рецидивировавших в течение ближайшего года после операции ТУР (p=0.038).

Делеции локуса 9р21, в котором располагается кластер генов-супрессоров Р14, Р15, Р16, согласно литературным данным определяются более чем у 60% пациентов с РМП и рассматриваются как одно из ключевых событий в развитии

Группы

Количество

Структурная патология

Эпигенетическая патология

17р13

FGFR3

3p14

9p21

9q34

RASSF

RARв2

Р16

Р14

CDH1

Рецидивирование в течение первого года после ТУР*

8

1/6

2/8

2/6

3/8

1/5

2/8

0/8

0/8

0/8

1/8

Безрецидивное течение заболевания в течение первого года после ТУР*

31

1/27

5/31

5/19

2/31

4/16

13/31

12/30

6/31

4/30

7/31

р†

0,3

0,6

1,0

0,049

1,0

0,4

0,038

0,3

0,5

1,0

Неинвазивная карцинома (Ta)

24

1/22

9/24

2/14

4/23

2/13

6/24

7/23

5/24

1/22

8/23

Минимально инва-зивная карцинома (T1)

84

9/69

9/84

11/45

11/78

10/45

23/82

18/82

8/82

7/69

15/81

р†

0,4

0,004

0,7

0,7

0,7

1,0

0,4

0,1

0,6

0,1

Высоко дифференци-рованная опухоль (G1)

41

3/33

6/41

2/22

8/39

4/15

13/41

5/41

5/41

3/37

7/38

Умеренно дифференци-рованная опухоль (G2)

43

4/38

10/43

5/25

4/39

7/29

11/43

16/42

4/43

5/39

12/42

Низко дифференци-рованная опухоль (G3)

13

2/11

0/13

4/8

3/12

1/8

4/12

3/12

4/12

0/11

2/13

р‡

0,4

0,1

0,018

0,7

0,09

0,6

0,01

0,023

0,8

0,6

Монофокальные опухоли

61

6/50

10/61

7/32

9/59

7/35

16/59

14/58

8/59

2/50

9/59

Полифокальные опухоли

45

4/40

8/45

5/26

6/40

5/22

13/45

11/45

5/45

6/40

13/43

р†

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

0,7

0,1

0,09

Опухоли менее 3см в диаметре

81

8/67

12/81

10/44

11/76

11/43

22/79

22/78

11/79

6/71

18/77

Опухоли более 3см в диаметре

23

2/20

6/23

3/12

4/21

1/13

7/23

3/23

2/23

2/16

5/22

р†

1,0

0,2

1,0

0,7

0,2

0,7

0,1

0,7

0,6

1,0

Таблица 1. Результаты исследования молекулярно-генетических повреждений исследуемых генов и районов в различных клинических группах пациентов с ПРМП.

Примечание: в ячейках с численными значениями указано количество определенных изменений по отношению к количеству информативных случаев в группе.

*При оценке скорости рецидивирования в группы были включены пациенты с ПРМП, у которых в течение 1 года после ТУР развился или не развился рецидив.

р^† - сравнение групп с помощью двустороннего точного критерия Фишера (уровень значимости б=0.05). р^‡ - проведение дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса.

РМП (Wu X.R. et al., 2005).

Полученные нами данные подтверждают предположение о роли делеции 9р21 в процессе приобретения опухолью рецидивирующего фенотипа, а также о связи делеции 9р21 с развитием ПРМП, имеющего более агрессивное поведение и характеризующегося ранней прогрессией и рецидивированием заболевания.

Показано, что метилирование гена RARв2 достоверно выше в группе опухолей, не рецидивировавших в течение года по сравнению с быстро рецидивирующими опухолями (р=0.038), что позволяет отнести этот фактор к маркерам более благоприятного течения ПРМП.

Частота активирующей мутации гена FGFR3 (7 экзон) достоверно выше в группе неинвазивных карцином Та по сравнению с группой минимально инвазивных опухолей Т1 (p=0.004).

