Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Молекулярно-генетический анализ особенностей структуры и экспрессии генов BRCA1/2 при раке яичников и молочной железы

03.02.07 - генетика

Шубин Виталий Павлович

Москва - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель - Доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Сломинский Пётр Андреевич

доктор биологических наук, профессор Брага Элеонора Александровна

Ведущая организация - Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития Российской Федерации

Защита состоится 2011г. на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан 2011г.

Учёный секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Характеристика работы

Актуальность исследования

Рак яичников (РЯ) и молочной железы (РМЖ) являются наиболее распространенными заболеваниями женской репродуктивной системы в развитых странах. За пятилетний период 2001-2006 гг. отмечен заметный прирост заболеваемости опухолями яичников в России - на 5,8% (Давыдов М.И и Аксель Е.М., 2009). Одновременно растёт и смертность от РЯ. Рак этой локализации имеет один из самых высоких показатели смертности среди всех гинекологических опухолей.

Одним из факторов риска развития РЯ является онкологически отягощенный семейный анамнез. Основная доля наследственной формы РЯ обусловлена мутациями в генах BRCA1 и BRCA2. Спектры и частоты мутаций в указанных генах зависят от этнической принадлежности и географического положения популяций. Информация об этих характеристиках важна с точки зрения понимания процессов возникновения и распространения мутаций и необходима для решения практической задачи - профилактики рака. Примерно 70% диагностированных случаев РЯ приходится на 3-4 стадию развития опухоли яичников. Это обстоятельство влияет на уровень тяжких последствий при этом заболевании и дополнительно акцентирует значимость выявления женщин с мутациями в генах BRCA1/2 и проведения в дальнейшем динамического диспансерного наблюдения. Кроме того, присутствие у больного РЯ мутации в гене BRCA1 может являться фактором, влияющим на выбор средств терапии.

Однако наследственная форма занимает хотя и существенную, но меньшую долю всех случаев РЯ, по сравнению со спорадической формой этого заболевания. Молекулярные причины возникновения спорадических случаев РЯ в настоящее время не ясны. В недавней работе Alimonti A. с соавт., (2010) показано возникновение рака при снижении экспрессии гена-супрессора в опухоли, причем для этого было достаточно снижения экспрессии на 30%. Такое влияние частичной потери функции гена-супрессора может иметь широкое распространение, и нуждается в дальнейшем исследовании (Berger A.H. et al., 2011). Супрессорами спорадической формы РЯ могут быть те же гены - BRCA1/2 (Bowtell D.D, 2010). Прояснению значения генов BRCA1 и BRCA2 для возникновения и развития спорадической формы РЯ может способствовать изучение характеристик их экспрессии в раковой опухоли. Необходимость такого исследования усиливают накапливающиеся в последнее время данные о наличии популяционных различий характеристик экспрессии генов в опухоли (Patel T.A et al., 2010). Дополнительный свет на участие генов BRCA1 и BRCA2 в опухолевом росте может пролить сравнительный анализ экспрессии генов при РЯ и связанном с этими генами раком другой локализации - раке молочной железы. Этот аспект существенен также в плане данных о взаимодействии генов BRCA1 и рецептора эстрогена (ESR1) при раке молочной железы. Именно такое взаимодействие рассматривается как определяющее органоспецифичность супрессорной функции гена BRCA1 (Gorsky B. et al., 2009). В то же время, данные о взаимодействии генов BRCA1/2 с ESR1 при раке яичников отсутствуют. Исследование в этом направлении, при выявлении особенностей взаимодействия указанных генов при РЯ, могло бы дать дополнительную информацию о причинах различных локализаций рака при одном и том же гене-супрессоре. В связи с этим, представлялось также целесообразным изучить важные для развития рассматриваемых типов рака гены рецептора эстрогена (ESR1) и остеопонтина (OPN), которые могут быть взаимосвязаны на уровне регуляции с геном BRCA1.

В последнее время большое значение для роста опухоли связывают с процессами, происходящими в прилегающей к ней ткани и которые функционально могут быть связаны с процессами в опухоли (Wang E. et al., 2005; Goetz J.G. et al., 2011). Эта важная для понимания развития опухоли область исследований находится в процессе изучения.

Цель исследования

Изучение особенностей структуры и экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 при раке яичников и молочной железы.

Задачи исследования

1. Исследовать спектр и частоту мутаций в гене BRCA1 в неселектированной выборке больных РЯ в Республике Мордовия.

2. Провести исследование экспрессии генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN в злокачественной опухоли яичников и сравнить с экспрессией этих генов при РМЖ.

3. Изучить экспрессию генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN в ткани ближайшего окружения опухоли при РЯ.

4. Изучить взаимосвязь уровней экспрессии генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN в злокачественных опухолях яичников и молочной железы и в ткани ближайшего окружения опухоли яичников.

Научная новизна полученных результатов

Впервые изучены частота и спектр мутаций в гене BRCA1 в Республике Мордовия. Выявленная частота мутаций в гене BRCA1 при РЯ составила 26% и относится к наиболее высокой в неселектированных выборках больных из других популяций. В спектре преобладают две мутации - 3819del5 и 5382insC.

Результаты гаплотипирования по микросателитным маркерам могут свидетельствовать в пользу распространения мутации 3819del5 вследствие эффекта основателя.

Получены данные о пониженном уровне экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли спорадической (без наличия герминальной мутаций в данном гене) формы РЯ. Обнаружен повышенный уровень экспрессии гена BRCA2 в злокачественной опухоли молочной железы.

