Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Эффективность программы массового обследования новорожденных на муковисцидоз

03.02.07 - Генетика

14.01.08 - Педиатрия

Кусова Залина Ахсаровна

Москва - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научные руководители доктор биологических наук, Петрова Ника Валентиновна

доктор медицинских наук, профессор, Каширская Наталья Юрьевна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, Петрин Александнр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, Волков Игорь Константинович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования

Защита состоится "14" июня 2011 г. в ___ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан "______"___________________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Муковисцидоз (МВ, CF; OMIM: 219700) - частая наследственная полиорганная патология, обусловленная мутацией в гене трансмембранного регулятора проводимости CFTR, манифестирующая, как правило, в раннем детском возрасте. На сегодняшний день, во всем мире, профилактика наследственных заболеваний имеет огромное медико-социальное значение. Так обследование новорожденных на МВ в первые месяцы после рождения, является одним из методов, позволяющих обеспечить доклиническое выявление заболевания. В мире, неонатальный скрининг на МВ успешно проводится более тридцати лет. Как показал многолетний опыт зарубежных исследователей, активное диспансерное наблюдение вновь выявленных больных, своевременное начало комплексного лечения, позволяет предотвратить или, по крайней мере, замедлить развитие осложнений, ведущих к ранней инвалидизации. Подтверждением этому является рост числа больных взрослого возраста, произошедший в мире за последние десятилетия (Donna L., et al. 1999; Brice P., et al. 2007; Erika J., et al. 2007; Southern K., et al. 2007; Castellani C., et al. 2009).

В России обследование новорожденных на МВ проводится не так давно-с июня 2006 года в рамках приоритетного проекта “Здоровье”. В нашей стране скрининг на МВ проводится по схеме ИРТ/ИРТ/потовый тест, с использованием в качестве биохимического маркера иммунореактивного трипсиногена. По данным европейского консенсуса неонатальная гипертрипсиногенемия в популяции обнаруживается с частотой 1 на 100-200 здоровых новорожденных. Кроме того, причиной повышения уровня ИРТ в крови новорожденных, помимо МВ, может быть ряд врожденных и наследственных патологий, таких как: внутриутробная гипоксия плода, внутриутробные инфекции, перинатальный стресс, незрелость плода, коньюгационная желтуха новорожденных, хромосомные перестройки и др., а также гетерозиготное носительство мутаций в гене CFTR, как следствие функциональной недостаточности поджелудочной железы (Scotet V., et al. 2001; Gomez Lira M., et al. 2001). Доля ложноотрицательных результатов скрининга с использованием различных протоколов обследования, не превышает 3% (данные по европейским странам).

Несмотря на небольшой срок существования программы неонатального скрининга на МВ в РФ (около 4,5 лет), в московском регионе за этот период диагностировано более шестидесяти детей. До настоящего времени оценку эффективности раннего выявления и последующего пресимптоматического лечения детей с МВ в России не проводили. С учетом этого были сформулированы цели и задачи настоящего исследования.

Целью данного исследования является оценка эффективности программы массового обследования новорожденных на МВ в России, на примере г. Москвы.

Задачи исследования:

1. Оценить достоверность метода двукратного определения концентрации иммунореактивного трипсиногена в плазме крови новорожденных (ИРТ/ИРТ), выбранного в качестве диагностического теста неонатального скрининга на МВ в РФ.

2. Сравнить протокол скрининга ИРТ/ИРТ со схемой ИРТ/ДНК, используемой при обследовании новорожденных на МВ в большинстве зарубежных стран.

3. Оценить клиническую эффективность неонатального скрининга на примере сравнения тяжести течения МВ у больных, выявленных по скринингу, и диагностированных по симптомам заболевания.

4. Изучить частоту мутаций в гене CFTR (CFTRdele2,3 (21kb), F508del, Idel507, 1677delTA, 2184insA, 2143delT, 2183AA>G, 2184delA, 394delTT, 3821delT, L138ins) в выборке новорожденных с высоким уровнем ИРТ после первого этапа неонатального скрининга.

муковисцидоз новорожденный массовое обследование

5. Рассчитать условную вероятность МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных с гипертрипсиногенемией после каждого из двух этапов обследования.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые в РФ дана оценка эффективности программы неонатального скрининга на МВ, проводимой в нашей стране по схеме ИРТ/ИРТ/потовый тест. Рассчитаны критерии достоверности протокола обследования: чувствительность и специфичность метода, предсказательная ценность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия, доля ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Научно обоснована необходимость ранней диагностики МВ, с последующим динамическим наблюдением вновь выявленных больных и проведением комплекса лечебно-профилактических мероприятий. Продемонстрированы особенности течения заболевания у пациентов, диагностированных в разном возрасте.

Предложен алгоритм обследования и наблюдения больных МВ, выявленных по неонатальному скринингу для внедрения в российские центры МВ.

Показано влияние гетерозиготного носительства мутантных аллелей гена CFTR на внешнесекреторную функцию поджелудочной железы у новорожденных.

