СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

биохимический генетический наследственный болезнь

Материалы и методы исследования

В основу работы положены результаты исследований, проведенных в лаборатории наследственных болезней обмена веществ в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (лаб.НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН). Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 - 2009гг. Характеристика относительной частоты подклассов НБО проведена на выборке из 370 пациентов, выявленных при обследовании 9875 пациентов, направленных с подозрением на НБО научно-консультативного отдела ФГБУ «МГНЦ» РАМН, отделений неврологии и эндокринологии ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, Клиники нервных болезней им. А.Я.Кожевникова Московского Государственного Медицинского Университета им. И.М. Сеченова, ФГБУ «Эндокринологический научный центр Министерства Здравоохранения РФ», ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН, ФГБУ "Московский НИИ педиатрии и детской хирургии Минздрава России", региональных медико-генетических консультаций.

Частота ЛБН в Центральном Федеральном округе России, рассчитана по числу новых случаев заболеваний диагностированных в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН за период 2000-2009гг. Данные по числу живых новорожденных за этот период по регионам Российской федерации получены по данным Росстата на сайте: (http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat/). Для расчета частоты применен метод, описанный Poorthuis B.J. с соавт. (1999). Частота рассчитывалась как общее число диагностированных пациентов по отношению к общему числу новорожденных в этот же период (при этом период рождения являлся интервалом между годом рождения старшего пациента и годом рождения младшего пациента в выборке). Если за указанный период был выявлен только один пациент, то учитывалось общее число новорожденных за эти годы.

Образцы пятен крови (n=113), а также данные по концентрации тотальной галактозы в крови у новорожденных с подозрением на галактоземию предоставлены Московским центром неонатального скрининга. Для селективного скрининга на НБО методом МС/МС проанализированы 500 образцов пятен новорожденных из Московского Центра неонатального скрининга и 5205 пациентов из психо-неврологических отделений крупных детских клинических стационаров: ФГБУ «Российская детская клиническая больница» Министерства Здравоохранения РФ, ФГБУ «Научный Центр здоровья детей и подростков» РАМН. Для отбора пациентов на селективный скрининг применены общепринятые критерии, разработанные ранее (Краснопольская К.Д., 2000).

Материалом для биохимической диагностики являлись плазма гепаринизированной венозной крови и/или образцы утренней мочи.

В качестве материала для молекулярно-генетических исследований использованы образцы ДНК, выделенные из цельной крови или пятен высушенной крови на фильтрах.

Экспериментальные методы.

Анализ аминокислот и ацилкарнитинов проведен на квадрупольном тандемном масс-спектрометре PE Sciex API 2000 (PE Sciex, Онтарио, Канада) с положительной ионизацией в электроспрее. Пробоподготовка для анализа аминокислот и ацилкарнитинов методом МС/МС проведена с помощью набора «NeoGram Amino Acids and Acylcarnitines Tandem Mass Spectrometry Kit» (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Wallac OY, Finland).

Газовая хроматография - масс-спектрометрия выполнена на приборе HP5972A, колонка HP-5MS (30м*0,25мм*4 мкм). Концентрация органических кислот в моче определяли в виде триметилсилиловых эфиров.

Для определения активности фермента Г-1-ФУТ использован модифицированный флюориметрический тест Бутлера (Beutler E., 1968).

Для молекулярно-генетического анализа геномную ДНК из цельной крови и пятен крови на фильтрах выделяли, используя набор реактивов Diatom DNA Prep (ООО Биоком, Россия) по методике, рекомендованной изготовителем. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере “МС2” (АО “ДНК-Технология”, Москва).

Для каждой пары праймеров подобраны условия, отличающиеся необходимой температурой отжига и концентрацией MgCl2. Анализ частых мутаций проводили методами ПЦР, рестрикционного анализа, гель-электрофореза, используя олигонуклеотидный праймеры, последовательности которых подобраны на основании нуклеотидной последовательности генов, опубликованных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Поиск мутаций в генах проведен методом автоматического секвенирования фрагментов ДНК согласно протоколу фирмы производителя на приборе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems).

