Общие закономерности метаболических расстройств при гипоксии различного генеза и патогенетическое обоснование принципов их медикаментозной коррекции

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Общие закономерности метаболических расстройств при гипоксии различного генеза и патогенетическое обоснование принципов их медикаментозной коррекции

14.00.16 - патологическая физиология

кандидата медицинских наук

Бизенкова Мария Николаевна

Саратов, 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Чеснокова Нина Павловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Пучиньян Даниил Миронович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «___»________2008 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан «___»__________2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Кодочигова А.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Как известно, гипоксические состояния осложняют течение многих заболеваний различного генеза, являясь важнейшей составляющей самых разнообразных нозологических форм патологии, включающих такие типовые патологические процессы, как воспаление, лихорадка, шок, ДВС-синдром и др. (Чазов Е.И., 1992; Шевченко Ю.Л., 2000; Ливанов Г.А. и соавт., 2002; Окороков А.И., 2003, 2004; Беленков Ю.Н., Оганов Р.Г., 2007; Янковская Л.В., Зинчук В.В., Лис М.А., 2007).

Несмотря на очевидные различия в пусковых механизмах формирования гипоксии экзогенного или эндогенного происхождения, метаболические сдвиги в условиях дефицита кислорода в биологических системах в значительной мере стереотипны (Шепелев А.П. и соавт., 2000; Ляхович В.В. и соавт., 2005; Шулутко Б.И., Макаренко С.В., 2005; Шевченко Н.М., 2006; Balaban R.S., 2006; Espey M.G., 2006; Vo T.D., Palsson B.O., 2007).

Среди механизмов, приводящих к повреждению биологических мембран клеток в условиях гипоксии, необходимо выделить активацию свободнорадикального окисления липидов, белков, нуклеиновых кислот (Николаев С.М. и соавт. 1997; Зайцев В.Г., Закревский В.И., 1998; Лапкин В.З. и соавт. 2001; Голиков А.П. и соавт., 2003; Luczaj W., Skrzydlewska E., 2006; Stadtman E.R., 2006; Yoshida Y, Niki E., 2006).

До настоящего времени не проводилась сравнительная оценка характера метаболических сдвигов в миокарде и структурах головного мозга при различных видах системной и локальной гипоксии; не установлена патогенетическая взаимосвязь активации процессов липопероксидации - одного из эфферентных звеньев развития гипоксии - с характером энергетического обеспечения клеток различных органов и тканей (Максименко А.В., 1993; Косолапов В.А. и соавт., 1994; Костюченко А.П., 1998; Chang C.Y. et al., 2006). В связи с этим очевидно, что, несмотря на широкие возможности применения разнообразных по месту приложения действия антиоксидантов и антигипоксантов, до настоящего момента отсутствует систематизация данных относительно патогенетического обоснования эффективности и целесообразности экстренного применения тех или иных способов медикаментозной коррекции расстройств метаболизма в структурах миокарда и головного мозга при острой гипоксии различного генеза (Коваленко А.Л., Белякова Н.В., 2000; Бульон В.В. и соавт., 2002; Зарубина И.В., 2002; Коровина Н.А., Рууге Э.К., 2002; Murakami A, Ohigashi H., 2006; Wassmann S. et al., 2006). Последнее определило цель и задачи данного диссертационного исследования.

Цель работы: изучить общие закономерности и особенности метаболических расстройств при острой гипоксической и циркуляторной гипоксии; патогенетически обосновать эффективность применения субстратных и регуляторных антигипоксантов, антиоксидантов при локальной ишемии миокарда и структур головного мозга, а также при системной циркуляторной и гипоксической гипоксии.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку системных и локальных метаболических сдвигов при гипоксической и циркуляторной гипоксии экзогенного происхождения, а также при локальной циркуляторной гипоксии эндогенного происхождения.

2. Исследовать состояние процессов липопероксидации и активности антиоксидантной системы крови и гомогенатов головного мозга мышей при острой системной экзогенной гипоксической гипоксии. Установить патогенетическую взаимосвязь между степенью накопления продуктов липопероксидации в крови и гомогенатах мозга, а также продолжительностью жизни экспериментальных животных в условиях острой экзогенной гипоксической гипоксии; выявить возможности медикаментозной коррекции метаболических расстройств и сроков увеличения продолжительности жизни экспериментальных животных.

3. Установить закономерности вторичных неспецифических расстройств при экспериментальной системной циркуляторной гипоксии на модели эндотоксинового шока; сопоставить состояние процессов липопероксидации и антирадикальной защиты клеток при системной гипоксической и циркуляторной гипоксии; выявить возможности медикаментозной коррекции метаболического статуса при циркуляторной гипоксии.

4. Провести сравнительную оценку интенсивности процессов липопероксидации, активности антиоксидантной системы в гомогенатах ишемизированного мозга в условиях острой локальной гипоксии и реперфузии мозга по общепринятым показателям содержания промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, активности ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы. Установить взаимосвязь недостаточности антирадикальной защиты тканей головного мозга и их энергообеспечения, а также возможности медикаментозной коррекции метаболического статуса.