Рассчитаны условные вероятности МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных с положительным скринингом после первого и второго этапов обследования, необходимые для медико-генетического консультирования российских семей группы риска по МВ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Протокол неонатального скрининга ИРТ/ИРТ, используемый в качестве диагностического теста на МВ в РФ, обладает высокой чувствительностью, не менее 96,77%, и специфичностью не менее 99,82%. Доля ложноположительных результатов после первого этапа обследования составляет 0,01035 (1: 97), при повторном определении уровня ИРТ в плазме крови новорожденных - снижается до 0,00178 (1: 558). Величина ожидаемых ложноотрицательных результатов метода не превышает 3% (0,03). Вероятность гипертрипсиногенемии после двукратного определения концентрации ИРТ (+LR) в 537 раз выше у детей с МВ, по сравнению со здоровыми детьми. Положительная предсказательная ценность (+PV) метода ИРТ/ИРТ равна 0,00332.

2. Метод двукратного определения ИРТ в крови новорожденных уступает протоколу ИРТ/ДНК по чувствительности (96,77% против 100%), большей вероятности ложноположительных (0,00178 против 0,000344) и ложноотрицательных показателей (0,03 против 0). Несмотря на это, является наиболее оптимальным для использования в РФ, с экономической точки зрения.

3. Определены особенности клинической картины МВ у больных, выявленных по неонатальному скринингу. По сравнению с больными, диагностированными по симптомам заболевания, для них, в большей мере, характерно хорошее самочувствие с оценкой по шкале Швахмана-Брасфильда более 70 баллов. К трем годам отмечены достоверно лучшие показатели рентгенологического индекса (p<0,05), достоверно меньшая частота обострений бронхолегочного процесса (p<0,05), обусловленная более редкой частотой высева патогенной микрофлоры (p<0,05); значимо меньшая частота декомпенсации кишечного синдрома (p<0,05); лучшие показатели физического статуса, включая массо-ростовой индекс (p>0,05).

4. Среди новорожденных с гипертрипсиногенемией после первого этапа скрининга на МВ, суммарная частота обнаруженных мутантных аллелей гена CFTR (F508del, CFTRdele2,3 (21kb), 2143delT, 2184insA, 3821delT), а также частота гетерозиготных носителей, достоверно выше тех же частот в российской популяции (0,0231 против 0,0068; p<0,05; 0,0358 против 0,0134 p<0,05).

5. Условная вероятность МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных c гипертрипсиногенемией после первого ИРТ - теста, составляет 1, 0,0345 и 0,0095, после повторного обследования - 0,78, 0,0067 и 0,0012 соответственно.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на Заседании диагностической группы Европейского общества МВ (Париж, Франция, 2010 год), Школе по МВ (Воронеж, 2010 год), 33-й Европейской конференции по МВ (Валенсия, Испания, 2010 год), на семинарах в научно-консультативном отделе МГНЦ РАМН. Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета МГНЦ РАМН 20 апреля 2011 года.

Личный вклад автора.

Автором проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Проведен подбор материала исследования: образцов высушенных пятен крови 1254 новорожденных с гипертрипсиногенемией, обследованных по скринингу на МВ в 2008 году. Выделение образцов ДНК из пятен крови выполнено автором лично; анализ частых мутаций в гене CFTR проведен совместно с сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ РАМН Петровой Н.В., Васильевой Т.А. Также автором лично сформированы клинические группы исследования, проведен анализ историй болезни, статистическая обработка полученных результатов; расчет критериев достоверности протоколов скрининга ИРТ/ИРТ, ИРТ/ДНК, расчет условной вероятности МВ, а также относительной частоты 11-ти частых мутаций в гене CFTR у новорожденных с гипертрипсиногенемией.

Описание собственных исследований, обработка и обсуждение результатов, формулировка выводов и подготовка статей к публикации выполнена автором самостоятельно.

Публикации

Основные результаты исследования представлены в 12 научных работах, в том числе в 3-х статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Текст работы изложен на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирован 22 таблицами, 6 рисунками и 7 схемами. Библиографический указатель включает 157 источников, из которых 130 иностранные.

Материалы и методы иследования

Оценка достоверности протоколов скрининга ИРТ/ИРТ, ИРТ/ДНК, проведена на основании расчетов качественных признаков: чувствительности, специфичности, предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов, отношения правдоподобия, а также, доле возможных ложноположительных и ложноотрицательных результатов, проведенных по общепринятой методике.

Проанализирована база данных пациентов, наблюдающихся в отделении МВ поликлиники ДГКБ№13 им. Н.Ф. Филатова (зав. отделением к. м. н. Шерман В. Д.). Сформированы две группы исследования. Первую группу составили 19 детей больных МВ (ср. возраст 3,8±0,08 лет), выявленных по неонатальному скринингу в 2006 - 2007 годах. Вторую группу составили 20 пациентов (ср. возраст 8,24±0,74 лет), у которых диагноз был заподозрен по клиническим проявлениям. Для достоверности сравнения оценивали течение заболевания в первые три года жизни детей в обеих группах. Основные критерии отбора, которых придерживались при составлении выборки, включали следующие пункты: возраст пациентов на момент исследования не менее трех лет; наличие медицинских сведений о пациенте до момента постановки диагноза МВ. Оценивали показатели физического статуса в возрасте одного, двух и трех лет жизни включительно; время появления первых симптомов заболевания; возраст установления диагноза и начала базисной терапии; частоту декомпенсации кишечного синдрома, характер и частоту обострений респираторного синдрома; результаты микробиологического исследования бронхиального секрета, данные рентгенологического индекса (РИ) и балльной оценки тяжести течения заболевания по шкале Швахмана-Брасфильда, в модификации С.В. Рачинского и Н.И. Капранова.