Статистическая обработка результатов исследований

Оценка статистической значимости результатов проведена с использованием методов параметрической и непараметрической статистики для множественных сравнений. Анализу данных предшествовала проверка распределений значений показателей на соответствие их критериям «нормальности». В случае нормального распределения применен однофакторный дисперсионный анализ ANOVA или ANOVA для повторных измерений, в противном случае - критерий Крускала-Уоллиса и/или критерий Ньюмана-Кейлса. Обработка результатов осуществлена с помощью программного обеспечения Excel 2000, Statistica 6.0

Результаты и обсуждение

Спектр и относительные частоты отдельных подклассов НБО

В общей совокупности в лаборатории НБО проводится диагностика 157 различных форм заболеваний, что составляет около 30% от всех известных НБО. За период 2004-2009гг обследовано 9875 пациентов с подозрением на НБО, выявлено 48 различных нозологических форм из 10 различных подклассов НБО у 370 пациентов.

Результаты проведенного анализа показали, что наиболее распространенными формами НБО в обследуемой выборке являются ЛБН (n=177 - 48%) и МБ (n=69 - 19%), которые в совокупности составляют более половины всех случаев (рис. 1).

Болезни, связанные с нарушением обмена аминокислот, органических кислот и дефектами митохондриального в-окисления составляют 2%, 7%, 4%, соответственно (в расчет не включены случаи фенилкетонурии).

По данным зарубежных лабораторий относительные доли заболеваний этих классов более существенны, чем в нашей выборке, что указывает на необходимость совершенствования методов их диагностики.

Рис 1. Относительные частоты отдельных подклассов НБО в исследуемой выборке.

Примечание: МБ-митохондриальные болезни, ОА- органические ацидурии, АА-аминоацидопатии, УГ-нарушения обмена углеводов, ЛБН-лизосомные болезни накопления, ПБ-пероксисомные болезни,в-окисление- дефекты митохондриального в-окисления жирных кислот

Анализ нозологической структуры наиболее представленных подклассов НБО

Для оценки нозологической структуры группы ЛБН, проведен анализ 902 случаев ЛБН, которые были диагностированы в лаборатории с 1992 гг- 2009гг. За этот период было установлено 25 различных форм ЛБН. Проведенный анализ показывает, что самыми частыми являются мукополисахаридозы и липидозы (сфинголипидозы и ганглиозидозы), которые составляют существенную долю всех диагностированных случаев ЛБН. В группе сфинголипидозов самой частой формой заболевания является болезнь Гоше (рис. 2). Сходная тенденция наблюдается и в других странах Европы - Чехии, Австралии и Германии.

Для оценки нозологической структуры группы МБ, проведен анализ 176 случаев МБ, которые диагностированы в лаборатории с 2004 -2009гг. Выбранный временной интервал соответствует началу диагностики данных заболеваний в лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН. В группе МБ наиболее часто встречаются заболевания, связанные с мутациями мтДНК, среди них превалируют мутации, приводящие к синдрому Лебера (n=62).

Рис. 2. Относительная частота нозологических форм в выборке больных с ЛБН

Примечание: Б.Гоше- болезнь Гоше, МЛД- метахроматическая лейкодистрофия, МПС- мукополисахаридоз, НЦЛ2- нейрональный цероидный липофусциноз тип 2, МЛII/III- муколипидоз II/III типа, Б.Краббе- болезнь Краббе

В нашем исследовании было зарегистрировано большое число случаев (n=34), связанных с мутациями гена SURF1, что приводит к недостаточности цитохром с оксидазы (IV комплекса дыхательной цепи митохондрий). Мутации этого гена являются причиной одной из частых форм МБ, дебютирующих в детском возрасте - синдрома Ли.

Частота заболеваний из группы лизосомных болезней накопления в России (Центральный федеральный округ)

ЛБН - одна из наиболее многообразных и хорошо изученных групп НБО, которая включает более 45 различных нозологических форм. Подтверждающей лабораторной диагностикой ЛБН лаборатории НБО ФГБУ «МГНЦ» РАМН занимается с 1982 года и является единственной в РФ лабораторией, осуществляющей точную диагностику большинства ЛБН. В лабораторию поступают образцы из всех регионов РФ, но в настоящем исследовании учтены только больные, проживающие в Центральном Федеральном округе (ЦФО), которым был установлен диагноз в лаборатории в период с 2000 по 2009гг (табл. 1). Это связанно с географической близостью к г. Москве и достаточно высоким уровнем медико-генетической помощи в данном регионе.