5. Изучить состояние процессов липопероксидации, активности антиоксидантной системы миокарда и характер его энергообеспечения в динамике острой локальной ишемии и сопоставить их с системными метаболическими сдвигами по интегративным показателям содержания в крови промежуточных продуктов перекисного окисления липидов, по активности антиоксидантной системы.

6. Патогенетически обосновать возможности медикаментозной коррекции интенсификации процессов липопероксидации, недостаточности антирадикальной защиты клеток крови и миокардиоцитов, а также их энергообеспечения при острой локальной ишемии миокарда с использованием антигипоксантов и макроэргических соединений.

7. На основе изучения патогенеза метаболических расстройств и выявления общих закономерностей активации процессов липопероксидации, недостаточности антирадикальной защиты клеток при острой локальной и системной гипоксии различного генеза выявить наиболее чувствительные диагностические и прогностические критерии тяжести вторичных неспецифических метаболических расстройств при гипоксических состояниях, эффективность использования антиоксидантов, антигипоксантов.

Положения, выносимые на защиту:

1. В различных вариантах моделирования острой гипоксии на животных разной видовой принадлежности: при локальной ишемии структур миокарда и головного мозга, системной гипоксической и циркуляторной гипоксии установлены общие закономерности метаболических сдвигов в виде активации процессов липопероксидации, недостаточности ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы крови, а также тканей миокарда, коры головного мозга.

2. В экспериментах на белых мышах, спустя 30 мин с момента развития острой системной гипоксической гипоксии экзогенного характера, обнаружены активация процессов липопероксидации и недостаточность антиоксидантной системы крови, гомогенатов головного мозга, которые носят обратимый характер и могут быть депотенцированы при использовании антиоксидантов - оксибутирата натрия, цитофлавина, реамберина. Метаболические эффекты в гомогенатах коры головного мозга при использовании оксибутирата натрия более выражены по сравнению с влиянием цитофлавина. Системные метаболические сдвиги при острой экзогенной гипоксической гипоксии обратимы: оптимальный эффект достигнут при использовании цитофлавина, реамберина.

3. В динамике системной циркуляторной гипоксии на модели эндотоксинового шока обнаружены одномоментное возрастание уровня промежуточных продуктов липопероксидации в крови и гомогенатах миокарда, недостаточность ферментного звена антиоксидантной системы, антирадикальной защиты клеток крови и миокардиоцитов, а также увеличение содержания в крови молекул средней массы (МСМ). Достигнуты положительные метаболические эффекты при использовании цитофлавина.

4. В опытах на белых крысах с экспериментальной ишемией головного мозга, достигаемой частичным ограничением мозгового кровотока, обнаружены интенсификация процессов липопероксидации, недостаточность уровня восстановленного глутатиона, коррелирующие с усилением гликолиза и подавлением активности сукцинатдегидрогеназы, - одного из важнейших ферментов цикла Кребса. Спустя сутки с момента реперфузии ишемизированного мозга не выявлено нормализации энергообеспечения и интенсивности свободнорадикального окисления в гомогенатах мозга. Спустя 3 суток с момента реперфузии мозга отмечена дальнейшая активация процессов липопероксидации на фоне истощения системы антирадикальной защиты клеток.

5. Выявлена возможность депотенцирования метаболических расстройств в гомогенатах головного мозга при локальной ишемии мозга, а также в динамике развития реперфузионного синдрома при использовании пирацетама и цитофлавина. Эффекты цитофлавина на интенсивность гликолитических реакций в указанной модели эксперимента были более выражены по сравнению с влиянием пирацетама.

6. В динамике острой ишемии миокарда отмечены одномоментное увеличение содержания продуктов липопероксидации и снижение уровня восстановленного глутатиона в гомогенатах миокарда и сыворотке крови, коррелирующие с подавлением активности супероксиддисмутазы гомогенатов миокарда. Активность ферментного звена антиоксидантной системы крови претерпевает фазные изменения: на ранней стадии ишемии возникает активация супероксиддисмутазы и каталазы сыворотки крови, как одного из проявлений синдрома цитолиза, сменяющаяся подавлением этих ферментов на более поздних стадиях ишемии. Установлена патогенетическая взаимосвязь активации свободнорадикального окисления в ишемизированном миокарде с прогрессирующим снижением содержания АТФ, креатинфосфата, подавлением активности сукцинатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы гомогенатов миокарда.