Для исключения возможного специфического влияния на клинические фенотипы больных мутаций различных классов, проведен анализ генотипов по гену CFTR. В обеих группах дефекты гена CFTR представлены т. н. "тяжелыми" мутациями I и II класса.

С целью определения частоты 11-ти частых мутаций в гене CFTR (CFTRdele2,3 (21kb), F508del, Idel507, 1677delTA, 2184insA, 2143delT, 2183AA>G, 2184delA, 394delTT, 3821delT, L138ins - 69,5% от всех мутантных аллелей у российских больных), частоты гетерозиготных носителей, и расчета условной вероятности МВ, носительства или не носительства мутантных аллелей гена CFTR среди новорожденных с гипертрипсиногенемией, а также для сравнения протоколов ИРТ/ИРТ и ИРТ/ДНК, проведен анализ образцов ДНК 1254 новорожденных с высоким ИРТ I - тестом. Все дети родились в 2008 году в г. Москве.

Выделение геномной ДНК из образцов пятен крови, нанесенных на фильтровальную бумагу, проведено с использованием набора реактивов Diatom^TM DNA Prop (ООО "Изоген") в соответствии с рекомендациями производителя. Анализ одиннадцати мутаций в гене CFTR проведен методом мультиплексной ПЦР с последующим анализом длин амплифицированных фрагментов ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения нуклеотидных замен проведен гидролиз амплифицированных фрагментов соответствующей рестриктазой. Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программы Excel Microsoft Office (“Microsoft”), Statistica 6.

Результаты и обсуждение

Оценка критериев достоверности протоколов неонатального скрининга на муковисцидоз.

Для оценки эффективности программы массового обследования новорожденных на МВ в г. Москве, нами проанализированы результаты скрининга за четыре с половиной года (2006-2010гг.), также рассчитаны показатели достоверности метода ИРТ/ИРТ. В г. Москве за этот период обследовано 557344 ребенка (табл.1).

Таблица 1. Итоги неонатального скрининга на муковисцидоз в г. Москве.

Характеристики	2006г.	2007 г.	2008 г.	2009 г.	2010 г.	Всего
Число обследованных, абс.	60372	109860	124772	125772	136568	557344
Положительный ИРТI, абс.	563	729	1 254	1 374	1851	5771
Положительный ИРТ II, абс.	52	100	179	259	467	1057
Потовый тест, абс.	36	71	133	193	333	766
Диагностированные случаи МВ, абс	7	15+1*	7+2*	17+1*	14	64
Частота	1: 8624	1: 6866	1: 13863	1: 6987	1: 9754	1: 8708

Примечание: * - ложноотрицательный скрининг

Повышение уровня ИРТ > 70 нг/мл на первом этапе скрининга отмечено у 5771 ребенка, при повторном обследовании на 23-27 сутки, гипертрипсиногенемия (ИРТ II>40нг/мл) сохранялась у 1057 детей, однако потовый тест проведен 766 (72,37%) новорожденным, т.к. в 27,63% случаев родители по тем или иным причинам отказались от дальнейшего обследования. В четырех случаях обнаружен ложноотрицательный результат. Двое детей выявлены при анализе частых мутаций в гене CFTR в образцах ДНК 1254 новорожденных с гипертрипсиногенемией, обследованных в 2008 году. Генотипы детей представлены мутациями I, II и V классов: CFTRdele2,3 (21kb) /CFTRdele2,3 (21kb), F508del / L138ins.

Еще двоим детям с отрицательным результатом скрининга (1-й ребенок 2007 г. р.: ИРТ I = 38,32нг/мл, L138 ins/?; 2-й ребенок 2009 г. р.: ИРТI = 32нг/мл, F508del/?), диагноз установлен в московском центре МВ в возрасте 6 месяцев и 1 года 5 месяцев по клинической картине заболевания, положительному потовому тесту и анализу ДНК.

Таким образом, частота МВ по г. Москве, рассчитанная за 4,5 года, составила 1: 8708. Однако, учитывая количество семей, отказавшихся от обследования (27,63%), а также долю ожидаемых ложноотрицательных результатов, предполагаем, что истинная частота заболевания по г. Москве может быть выше представленной (около 1: 6400).

При расчете критериев достоверности метода ИРТ/ИРТ после первого этапа обследования, чувствительность метода, оказалась равной 96,87%. Это означает, что практически все дети с гипертрипсиногенемией, будут обнаружены при проведении скрининга. Специфичность метода составила 98,97%, т.е. почти все дети с отрицательным результатом скрининга будут здоровы.

Таблица 2. Оценка достоверности протокола ИРТ/ИРТ после первого этапа скрининга.

	Наличие признака (МВ)	Отсутствие признака (МВ)
ИРТ I > 70 нг/мл	a = 62	b = 5709	a+b= 5771	+PV=a/ (a+b) = 0,0107
ИРТ I < 70 нг/мл	c = 2	d = 557344-5771-2=551571	c+d= 551573	-PV=c/ (c+d) = 0,0000036
	Se=a/ (a+c) =62/64= 0,9687	Sp= d/ (b+d) = 551571/557280= 0,9897	a+b+c+d=557344
	ЛО=с/ (а+с) =2/64=0,03125	ЛП=b/ (b+d) = 5709/557280= 0,01035
	+LR= Se/ (1-Sp) 0,9687/0,0103= 94,04	-LR= (1-Se) /Sp =0,016/0,9897= 0,0316	P = (a+c) / (a+b+c+d) = 0,00011483

После первого этапа скрининга ложноотрицательное снижение уровня ИРТ выявлено у двоих детей, диагностированных позже по клинической картине заболевания, положительному потовому тесту и анализу ДНК. Доля ложноположительных результатов составила 0,01035 (1: 97) (табл.2). Так как повышение концентрации ИРТ (>70 нг/мл) может быть выявлено у детей с функциональной недостаточностью поджелудочной железы, для уменьшения доли ложноположительных результатов, рекомендовано использовать отсекающие значения, которые для повторного ИРТ - теста составляют 40 нг/мл. Так, доля ложноположительных результатов на ретесте снизилась, и составила 0,00178 (1: 558) (табл.3).