В результате исследования показана высокая частота активирующей мутации в 7 экзоне гена FGFR3 в группе неинвазивных поверхностных опухолей (группа Та) по сравнению с минимально инвазивными опухолями ПРМП, что подтверждает предположение о роли мутаций FGFR3 в развитии менее агрессивного ПРМП. Мутации FGFR3 не только ассоциированы с группой неинвазивных опухолей Та, но и являются индикатором благоприятного прогноза, по причине отсутствия их в группе опухолей (G3), которую составляют опухоли с низкой степенью опухолевой дифференцировки и неблагоприятным прогнозом. Показано полное отсутствие мутаций FGFR3 в группе G3 опухолей по сравнению с группами G1 и G2, с тенденцией к достижению достоверности.

Достоверное увеличение частоты делеции локуса 3р14 и метилирования генов Р16 и RARв2 наблюдается при нарастании степени клеточной анаплазии в опухолях (p=0.018, р=0.023 p=0.017, соответственно).

Эти молекулярно-генетические изменения можно отнести к маркерам неблагоприятного прогноза ПРМП, связанным с уменьшением степени гистопатологической дифференцировки опухолевых клеток. Установлено, что частота делеции 3р14, района, в котором локализован ген FHIT, достоверно увеличивается при снижении клеточной дифференцировки в опухоли, и достигает 50% в группе низко дифференцированных опухолей G3.

При анализе метилирования генов RASSF1A, Р16, Р14, RARв2 и CDH1 выявлено увеличение частоты метилирования генов RARв2 и Р16 также при нарастании степени клеточной анаплазии (p=0.017 и p=0.023, соответственно). Метилирования гена RARв2 имеет неоднозначное проявление в качестве маркера прогноза: с одной стороны он ассоциирован с отсутствием быстрого рецидивирования при ПРМП, с другой стороны является маркером опухолей с низкой дифференцировкой.

Статистически значимых ассоциаций между молекулярно-генетическими изменениями и такими клинико-морфологическими параметрами как размер и количество опухолевых локусов у пациента не обнаружено.

С целью анализа вклада метилирования генов-супрессоров в процесс рецидивирования рассчитан индекс метилирования (ИМ) генов RASSF1A, RARв2, P16, P14, CDH1 для каждого образца как отношение числа метилированных генов к общему числу исследованных на предмет метилирования генов в соответствии с формулой:

Медианные значения в группах рецидивировавших и нерецидивировавших в течение 1 года опухолей составили 0.0 и 0.2 соответственно (рис. 1), демонстрируя статистически достоверное различие групп (р=0.047 при использовании U-критерия Манна-Уитни). Таким образом, выявлена обратная зависимость между общим уровнем метилирования генов-супрессоров и рецидивным потенциалом опухоли ПРМП: более высокий уровень метилирования ассоциирован с низким рецидивным потенциалом.

Рисунок 1. Диаграмма размаха значений индекса метилирования в группах рецидивного и безрецидивного течения РМП в течение первого года после ТУР.

Примечание: рц нет - опухоли с безрецидивным течение в течение первого года после удаления опухоли; рц да - опухоли, рецидивировавшие в течение первого года после удаления первичной опухоли.

Внедрение изученных молекулярно-генетических маркеров в клиническую практику позволит выделить опухоли с различным клиническим течением, отличать опухоли с высоким риском рецидивирования и прогрессирования от менее агрессивных новообразований, персонифицировать прогноз заболевания и применять дифференцированный лечебный подход.

Использование многомерного разведочного анализа.

Для определения прогностической значимости исследованных маркеров был проведен многомерный разведочный анализ (анализ соответствий), позволяющий судить о связи тестируемых параметров. Чем ближе друг к другу расположены точки, соответствующие клиническим и молекулярным маркерам, тем более тесно они взаимосвязаны. Кодировка молекулярных маркеров: “0” - отсутствие изменения, “1” - наличие изменения. Клинические параметры: рТа - рТ:0, Т1 - рТ:1; G1 опухоли - G:1, G2 опухоли - G:2, G3 опухоли - G:3; рецидивирование в течение 1 года: 0 - отсутствие, 1 - наличие рецидива. Результаты представлены на рисунках 2 и 3.

Рисунок 2. Анализ соответствий клинических и молекулярно-генетических характеристик опухоли. Фрагмент 4 увеличен и представлен отдельно на рисунке 3.