7. Обнаружена принципиальная возможность коррекции процессов липопероксидации и нарушений энергообеспечения при экспериментальной острой ишемии миокарда на фоне использования неотона и цитофлавина, причем цитофлавин обеспечивает противоишемический эффект за счет активации сукцинатдегидрогеназного окисления, окислительно-восстановительных процессов, поскольку один из компонентов цитофлавина - никотинамид - является простетической группой ферментов - кодегидрогеназы I (НАД) и кодегидрогеназы II (НАДФ), в то время как неотон является не только донатором макроэргических связей, но и одновременно активизирует лактатдегидрогеназу и сукцинатдегидрогеназу.

Научная новизна. Впервые проведена сравнительная оценка состояния процессов липопероксидации, активности антиоксидантной системы крови, а также тканей миокарда и головного мозга и их энергообеспечения в условиях локальной ишемии и системной гипоксии. Установлены общие закономерности и особенности метаболических сдвигов в указанных структурах; дано патогенетическое обоснование эффективности применения антиоксидантов, антигипоксантов субстратного и регуляторного действий при гипоксических состояниях.

В экспериментах на белых крысах обнаружено, что активация липопероксидации является типовым процессом дезинтеграции структур миокарда и головного мозга на фоне развития острой локальной циркуляторной гипоксии, а также в процессе реперфузии ишемизированных структур головного мозга. Аналогичная закономерность интенсификации свободнорадикальных процессов выявлена в экспериментах с моделированием острой системной гипоксической и циркуляторной гипоксии на животных другой видовой принадлежности - белых мышах.

Активация процессов липопероксидации коррелирует с нарушением энергообеспечения и подавлением энергозависимых процессов в ишемизированном миокарде и головном мозге, а также в процессе реперфузии структур головного мозга.

К особенностям нарушения энергообеспечения миокарда в условиях острой ишемии относится подавление активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ), опережающее во времени подавление активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Активность СДГ остается стабильно сниженной в течение трех суток развития острой ишемии миокарда.

Избыточное потребление лактата в период острой ишемии миокарда приводит к конкурентному вытеснению из метаболизма миокардиоцитов жирных кислот и соответственно накоплению малоната - трехуглеродного субстрата синтеза жирных кислот. Последний, в свою очередь, является основным ингибитором СДГ.

Активация гликолиза и подавление активности СДГ, коррелирующие с избыточным накоплением в гомогенатах мозга продуктов липопероксидации, обнаружены и в ткани ишемизированного головного мозга. В процессе реперфузии ишемизированного мозга (спустя 1-е сутки) возникают прогрессирующая активация липопероксидации, дефицит антирадикальной защиты структур мозга, активация гликолитических и подавление аэробных реакций. Спустя 3 суток с момента реперфузии ишемизированного мозга еще более снижается антирадикальная защита клеток мозга, на что указывает падение уровня восстановленного глутатиона, несмотря на нормализацию активности супероксиддисмутазы (СОД).

Таким образом, активация процессов липопероксидации является ведущим фактором дезинтеграции структур и функций миокардиоцитов, клеток головного мозга, крови в условиях гипоксии различного генеза, а также в процессе развития реперфузии ишемизированных тканей мозга.

Практическая значимость работы. Установление общих закономерностей активации процессов липопероксидации и недостаточности антиоксидантной системы крови, тканей миокарда и коры головного мозга при острых гипоксических состояниях различного генеза позволяет рекомендовать в качестве объективных критериев оценки тяжести метаболических нарушений и эффективности корригирующей терапии определение содержания в крови промежуточных продуктов липопероксидации: диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, а также показателей антирадикальной защиты клеток - активности супероксиддисмутазы, каталазы, уровня восстановленного глутатиона.

На основании экспериментальных исследований патогенетически обоснованы целесообразность и эффективность применения при острых системных гипоксических состояниях антиоксидантов и антигипоксантов субстратного и регуляторного действий, в частности, цитофлавина, оксибутирата натрия, реамберина, пирацетама и неотона.

Подавление чрезмерной активации процессов перекисного окисления липидов и реактивация ферментного звена антиоксидантной системы, энергообеспечения ишемизированного миокарда свидетельствуют о целесообразности использования цитофлавина в комплексной терапии ишемического поражения миокарда.

Макроэргические соединения - АТФ и креатинфосфат - могут использоваться не только в качестве высокоэнергетических источников, но и как антигипоксанты.

По материалам исследований издано учебное пособие «Свободнорадикальные процессы и воспаление (патогенетические, клинические и терапевтические аспекты)», которое рассмотрено и утверждено Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России и рекомендовано к использованию в качестве учебного пособия для врачей.

Апробация работы и внедрение в практику ее результатов. Материалы работы доложены или представлены на 65-й юбилейной научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМУ «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2004); научной конференции с международным участием «Медицинские, социальные и экономические проблемы сохранения здоровья населения» (Турция, 2004); 3-й осенней научно-практической конференции «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2005); научной конференции с международным участием, секция «Молодых ученых и студентов» (Египет, 2006); 67-й весенней научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМУ «Молодые ученые - здравоохранению региона» (Саратов, 2006); конференции с международным участием «Климат и окружающая среда» (Амстердам, 2006); межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и наука: итоги и перспективы» (Саратов, 2006); II международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Испания, 2006).