На втором этапе скрининга ложноотрицательное снижение уровня ИРТ, также выявлено у двоих детей.

Таким образом, доля ложноотрицательных результатов после каждого из последовательно проведенных этапов не превышает 3%, что сопоставимо с зарубежными данными.

Чувствительность метода на ретесте практически не изменилась (96,77%), специфичность приблизилась к 100%. Как известно, чем специфичнее диагностический метод, тем выше предсказательная ценность его положительного результата, что и получено (табл.3). Отношение правдоподобия положительного результата после повторного исследования концентрации ИРТ, также увеличилось более чем в 5 раз.

Таблица 3. Оценка достоверности протокола ИРТ/ИРТ после второго этапа скрининга.

	Наличие признака (МВ)	Отсутствие признака (МВ)
Положительный тест: ИРТI>70нг/мл ИРТII>40нг/мл	a = 60	b = 1057-60= 997	a+b= 1057	+PV= a/ (a+b) = 0,0567
Отрицательный тест: ИРТI>70нг/мл ИРТII<40нг/мл	с = 4-2*= 2	d =557344-1057-1-3 =556283	c+d= 556285	-PV= c/ (c+d) = 0,0000035
	Se=a/ (a+c) = 0,9677	Sp=d/ (b+d) =0,9982	P = 0,0001112
	с/ (а+с) =2/62=0,03	b/ (b+d) = 0,00178
	+LR=Se/ (1-p) =537	-LR= (1-Se) /Sp= 0,0323

Примечание: * - ложноотрицательный скрининг с ИРТI<70нг/мл.

Третьим этапом всех протоколов неонатального скрининга на МВ является потовая проба. Чувствительность и специфичность метода составляют не менее 95,31% и 100% соответственно, вероятность ложноположительных результатов равна нулю. Однако не исключена вероятность ложноотрицательных значений. На данном этапе обследования выявлены трое детей, больных МВ, с отрицательной потовой пробой (табл.4).

Таблица 4. Критерии достоверности протокола ИРТ/ИРТ, потовый тест после каждого из трех этапов обследования.

Показатели	ИРТ I	ИРТ II	Потовый тест
Ложноотрицательные значения	0,03 (1: 31)	0,03 (1: 31)	0,04 (1: 21)
Ложноположительные значения	0,01035 (1: 97)	0,00178 (1: 558)	0
Чувствительность (Se)	0,9687	0,9677	0,9531
Специфичность (Sp)	0,9897	0,9982	1,0
Предсказательная ценность положительная (+PV)	0,0107	0,0567	1,0
Отношение правдоподобия (likelihood ratio, LR+)	94: 1	537: 1	-

Однако можно предположить, что причиной ложноотрицательного теста, в данном случае, является, обнаруженная у двоих из этих детей, мутация 3849+10kbC>T, которая согласно литературным данным, зачастую ассоциируется с остаточной функцией хлорного канала, и как следствие, нормальным уровнем хлоридов пота.

При сравнении метода ИРТ/ИРТ с протоколом ИРТ/ДНК установлено, что протокол ИРТ/ДНК обладает высокой чувствительностью, не менее 100% и специфичностью порядка 99,96%. Вероятность наличия заболевания (+PV) при положительном результате ИРТ/ДНК теста, оказалась выше, по сравнению с двукратным определением концентрации ИРТ в плазме крови новорожденных (табл.5). Однако, вероятность получения положительного результата скрининга при наличии МВ у новорожденного (+LR), выше при обследовании по схеме ИРТ/ИРТ, по сравнению с ИРТ/ДНК, более чем в пять раз (555: 1 против 100:

1). Т.е. обнаружение даже одной мутации в генотипе, не подтверждает диагноза, и требует проведения дальнейших диагностических мероприятий.

Не выявлено значимых отличий по частоте ложноотрицательных результатов. Но доля ложноположительных результатов после двухэтапного обследования, достоверно выше при проведении ИРТ/ИРТ - теста, по сравнению с ИРТ/ДНК (1: 725 против 1: 2901, p<0,05) (табл.5).

Таблица 5. Сравнительная оценка протоколов ИРТ/ИРТ и ИРТ/ДНК по данным неонатального скрининга на МВ, проводимого в Москве в 2008 году.