Возможно выделить несколько областей с особо плотной группировкой точек (указаны стрелками с цифрами). Первая область включает точки, соответствующие неинвазивной уротелиальной карциноме Та (T:0) и наличию мутации FGFR3 (FGFR:1), что указывает на их тесную взаимосвязь. Вторая область включает точки повышенной скорости рецидивирования (рц за год:1) и отсутствия метилирования гена RARв2 (RAR:0). Третья группа отражает связь между низко дифференцированными опухолями G3 (G:3) и делецией локуса 3р14 (3р:1). Четвертая область объединяет большое количество близко расположенных точек, соответствующих отсутствию рецидива за 1 год после ТУР, аберрантному метилированию гена RARв2 и отсутствию метилирования Р16 и CDH1, мутации FGFR3 и делеции всех исследуемых локусов. Это свидетельствует о более благоприятном течении опухолей, имеющих минимальные молекулярно-генетические повреждения. Область 5 объединяет клинический признак появления рецидивов за год (рц за год:1) и гиперметилирование гена CDH1 (CDH1:1). Наличие связи между статусом метилирования гена CDH1 и появлением ранних рецидивов не подтверждается статистическим анализом данных при помощи двустороннего точного критерия Фишера. Однако, многомерный разведочный анализ является самостоятельным методом анализа и для оценки взаимосвязи метилирования гена CDH1 и скорости рецидивирования требуется проведение дополнительных исследований.

Внутри обширной группы 4 выделяются две области (6 и 7), в которых точки находятся в еще более тесной связи (рис.3). Группа 6 показывает связь между минимально инвазивной карциномой Т1 (Т:1) и отсутствием мутации в гене FGFR3 (FGFR:0). Группа 7 включает признаки безрецидивного течения заболевания (рц за год:0) и метилирования гена RARв2 (RAR:1). Полученные при анализе соответствий результаты подтверждают приведенные выше данные статистического анализа посредством критерия Фишера и подтверждают прогностическую значимость выбранных нами маркеров.



Рисунок 3. Анализ соответствий клинических и молекулярно-генетических характеристик опухоли.

Молекулярно-генетические изменения в группах поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря.

С целью определения возможного маркера инвазии было проведено сравнение молекулярно-генетические изменения в двух группах - ПРМП и ИРМП. Полученные результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты исследования молекулярно-генетических повреждений исследуемых генов и районов в группах пациентов с ПРМП и ИРМП.

РМП

Всего

Структурная патология

Эпигенетическая патология

17р13

FGFR3

3p14

9p21

9q34

RASSF

RARв2

Р16

Р14

CDH1

ПРМП

108

10/91

18/108

13/59

15/101

12/58

29/106

25/105

13/106

8/91

23/108

ИРМП

14

7/14

0/14

0/12

2/10

7/14

7/14

7/14

5/13

1/10

5/13

р*

0,0015

0,12

0,11

0,65

0,04

0,12

0,053

0,026

1,0

0,18

Примечание: Через знак “/” указано количество определенных изменений по отношению к количеству информативных случаев в группе. р* - сравнение групп с помощью двустороннего точного критерия Фишера (уровень значимости б=0.05).

В группе ИРМП по сравнению с ПРМП выявлено статистически достоверное увеличение частоты встречаемости делеций локусов 17р13 (ген ТР53) (р=0.0015) и 9q34 (p=0.04); метилирования промотора гена Р16 (p=0.026) (табл. 2). Выявление указанных изменений, ассоциированных с ИРМП, в опухолевом материале ПРМП, полученном после ТУР, свидетельствует о высоком инвазивном потенциале опухоли, и должно учитываться при выборе дальнейшей тактики лечения.

Для изучения инвазивных свойств в опухолях МП мы рассматривали и противопоставляли не только ПРМП и ИРМП, но и подгруппы опухолевых образцов рТа, рТ1 и опухоли от рТ2 и выше. Таким образом, деление групп опухолевых образцов происходило по нарастанию инвазии на основании предположения о различиях природы и поведения опухолей этих групп.

В результате показано, что частоты делеции локуса гена ТР53 нарастают с увеличением глубины инвазии, достигая 50% в группе ИРМП. Аналогичная картина наблюдается для метилирования генов RASSF1А и RARв2 и делеций 9q34. Прямо противоположная зависимость выявлена при сравнении частот мутаций в FGFR3: максимальная частота выявлена в группе Та, на треть снижается в группе Т1 и составляет 0% в группе ИРМП (рис. 4).



Рисунок 4. Сравнение частот молекулярных повреждений (%) в образцах рТа, рТ1 и опухолей ИРМП.