Впервые установлена корреляция уровней экспрессии гена BRCA2 с уровнями экспрессии генов ESR1 и OPN в злокачественной опухоли яичников.

Впервые найдены координированные изменения уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли яичников и ткани её ближайшего окружения.

Практическая значимость

Полученные данные о частоте и спектре мутаций в гене BRCA1 при РЯ необходимы для выявления наследственной предрасположенности к раку указанной локализации с целью его профилактики и указывают на возможность и целесообразность проведения скрининговых исследований больных РЯ в Мордовии.

Данные о пониженном уровне экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли спорадической формы РЯ указывают на значение этого гена для развития не только наследственной, но и спорадической формы РЯ. Эти результаты, наряду с данными о повышенном уровне экспрессии гена BRCA2 в опухоли при РМЖ могут быть в дальнейшем использованы при разработке маркеров указанных типов злокачественных новообразований.

Полученные новые данные по функционированию генов в ткани ближайшего окружения опухоли важны для понимания взаимодействия опухоли и ее микроокружения и могут быть востребованы при разработке новых способов терапии РЯ и при хирургическом вмешательстве.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявленная частота мутаций в гене BRCA1 при РЯ в Мордовии, составившая 26%, относится к наиболее высоким частотам, найденным в неселектированных выборках больных из других популяций.

2. В спектре мутаций в гене BRCA1 при РЯ в Мордовии преобладают две мутации - 3819del5 и 5382insC. Результаты гаплотипирования по микросателитным маркерам демонстрируют общий гаплотип при мутации 3819del5, что может свидетельствовать в пользу распространения этой мутации вследствие эффекта основателя.

3. Уровень экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли спорадической формы РЯ в основном числе случаев понижен. В злокачественной опухоли молочной железы уровень экспрессии гена BRCA2 в основном повышен. Уровень экспрессии гена BRCA2 коррелирует с уровнями экспрессии генов ESR1 и OPN в злокачественной опухоли яичников. При раке молочной железы обнаружена корреляция уровней экспрессии генов BRCA1 и ESR1.

4. Существуют координированные изменения уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли яичников и ткани ее ближайшего окружения.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы представлены и обсуждены на российских и международных конференциях и съездах: IV съезд Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конгресс с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины: возможное и реальное» (Санкт-Петербург, 2010), European Human Genetics Conference (Вена, 2009; Гетеборг, 2010; Амстердам, 2011).

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 28 сентября 2011 года.

Личный вклад автора в проведение исследования

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов их выполнения, проведении исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 9 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата наук.

Объем и структура работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 117 источников: 8 отечественных и 109 зарубежных. Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 11 таблиц.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Группа больных РЯ для исследования мутаций в генах BRCA1/2 была сформирована из 65 женщин, проживающих в Республике Мордовия, только на основании соответствующего диагноза без учета семейной истории заболевания. Основное число больных РЯ, 36 человек, составили русские (не исключено присутствие мордовских корней), 15 мордовок, 14 относили себя к другим национальностям. Возраст больных находился в интервале 25 - 70 лет, все являлись коренными жителями Республики Мордовия. Сбор образцов крови пациентов и анализ семейной истории осуществлены при участии сотрудников республиканского онкологического диспансера г. Саранска Волковой О.В. и Мельцаева Г.Г.

Для анализа экспрессии генов при РЯ была сформирована выборка из образцов ткани от 19 больных (57 образцов). Средний возраст пробандов составлял 49 лет. Опухоль характеризовалась как серозно-папилярная аденокарцинома 3 стадии развития заболевания (Т_3сN_оМ_о). Экспрессию исследовали в образцах опухоли, прилегающей к ней гистологически нормальной ткани, а также отдаленной на максимальном расстоянии от очага опухоли ткани этого же органа, полученных от того же пациента. Сбор образцов проводился при участии сотрудников РОНЦ РАМН Грицая А.Н. и Кашурникова А.Ю. Экспрессию генов при РМЖ исследовали в образцах злокачественной опухоли молочной железы и гистологически нормальной ткани, максимально отдаленной от опухоли, того же пациента (19 пациентов; 38 образцов). Все образцы опухоли характеризовались как инфильтративный протоковый рак второй степени злокачественности и 3 стадией развития. Средний возраст пробандов 52 года. Сбор образцов проводился при участии сотрудников РОНЦ РАМН Ким Е.А. и Высоцкой И.В. У пациентов получено письменное информированное согласие на проведение исследования.

Определение мутаций в генах BRCA1/2 проводили с помощью конформационно-чувствительного электрофореза - CSGE, который обладает высокой чувствительностью и универсальностью, с последующим подтверждением наличия мутации и выявлением ее характеристик путем секвенирования. В гене BRCA1 исследованы все экзонные участки с прилегающими участками интронов; в гене BRCA2 - 9, 15, 23 и 11 (nt 5886-6420) экзоны, в которых встречались мутации в странах с населением, входящим в состав финно-угорских народов.

Уровень экспрессии генов BRCA1, BRCA2, OPN и ESR1 измеряли с помощью ПЦР в реальном времени (StepOnePlus, ABI, США), используя фирменный набор TaqMan, либо, в некоторых случаях, краситель Sybr Green. Для определения экспрессии использована стандартная оценка ДДСt. Суммарная РНК выделена с помощью набора YellowSolve. Качество выделения РНК проверяли электрофоретически. Обратную транскрипцию проводили, используя набор ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, США). Для каждого гена определена область линейности экспрессии. Анализ экспрессии проводили, используя стандартный метод ДДCt.

Статистический анализ выполняли с помощью стандартного пакета «Statistica» (версия 6.0, «Statsoft Inc.», США).