	ИРТ/ИРТ	ИРТ/ДНК
Se (sensitivity)	0,7778	1
Sp (specificity)	0,9986	0,9996
+PV (positive prevalent value)	0,039	0,173
-PV (negative prevalent value)	0,000016	0
LR+ (likelihood ratio positive)	555: 1	100: 1
LR - (likelihood ratio negative)	0,22	0
Частота ЛП№ результатов	0,00137 (1: 725)	0,000344 (1: 2901)
Частота ЛОІ результатов	0,22	0

Примечание: ЛП№ - ложноположительный, ЛОІ - ложноотрицательный

Оценка клинической эффективности программы неонатального скрининга на МВ

Для определения клинической эффективности неонатального скрининга, проведен сравнительный анализ течения МВ в двух группах. В первую группу вошли 19 больных МВ, выявленных по скринингу в 2006-2007 годах. Вторую группу составили 20 пациентов, диагностированных по клиническим симптомам заболевания. Сроки установления диагноза, ожидаемо достоверно отличались в обеих группах: в первой группе (n=19) средний возраст составил 2 месяца, во второй группе (n=20) - 1,5 года (0,177±0,026 года против 1,469 ± 0,281 года; р<0,001). Возраст появления первых клинических симптомов МВ, в обеих группах достоверно не отличался (0,155 ± 0,037 года и 0,251 ± 0,113 года, p=0,87) (табл.6). Однако первые признаки заболевания у детей группы скрининга, выявлены в самом дебюте, ввиду наблюдения и обследования в специализированном центре с первых месяцев жизни (табл.6). Именно поэтому, средний возраст начала базисной терапии МВ (терапия панкреатическими ферментами, муколитическая и бронхолитическая, антибиотикотерапия, витаминотерапия, кинезитерапия) у детей в первой группе достоверно меньше, по сравнению с тем же показателем у детей второй группы (0,449±0,17 года против 1,768±0,47 года, p=0,002) (табл.6).

Таблица 6. Оценка статистической значимости различий (р) возраста проявлений признаков в исследуемых группах.

Признак	ГруппаI	ГруппаII	p
Возраст первых клинических проявлений болезни (годы)	0,155±0,037	0,251±0,113	0,87
Возраст постановки диагноза (годы)	0,177±0,026	1,469±0,281	0,000002
Возраст манифестации кишечного синдрома (годы)	0,14 ± 0,04	0,37 ± 0,1	0,25
Возраст манифестации респираторного синдрома (годы)	0,28 ±0,046	0,49 ± 0,16	0,5
Возраст регистрации первого высева Ps. аeruginosa (годы)	1,39 ± 0,33	2,26 ± 0,28	0,09
Возраст регистрации первого высева St. aureus (годы)	1,06 ± 0, 19	1,58 ± 0,24	0,07
Возраст начала специфического лечения (годы)	0,449±0,17	1,768±047	0,002

В обеих наблюдаемых группах МВ преимущественно манифестировал появлением кишечного синдрома (у 72% детей). В группе I - отставанием в весе, незначительной стеатореей, но достаточно сохранной внешнесекреторной функцией поджелудочной железы, о чем свидетельствовал высокий уровень панкреатической эластазы у большинства детей (у 62%). Респираторный синдром манифестировал появлением сухого затяжного кашля.

В группе II, к моменту установления диагноза, у всех детей наблюдалась декомпенсация кишечного синдрома (стеаторея, полифекалия, плохая прибавка в весе), т.к. большинство из них до установления диагноза не получали адекватной заместительной терапии, в том числе панкреатическими ферментами. Бронхолегочные проявления также носили более тяжелый характер. У 74% детей из группы II в анамнезе отмечены неоднократные госпитализации по причине рецидивирующего бронхообструктивного синдрома (у 15%), бронхопневмоний (у 25%), ателектазов (у 5%).

Одним из критериев оценки тяжести течения заболевания является частота рецидивов кишечного и респираторного синдромов. Анализ клинических данных показал, что частота декомпенсации кишечного синдрома в первые три года жизни, как и частота обострений патологического процесса со стороны легких, выше у детей с поздней верификацией диагноза (p<0,05) (табл.7).

Таблица 7. Оценка статистической значимости различий (р) в частоте проявлений признаков в обеих группах больных МВ.

Клинические данные	Возраст	Средние значения показателя	p
		в группе I (n=19)	в группе II (n=20)
Частота декомпенсации кишечного синдрома	на 1-м году	0,71±0,21	2,11±0,43	0,02
	на 2-м году	0,38±0,22	1,7±0,34	0,04
	на 3-м году	0,37±0,13	0,82±0,21	0,07
Частота обострений респираторного синдрома	на 1-м году	1,87±0,22	3,06±0,49	0,01
	на 2-м году	1,59±0,25	3,5±0,43	0,01
	на 3-м году	1,6±0,27	2,6±0,30	0,07

Как известно, прогрессирование заболевания легких у больных МВ в значительной мере обусловлено хронической респираторной инфекцией.

К трем годам микробиологический статус пациентов из первой группы был представлен хронической стафилококковой (S. aureus) инфекцией у 68%, хронической синегнойной (Ps. aeruginosae) инфекцией у 5,3% больных. У 5% при исследовании бронхиального секрета периодически высевалась стенотрофомонас мальтофилия (St. maltophilia).

Во второй группе все дети к трем годам имели хроническую обсемененность легких патогенной флорой, представленной у большинства (у 75%) золотистым стафилококком, синегнойной палочкой (31%). У 16% больных имела место комбинированная хроническая синегнойная и стафилококковая инфекция, 20% детей высевали St. maltophilia, у одного ребенка в анамнезе - хроническое инфицирование легких возбудителем буркхолдерия цепация (B. cepacia).

В группе II высев синегнойной палочки Ps. aeruginosae отмечен у большего процента больных (p>0,05), однако возраст регистрации первого высева Ps. aeruginosae меньше в группе I (1,39±0,33года и 2,26±0,28 года; p=0,09) (табл.6). Возможно, это является следствием более ранней диагностики и комплексного обследования детей, диагностированных по скринингу. Но не исключена вероятность перекрестного инфицирования детей, при посещении центра МВ, а значит и более раннего контакта с тяжелой патогенной флорой.