Результаты исследований используются в процессе обучения слушателей факультета повышения квалификации, кинических ординаторов, студентов 2 и 3-го курсов на кафедрах нормальной физиологии, биохимии, патологической физиологии Саратовского государственного медицинского университета; на кафедрах патологической физиологии, фармакологии и кафедре внутренних болезней Медицинского института Пензенского государственного университета; на кафедре военно-полевой терапии Саратовского военно-медицинского института.

Публикации. Основные результаты работы изложены в 34 публикациях, в том числе в монографии «Активация свободнорадикального окисления - эфферентное звено типовых патологических процессов» (Саратов, 2006), в учебном пособии для врачей «Свободнорадикальные процессы и воспаление (патогенетические, клинические и терапевтические аспекты)» (Москва, 2008) и в журнале, рекомендованном ВАК: «Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова» (Санкт-Петербург, 2006, 2007).

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 246 страницах и состоит из введения, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 430 источников, из которых 246 отечественных и 184 иностранных автора. Диссертация иллюстрирована 26 таблицами и 19 рисунками.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены с применением различных контрольных групп сравнения, а также моделей системной и локальной гипоксии. Всего в работе использованы 870 белых беспородных мышей массой 18-20 г и 450 белых беспородных крыс массой 180-200 г.

В соответствии с целью и задачами исследования изучено состояние процессов липопероксидации, антирадикальной защиты клеток крови, гомогенатов миокарда, головного мозга, а также их энергетического обеспечения при экзогенной острой системной гипоксической гипоксии, системной циркуляторной гипоксии, а также циркуляторной гипоксии миокарда и структур головного мозга при локальном ограничении кровотока.

Моделирование экзогенной гипоксической гипоксии на белых мышах достигалось помещением животных массой 18-20 г в герметически закрытый сосуд объемом 250 мл при постоянной температуре окружающей среды.

Системная циркуляторная гипоксия развивалась при моделировании эндотоксинового шока, достигаемого внутривенным введением холерного липополисахарида (ЛПС) белым мышам в летальных дозах, соответствующих 4 LD₅₀. Эндотоксин получен в РосНИПЧИ «Микроб» г. Саратова из свежевыращенной реакторной культуры Vibrio Cholerae Inaba 569B водно-фенольным методом (Westphal O., Jam K., 1965).

В модификации экспериментов на белых крысах произведено моделирование ишемии миокарда в условиях острого опыта по методу H. Selyе, в процессе которого производилась окклюзия нисходящей ветви левой коронарной артерии на уровне нижнего края ушка.

Локальная ишемия структур головного мозга достигалась за счет ограничения кровотока при наложении зажимов на общие сонные артерии.

Все опыты проводились под эфирным наркозом. Эксперименты были выполнены на кафедре патологической физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» и на научно-экспериментальной базе фирмы «Полисан», г. Санкт-Петербург*.

Содержание животных, моделирование локальной гипоксии, а также выведение животных из опыта проведено в соответствии с этическими нормами, изложенными в Женевской конвенции (1961), а также в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) в соответствии с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики» (Минздрав СССР, № 755 от 12.08.1977г.).

О состоянии процессов липопероксидации при различных видах гипоксии судили по содержанию в крови и тканях промежуточных продуктов липопероксидации - гидроперекисей липидов (ГПЛ) (Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И., 1983), малонового диальдегида (МДА) (Суплонов С.Н., Баркова Э.Н., 1985) и диеновых конъюгатов (ДК) (Стальная И.Д., 1977), определяемых спектрофотометрическими методами исследования.

Интегративными показателями состояния активности антиоксидантной системы крови и тканей, а также и антирадикальной защиты клеток явились перекисная резистентность эритроцитов (ПРЭ) (Cogan G., Gyorgy P., Rose C.F.,1952, в модификации Покровского А.А., Абрамова А.А., 1964), уровень витамина Е (Габриэлян Н.И., Левицкий Э.Г., Щербакова О.И., 1983) и общих сульфгидрильных групп (Фоломеев В.Ф., 1981), уровень восстановленного глутатиона, а также активность СОД (Frid R., 1975) и каталазы (Conen J., Dembuc D., Markec J., 1970). Для оценки степени аутоинтоксикации и развития синдрома цитолиза использовали показатели содержания в крови МСМ (Габриэлян Н.И., 1983) и активности трансаминазы - аспартатаминотрансферазы (АсАТ) с помощью наборов Био-Ла-Тест чешской фирмы «Лахема».

Интенсификация процессов липопероксидации в миокарде сопоставлялась с энергообеспечением миокардиоцитов, которое оценивали по содержанию в миокарде АТФ (Acatuna B.C., 1969, Dennemann H.Z., 1961), КФ, а также по активности ряда ферментов - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) (Кривченкова Р.С., 1971), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и АсАТ, определяемых с помощью наборов Био-Ла-Тест чешской фирмы «Лахема».