Суммарная частота заболеваний группы ЛБН определена в разных странах Европы и составляет от 7,6 до 25 на 100 000 новорожденных (Meikle P.J. et al., 1999; Poorthuis B.J. et al., 1999; Applegarth D.A. et al., 2000; Dionisi-Vici С. et al., 2002; Pinto R. et al., 2004). В РФ подобные исследования не проводились.

Проведенный анализ показывает, что суммарная частота ЛБН в РФ (ЦФО) составляет 5,22 : 100 000 новорожденных (1:19937), в других странах Европы значение примерно в 2-3 раза выше, однако следует учитывать, что все эти заболевания чрезвычайно редкие и случайная вариация в оценке их частоты очень высока, что отражает минимальное и максимальное пороговое значение при 95% доверительном интервале а также различные подходы к расчету.

Наибольшая частота показана для следующих нозологических форм: болезнь Гоше -0,93 (95% ДИ 0,790-1,070), МПС I типа - 0,82 (95% ДИ 0,552-1,089), МПС II типа -0,74 (95% ДИ 0,478-1,075), GM1-ганглиозидоз -0,58 (95% ДИ 0,117-1,052). Следует отметить, что в отличие от других стран в РФ диагностированы лишь единичные случаи болезни Ниманна-Пика тип С (n=3), болезни Помпе (n=5), что в совокупности также влияет на общую частоту ЛБН. В группе МПС наблюдается меньшее число случаев МПС III типа, по сравнению с другими странами.

Таблица 1. Частота некоторых форм ЛБН на 100 000 новорожденных

Оптимизация программ биохимического скрининга на НБО

За последние годы произошли существенные методические и технические изменения в области биохимического селективного и массового скрининга на НБО. Методические рекомендации по выявлению НБО с помощью простых качественных и полуколичественных тестов, изданные в 1984 году, не обновлялись, приведенные в рекомендациях тесты имеют высокий процент ложноположительных результатов и, в совокупности обеспечивают предположительное выявление около 20 форм НБО.

На необходимость совершенствования методов диагностики трех групп заболеваний, относящихся к нарушениям обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального в-окисления указывает их низкий удельный вес в общей структуре НБО, что было показано в нашем исследовании.

Одной из современных широко применяемых технологий для массового и селективного скрининга на НБО является МС/МС, которая включает определение концентрации аминокислот и ацилкарнитинов с целью выявления нарушений обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального в-окисления (всего более 100 различных нозологических форм). Для внедрения технологии МС/МС для обследования на НБО определены референсные значения метаболитов и их соотношения в 3 возрастных группах: новорожденные, дети в возрасте от 8 дней до 6 мес. и в возрасте от 6 мес. до 5 лет. Выбор групп обусловлен тем, что именно в этих возрастных периодах по данным литературы дебютирует большинство выявляемых этим методом заболеваний.

Для определения референсных значений метаболитов проведено исследование 3572 образцов пятен высушенной крови. Оценка межгрупповых различий с использованием непараметрического критерия Ньюмана-Кейлса показала, что по многим исследуемым метаболитам новорожденные и дети других возрастных групп достоверно отличаются друг от друга (р<0,01), что говорит о необходимости применения своих референсных значений для каждой возрастной группы. В качестве возрастных референсных границ предложено использовать значения концентраций метаболитов, соответствующие 0,5% (Q0,5) и 99,5% (Q99,5) персентилям. В литературе данные для разных возрастных групп не приводится, поскольку МС/МС применяется в основном для массового скрининга новорожденных. Полученные результаты по концентрации метаболитов у новорожденных согласуются с данными литературы.

Выявленные после проведения МС/МС отклонения в концентрации метаболитов, в подавляющем большинстве случаев требуют проведения подтверждающей диагностики. Для каждого заболевания были составлены дифференциально-диагностические таблицы, которые включали определение органических кислот мочи методом, исследование активности ферментов и ДНК-диагностику (табл. 2).