Для оценки физического статуса у детей обеих групп рассчитан и проведен сравнительный анализ показателей массы тела, роста, массо-ростового индекса (МРИ) на момент рождения, в возрасте 1 года, 2-х и 3-х лет жизни включительно (табл.8.).

Таблица 8. Сравнительная оценка показателей физического статуса у больных МВ в зависимости от возраста наблюдения.

Возраст	Показатель	Средние значения показателя	p
		в группе I	в группе II
При рождении	Масса (% от нормы)	98,16±1,67	93,37±2,96	0,17
	Рост (% от нормы)	101±0,67	100,76±1,41	0,87
	МРИ (%)	93,00±1,35	88,0 ±2,08	0,07
Один год	Масса (% от нормы)	93,97±1,86	91,02±3,37	0,43
	Рост (% от нормы)	100,16±1,05	100,33±2,04	0,94
	МРИ (%)	96,11±1,77	93,33±5,61	0,55
Два года	Масса (% от нормы)	96,84±2,33	95,47±3,77	0,75
	Рост (% от нормы)	100,17±0,78	98,87±1,79	0,50
	МРИ (%)	98,63±1,78	100,56±2,2	0,35
Три года	Масса (% от нормы)	97,55±2,55	92,97±3,42	0,29
	Рост (% от нормы)	100,2±0,77	99,65±1,81	0,77
	МРИ (%)	98,88±2,23	95,31±1,96	0,55

Не было получено статистически достоверных отличий по антропометрическим показателям у пациентов обеих групп. Однако тенденция к более выраженным нарушениям по массе отмечена у детей из группы II. Доля больных МВ с уровнем МРИ ниже возрастной нормы, в группе II также преобладала по сравнению с группой I.

При оценке тяжести течения заболевания в обеих выборках по шкале Швахмана - Брасфильда, к возрасту трех лет, состояние всех детей группы I расценено как хорошее (со средней оценкой по шкале свыше 70 баллов). Больные характеризовались хорошей прибавкой в весе, компенсированным кишечным синдромом и редкими респираторными эпизодами. Рентгенологический индекс (РИ) в среднем составил 4,8±2,74 из 38 баллов.

В группе II к трем годам только у 16,7% детей состояние здоровья расценено как хорошее. У 75% больных отмечено среднетяжелое течение МВ (41-55 баллов), у 8,3% - тяжелое течение МВ, с оценкой по шкале Швахмана - Брасфильда менее 40 баллов. У этих больных отмечено двустороннее поражение лёгких с развитием выраженной дыхательной недостаточности, симптомы панкреатической недостаточности, нарушения нутритивного статуса. РИ по группе к трем годам составил 12,41±2,87 баллов, что достоверно хуже по сравнению с группой I (p<0,05) (табл.9).

Таблица 9. Оценка статистической значимости различий (р) в показателях рентгенологического индекса (в баллах) у детей обеих групп.

РИ	Группа I	Группа II	p
На 1-м году жизни	7,0±4,30	11,36±2,57	0,013
На 2-м году жизни	6,36±2,33	11,25±2,91	0,0008
На 3-м году жизни	4,85±2,74	12,41±2,87	0,000000

Для оценки частоты встречаемости одного из ранних осложнений МВ, синдрома потери солей (псевдо-Барттера синдром), при котором, в случае отсутствия своевременной терапии возможен летальный исход, проанализированы истории болезни всех 64-х детей, выявленных по неонатальному скринингу с 2006 по 2010 годы и наблюдающихся в московском центре МВ. Данное осложнение зафиксировано у 28 (43%) из 64 детей, преимущественно, на первом году жизни. Благодаря систематическому наблюдению и обследованию, гипоэлектролитемия у всех детей вовремя диагностирована, летальных исходов по причине с-ма псевдо-Барттера в московском центре МВ не зафиксировано.

Анализ мутаций в гене CFTR у новорожденных группы риска по МВ.

Для выполнения следующей задачи проанализировано 1254 пар хромосом. Мутации обнаружены у 52 индивидов: в 45 случаях - в гетерозиготном, а в 7 случаях - в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии (табл.10).

Таблица 10. Генотипы 1254 новорожденных, проскринированных на 11 частых мутаций в гене CFTR.

Генотипы	Количество
2143delT/n	2
2184insA/n	2
3821delT/n	1
CFTRdele2,3 (21kb) /CFTRdele2,3 (21kb)	1
CFTRdele2,3 (21kb) /n	6
F508del/2184insA	1
F508del/3821delT	1
F508del/F508del	3
F508del/L138ins	1
F508del/n	32
L138ins/n	2
n/n	1202

Примечание: n - мутации не обнаружены.

Таким образом, из обследованных 2508 хромосом, выявлены 58 мутантных аллелей гена CFTR, что составляет 0,0231, частота гетерозиготных носителей в выборке детей с гипертрипсиногенемией равна 0,0358. В лаборатории генетической эпидемиологии МГНЦ РАМН, проведена оценка тех же частот в российских популяциях. Частота мутантных аллелей гена CFTR оказалась равной 0,0068 (p<0,05). Частота гетерозигот - 0,0134 (p<0,05).