Показателями энергетического обеспечения мозга, в частности, за счет гликолитических реакций, были уровень пирувата (Gloster J., Harris P., 1962), лактата (Friedland J.M., Dietrich L.S., 1961), а также активности ЛДГ. Одновременно исследована активность СДГ - ключевого фермента цикла Кребса.

Процессы энергетического обеспечения ишемизированного мозга, а также в условиях его реперфузии сопоставлялись с состоянием липопероксидации и антирадикальной защиты клеток.

Важнейшим направлением работы явилось патогенетическое обоснование возможностей медикаментозной коррекции метаболических сдвигов при различных видах системной и локальной гипоксии.

В целях медикаментозной коррекции метаболических сдвигов при экспериментальной гипоксической гипоксии за 10 мин до эксперимента использовали однократное внутрибрюшинное введение следующих фармакологических препаратов со свойствами антиоксидантов и антигипоксантов: оксибутирата натрия (в дозе 50 мг/кг) (Леоненков В.В. и соавт., 1994), цитофлавина (в дозе 1,5 мл/кг) (Скоромец А.А., Никитина В.В., Голиков К.В., 2003; Федин А.И. и соавт., 2005), реамберина (в дозе 10 мг/кг) (Суслина З.А. и соавт., 2002). Коррекция метаболических расстройств при системной циркуляторной гипоксии достигалась при использовании цитофлавина в той же суточной дозе.

В целях медикаментозной коррекции локальных и системных метаболических сдвигов при ишемическом повреждении миокарда в динамике наблюдения использовали препараты: цитофлавин (внутрибрюшинно в суточной дозе 1,5 мл/кг) и неотон (в суточной дозе 150 мг/кг) (Галяутдинов Г.С. и соавт., 1990; Долгих В.Т., Захаров И.В., Иванов С.Р., 1999; Захаров И.В. и соавт., 2002).

Медикаментозная коррекция метаболических сдвигов при ишемии мозга выполнялась с использованием цитофлавина (внутрибрюшинно в дозе 1,5 мл/кг) и пирацетама в динамике наблюдения (в дозе 1,5 мл/кг 20% раствора) (Клейменова И.С., 2004; Котов С.В., Исакова Е.В., 2005).

Результаты исследований были обработаны на ЭВМ типа IBM-PC с помощью программной системы Statistica for Windows (версия 5.5, г. Москва, 1999) и «Microsoft Excel, 97 SR-1» (Microsoft, 1997).

Результаты исследований и их обсуждение. Результаты исследования метаболических сдвигов при острой гипоксической гипоксии позволили выявить системную и локальную в структурах головного мозга активацию процессов липопероксидации, о чем свидетельствовало возрастание уровня ГПЛ (р<0,001) и МДА (р<0,001) в крови и гомогенатах мозга в претерминальный период патологии (спустя 30 мин с момента моделирования гипоксии). В данной модификации экспериментов средняя продолжительность жизни белых мышей составила 32 мин.

Выявленный нами факт избыточного накопления в крови и тканях мозга промежуточных продуктов липопероксидации в условиях острой гипоксической гипоксии является следствием недостаточности ферментного и неферментного звеньев антирадикальной защиты клеток.

Как показали результаты проведенных экспериментов, активность каталазы мозга (p<0,001), активность СОД крови, содержание в крови витамина Е, уровень общих SH-групп сыворотки крови, а также перекисная резистентность эритроцитов снижались по сравнению с таковыми показателями группы контроля (табл. 1).

Как известно, СОД крови ускоряет спонтанную дисмутацию супероксидного анион-радикала в десятки раз до перекиси водорода. Последняя, в свою очередь, восстанавливается до воды в основном каталазой и глутатионпероксидазой. Важная роль в антиоксидантной защите клеток отводится SH-соединениям - активным перехватчикам ОН-соединений.

Таким образом, при острой гипоксической гипоксии возникает недостаточность всех звеньев антирадикальной защиты клеток - ферментного и неферментного звеньев. Как известно, образующиеся в организме свободные радикалы антиоксидантов выводятся из организма в виде продуктов взаимодействия с другими антиоксидантами - токоферолами, хинонами, витаминами группы К, Se-содержащими соединениями.

Выявленный нами дефицит витамина Е (табл. 1) при острой экзогенной гипоксической гипоксии свидетельствует о дестабилизации митохондриальных, лизосомальных, цитоплазматических мембран, поскольку, как известно, жирорастворимые антиоксиданты, в частности, витамин Е, локализуются в основном в биологических мембранах, предохраняя их от свободнорадикальной деструкции. Недостаточность СОД и каталазы в гомогенатах мозга и крови свидетельствует о недостаточной защите биополимеров.

Избыточное накопление продуктов ПОЛ при острой гипоксической гипоксии коррелировало с развитием аутоинтоксикации, о чем свидетельствовало избыточное накопление в крови МСМ (табл. 1).