Таблица 2. Дифференциальная диагностика органических ацидурий и аминоацидопатий (фрагмент таблицы)

Примечание: 2МБД- недостаточность 2-метил-бутирил-КоА дегидрогеназы, 3Г3МГ- Недостаточность 3-гидрокси-3-метил-глутарил-КоА-лиазы,3МГГ- Недостаточность 3-метилглутаконил-КоА-гидратазы, 3МКК- Недостаточность 3-метилкротонил-КоА-карбоксилазы, АГС- недостаточность N-ацетилглютамат-синтазы,БКТ- Недостаточность в-кетотиолазы, ГА2-глутаровая ацидурия тип 2,ИВА-изовалериановая ацидурия, КФС- Недостаточность карбамилфосфат синтазы, НСГ- недостаточность синтетазы голокарбоксилаз, ОКМ -органические кислоты мочи

ОТК- Недостаточность орнитин транскарбамилазы, ПА- пропионовая ацидурия.

Разработка биохимических методов подтверждающей диагностики НБО

С целью повышения эффективности диагностики 4 редких форм НБО для которых существует один наиболее значимый дополнительный биохимический маркер (табл.2), разработаны высокочувствительные микрометоды определения некоторых органических кислот методом ВЭЖХ-МС/МС.

Для дифференциальной диагностики тирозинемии тип 1 разработан метод определения сукцинилацетона в моче, который сохраняет линейность в пределах от 0,5 до 1200 мM/л (0,1 - 360 мM/М креатинина), предел обнаружения составил 0,25 мM/л (0,05 мM/М креатинина). Концентрация сукцинилацетона в моче в контрольной выборке (n=102) варьировала от 0 до 1,2 мM/M креатинина, в то время как, у больных тирозинемией тип 1 (n=8) концентрация сукцинилацетона составила от 20 до 254 мM/M креатинина. Данный тест можно применять для контроля лечения тирозинемии тип 1.

Для дифференциальной диагностики дефектов цикла мочевины разработан метод определения оротовой кислоты в моче, который сохраняет линейность в пределах от 1 до 1000 мМ/М креатинина, предел обнаружения 0,1 мМ/М креатинина. Концентрация оротовой кислоты в контрольных образцах мочи составляла от 1 до 6 мМ/М креатинина (n=47), в моче пациентов с недостаточностью орнитинтранскарбамилазы - 560 и 1090 мМ/М креатинина.

Для диагностики глутаровой ацидурии тип 1 разработан метод определения глутаровой кислоты в моче, метод сохраняет линейность в пределах от 4 до 4000 мМ/М креатинина, предел обнаружения 1 мМ/М креатинина. Концентрация глутаровой кислоты в контрольных образцах мочи составляла 10 - 130 мМ/М креатинина (n=47), в моче пациентов с глутаровой ацидурией тип 1 850 -2060 мМ/М креатинина (n=12).

Анализ соотношений метаболитов позволил определить новые диагностические значимые параметры для недостаточности длинноцепочечной 3-гидрокси-ацил-КоА дегидрогеназы (ДЦГАД) и среднецепочечной ацил-КоА дегидрогеназы (СЦАД), (С18ОН+С18:1ОН+С16ОН)/С0 и (С6+С8+С10:1)/(С16+С18+С18:1) соответственно, применение которых повышает чувствительность, специфичность и положительную прогностическую ценность метода МС/МС для диагностики этих заболеваний. Показано, что данные соотношения особенно важны при низких концентрациях свободного карнитина в крови, что нередко наблюдается у пациентов с данными заболеваниями.

Одним из важнейших маркеров пероксисомных болезней (ПБ) является уровень ОДЦЖК в плазме крови или мембранах эритроцитов, который не является возраст-зависимым параметром в отличие от уровня плазмалогенов и фитановой кислоты. При диагностике определяются количества докозановой (С22), тетракозановой (С24), гексакозановой кислот (С26), а также соотношения С24/С22 и С26/С22 (Aubourg Р.А., 1985).

Проведено исследование концентрации ОДЦЖК у пациентов с перокисомными заболеваниями методом ГХ-МС. Наблюдаются статистически достоверные (р< 0.05) различия между средними значениями отношения концентраций С26/С22 в контрольной группе и группах больных с разным фенотипом Х-АЛД и НБП (табл. 3). При этом не выявлены статистически значимые различия в средних значениях отношений концентраций С26/С22 между группами пациентов с различным фенотипом Х-АЛД (церебральная форма, адреномиелоневропатия, изолированная надпочечниковая недостаточность).