На основании полученных данных можно предположить, что если опухолеобразование идет по преимущественному пути активации протоонкогенов, например, таких как FGFR3, H-Ras, то малигнизация и пролиферация клеток приведут к развитию ПРМП. Если в клетках нормального уротелия, или в клетках ПРМП, произойдет накопление повреждений и инактивация основных генов-супрессоров (Р53, PTEN, RВ1), это приведет к развитию потенциально более агрессивного ИРМП. Этот феномен объясняется сохранностью основных регуляторных путей в первом случае и их инактивацией во втором (Бабаян А.Ю. с соавт., 2011). Для развития инвазивных свойств опухоли большое значение имеет снижение экспрессии ламинина, что происходит в результате делеции хромосомного локуса 9q34.13.

Исследованы аллельные делеции локуса 9q34.13, в котором расположен ген LAMC3, кодирующий 3 цепь ламинина. Ламинин обеспечивает взаимодействие клеток с базальной мембраной. Нарушение базальных взаимодействий ведет к нарушениям клеточной адгезии, что, возможно, способствует приобретению клетками способности к активной миграции и инвазии. Частота делеций локуса гена ламинина составила 50% в ИРМП и 20% в группе ПРМП (р=0.04), что подтверждает возможную роль делеций гена ламинина в развитии инвазивных свойств РМП. Характеризуя аллельные делеции локуса 9q34, оценен аллельный дисбаланс гена LAMC3, используя внутригенно расположенные микросателлитные маркеры D9S313 и D9S148.

При анализе метилирование генов RASSF1A, Р16, Р14, RARв2 и CDH1 выявлена статистически достоверно повышенная частота аномального метилирования гена Р16 (р=0.026) в ИРМП по сравнению с ПРМП. При оценке частот метилирования в целом, очевидно, что частота эпигенетических событий в группе ИРМП значительно выше по сравнению с ПРМП. Возможно, путь развития ИРМП предполагает повышение частоты эпигенетических событий в геноме опухолевых клеток. Для доказательства данного предположения был исследован ИМ. Медиана ИМ в группе ПРМП составила 0.1, в группе ИРМП - 0.25 (р=0,017 при использовании U-критерия Манна-Уитни) (рис. 5), что подтверждает наше предположение о повышении частоты эпигенетических событий в группе ИРМП по сравнению с ПРМП.

Рисунок 5. Диаграмма размаха значений индекса метилирования в группах поверхностного и инвазивного РМП.

Примечание: 0 - ПРМП, 1 - ИРМП.

При сравнении значения ИМ для всех клинических групп показано, что медианные значения ИМ составляют: 0.0 в группе рецидивировавших в течение первого года после ТУР опухолей; 0.1 в группе ПРМП; 0.2 в группе нерецидивировавших опухолей; 0.25 в группе ИРМП. При анализе полученных данных можно заключить, что опухоли, нерецидивирующие в течение 1 года после ТУР, по своим эпигенетическим характеристикам более приближены к ИРМП, для которого рецидивирование не столь характерно, как для классических опухолей ПРМП, рецидивирующих с частотой до 80% в течение 1-2 лет после ТУР (рис. 6). Эти данные позволяют объяснить неоднозначное поведение метилирования RARв2 в качестве маркера прогноза ПРМП.

Таким образом, ИМ, возможно, мог бы стать чувствительным маркером для оценки потенциала рецидивирования поверхностного РМП, повышение значения ИМ при ПРМП может указывать на приобретение РМП инвазивнных свойств.

Рисунок 6. Диаграмма размаха значений индекса метилирования в группах РМП.

Примечание: рец. - рецидивировавшие в течение 1 года после ТУР опухоли; б/рец - опухоли, не рецидивировавшие в течение первого года.

Молекулярно-генетические изменения в качестве системы маркеров течения рака мочевого пузыря.

В результате настоящего исследования определена группа молекулярно-генетических изменений, коррелирующих с фенотипом опухоли и, следовательно, являющихся маркерами течения злокачественного процесса. Из 10 протестированных молекулярно-генетических повреждений 7 - делеции локусов 3р14, 9р21, 9q34, 17р13, метилирование генов RARв2 и Р16 и мутации в гене FGFR3, достоверно ассоциированы с клиническими характеристиками опухолевого процесса, и, следовательно, могут быть использованы в качестве маркеров течения РМП.