Суммарная частота обнаруженных мутантных аллелей гена CFTR (F508del, CFTRdele2,3 (21kb), 2143delT, 2184insA, 3821delT) и частота гетерозиготных носителей среди новорожденных с гипертрипсиногенемией после первого ИРТ-теста, достоверно выше тех же частот в российской популяции (p=0,0000045 и p=0,000288, соответственно). Данный результат согласуется с мнением ряда исследователей о том, что гипертрипсиногенемия у новорожденных в первые месяцы жизни, может быть обусловлена и гетерозиготным носительством мутаций в гене CFTR, как следствие нарушения внешнесекреторной функции поджелудочной железы (Scotet V., De Braekeleer M., Audrйzet M. P., et al. 2001).

Расчет условной вероятности МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных группы риска.

Результаты анализа частых мутаций в гене CFTR использованы при расчете условной вероятности МВ у новорожденных с положительным скринингом. Предполагая равновесие Харди-Вайнберга, частота МВ среди 124772 новорожденных, обследованных в 2008 году, составила 1: 13680. С учетом полученной величины, рассчитана частота мутантных аллелей гена CFTR (q=0,0085), и частота гетерозиготных носителей (2pq=0,0168); а также число носителей (2096 (=0,0168 • 124772)) и не носителей (122667 (=124772-9-2096)) мутаций в гена CFTR в выборке 124772 обследованных новорожденных, а также в выборке 1254 новорожденных с гипертрипсиногенемией после первого ИРТ-теста (~72 (=50•1/0,695) и ~1173 (=1254-9-72)).

На основании полученных данных рассчитана вероятность, что новорожденный с первым положительным ИРТ поражен МВ, является носителем или не является носителем мутантных аллелей гена CFTR: 1 (=9/9), 0,0345 (=72/2096) и 0,0095 [=1173/ (124772-9-2096) =1173/122667].

По такому же принципу рассчитана условная вероятность МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных с гипертрипсиногенемией после второго ИРТ-теста (0,78 [=7/9], 0,0067 [=14/2096] и 0,0012 [=158/122667]).

Полученные величины можно использовать в теореме Байеса, как условные вероятности при расчете риска МВ у новорожденного с положительным ИРТ тестом после первого и второго этапов скрининга.

Выводы

1. Оценка эффективности программы неонатального скрининга на муковисцидоз показала, что протокол скрининга ИРТ/ИРТ обладает высокой чувствительностью, не менее 96,77%, и специфичностью не менее 99,82%. Доля ложноположительных результатов скрининга составляет 0,00178 (1: 558), величина ложноотрицательных результатов после каждого из двух последовательно проведенных этапов не превышает 3 % (0,03). Отношение правдоподобия положительного результата теста (+PV) равно 537:

2. 1. Положительная предсказательная ценность (+PV) метода ИРТ/ИРТ составляет 0,00332.

3. Показано, что метод двукратного определения ИРТ в крови новорожденных отвечает требованиям достоверности, но уступает протоколу ИРТ/ДНК по чувствительности (96,77% против 100%); большей вероятности ложноположительных (0,00178 против 0,000344) и ложноотрицательных показателей (0,03 против 0). Несмотря на это, является оправданным для использования в РФ с экономической точки зрения.

4. Определены особенности клинической картины МВ у больных, выявленных по неонатальному скринингу. По сравнению с больными, диагностированными по симптомам заболевания, для них, в большей мере, характерно хорошее самочувствие с оценкой по шкале Швахмана-Брасфильда более 70 баллов. К трем годам отмечены достоверно лучшие показатели рентгенологического индекса (p<0,05), достоверно меньшая частота обострений бронхолегочного процесса (p<0,05), обусловленная более редкой частотой высева патогенной микрофлоры (p<0,05); значимо меньшая частота декомпенсации кишечного синдрома (p<0,05); лучшие показатели физического статуса, включая массо-ростовой индекс (p>0,05).

5. Суммарная частота обнаруженных мутантных аллелей гена CFTR (F508del, CFTRdele2,3 (21kb), 2143delT, 2184insA, 3821delT) и частота гетерозиготных носителей среди новорожденных с гипертрипсиногенемией после первого ИРТ-теста, достоверно выше тех же частот в российской популяции (0,0231 против 0,0068; p<0,05; 0,0358 против 0,0134 p<0,05), что подтверждает влияние гетерозиготного носительства мутаций в гене CFTR на внешнесекреторную функцию поджелудочной железы.

6. Условные вероятности МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных с гипертрипсиногенемией после первого этапа неонатального скрининга на МВ составили: 1, 0,0345 и 0,0095, после второго этапа обследования: 0,78, 0,0067 и 0,0012, соответственно. Полученные величины необходимо учитывать при проведении медико-генетического консультирования российских семей группы риска по МВ.

Практические рекомендации

1. Учитывая отсутствие значимых отличий протоколов неонатального скрининга ИРТ/ИРТ и ИРТ/ДНК, отсутствие необходимости получения информированного согласия от родителей при обследовании новорожденного по схеме ИРТ/ИРТ (что имеет место при ДНК-диагностике), а также экономическую выгоду последнего, данный протокол является наиболее оптимальным для использования в РФ.

2. В случае высоких показателей ИРТ после двух, последовательно проведенных этапов скрининга, новорожденным с гипертрипсиногенемией рекомендовано обязательное двукратное проведение потового теста разными методами (определение проводимости электролитов на аппарате Nanoduct и концентрации хлоридов в потовой жидкости классическим биохимическим методом по Гибсону-Куку). При отрицательном результате потовой пробы - динамическое наблюдение в центре МВ с повторной консультацией в возрасте 1 года.