Целью последующих наблюдений явилась сравнительная оценка вторичных неспецифических метаболических расстройств при системной циркуляторной гипоксии, развивающейся при эндотоксиновом шоке. Шок моделировали в опытах на белых мышах введением летальных доз, эквивалентных 4 LD₅₀ (ЛПС) холерного эндотоксина. Признаки интоксикации появлялись уже через 1-2 часа, достигая максимума через 4 часа в виде адинамии, гипертермии, судорог и развития летальных исходов.

Как оказалось, на высоте развития тяжелого эндотоксикоза возникали одномоментное увеличение содержания МДА и ГПЛ в крови (табл. 2) и гомогенатах миокарда, а также снижение активности СОД, уровня SH-групп и витамина Е (табл. 2). Недостаточность антирадикальной защиты системы крови при эндотоксикозе сочеталась со снижением ПРЭ и увеличением содержания в крови МСМ (табл. 2).

Касаясь значимости обнаруженных нами метаболических сдвигов, следует отметить, что различные виды СОД отличаются строением активного центра, катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала:

*ОО^- +*ОО^- + 2Н⁺ > О₂ + НООН

Что касается повышения активности каталазы, возникающей при эндотоксиновом шоке, необходимо отметить компенсаторную значимость этого феномена, направленного на устранение образования избыточных концентраций перекиси водорода и соответственно трансформации этого соединения в реакции Фентона в высокореактогенные гидроксильные радикалы. метаболический сдвиг циркуляторный гипоксия

В то же время выявленное нами подавление активности СОД гомогенатов миокарда (р<0,001) и крови (табл. 2) приводит к избыточному накоплению супероксидного анион - радикала. Последний, хотя и обладает меньшей реактогенностью по отношению к липидам, белковым компонентам биомолекул, а также нуклеиновым кислотам, но вызывает достаточно выраженную дезорганизацию этих структур с нарушением их функции. Этот вывод находит реальное подтверждение в результатах наших исследований, согласно которым в крови (табл. 2) и гомогенатах миокарда при эндотоксиновом шоке в избытке накапливаются МДА (р<0,001) и ГПЛ (р<0,001). Последние, как известно, являются промежуточными продуктами липопероксидации, индуцируемой в процессе взаимодействия активных форм кислорода с полиненасыщенными жирными кислотами биомембран, в частности, линолевой, арахидоновой.

Таким образом, результаты проведенных исследований на различных моделях системной гипоксической и циркуляторной гипоксии, убедительно показали, что эфферентным звеном гипоксической дезорганизации клеток является активация свободнорадикального окисления. В связи с этим на подавление этих процессов и активацию антиоксидантных систем, повышение антирадикальной защиты клеток, должна быть направлена медикаментозная коррекция метаболических сдвигов при системных гипоксических расстройствах различного генеза.

В последующих экспериментальных исследованиях представлялось целесообразным изучить характер метаболических расстройств, в частности, состояние процессов липопероксидации, антирадикальной защиты структур головного мозга при острой ишемии мозга и в процессе его реперфузии, а также установить общие закономерности и особенности метаболических сдвигов в структурах головного мозга при системной и локальной гипоксии.

Как оказалось, спустя 90 мин с момента развития ишемии мозга возникала выраженная активация процессов липопероксидации на фоне недостаточности антиоксидантной системы мозга, о чем свидетельствовало увеличение содержания МДА (р<0,001, рис. 1) в гомогенатах мозга, ДК (р<0,001, рис. 1) в гомогенатах мозга, снижение активности СОД (р<0,001) и уровня восстановленного глутатиона (р<0,001). Спустя 1 сутки с момента реперфузии уровень МДА оставался высоким, активность СОД и содержание восстановленного глутатиона - значительно ниже показателей контроля. Спустя 3 суток содержание МДА возрастало, а уровень восстановленного глутатиона оставался критически низким.



Была обнаружена также отрицательная корреляция между возрастанием уровня МДА и снижением содержания восстановленного глутатиона в гомогенатах мозга (r= -0,78, р<0,001).

Целью последующих экспериментальных исследований, проводимых на той же модели ишемии мозга и последующей его реперфузии, являлось установление патогенетической роли активации процессов липопероксидации в нарушениях энергообеспечения структур мозга. Для решения этой задачи изучено состояние гликолитических реакций по уровню пирувата, лактата и активности фермента - ЛДГ в гомогенатах ишемизированного головного мозга, а также активности СДГ.

Как известно, СДГ-важнейший фермент цикла Кребса - флавопротеин, прочно связанный с внутренней митохондриальной мембраной, катализирующий дегидратирование сукцината с образованием фумарата.