Делеция локуса 9р21 в клетках первичной уротелиальной карциномы является маркером высокого рецидивного потенциала со специфичностью 94% и чувствительностью 38%, диагностическая эффективность 0.66.

Выявление делеции локусов 17р13 и 9q34 и метилирования гена Р16 у пациентов с поверхностным РМП свидетельствует о высоком инвазивном потенциале опухоли и является маркером крайне неблагоприятного течения заболевания. Объединение исследуемых повреждений в систему позволяет повысить специфичность, чувствительность и диагностическую эффективность системы в целом, так специфичность этой системы маркеров составляет 72%, чувствительность - 71%, диагностическая эффективность 0.72.

Делеции локуса 3р14 и метилирование гена P16 достоверно чаще выявляются в группе опухолей с низкой степенью дифференцировки. В результате специфичность такой системы маркеров составляет 85%, чувствительность - 58%, диагностическая эффективность 0.72.

Мутации в гене FGFR3 являются прогностическим признаком, ассоциированным с более благоприятным течением заболевания. Специфичность маркера составляет 89%, чувствительность - 38%, диагностическая эффективность 0.64.

Также нами показано, что оценка индекса метилирования панели генов RASSF1A, RARв2, CDH1, P16 и P14 может стать чувствительным маркером течения РМП. Так, повышение значения ИМ может указывать на инвазивное течение заболевания.

Хотя нами показана статистически достоверная ассоциация метилирования гена RARв2 с низкой степенью дифференцировки опухолевых клеток (р=0.017), однако, также, и с безрецидивным течением заболевания в течение первого года после удаления опухоли (р=0.038). Таким образом, метилирование гена RARв2 может иметь неоднозначную трактовку при прогнозе, в связи с чем, данное молекулярное событие не может рассматриваться в качестве маркера течения РМП.

Получение этих результатов позволило нам добавить к классическим клинико-морфологическим критериям молекулярно-генетические маркеры (рис. 7), определение которых в биопсийных и/или операционных образцах опухоли позволит выявить группу пациентов с повышенным риском рецидивирования и прогрессии и, следовательно, нуждающихся в более интенсивной терапии и тщательном наблюдении.

Рисунок 7. Оценка уровней риска при помощи дополнительных молекулярно-генетических маркеров.

Примечание: Выделение групп низкого, промежуточного и высокого риска рецидивирования и прогрессии при РМП в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухоли приведено в соответствии с рекомендациями европейского общества по изучению и лечению рака (EORTC).

Изучение клонального происхождения рецидивных и множественных опухолей мочевого пузыря.

ПРМП характеризуется высокой частотой появления первично-множественных и рецидивных опухолей. Согласно теории моноклонального происхождения первично-множественные и рецидивные опухоли МП являются потомками единственной трансформированной клетки, в процессе пролиферации способными приобретать дополнительные генетические повреждения и становиться опухолевыми субклонами, но первичные изменения, характерные для исходной опухолевой клетки, сохраняются. Такие клетки способны распространяться интралюминально в уротелии или сверху вниз с током мочи, и давать начало множественным опухолям. Теория олигоклонального происхождения рассматривает РМП как комплексное заболевание всей слизистой МП, при котором в основе опухолеобразования лежат независимо возникающие поля канцеризации. Опухоли, развивающиеся из различных полей канцеризации, с молекулярной точки зрения являются олигоклональными. Решение вопроса о клональном просхождении рецидивных и первично-множественных опухолей имеет не только фундаментальное, но и огромное прикладное значение.

При моноклональном характере развития рецидивов РМП оптимизация лечения и снижение частоты рецидивов произойдет при совершенствовании хирургических/диагностических внутрипузырных технологий. Использование этих технологий позволит свести к минимуму возможность диссеминации и имплантации отдельных опухолевых клеток, а также повысит эффективность обнаружения малых опухолевых узлов. В случае олигоклонального развития рецидивных опухолей постоперационные профилактические, а также терапевтические мероприятия должны оказывать воздействие на всю слизистую МП, и оказывать комплексное терапевтическое и иммуномодулирующее действие.