Таблица 3. Показатели метаболизма ОДЦЖК в норме и при пероксисомных болезнях

Оптимизация подтверждающих молекулярно-генетических методов диагностики НБО

Для большинства НБО в качестве основных подтверждающих тестов применяются биохимические, но для некоторых заболеваний требуется проведение ДНК-диагностики. Данные исследования особенно актуальны в тех случаях, когда семья планирует проведение пренатальной диагностики.

С целью совершенствования программ подтверждающей диагностики проведен анализ 37 редких форм НБО, относящихся к разным подклассам: аминоацидопатии (n=7), органические ацидурии (n=4), нарушения углеводного обмена (n=4), МБ (n=5), дефекты митохондриального в-окисления (n=4), ЛБН (n=5), другие НБО (n=5). Для 14 разных форм НБО определены частоты наиболее распространенных по данным литературы мутаций в рамках данного исследования (табл.4).

Таблица 4. Частые мутации при 14 формах НБО

Тестирование на данные мутации является высокоинформативным. Были разработаны простые ДНК-тесты (ПЦР-ПДРФ-анализ, SSCP-анализ) для выявления 23 из 26 мутаций. Для диагностики галактоземии тип 1 был создан биочип, который позволяет определять несколько мутаций и полиморфизмов в гене GALT: Phe95Leu, IVS3-2A->C, IVS4-27 G->C, Met142Lys, Met142Val, Gln188Arg, Lys285Asn, Trp316Term, Asn314Asp, Arg333Trp, Arg333Gln, Arg333Gly, Glu352Gln, Leu358Pro, одновременно, характеризуется низкой себестоимостью, малым временем получения результата. Для диагностики тирозинемии разработан биочип, позволяющий выявлять следующие мутации в гене FAH: Pro342Leu, Arg174Term, IVS 12+5 G->A, IVS6-1 G->T, IVS7-1 G->А.

В целом, данные по частотам наиболее распространенных мутаций сходны с другими странами Европы, из выявленных особенностей следует отметить превалирование мутации с.845delCT у пациентов с синдромом Ли в нашей выборке по сравнению с данными других стран. В ходе работы при болезни Краббе в 22% аллелей выявлена не описанная ранее мутация р.Ile177Thr. Эта мутация затрагивает эволюционно-консервативную область белка. В результате исследования 200 контрольных образцов эта мутация не была обнаружена. Эти данные являются убедительными доказательствами ее патогенности. Высокая частота данного аллеля, вероятно, является особенностью российской популяции. Мутация р.Ile177Thr в сочетании с любым другим аллелем приводит к формированию поздней младенческой формы болезни (Zakharova E., 2008).

Селективный скрининг на НБО

С целью определения вклада трех групп НБО, относящихся к нарушениям обмена аминокислот, органических кислот и дефектов митохондриального в-окисления в структуру психоневрологических заболеваний у детей, с января 2004 по октябрь 2011 года обследовано 5205 пациентов в возрасте от 8 дней до 5 лет из отделений психоневрологии различных детских стационаров и специализированных клиник Российской Федерации. После проведения МС/МС и дополнительных исследований, которые включали определение концентрации ацилкарнитинов в плазме крови, определение органических кислот мочи методом ГХ-МС и ДНК-диагностики, диагноз НБО подтвержден у 119 пациентов (2,3%), из них аминоацидопатии выявлены у 39 пациентов, органические ацидурии - у 62, дефектами митохондриального в-окисления - у 18. Выявлено 15 пациентов с фенилкетонурией (ФКУ) из разных регионов РФ, который были пропущены при проведении массового скрининга новорожденных. Наиболее частыми формами НБО были недостаточность биотинидазы (n= 24 из 22 семей) и глутаровая ацидурия тип 1 (n=16 из 15 семей), болезнь с запахом кленового сиропа мочи (n=10 из 8 семей), недостаточность митохондриального трифункционального белка (n=12), что указывает на необходимость селективного скрининга на эти заболевания среди данного контингента больных.