Результаты и обсуждение

Изучение пациентов с раком яичников на наличие мутаций в генах BRCA1/2

В гене BRCA1 у пробандов обнаружено 4 мутации (3819del5, 5382insC, 4154delA, C61G) и два миссенс-варианта R1347G, R841W. В гене BRCA2 мутаций не обнаружено.

На рис. 1 показана последовательность нуклеотидов участка ДНК с наличием мутации 3819del5 и электрофоретическое разделение данного фрагмента ДНК. При этой мутации происходит делеция пяти нуклеотидов GTAAA в 11 экзоне гена BRCA1. В результате сдвига рамки считывания в 11 экзоне образуется стоп-кодон в положении 1242.

Среди 65 мордовских больных РЯ мутации в гене BRCA1 обнаружены у 17 больных (26%). Обнаруженная частота мутаций в гене BRCA1 среди мордовских больных РЯ относится к наиболее высоким. Самая высокая частота мутаций в неселектированной выборке РЯ ранее наблюдалась у евреев ашкенази (30%) и в Белоруссии (26%) (Bogdanova NV et al., 2010). В выборках больных, исследованных в других странах, частота мутаций в гене BRCA1 ниже. В Европе данная частота изменялась от 7,4% (Швеция) до 12,9% в Польше и 14,8% в Московском регионе (Смирнова Т.Ю и др., 2007). Найденная частота мутаций значимо не отличается от частоты среди евреев ашкенази, но выше, чем у поляков и в Московском регионе (р=0,02).

Рис.1. Определение изменений первичной структуры ДНК гена BRCA1.

Примечание: А - Фрагмент результата секвенирования 11 экзона гена BRCA1. В последовательности ДНК одного аллеля обнаружена делеция 5 нуклеотидов в положении 3819 нуклеотидной последовательности (1 - норма; 2 - мутация). Б - Электрофоретическое разделение методом CSGE амплифицированных фрагментов ДНК гена BRCA1 (11 экзон) у больной РЯ и двух контролей. Стрелкой указана дорожка с образцом ДНК больной РЯ с мутацией.

Полученные в настоящей работе характеристики спектра мутаций при РЯ в гене BRCA1 (рис.2) отличаются от спектра, выявленного в Московском регионе (рис. 3) (Смирнова Т.Ю. и др., 2007).

Рис.2. Спектр мутаций в гене BRCA1 при РЯ в Республике Мордовия.

Рис.3 Спектр мутаций в гене BRCA1 при РЯ в Московском регионе (Смирнова Т.Ю. и др., 2007).

Помимо значимо отличающейся частоты мутации 3819del5 (53%) (р<0,00001), частота преобладающей в Московском регионе мутации 5382insC (60%; Смирнова Т.Ю. и др. 2007), выше частоты (17%) этой же мутации в Мордовии (р=0,03). Частоты мутаций 4154delA, C61G не отличаются. Частота миссенс-варианта R1347G, который в Московском регионе встречается очень редко, преимущественно при РМЖ (0,75%), в Мордовии значительно выше и составляет 15%. По данным базы данных BIC, R1347G относится к мутациям неизвестного значения. У одного пробанда в нашем исследовании, помимо мутации 3819del5, присутствовал данный вариант. Это дает основание предположить, что R1347G не является мутацией, обусловливающей высокий риск РЯ.

Наиболее высокая частота мутации 3819del5, помимо Мордовии, найдена в Чехии (15%) (Clark-Knowles KV. et al., 2010). Среди чешских больных РЯ, она по частоте занимает второе место в спектре мутаций и отличается от частоты, обнаруженной в Мордовии - 56%. Так же эту мутацию, с частотой около 10%, нашли в Германии и в Польше.

Так как население Республики Мордовия включает в себя национальность мордва (около 30% населения всей Республики Мордовия), которая относится к финно-угорским народам, проведено сравнение полученной частоты и спектра мутаций с таким же образом полученными данными в странах с финно-угорским населением - Финляндии и Эстонии. Самая высокая частота мутаций была в Республике Мордовия -26%; в Эстонии - 9% (р=0,022) и в Финляндии - 5,6% (р=0,001).

Как следует из полученных данных, часто встречающиеся в указанных странах мутации в гене BRCA1 также в основном различны. У мордвы наиболее повторяющейся является мутация 3819del5, не найденная среди других финно-угров. Отсутствие общности в спектрах мутаций обусловлено, по-видимому, сравнительно недавним их возникновением в генах BRCA1/2. Мутация 5382insC является часто встречающейся в Европе и, по-видимому, распространилась из России (Карпухин, 2006). Присутствие мутации 5382insC у некоторых финно-угорских народов связано, скорее, не с их этнической общностью, а с характеристиками ее распространения.

Из 17 больных с мутацией в гене BRCA1 семейный анамнез по РЯ/РМЖ установлен для 6 пробандов, что составляет 35%. В Финляндии частота семейных случаев при мутациях в генах BRCA1/2 составляет 80% (Elmasry K. et al., 2006). По этому показателю больные РЯ в Мордовии также отличаются (р=0.028). В Польше доля семейных случаев при мутациях в гене BRCA1 была 72% (Bergman A. et al., 2005). Более 90% семейного рака яичников/молочной железы среди пробандов с мутациями обнаруживали в Московском регионе России, Швеции и Канаде. Наиболее близкие значения к найденной нами частоте семейных случаев, наблюдали в США (Einbeigi Z. et al., 2007) и в Китае (Bergthorsson J.T. et al., 2001).