С целью изучения клонального происхождения рецидивных и первично-множественных опухолей МП нами было проведено сравнение паттернов молекулярных повреждений локусов 9р21 и 17р13 в образцах этих опухолей. Опухоли, имеющие делецию одинакового по длине аллеля во всех узлах, рассматривали как моноклональные, предполагая, что потеря хромосомного материала произошла в клетке-предшественнице и сохранилась в качестве исходного молекулярного повреждения во всех узлах. Опухоли, имеющие делеции разных по молекулярной массе аллелей, считали олигоклональными, так как делеции различных аллелей одного локуса происходят независимым образом. Результаты представлены в таблице 3.

Сравнение паттернов молекулярных повреждений в первичных и соответствующих рецидивных опухолях было проведено на архивном материале от 19 пациентов, включая образцы первичной опухоли и рецидивов (1-4 для каждого пациента), всего 47 образцов. Количество информативных случаев составило 13 из 19 исследованных. Шесть случаев признаны неинформативными, поскольку гомо- или гетерозиготное состояние аллелей не позволяет сделать вывод о клональном происхождении опухолей. Тем не менее, гомо/гетерозиготное состояние использованных для анализа микросателлитных маркеров не исключает возможности моно- или олигоклонального происхождения данных опухолей, соответственно определенные частоты опухолей с моно- или олигоклональным происхождением отражают лишь нижнюю границу возможных истинных частот.

Различный паттерн аллельных потерь был показан в материале первичной и рецидивных опухолей 12 пациентов из 13 информативных случаев (92%). В одном случае из 13 (8%) аллельные потери были идентичны во всех образцах.

Таблица 3. Анализ паттернов молекулярных повреждений в образцах рецидивного и первично-множественного рака мочевого пузыря.

Материал	Неинформативные случаи	Информативные случаи, паттерн молекулярных повреждений
	Гомо/гетерозиготное состояние аллелей	Дискордантный	Конкордантный
Первичные и рецидивные опухоли МП	6/19 (32%)	12/13 (92%)	1/13 (8%)
Первично-множественные опухоли МП	3/22 (14%)	10/19 (53%)	9/19 (47%)

При изучении аллельного дисбаланса локусов 17р13 и 9р21 в образцах первично множественного РМП 3 случая из 22 (14%) признаны неинформативными, количество информативных случаев составило 19. Из 19 информативных случаев у 9 пациентов (47%) выявлен сходный паттерн аллельных потерь хотя бы одного из локусов 9р21 и 17р13 в образцах первично-множественных опухолей МП. В 10 из 19 случаев (53%) паттерн повреждений хотя бы одного из исследуемых локусов был различен. Причем в 5 из 10 случаев (50%) опухоли одного пациента различались наличием или отсутствием аллельного дисбаланса, тогда как в остальных 5 случаях (50%) определялись потери различных аллелей в опухолевых образцах.

Таким образом, по результатам нашего исследования в подавляющем большинстве случаев (не менее 92%) рецидивные опухоли МП предположительно имеют олигоклональное происхождение; первично-множественные опухоли демонстрируют возможное олигоклональное происхождение не менее, чем в 53% случаев. Это скорее опровергает теорию возникновения рецидивов РМП вследствие не выявленных на момент ТУР очагов и/или контаминации слизистой МП опухолевыми клетками при внутрипузырном вмешательстве.

Первично-множественные опухоли РМП, в отличие от рецидивных, практически равновероятно могут иметь как моно- так и олигоклональное происхождение. Тем не менее, полученные при исследовании рецидивных опухолей данные могут свидетельствовать в пользу теории полей канцеризации.

С целью изучения проблемы клонального происхождения опухолей МП и вовлеченности нормальной слизистой в процесс канцерогенеза было проведено исследование паттернов метилирования генов RASSF1A, P16, CDH1, LAMC3, DAPK в 64 парных образцах опухоль/условно нормальная ткань МП (табл. 4).

Наличие метилирования генов в морфологически нормальной ткани, расположенной на границе с опухолевым узлом в группах (оп.+/н.тк.+) и (оп.-/н.тк.+) предполагает существование в этих образцах поля канцеризации, которое характеризуется ранним аномальным метилированием исследуемых генов.