3. Для уменьшения количества семей, отказывающихся от обследования на разных этапах скрининга, зачастую, из-за неквалифицированного информирования родителей ребенка о важности проводимо обследования, рекомендовано разработать информационные бюллетени для медицинского персонала детских городских поликлиник (ДГП), а также для родителей, с кратким описанием заболевания, этапов неонатального скрининга, с указанием контактных данных специализированных центров, где желающие смогут получить квалифицированную консультацию по интересующим вопросам.

4. Предложенный алгоритм комплексного обследования и ведения больных МВ, выявленных по неонатальному скринингу, рекомендован для использования в центрах МВ. (Рис.1).

5. Рекомендован изолированный амбулаторный прием (в условиях боксированного отделения) пациентов с разными видами патогенной флоры, для исключения перекрестного инфицирования и раннего контакта вновь выявленных детей с тяжелой инфекцией.

6. Полученные в ходе исследования условные вероятности МВ, носительства или не носительства мутаций в гене CFTR у новорожденных с высоким уровнем ИРТ I и II, рекомендованы для использования при медико-генетическом консультировании российских семей группы риска по заболеванию.



Рис.1. Алгоритм обследования и наблюдения больных МВ, выявленных по неонатальному скринингу

Список публикаций теме диссертации

1. Шерман В.Д., Кусова З.А., Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. Массовый скрининг на муковисцидоз в Москве // Сборник материалов IX Национального конгресса по муковисцидозу ”Муковисцидоз у детей и взрослых-2009”. - Москва. - 2009. - С.91-92.

2. Кусова З.А., Петрова Н.В., Васильева Т.А., Каширская Н.Ю., Зинченко Р.А., Капранов Н.И. Результаты массового скрининга новорожденных на муковисцидоз в Москве // Вопросы современной педиатрии. - 2010. - Т.9, №6. - С.26-30.

3. Кусова З.А., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Неонатальный скрининг на муковисцидоз // Медицинская генетика. - 2010. - Т.9. - С.36-40.

4. Кусова З.А., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Особенности массового скрининга новорожденных на муковисцидоз. // Российский медицинский журнал. - 2010. - Т.18. - №5. - С.265-269.

5. Z.A. Kusova, N.V. Petrova, N.Y. Kashirskaya, N.I. Kapranov. Analysis of CFTR mutations in Russian newborns with first positive IRT test. CF newborn screening efficacy and diagnostic outcomes. // Materials of the 33th ECFS Conference, Valencia, Spain 16-19 June 2010. The Journal of Cystic Fibrosis. - 2010. - P. S8.

6. Петрова Н.В., Кусова З.А., Васильева Т.А., Тимковская Е.Е., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Зинченко Р.А. Анализ мутаций в гене CFTR и расчет риска муковисцидоза у новорожденных с гипертрипсиногенемией из Москвы // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. - 2010. - С.139-140.

7. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю., Ходунова А.А., Кусова З.А. Актуальность проблемы муковисцидоза // Материалы VI Съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. - 2010. - С.80

8. Каширская Н.Ю., Капранов Н.И., Кусова З.А., Шелепнева Н.Е. Поражение поджелудочной железы при муковисцидозе // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология - Москва. - 2010. - №8. - C.98-105.

9. Кусова З.А., Каширская Н.Ю., Капранов Н.И. Особенности массового скрининга новорожденных на муковисцидоз. // Пульмонология детского возраста: Проблемы и решения. - 2010. - С.107-113.

10. Petrova N.V., Kusova ZA, Vasilyeva T. A., Timkovskaya E. E. Kashirskaya N. Y., Kapranov N.I., Zinchenko R. A. Analysis of CFTR mutations in hypertrypsinogenemic newborns in Russian population. // Abstracts of the 33rd European Cystic Fibrosis Conference, 16 - 19 June 2010, Valencia, Spain. - Eur. J. Cyst. Fibr., V.9. - Suppl.1. - P. S9.

11. Тимковская Е.Е., Каширская Н.Ю., Кусова З.А., Петрова Н.В. Анализ полиморфизма генов TNFA, LTA, eNOS, GSTM1, MBL2, ADR2 и HFE у больных муковисцидозом // Материалы IX Национального конгресса по муковисцидозу "Муковисцидоз у детей и взрослых - 2009". - Москва. - 2009. - С.77.

12. Petrova N.V., Kusova Z.A., Vasilyeva T.A., Timkovskaya E.E., Kashirskaya N.Y., Kapranov N.I., Zinchenko R.A. CFTR mutations in newborns with hypertrypsinogenemia in Russian population // European Conference of Human Genetics 2010, June 12 - 15, 2010, Gothenburg, Sweden. - Eur. J. Hum. Genet. - 2010. - V.18. - Suppl.1. - P.309. - P12.043.

Список сокращений

ИРТ МВ МРИ НС РИ Э1 CF CFTR LR PV Se Sp	Иммунореактивный трипсин Муковисцидоз Массо-ростовой индекс Неонатальный скрининг Рентгенологический индекс Эластаза 1 фекальная Cystic fibrosis Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator Отношение правдоподобия (Likelihood ratio) Предсказательная ценность (Predictive value) Чувствительность метода (Sensitivity) Специфичность метода (Specificity)

Размещено на Allbest.ru

...