Таким образом, впервые изучены молекулярно-генетические характеристики генов BRCA1 и BRCA2 среди мордовских больных РЯ. Частота мутаций в гене BRCA1 в мордовской выборке больных составила 26% и относится к наиболее высокой среди изученных выборок в других странах. Спектр мутаций в этом гене включает две высокоповторяющиеся мутации - 3819del5 и 5382insC, в сумме занимающие 70% спектра.

Гаплотипирование гена BRCA1 с мутацией 3819del5

Ряд повторяющихся BRCA-мутаций распространились вследствие эффекта основателя (founder mutation) (Clark-Knowles KV. et al., 2010). Для выяснения происхождения мутации 3819del5 от одного или нескольких предшественников проведено гаплотипирование 9 мордовских больных РЯ с мутацией 3819del5 по 4 микросателлитным маркёрам, расположенным внутри гена BRCA1 и в прилегающем к BRCA1 локусе. Обнаружен общий гаплотип гена BRCA1 (D17S855-D17S1320-D17S1323-D17S1325): 154-177-156-201 для всех образцов с мутацией 3819del5.

Гаплотип гена BRCA1, найденный при мутации 3819del5, отсутствовал среди 10 больных РЯ без мутаций в этом гене и не выявлен среди 10 контрольных образцов женщин без РЯ (р=0,00001).

Следовательно, полученные данные могут свидетельствовать о распространении мутации 3819del5 в Мордовии вследствие эффекта основателя. Родственных связей между семьями с мутацией 3819del5 выявить не удалось. опухоль яичник ген

Экспрессия генов BRCA1 и BRCA2 в опухоли рака яичников

Наследуемые мутации в гене BRCA1 объясняют возникновение части случаев РЯ, однако механизмы развития основной доли этого заболевания остаются невыясненными. В этом плане весьма интересными представляются данные, свидетельствующие о значении снижения экспрессии гена-супрессора (даже на 30%) для возникновения злокачественного новообразования (Alimonti A. et al., 2010). В связи с этим, представляло интерес изучение экспрессии генов-супрессоров рака яичников - BRCA1 и BRCA2.

Как видно на рис.4, в большинстве случаев экспрессия гена BRCA1 в опухоли РЯ понижена относительно условно-нормальной ткани (P=0,01; критерий Уилкоксона для парных значений).

Рис.4. Уровень экспрессии гена BRCA1 в опухоли при РЯ.

Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

В ранних работах с использованием иммуногистохимических методов находили уменьшение экспрессии белка гена BRCA1 в диапазоне 34% - 90% случаев РЯ. Однако оценки с использованием таких методов имеют значительную долю субъективизма (Clark-Knowles KV. et al., 2010).

В работе (Press J.Z. et al., 2008) в 47% случаев РЯ найдены генетические или эпигенетические события, приводящие к снижению функции гена BRCA1.

Для оценки частот разных уровней экспрессии гена BRCA1 в опухоли применили подход, использованный в работе (An J. et al., 2010). Определена медиана уровней экспрессии гена BRCA1 в условно-нормальной ткани, составившая 0,92 и в опухоли - 0,52. Экспрессию в опухоли считали повышенной, если ее значение выше медианы условно-нормальной ткани, и пониженной - если ниже медианы. Рассчитанные различия частот уровня экспрессии гена BRCA1 в опухоли и в условно-нормальной ткани весьма существенны (OR=8,5; P=0,009). Этот результат качественно совпадает с полученным в работе An и др. (2010). Следовательно, два способа оценки приводят к заключению о пониженном уровне экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли яичника.

Для гена BRCA2 наблюдается обратная, по сравнению с геном BRCA1 картина - больше, чем в половине случаев, экспрессия гена BRCA2 в опухоли повышена (рис. 5).

Рис.5. Уровень экспрессии гена BRCA2 в злокачественной опухоли яичников. Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

Проведенная обработка данных, аналогично расчетам для BRCA1, не выявила значимых отличий от нормы. При сравнении уровней экспрессии гена BRCA2 в опухоли и в условно-нормальной ткани с помощью критерия Уилкоксона для парных значений уровень значимости различий составил Р=0,37. Снижение экспрессии в опухоли относительно медианы условно-нормальной ткани наблюдали в 53%(10/19), а повышение - в 47%(9/19) (ч²=0,03, P=0,87).

Следовательно, изменение экспрессии гена BRCA2 в опухоли в целом по выборке достоверно не отличается от таковой в условно-нормальной ткани.

Сравнение частот пониженной и повышенной экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в опухоли (рис. 4 и 5) показало значимые их отличия (Р=0,02). Этот результат дополнительно демонстрирует различие характеристик экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в опухоли яичников.

Значительное число случаев (15% - 37%) повышенной экспрессии белка гена BRCA2 в злокачественной опухоли найдено в работах (Yang F. et al., 2011; Yang G. et al., 2010). Повышенная экспрессия этого гена ассоциирована с более продолжительным временем жизни больных. В то же время около 40% случаев могут иметь пониженную экспрессию белка гена BRCA2 в злокачественной опухоли яичника (Swisher EM. et al., 2009). В работе Chan с соавт. (2002) наблюдали пониженную экспрессию гена BRCA1 в 67% случаев и повышенную экспрессию гена BRCA2 по сравнению с нормальной тканью в 80% случаев при РЯ.

С помощью количественного ПЦР-РВ показано, что гетерогенность экспрессии гена BRCA2 в злокачественных опухолях яичника существенно выше, чем экспрессии гена BRCA1, и в целом выборку нельзя охарактеризовать одной направленностью изменения экспрессии этого гена.