Возможно предположить, что в группе (оп.+/н.тк.+) возникновение опухолевого клона произошло на фоне поля канцеризации, в котором уже имелось аномальное метилирование генов в качестве раннего события. Вероятно, для группы (оп.-/н.тк.+) опухолей аномальное метилирование исследуемых генов также явилось ранним событием, поэтому оно существует в условной норме, но затем клональная экспансия привела к преимущественному росту клона с другими генетическими повреждениями.

Таблица 4. Частоты метилирования генов по группам и общая оценка метилирования всех генов в нормальной и опухолевой ткани МП.

Метилирование	RASSF1А	P16	CDH1	LAMC3	DAPK
оп.+/н.тк.-	24 (37%)	16 (25%)	19 (29%)	17 (26%)	21 (32%)
оп.+/н.тк.+	15 (23%)	13 (20%)	12 (18%)	17 (26%)	14 (21%)
оп.-/н.тк.-	20 (31%)	29 (45%)	28 (43%)	28 (44%)	18 (28%)
оп.-/н.тк.+	5 (7%)	6 (9%)	5 (7%)	1(1%)	11 (17%)
в опухолевой ткани	39 (60%)	29 (45%)	32 (50%)	35 (54%)	34 (53%)
в нормальной ткани	20 (31%)	19 (29%)	17 (25%)	18 ( 29%)	25 (39%)

Примечание: группы: (оп. +/ н.тк.-) - метилирование определено в опухоли при отсутствии в норме; (оп. +/ н.тк. +) -определено как в опухоли, так и в норме; (оп. -/ н.тк. -) -не определено ни в опухоли, ни в норме; (оп. -/ н.тк. +) - определено в норме при отсутствии в опухоли.

Для групп (оп.+/н.тк.-) и (оп.-/н.тк.-) невозможно доказать или опровергнуть наличие поля канцеризации.

В результате исследования показано, что гены RASSF1A, P16, CDH1, LAMC3, DAPK с высокой частотой метилируются как в опухоли, так и в морфологически нормальной ткани, расположенной на границе с опухолью. Наибольшая частота метилирования в опухоли определена для гена RASSF1A (60%), в условно номальной ткани - для гена DAPK (39%).

При анализе паттернов метилирования панели генов в нормальной и опухолевой ткани МП нами было показано, что в 18-26% случаев паттерн метилирования генов в опухоли и нормальной ткани совпадает, а в 1-11% случаев метилирование исследованных генов может быть детектировано лишь в нормальном эпителии и отсутствует в опухолевой ткани. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу существования полей канцеризации не менее, чем в 30% случаев опухолей МП.

ВЫВОДЫ

1. В результате комплексного молекулярно-генетического исследования различных форм рака мочевого пузыря определены значимые для патогенеза заболевания генетические и эпигенетические нарушения (мутации в гене FGFR3, делеции локусов 3p14, 9p21, 9q34, 17p13, аберрантное метилирование генов RASSF1A, P16, P14, CDH1, RARв2, LAMC3, DAPK), определены их частоты и сформирована панель для исследования опухолевого материала.

2. Выявлены ассоциации молекулярно-генетических нарушений с клинико-морфологическими характеристиками поверхностного рака мочевого пузыря: делеция локуса 9р21 достоверно ассоциирована с высокой скоростью рецидивирования заболевания (р=0.049); делеция локуса 3р14, а также метилирование RARв2 и Р16 - с низкой дифференцировкой опухолей (р=0.018, 0.017 и 0.023, соответственно). Мутации FGFR достоверно ассоциированы с отсутствием инвазии (р=0.004).

3. Выявлены молекулярно-генетические нарушения в опухолевой ткани, определяющие различия молекулярного патогенеза поверхностного и инвазивного рака мочевого пузыря и ассоциированные с высоким инвазивным потенциалом опухоли: делеции локусов 17р13, 9q34 и метилирование Р16 (р=0.015, р=0.04 и р=0.026, соответственно). Высокая прогностическая значимость в качестве маркера инвазии показана также для индекса метилирования (р=0.017).

4. Проведен анализ клонального происхождения множественных и рецидивных опухолей при поверхностном раке мочевого пузыря. Исследование молекулярно-генетических маркеров позволяет выявить различие спектров молекулярных повреждений в случае рецидивных опухолей не менее, чем в 92% случаев, в случае множественных опухолей - не менее, чем в 53% случаев, что подтверждает возможность развития рака мочевого пузыря, как по моноклональному, так и по олигоклональному типу.

...