Выводы

1. Разработана оригинальная модификация лабораторного протокола адаптер-опосредованной амплификации интерметилированных сайтов: модифицированы этапы лигирования и амплификации, предложены оригинальные подходы к определению геномной локализации дифференциально метилированных фрагментов ДНК на основе картирования по подобию, прямого секвенирования и рестриктазного картирования для локусов, предсказанных in silico.

2. С помощью разработанного метода выявлено 23 локуса, принадлежащих пулу интерметилированных сайтов. Из них 15 локусов, принадлежащие генам LAMB1, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2, SH3KBP1, PPP2R5C, PHF15, ATMIN, C2CD2, KIAA1324L, AX746725/AK127124, TMEM176A/TMEM176B, FOXM1/HKMT1188, IQSEC2, и 4 локуса, принадлежащие межгенным областям хромосомных районов 1p33, 5p15.33, 12q13.13 и 13q32.1, охарактеризованы как дифференциально метилированные в злокачественных опухолях, тканях, пограничных с опухолью, и аутопсийном материале молочной железы. Четыре локуса, представляющие собой участки генов CUX1, MAD1L1, TAF4 и ZBTB4, охарактеризованы как константно метилированные во всех исследованных нормальных и опухолевых образцах молочной железы.

3. Частоты аномального метилирования выявленных локусов при раке молочной железы составляют от 5,1% до 87,4%. Существуют значительные различия информативности маркеров в наборах, получаемых при использовании различных вариантов амплификации интерметилированных сайтов, в выборке образцов рака молочной железы. Частоты метилирования локусов панели GCG находятся в диапазоне от 34,5% до 87,4%, в то время как частоты метилирования локусов панели CCG - в диапазоне от 5,1% до 59,7%.

4. Промоторные CpG-островки генов SH3KBP1 и PHF15 достоверно чаще метилированы в образцах рака молочной железы со второй степенью злокачественности по сравнению с третьей степенью злокачественности. В то же время CpG-островок гена GPC2 обнаруживает различия уже в пределах второй степени злокачественности, что может свидетельствовать о субъективизме критерия «степень злокачественности» и недостаточности только морфологических характеристик для его определения. Метилирование промоторного CpG-островка гена LAMB1 в материале РМЖ ассоциировано с негативным иммуногистохимическим статусом эстрогеновых и прогестероновых рецепторов. Промотор гена SH3KBP1 достоверно чаще метилирован в группе опухолей молочной железы с размером Т1 против опухолей с размером Т2.

5. Для диагностики рака молочной железы предложены две системы, оптимизированные по количеству маркеров. Первая включает 13 маркеров (PPP2R5C, IQSEC2, PHF15, ATMIN, TMEM176A/TMEM176B, TAF4, RAI1, KCNH8, DOCK6, GPC2 и фрагменты межгенных хромосомных районов 12q13.13, 1p33, 5p15.33) и характеризуется чувствительностью 93,9% и специфичностью 93,9%. Вторая состоит из 7 маркеров (RAI1, KCNH8, DOCK6, TAF4, GPC21 и фрагменты межгенных хромосомных районов 1p33, 5p15.33), с чувствительностью 89,8% и специфичностью 100%. Относительно нормальной молочной железы вторая система маркеров метилирования характеризуется чувствительностью 100% и специфичностью 100%. При использовании любой из двух систем для постановки диагноза «рак молочной железы» достаточно выявления 4 маркеров в метилированном состоянии; метилирование 2-3 маркеров характерно для прилежащей к опухоли морфологически нормальной ткани; в здоровой ткани молочной железы выявляется метилирование одного из маркеров (TAF4).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод скрининга дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Молекулярная медицина, 2009. № 4. С. 18-26

2. Залетаев Д.В., Стрельников В.В., Немцова М.В., Бабенко О.В., Кузнецова Е.Б., Землякова В.В., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Танас А.С. Маркеры метилирования в диагностике онкологических заболеваний // Медицинская генетика, 2010. Т.9 №1. С. 15-21

3. Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Дизайн эксперимента и анализ результатов амплификации интерметилированных сайтов с использованием компьютерной программы AIMS in silico // Молекулярная биология, 2010. Т.44 № 2. С. 355-365

4. Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Novel tools for unbiased DNA differential methylation screening // Epigenomics, 2010. Vol. 2. No. 2. P. 325-333

Публикации в других изданиях:

5. Танас А.С., Стрельников В.В., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Современный высокотехнологичный метод диагностики маркеров метилирования в онкологии // Онкогематология, 2008. №4. С. 73-74