Полученные результаты соответствуют ведущей роли гена BRCA1 в качестве гена-супрессора наследственной формы РЯ среди российских больных и указывают на его значение в развитии и спорадической формы рака этой локализации.

Экспрессия генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли молочной железы

Для сравнения изучены изменения экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли молочной железы. Хотя указанные гены ответственны за возникновение наследственных форм, как РЯ, так и РМЖ, частоты мутаций в них при раке этих двух локализаций различны.

На рис. 6 видно, что частота пониженной экспрессии гена BRCA1 в опухоли молочной железы (около 25%) существенно ниже, чем в яичниках (рис. 6). Это значение соответствует данным полученных в других работах (Turner NC. et al., 2007). Найденная доля случаев РМЖ, демонстрирующих повышенную экспрессию гена BRCA1, близка к полученной иммуногистохимически (Mangia A. et al., 2009). На различия в экспрессии гена BRCA1 при раке изучаемых локализаций (яичников и молочной железы) указывает также статистически значимое различие частот пониженной и повышенной экспрессии гена BRCA1 в опухолях яичников и молочной железы (Р=0,02).

Рис. 6. Уровень экспрессии гена BRCA1 в опухоли молочной железы.

Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

Статистическое сравнение уровней экспрессии гена BRCA1 в опухоли и в условно-нормальной ткани, проведенное аналогично расчетам для РЯ, не выявила значимых отличий от нормы. Иной результат получен при исследовании экспрессии гена BRCA2 (рис. 7).

Рис.7. Уровень экспрессии гена BRCA2 в опухоли молочной железы.

Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

Сравнение уровней экспрессии гена BRCA2 в опухоли и в условно-нормальной ткани с помощью критерия Уилкоксона для парных значений выявило значимые различия (Р=0,0001). Снижение экспрессии в опухоли наблюдали в 5% (1/19), а повышение - в 95% (18/19) (ч²=9,38, p=0,002). Указанные частоты экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 при РМЖ значимо различаются (Р=0,01).

Следовательно, при впервые проведенном сравнительном исследовании характеристик экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в злокачественной опухоли яичников и молочной железы, найдена более высокая частота пониженной экспрессии гена BRCA1 в опухоли яичников, по сравнению с соответствующей частотой в опухоли молочной железы (OR=4,8; Р=0,02). Такое различие коррелирует с частотами мутаций в гене BRCA1 при наследственном раке указанных локализаций. Частота мутаций при наследственном РЯ составляет 70%, в то время как при РМЖ - 27% (Russo A. et al., 2009). Значение такой корреляции усиливают данные по профилям экспрессии генов, свидетельствующие о сходстве спорадических и наследственных форм рака этих локализаций (Mangia A. et al., 2009).

При раке обоих изучаемых локализаций, характеристики экспрессии гена BRCA2 отличаются от таковых для гена BRCA1: ген BRCA2 чаще имеет повышенную экспрессию, причем этот эффект более выражен в опухолях молочной железы. Механизмы такого явления в настоящее время не ясны. Однако данные, свидетельствующие о значении повышенной экспрессии гена BRCA2 для патогенеза и ответа на терапию РЯ (Yang G. et al., 2010), указывают на значимую роль изменения экспрессии гена BRCA2 в развитии рака.

Поскольку гены BRCA1/2 функционируют, в том числе, в качестве транскрипционных факторов, не исключено влияние гена BRCA2 (как и гена BRCA1) на развитие злокачественного новообразования путем контроля действия других генов.

Экспрессия гена ESR1 в злокачественных опухолях молочной железы и рака яичников

Рак молочной железы и яичников относится к злокачественным опухолям, развитие которых является эстроген-зависимым. Выполнение генами BRCA1/2 функций супрессоров злокачественной трансформации клеток гормонально регулируемых тканей приводит ряд исследователей к заключению о взаимосвязи гормональных сигнальных путей с этими генами.

В связи с этим исследована экспрессия гена рецептора эстрогена альфа (ESR1) в опухолях указанных локализаций и ее связь с экспрессией генов BRCA1 и BRCA2.

Повышенная экспрессия гена ESR1 найдена примерно в половине случаев РМЖ. Это значение соответствует определяемым, в том числе другими методами, частотам повышенной экспрессии ESR1 в опухоли молочной железы.

При изучении взаимосвязи экспрессии гена ESR1 и генов BRCA1 и BRCA2, статистически значимая корреляция найдена только между уровнями экспрессии генов BRCA1 и ESR1 при РМЖ (рис. 8; R=0,60 Р=0,006). Этот результат указывает на прямую взаимосвязь экспрессии этих генов и соответствует данным о взаимодействии BRCA1 и ESR1, имеющем взаимное регуляторное значение (Gorski JJ. et al., 2009). Экспрессия гена BRCA2 в опухолях молочной железы статистически значимо не коррелировала с экспрессией гена ESR1.

Рис.8. Корреляция значений уровней экспрессии генов BRCA1 и ESR1 в злокачественной опухоли молочной железы.

При РЯ частота повышенной экспрессии гена ESR1 в два раза меньше (26%, в расчет брали значения более чем двукратно превышающие норму), чем при РМЖ. Различие статистически не значимо (Р=0,1). В работе Geisler J.P. с соавт. (2008) повышенную экспрессию ESR1 находили в 5 из 10 изученных случаев серозных аденокарцином.

Статистически значимой корреляции экспрессии генов BRCA1 и ESR1 при РЯ не найдено. В тоже время экспрессия гена ESR1 коррелировала с экспрессией гена BRCA2 в опухоли (рис.9; R=0,79, Р=0,0001), что свидетельствует о связи экспрессии этих генов при РЯ.