Проведенный анализ клинических проявлений, данных лабораторных исследований 119 пациентов позволяют сделать вывод, что в подавляющем большинстве случаев заболевания из данных групп манифестируют остро (85%), у 75% выявляют нарушения в кислотно-щелочном состоянии крови. Многие пациенты (64%) в дополнение к неврологической симптоматике имеют изменения в биохимическом и общем анализе крови (анемию, повышение активности печеночных трансаминаз и изменение уровня глюкозы). Хроническим характером течения без острых эпизодов декомпенсации наблюдался у всех пациентов с ФКУ и 4-х пациентов с изовалериановой ацидурией. На основании полученных результатов сформулированы рекомендации по проведению селективного скрининга на НБО среди пациентов отделений психоневрологического профиля.

Неонатальный скрининг на галактоземию

В процедуру подтверждающей диагностики галактоземии нами было включено определения активности фермента Г-1-ФУТ в пятнах высушенной крови и в цельной крови, а также ДНК-диагностика с целью выявления наиболее распространенных мутаций в гене GALT и полиморфного варианта Дуарте, приводящего к снижению активности фермента.

На первом этапе работы определена активность фермента Г-1-ФУТ в пятнах высушенной крови и цельной гепаринизированной крови в контроле (n=166), у пациентов с классической галактоземией (n=15) и у гетерозиготных носителей (n=65) (рис. 3).

Рис.3 Активность галактозо-1-фосфат уридилтрансферазы в контроле, у гетерозиготных носителей заболевания и пациентов с галактоземией тип 1.

Оценка межгрупповых различий с использованием непараметрических критериев Крускала-Уоллиса и Ньюмана-Кейлса показала, что активность Г-1-ФУТ, измеренная в цельной крови, достоверно различается в сравниваемых группах.

Для определения отрезной точки использован метод ROC-анализа. Из данных ROC-анализа следует, что оптимальной отрезной точкой (cut-offопт=max(Sek+Spk)), обеспечивающей максимум чувствительности и специфичности метода для пятен крови, является точка, соответствующая активности Г-1-ФУТ < 2,5 Е/гHb (чувствительность - 100%, специфичность - 92%). Оптимальной отрезной точкой для цельной крови является точка, соответствующая активности Г-1-ФУТ < 1,3 Е/гHb (чувствительность - 100%, специфичность - 100%). Из данных ROC-анализа следует, что для подтверждающей диагностики классической галактоземии оптимальным является определение активности Г-1-ФУТ в цельной крови, так как данный метод является более чувствительным и специфичным, по сравнению с определением Г-1-ФУТ в высушенных пятнах крови.

С целью применения ДНК-диагностики в качестве одного из подтверждающих тестов проведен анализ частоты и спектра мутаций у 43 пациентов с галактоземией тип 1 из европейской части России. В результате работы определено 77 мутантных аллелей, что составляет 89,5%. 4 мутации не удалось обнаружить из-за отсутствия достаточного количества биологического материала пациентов.

Мутация р.Gln188Arg (Q188R) является наиболее распространенной среди российских пациентов с галактоземией тип I. Две ранее не описанные мутации p.Glu352Gln (E352Q) и p.Leu358Pro (L358P) обнаружены у трех пациентов из исследуемой выборки: у двух в сочетании с мутацией Q188R (E352Q/Q188R и L358P/Q188R) и у одного в сочетании друг с другом (E352Q/ L358P).

Среди редких мутаций, обнаруженных у пациентов, пять уже были описаны ранее (IVS3+2a->g, p.Phe95Leu, p.Met142Lys, p.Trp316Term, p.Arg333Trp), а две описаны впервые (p. Leu 264 Pro, p.Tyr286Term).

Подтверждающая диагностика галактоземии тип 1 должна включать как определение активности фермента, так и скрининг на наиболее частые мутации и вариант Дуарте. Исходя из полученных данных на первом этапе наиболее целесообразно проведение ДНК-диагностики следующих мутаций в гене GALT: р.Gln188Arg, p.Lys285Asn, IVS3-2a->c, p.Met142Lys, p.Leu358Pro, составляющие в совокупности 82,1% мутантных аллелей и p.Asn314Asp (N314D, вариант Дуарте).

На основании полученных данных, предлагается следующий алгоритм подтверждающей диагностики галактоземии тип 1 (рис. 4).