Как и следовало ожидать, спустя 90 мин с момента развития ишемии мозга, возникала активация гликолитических реакций, о чем свидетельствовали снижение уровня пирувата (р<0,001), возрастание лактата (р<0,001) и активности ЛДГ (р<0,001) в гомогенатах мозга. Известно, что ЛДГ катализирует обратимую реакцию взаимопревращения лактата в пируват и не относится к лимитирующим ферментам гликолиза. В условиях недостаточности оксигенации мозга и высокой активности ЛДГ возрастает скорость поглощения пирувата и превращение его в лактат, что и объясняет полученные нами данные. Высокой чувствительностью к гипоксии обладает СДГ, активность которой резко снижалась в условиях локальной ишемии мозга (р<0,001). Последнее приводило к обрыву окислительно-восстановительных реакций в цикле Кребса.

Обращает на себя внимание отрицательная корреляция между уровнем МДА и снижением активности СДГ (r= - 0,82, р<0,001).

Как показали результаты проведенных нами экспериментов, спустя сутки и трое суток с момента реперфузии не возникало нормализации метаболических реакций в гомогенатах мозга, о чем свидетельствовали повышенный уровень лактата (р<0,001) и активности ЛДГ (р<0,001).

В экспериментах с моделированием острой ишемии миокарда также установлен параллелизм чрезмерного накопления в крови и миокарде промежуточных продуктов липопероксидации на фоне снижения активности СОД (р<0,001), каталазы (р<0,001), уровня восстановленного глутатиона (р<0,001), причем активация процессов липопероксидации в ишемизированном миокарде коррелировала с нарушением его энергообеспечения, о чем свидетельствовало снижение уровня АТФ (р<0,001), КФ (р<0,001), активности СДГ, ЛДГ гомогенатов миокарда. Параллельно развивался синдром цитолиза, на что указывало прогрессирующее возрастание активности АсАТ (р<0,001), ЛДГ (р<0,001) сыворотки крови в динамике наблюдения.

Таким образом, использование 4 вариантов моделирования гипоксии - острой системной гипоксической гипоксии, системной циркуляторной гипоксии, а также локальной ишемии головного мозга и миокарда позволило выявить общую закономерность - активацию процессов свободнорадикального окисления и недостаточность антирадикальной защиты клеток крови, мозга и миокарда.

Целью последующих экспериментальных исследований явилось выявление возможностей медикаментозной коррекции вторичных неспецифических метаболических расстройств, в частности, чрезмерной активации процессов липопероксидации и нарушений энергообеспечения структур миокарда и головного мозга в условиях острой системной и локальной гипоксии.

Во всех экспериментальных исследованиях проведена оценка метаболических эффектов цитофлавина в условиях гипоксии различного генеза, а также реперфузии предварительно ишемизированного мозга. Эффекты цитофлавина сопоставлялись с действием других препаратов различной направленности действия, используемых при гипоксических состояниях.

Использование цитофлавина в экспериментах с острой экзогенной гипоксической гипоксией сопровождалось подавлением чрезмерной интенсификации процессов липопероксидации в гомогенатах мозга и крови, реактивацией ферментного звена антиоксидантной системы крови и гомогенатов мозга, повышением антирадикальной защиты структурных и ферментных белков клеток. Об этом свидетельствовали снижение уровня МДА (р<0,001) и ГПЛ (р<0,001) в гомогенатах мозга и крови, возрастание ПРЭ (р<0,005), общих SH-групп (р<0,001) в крови. На фоне введения цитофлавина подавлялась аутоинтоксикация, на что указывало снижение уровня МСМ (р<0,001) в тот же период развития гипоксии, как и в опытах без медикаментозной коррекции (30 мин с момента моделирования гипоксии).

Одновременно отмечали возрастание средней продолжительности жизни экспериментальных животных (с 32 мин у животных без медикаментозной коррекции с острой гипоксической гипоксией до 50 мин).

Метаболические эффекты цитофлавина при острой гипоксической гипоксии сопоставлялись с эффектами оксибутирата натрия, нашедшего широкое применение в экспериментальной и клинической практике в качестве антиоксиданта и антигипоксанта.

Как оказалось, оксибутират натрия препятствовал в большей степени интенсификации процессов липопероксидации в гомогенатах мозга, чем цитофлавин, при острой системной гипоксической гипоксии. В то же время введение оксибутирата натрия способствовало и более выраженной реактивации каталазы (р<0,001) гомогенатов мозга и соответственно характеризовалось увеличением средней продолжительности жизни экспериментальных животных в условиях острой гипоксической гипоксии (с 32 мин у животных без медикаментозной коррекции с острой гипоксической гипоксией до 62 мин).

Метаболические эффекты цитофлавина апробировали и на модели - системной циркуляторной гипоксии, свойственной эндотоксиновому шоку.