Рецепторы эстрогена регулируют рост и дифференциацию нормальных эпителиальных тканей. Повышенная экспрессия ESRб является прогностическим фактором в опухоли молочной железы и связана с медленным развитием злокачественной опухоли, низкодифференцированным типом новообразования и хорошим прогнозом (Welboren WJ. et al., 2009). При РЯ повышенный уровень экспрессии ассоциирован с улучшенной выживаемостью после действия неоадъювантной химиотерапии (Zamagni C. et al., 2009).

Рис.9. Корреляция значений уровней экспрессии генов BRCA2 и ESR1 в злокачественной опухоли яичников.

Взаимосвязь экспрессии генов BRCA1 и ESR1 ранее изучали при РМЖ. По имеющимся данным (Gorski JJ. et al., 2009), связанный с лигандом ESRб способен взаимодействовать с промотором гена BRCA1 и, в комплексе с кофакторами ESRб, регулировать транскрипцию гена BRCA1. Биологическое значение такого взаимодействия может состоять в механизме «ответа», требуемого для контроля пролиферативного эффекта эстрогена. При такой интерпретации, повышенная экспрессия гена BRCA1 рассматривается как сдерживающая повышенную пролиферацию (Tung N. et al., 2010). В свою очередь, BRCA1 может как через прямое взаимодействие, так и транскрипционно, регулировать функциональные проявления ESR1 (Gorski JJ. et al., 2009). Полученные данные соответствуют этим представлениям и имеющимся результатам (Roldan G. et al., 2006).

При РЯ не обнаружена взаимосвязь экспрессии генов BRCA1 и ESR1. Однако выявлена корреляция экспрессии ESR1 с экспрессией гена BRCA2. Этот результат является новым и, возможно, отражает различия тканевой регуляции эстрогена. В частности, известна мультивариантная природа промотора ESR1 и то, что в разных тканях могут использоваться разные варианты промотора (Ikeda K. et al., 2004). С другой стороны, не исключена тканевая специфичность и регуляторных свойств генов BRCA1 и BRCA2. Обращает внимание сходство характеристик экспрессии гена BRCA1 при РМЖ и гена BRCA2 при РЯ (рис. 6 и 5), которое может быть не простым совпадением, а отражать функционирование этих генов при раке анализируемых локализаций.

Экспрессия гена OPN в злокачественных опухолях молочной железы и яичников

Ген остеопонтина (OPN) играет важную роль в контроле пролиферативной и метастатической активности опухолевых клеток при ряде типов злокачественных новообразований, включая рак молочной железы и яичников (Rodrigues LR. et al., 2007). Кроме того, имеются данные, полученные на модели животных, о влиянии экспрессии гена BRCA1 на функциональную активность OPN при РМЖ (El-Tanani MK. et al., 2006). Имея в виду эти данные, исследована экспрессия гена OPN в злокачественной опухоли яичника и молочной железы.

Найдено преобладание числа случаев с повышенной экспрессией гена OPN в опухоли молочной железы. Сравнение уровней экспрессии в опухоли и нормальной ткани выявило их значимые различия (Р=0,002, критерий Уилкоксона для парных значений).

Частота экспрессии OPN в опухоли выше медианы экспрессии в условно-нормальной ткани также значимо отличалась от частоты пониженной относительно медианы экспрессии (OR=3,75; P=0,04). То есть, для РМЖ характерна повышенная экспрессия гена OPN. Аналогичное исследование при РЯ, хотя и характеризовалось подобным распределением характеристик экспрессии OPN, но не выявило значимых отличий от нормы.

В то же время, статистически значимо распределения уровней экспрессии гена OPN в опухолях молочной железы и яичников не различаются (Р=0,16)..

Значимой корреляции экспрессии генов OPN и BRCA1 ни в опухоли молочной железы, ни яичников не выявлено. Однако при РМЖ в 5 из 6 случаев более чем двукратного повышения экспрессии гена BRCA1 экспрессия гена OPN понижена. И, наоборот, пониженная (по аналогичной оценке) экспрессия гена BRCA1 сопровождалась повышенной или близкой к норме экспрессией гена OPN. Эти данные указывают в пользу представлений о супрессорном действии гена BRCA1 на экспрессию гена OPN (El-Tanani MK. et al., 2006). Такая взаимосвязь может не проявляться в виде корреляции во всем диапазоне уровней экспрессии изучаемых генов. При РЯ никаких фактов в пользу возможной связи экспрессии генов OPN и BRCA1 не найдено.

Экспрессия гена BRCA2 не коррелировала с экспрессией гена OPN в опухоли молочной железы, но такая связь обнаружена в опухолях яичников (рис. 10; R=0,58, Р= 0,009). То есть, экспрессия гена BRCA2 взаимосвязана с экспрессией гена OPN при РЯ.

Промотор остеопонтина имеет множественные участки связывания транскрипционных факторов, и количество выявленных индуцирующих транскрипцию OPN факторов постоянно растет (Rodrigues LR. et al., 2007). Поскольку BRCA2 выполняет функции транскрипционных факторов, нельзя исключить прямую активацию транскрипции OPN. Такая активация может осуществляться и опосредованно, например, отражать обнаруженную взаимосвязь экспрессии генов BRCA2 и ESR1 в опухоли яичников. Продукт гена ESR1, ESRб, способен активировать транскрипцию OPN (El-Tanani MK. et al., 2006).

Рис. 10. Корреляция значений уровней экспрессии генов BRCA2 и OPN в злокачественной опухоли яичника.