Применение алгоритма подтверждающей диагностики для массового скрининга

Данный раздел работы проводился совместно с Московским центром неонатального скрининга. За период с ноября 2006 по декабрь 2008 года в г.Москве обследовано 216938 новорожденных на галактоземию. После определения концентрации тотальной галактозы было выявлено 127 новорожденных с положительными результатами ретеста. В 98 случаях активность Г-1-ФУТ оказалась выше отрезной точки, таким образом, диагноз галактоземии тип 1 был исключен. Из них при ДНК-тестировании на частые мутации выявлено 15 случаев с генотипом галактоземия/Дуарте (G/D) и 12 случаев с генотипом галактоземия/нормальный аллель (G/N).

Рис. 4. Алгоритм подтверждающей диагностики галатоземии тип 1

Диагноз галактоземии подтвержден в 4 случаях. У одного пациента определение активности фермента не проводилось, и диагноз галактоземии подтвержден методами ДНК анализа (генотип Q188R/Q188R). У 3 других пациентов выявлена низкая активность фермента (0,54; 0,20 и 0,04 Е/гHb) и установлены генотипы (Q188R/L358P; Q188R/Q188R и Q188R/Q188R, соответственно).

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5. Результаты скрининга на галактоземию в г.Москве

В оставшихся 11 случаях активность Г-1-ФУТ оказалась ниже отрезной точки, из них, при ДНК-тестировании на частые мутации в 8 случаях выявлена одна частая мутация, в 3 случаях частых мутаций не идентифицировано. При проведении секвенирования других изменений в гене не выявлено. Таким образом, диагноз классической галактоземии подтвержден не был.

Всего при проведении ДНК-диагностики выявлено 26 случаев с генотипом G/D, 10 случаев с генотипом G/N и 6 случаев с генотипом D/D (средняя активность Г-1-ФУТ в цельной крови 1,85 + 0,55; 3,55 + 0,77 и 3,78 + 1,45 Е/гHb, соответственно).

Также с помощью критерия Ньюмана-Кейлса проведена оценка межгрупповых различий (группы разделялись по генотипу) по уровню тотальной галактозы, полученной при скрининге, и по активности Г-1-ФУТ, измеренной при подтверждающей диагностике.

На основании полученных данных установлено, что по уровню тотальной галактозы достоверно отличается от других групп только группа новорожденных с генотипом галактоземия/галактоземия (G/G), остальные группы не имеют статистически достоверных различий. По активности Г-1-ФУТ все группы достоверно различаются между собой, за исключением групп G/N и D/D, которые не имеют статистически достоверных различий между собой.

Высокая частота встречаемости генотипа G/D среди новорожденных с повышенным уровнем галактозы, а также статистически достоверные отличия пациентов с этим генотипом по активности Г-1-ФУТ, свидетельствует о влиянии данного генотипа на метаболизм галактозы и на активность Г-1-ФУТ.

Концентрация тотальной галактозы в крови у новорожденных с установленным генотипом.

При проведении неонатального скрининга в Российской Федерации принят пороговый уровень галактозы в сухих пятнах крови 7,2 мг/дл. Исследование, проведенное в рамках программы массового скрининга в г.Москве показывает, что на подтверждающую диагностику галактоземии поступает большое число пациентов (31,8%), у которых выявляют либо гетерозиготное носительство мутантного аллеля (8,8%) или вариант галактоземии-Дуарте (23%). При этом пациенты, имеющие данные генотипы, не нуждаются в назначении диеты, а семья подвергается необоснованному стрессу.

В табл. 6 приведены среднее значение и стандартное отклонение для 6 групп: пациентов с классической галактоземией (G/G), галактоземией Дуарте (G/D), носителей мутантного аллеля галактоземии (G/N), носителей (D/N) и гомозигот по варианту Дуарте (D/D) и новорожденных у которых не было выявлено изменений в гене GALT и был нормальный уровень фермента, но уровень галактозы был выше отрезной точки (N/N).

Таблица 6. Средние значения уровня галактозы у пациентов с положительными результатами скрининга на галактоземию

Проведенный ROC-анализ показывает, что отрезная точка, соответствующая максимальной чувствительности и специфичности относится к уровню галактозы- 20-25 мг/дл. Повышение отрезной точки при проведении ретеста до концентрации 20 мг/дл позволяет увеличить положительную прогностическую ценность (ППЦ) до 78%, специфичность до 95% (табл. 7).