6. Strelnikov V.V., Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V. Unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research. 11 European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumours // Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology, 2008. P. 59-60

7. Shkarupo (Rudenko) V.V., Tanas A.S., Kuznetsova E.B., Zavalishina L.E., Frank G.A., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. A semi-automated unbiased differential methylation screening assay for applications in cancer epigenetic research // Eur. J. Hum. Genet., 2008. V.16. Suppl. 2. P. 223

8. Шкарупо (Руденко) В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В.,Залетаев Д.В. Метод анализа структурно-функциональной организации эпигеномов клеток рака молочной железы // Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, 2008. С. 489

9. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Синтетический непредвзятый метод скрининга дифференциального метилирования геномов опухолевых клеток // V Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», научная программа и тезисы, 2008. С. 94-95

10. Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Программное обеспечение для скринига дифференциального метилирования геномов на основе амплификации интерметилированных сайтов // Медицинская генетика, 2009. Т.8. №12 (90). С. 33

11. Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletaev D.V., Strelnikov V.V. Amplification of intermethylated sites, Bioinformatics and Capillary electrophoresis: the ABC of the cancer methylomes // Eur. J. Hum. Genet., 2009. V.17. Suppl.2. P. 284

12. Tanas A.S., Shkarupo (Rudenko) V.V., Kuznetsova E.B., Zaletayev D.V., Strelnikov V.V. Software for Genomic/Epigenomic Research // Eposters.net - the online journal of scientific posters, 2009. EP10983

13. Шкарупо (Руденко) В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Современные подходы к скринингу дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // Медицинская генетика, 2009. Т.8. №12 (90). С. 41

14. Стрельников В.В., Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Современные высокотехнологичные методы диагностики маркеров метилирования ДНК в онкологии // Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 16-20 марта 2009. С. 90-91

15. Шкарупо (Руденко) В.В., Танас А.С., Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Скрининг дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 197

16. Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Шкарупо (Руденко) В.В., Танас А.С., Залетаев Д.В. Уроки непредвзятого скрининга дифференциального метилирования ДНК // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, г.Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010. С. 172-173

17. Strelnikov V., Tanas A., Shkarupo (Rudenko) V., Kuznetsova E., Gorban N., Zaletaev D. Non-microarray DNA differential methylation screening in breast cancer // 12th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumors, Nijmegen, the Netherlands, 3-6 June 2010. P. 104

18. Tanas A., Shkarupo (Rudenko) V., Kuznetsova E., Zaletaev D., Strelnikov V. AIMS in silico & PeakPick: a software package supporting unbiased screening of DNA differential methylation in cancer // 12th European Workshop on Cytogenetics and Molecular Genetics of Solid Tumors, Nijmegen, the Netherlands, 3-6 June 2010. P. 106

19. Танас А.С., Шкарупо (Руденко) В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программа AIMS in silico // Рекламно-техническое описание, описание программы, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050017. Москва, 2010 г.

20. Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В. Компьютерная программа PeakPick // Рекламно-техническое описание, описание программы, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201050040. Москва, 2010 г.

21. Руденко В.В., Танас А.С., Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В. Скрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса // Медицинская ДНК-технология, Разрешение ФС № 2011/132 от 27.05.2011г.

22. Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В., Залетаев Д.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга эпигенетических нарушений при раке // Шестой московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2011. С. 139-140

23. Танас А.С., Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Алгоритмы и программное обеспечение скрининга дифференциального метилирования геномов клеток злокачественных новообразований // III Международная Студенческая Научно-практическая Конференция РУДН, 2011. С. 25-26

24. Руденко В.В., Кузнецова Е.Б., Танас А.С., Залетаев Д.В., Стрельников В.В. Скрининг дифференциального метилирования геномов клеток рака молочной железы // III Международная Студенческая Научно-практическая Конференция РУДН, 2011. С. 24-25

25. Танас А.С., Руденко В.В., Стрельников В.В. Программа для ЭВМ "AIMS in silico 2". Рекламно-техническое описание, описание применения. Регистрационный номер ВНТИЦ 50201151514, Москва, 2011 г.

Список сокращений

АИМС - амплификация интерметилированных сайтов

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИМ - индекс метилирования

МЧ-ПЦР - метилчувствительная полимеразная цепная реакция

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РФФИ - Российский фонд фундаментальных исследований

СЗ - степень злокачественности

ENCODE - энциклопедия ДНК-элементов (The Encyclopedia of DNA Elements)

ROC - операционная характеристика классификатора (Receiver Operator Characteristic)

Размещено на Allbest.ru