В целом, при РЯ обнаружена взаимосвязь экспрессии гена BRCA2 с экспрессией генов, стимулирующих опухолевое развитие - ESR1 и OPN. В предположении причинно-следственного характера этой связи, роль гена BRCA2 при РЯ может состоять в модулировании процессов злокачественного развития опухоли. Однако окончательные суждения можно будет сделать только при дальнейшем исследовании.

Экспрессия генов в прилегающей к опухоли ткани

Прилежащая к опухоли ткань (называемая также микроокружением опухоли) имеет ряд особенностей, объясняемых взаимодействием опухоли с прилежащей тканью.

На рис. 11 дан уровень экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли и прилежащей ткани яичника.

Рис.11. Уровни экспрессии гена BRCA1 в злокачественной опухоли и в прилегающей к опухоли ткани яичника.

Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

В преобладающем числе случаев (68%) экспрессия гена BRCA1 относительно нормы в прилежащей к опухоли ткани еще ниже, чем в опухоли. При этом в целом по выборке уровень экспрессии гена BRCA1 в прилежащей ткани был ниже уровня нормы (Р=0,026; критерий Уилкоксона для парных значений; рис. 12).

Рис.12. Уровень экспрессии гена BRCA1 в прилегающей к опухоли ткани яичника. Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

Иное распределение уровней экспрессии в прилежащей к опухоли ткани было получено для гена BRCA2 (рис. 27). Экспрессия этого гена в большем числе случаев (68%) в прилежащей ткани оказалась выше уровня нормы, хотя это различие не дотягивало до уровня значимости (Р=0,08).

Как следует из данных на рис. 13, преимущественно наблюдается более высокая экспрессия гена BRCA2 в прилежащей к опухоли ткани, чем в опухоли.

Рис.13. Уровень экспрессии гена BRCA2 в прилегающей к опухоли ткани яичника.

Примечание: столбцы диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - десятичный логарифм отношения уровней экспрессии.

Из анализа данных следовало, что при более низкой, чем в опухоли, экспрессии гена BRCA1 в прилежащей ткани, экспрессия гена BRCA2, наоборот, выше, чем в опухоли в одних и тех образцах. Этот результат наводил на мысль о противоположных соотношениях уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в опухоли РЯ и в прилежащей к опухоли ткани. Для проверки гипотезы указанные соотношения были проверены на наличие корреляции, которую выявили (рис. 14; R=-0,70, P=0,001), что говорит о координации экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в опухоли и в прилегающей к ней ткани.

Рис.14. Корреляция отношений уровней экспрессии опухоли и прилегающей к опухоли ткани яичника генов BRCA1 и BRCA2.

Различия экспрессии изучаемых генов наглядно демонстрируют рис.15 и рис.16, на которых представлены наиболее выразительные случаи распределений уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в опухолевой ткани и ткани около опухолевого окружения одних и тех же больных.

Рис.15. Уровни экспрессии гена BRCA1 в опухоли и прилегающей к опухоли ткани яичника.

Примечание: Столбики диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - значения уровней экспрессии

Рис.16. Уровни экспрессии гена BRCA2 в опухоли и прилегающей к опухоли ткани. Примечание: Столбики диаграммы демонстрируют соответствующие значения для отдельных больных (обозначены номерами). Ось ординат - значения уровней экспрессии

При исследовании функциональной активности гена BRCA1 в злокачественной опухоли яичника найдена пониженная экспрессия гена. В прилежащей к опухоли ткани в наибольшем числе случаев экспрессия гена BRCA1 еще ниже, чем в опухоли. Исходя из трактовки пониженной экспрессии гена BRCA1 в качестве стимулирующего развитие опухоли фактора (Mangia A. et al., 2009), по аналогии можно предположить подобные механизмы действия этого гена и в ее ближайшем окружении. Имеющиеся в литературе данные о взаимосвязи функциональных процессов в опухоли и ее ближайшем окружении, позволяют интерпретировать полученные результаты как указывающие на «подстегивание» (McAllister SS. et al., 2008) опухоли со стороны ее микроокружения. С другой стороны, как следует из наших данных, значение для развития РЯ может иметь повышенная экспрессия гена BRCA2. В прилежащей к опухоли ткани часто наблюдается уровень экспрессии гена BRCA2, превышающий уровень его экспрессии в опухоли. Это явление также укладывается в представление о стимулировании опухоли со стороны микроокружения.

Корреляция отношений экспрессии в опухоли и ее окружении для генов BRCA1 и BRCA2 указывает на существование механизмов взаимодействия опухоли и ее окружения, в которых функциональная активность этих генов взаимосвязана. То есть, с этой точки зрения, найденная обратная корреляция означает координированное между генами BRCA1 и BRCA2, разное по уровню, влияние микроокружения на опухоль.

Разумеется, возможна и обратная трактовка полученных данных - можно предположить ведущее значение влияния опухоли на ее окружение. Однако с этой точки зрения труднее объяснить более низкие, чем в опухоли, уровни экспрессии гена BRCA1 в прилежащей ткани и более высокие - гена BRCA2. Наиболее вероятен обмен сигналами между опухолью и ее микроокружением (cross talk, (McAllister SS. et al., 2008)). В этом плане, можно предположить наличие сигналов со стороны опухоли, которые приводят к изменению экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 в ее окружении. Вследствие изменения экспрессии указанных генов, со стороны микроокружения в опухоль поступают стимулирующие ее сигналы. Нельзя исключить также, что таким путем осуществляется или облегчается экспансия опухоли в окружающую ткань.

Выводы

1. Частота мутаций в гене BRCA1 в неселектированной выборке больных РЯ в Республике Мордовия составила 26%. Данная частота мутаций в гене BRCA1 при раке яичников относится к наиболее высокой из найденных в выборках больных из других популяций.

2. Спектр мутаций в гене BRCA1 характеризуется наличием часто повторяющихся мутаций. В спектре преобладают две мутации - 3819del5 (53%) и 5382insC (17%). Результаты гаплотипирования по микросателитным маркерам, обнаружившие общий гаплотип при мутации 3819del5, свидетельствуют в пользу распространения этой мутации вследствие эффекта основателя.

3. Получены данные о пониженном уровне экспрессии гена BRCA1 в опухоли спорадической формы рака яичников (P=0,009), которые указывают на значение гена BRCA1 для развития не только наследственной, но и спорадической формы рака яичников.

4. При раке молочной железы статистически значимого изменения уровня экспрессии гена BRCA1 не найдено. Обнаружен повышенный уровень экспрессии гена BRCA2 в злокачественной опухоли молочной железы (P=0,002).

5. Установлена корреляция уровней экспрессии гена BRCA2 с уровнями экспрессии генов ESR1 (R=0,79, P=0,0001) и OPN (R=0,58, Р=0,009) в злокачественной опухоли яичников. При раке молочной железы показана корреляция уровней экспрессии генов BRCA1 и ESR1 (R=0,6, P=0,006). Полученные данные могут отражать различную взаимосвязь экспрессии генов BRCA1/2 и ESR1 при раке разной локализации.

6. Показана обратная корреляция отношений уровней экспрессии генов BRCA1 и BRCA2 (R=-0,7; P=0,001) в злокачественной опухоли яичников и ткани ее ближайшего окружения, свидетельствующая о координированных изменениях уровней экспрессии этих генов посредством взаимодействия опухоли и ее окружения.

Практические рекомендации

1. Высокая частота мутаций в гене BRCA1 в Мордовии позволяет рекомендовать молекулярно-генетическое исследование всех больных РЯ в этой Республике на наличие мутации в указанном гене.

2. Высокая доля двух мутаций (3819del5 и 5382insC; 70%) в гене BRCA1 среди больных в Мордовии указывает на возможность проведения молекулярно-генетического скрининга.

3. Выявление мутаций в гене BRCA1 необходимо для формирования групп риска РЯ с целью профилактики.

4. Результаты исследования экспрессии генов BRCA1, BRCA2, ESR1 и OPN могут быть в дальнейшем использованы при разработке маркеров прогноза развития РЯ, терапии при этом заболевании и при хирургическом вмешательстве.

5. Новые данные по функционированию и взаимодействию генов в ткани ближайшего окружения опухоли могут быть использованы при разработке новых способов терапии РЯ и при хирургическом вмешательстве.

Список публикаций по теме диссертационной работы

1. Shubin V.P., Loginova A.N., Gritsay A.N., Karpukhin A.V. Comparative analysis of BRCA1 gene expression in ovarian cancer tissue and an tumor environment // European Journal of Human Genetics. - 2009. - Vol. 17 (Suppl. 2). - P. 195.

2. Shubin V.P., Loginova A.N., Gritsay A.N., Kashurnikov A.U. Karpukhin A.V. The inverse ratio of BRCA1 and BRCA2 gene expression in ovarian cancer tissue and in tumor // European Journal of Human Genetics. - 2010. - Vol. 18 (Suppl. 1). - P. 168.

3. Шубин В.П., Логинова А.Н., Кашурников А.Ю., Грицай А.Н., Карпухин А.В. Функциональные особенности генов BRCA1 и BRCA2 в опухоли рака яичников и окружающей ткани // Медицинская генетика. - 2010. - с.199.

4. Шубин В.П., Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Волкова О.В., Карпухин А.В. Молекулярно-генетические особенности генов BRCA1/2 при раке яичников в Республике Мордовия // Научно-практический журнал «Клинико-лабораторный консилиум». - 2010. - Т.35. - №4. с. 56-57.

5. Шубин В.П., Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Волкова О.В., Мельцаев Г.Г., Карпухин А.В. Особенности спектра и частота мутаций в гене BRCA1 при раке яичников в Республике Мордовия // Медицинская генетика. - 2011. - Т.10. - №1. - с.19-24.

6. Апанович Н.В., Шубин В.П., Коротаева А.А., Бавыкин А.С., Ким Е.А., Закиряходжаев А.Д., Летягин В.П., Высоцкая И.В., Карпухин А.В. Современные молекулярно-генетические маркеры рака молочной железы // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2011. - №1. - С.19-28.

7. Шубин В.П., Карпухин А.В. Молекулярная генетика наследственной предрасположенности к раку яичников // Медицинская генетика. - 2011. - Т.10. - №4. - с.39-47.

8. Шубин В.П. , Логинова А.Н. , Поспехова Н.И. , Волкова О.В. , Мельцаев Г.Г. , Карпухин А.В. Наследственный рак яичников: молекулярно-генетические характеристики и популяционные особенности // Справочник акушера-гинеколога. - 2011. - №5. - С.53-58.

9. Shubin V.P., Loginova A.N., Kashurnikov A.U., Gritsay A.N., Karpukhin A.V. The functioning of important for tumor development genes in ovarian cancer tumor and its microenvironment // European Journal of Human Genetics. - 2011 - Vol.19 (Suppl.2). - P.206.

Список использованных сокращений

РЯ - рак яичников

РМЖ - рак молочной железы

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

BRCA1/2 - breast associated cancer 1, 2

ESR1 - estrogen receptor б

OPN - osteopontin

Размещено на Allbest.ru

...