В этом варианте моделирования цитофлавин подавлял чрезмерную интенсификацию процессов липопероксидации, свойственную развитию эндотоксинового шока, а также приводил к снижению аутоинтоксикации. При этом содержание МДА и ГПЛ резко снижалось в крови (табл. 2) и гомогенатах миокарда (р<0,001 и р<0,005 соответственно) по сравнению с таковыми показателями затравленных животных без медикаментозной коррекции. Одновременно возрастали активность СОД, уровень витамина Е, SH-групп в крови (табл. 2) и гомогенатах миокарда (р<0,001, р<0,001 и р<0,05 соответственно), увеличивалась ПРЭ, и снижался уровень МСМ в крови (табл. 2).

Последующие наблюдения по выявлению возможностей коррекции процессов липопероксидации и связанных с ними нарушений энергообеспечения головного мозга и миокарда проведены на моделях локальной циркуляторной гипоксии указанных структур. Прежде всего были изучены метаболические эффекты пирацетама и цитофлавина в динамике реперфузии предварительно ишемизированного мозга.

Как оказалось, спустя сутки с момента реперфузии предварительно ишемизированного мозга и пирацетам, и цитофлавин вызывали положительную динамику метаболических расстройств, причем эффекты цитофлавина по некоторым интегративным показателям были идентичны действию пирацетама, а по ряду показателей превосходили действие пирацетама.

Так, оба препарата, в динамике наблюдения (1 сутки и 3 суток с момента реперфузии предварительно ишемизированного мозга) препятствовали чрезмерному накоплению промежуточных продуктов липопероксидации в гомогенатах мозга, вызывали реактивацию СОД (1 сутки с момента реперфузии ишемизированного мозга р<0,001 и р<0,001 соответственно), способствовали быстрой нормализации уровня восстановленного глутатиона (р<0,001 и р<0,001 соответственно). Использование цитофлавина и пирацетама в динамике реперфузии предварительно ишемизированного мозга способствовало и более быстрой нормализации его энергообеспечения, подавлению чрезмерной активации гликолитических реакций, при одновременной активации ферментов ЛДГ (р<0,001 и р<0,001 соответственно) и СДГ (р<0,001 и р<0,001 соответственно). Как известно, ЛДГ катализирует реакцию взаимопревращения лактата и пирувата, а СДГ является важнейшим ферментом цикла Кребса.

Таким образом, реализация метаболических эффектов цитофлавина и пирацетама возможна в условиях реперфузии после острой ишемии головного мозга за счет подавления свободнорадикального окисления, гликолитических реакций и усиления активации окислительно- восстановительных реакций в цикле трикарбоновых кислот.

На экспериментальной модели локальной циркуляторной ишемии миокарда также выявлена принципиальная возможность коррекции вторичных неспецифических метаболических расстройств.

В этих целях проведена сравнительная оценка эффектов цитофлавина и неотона на состояние процессов липопероксидации в миокарде и его энергообеспечение спустя 60 мин и 72 часа с момента моделирования ишемии.

Как оказалось, оба препарата препятствовали чрезмерной интенсификации процессов липопероксидации, обеспечивали реактивацию ферментного звена антиоксидантной системы миокарда, увеличение содержания восстановленного глутатиона в миокарде (р<0,001 и р<0,001 соответственно).

Подавление чрезмерной интенсификации липопероксидации в гомогенатах миокарда обусловливало отрицательную корреляцию с усилением процессов энергообеспечения ишемизированного миокарда на фоне применения цитофлавина и неотона.

Выводы

1. В процессе сравнительной оценки характера и механизмов развития метаболических расстройств при гипоксических состояниях различного генеза установлено, что эфферентным звеном гипоксического некробиоза и реперфузионных повреждений ишемизированных тканей является активация процессов липопероксидации, независимо от инициирующих механизмов развития гипоксии и видовой принадлежности экспериментальных животных.

2. Острая экзогенная гипоксическая гипоксия приводит к локальной (в структурах мозга) и системной активации процессов липопероксидации, снижению антирадикальной защиты клеток, коррелирующих с резким укорочением продолжительности жизни экспериментальных животных. Обнаружен депотенцирующий эффект антиоксидантов и антигипоксантов субстратного и регуляторного действий - оксибутирата натрия, цитофлавина, реамберина - на интенсификацию процессов липопероксидации при острой системной гипоксической гипоксии, коррелирующий с увеличением продолжительности жизни животных.

3. В динамике системной циркуляторной гипоксии на модели эндотоксинового шока обнаружена активация процессов липопероксидации на фоне недостаточности антирадикальной защиты клеток крови и миокарда, подобно метаболическим сдвигам при системной циркуляторной гипоксии. Достигнуты положительные эффекты на показатели метаболического статуса комплексного препарата - цитофлавина.

4. Характерным метаболическим сдвигом в ишемизированных структурах коры головного мозга при локальной циркуляторной гипоксии является избыточное накопление МДА и ДК при одновременном снижении активности СОД и уровня восстановленного глутатиона, а также активности СДГ. Процесс реперфузии ишемизированного мозга характеризуется прогрессирующим снижением антирадикальной защиты тканей коры головного мозга и чрезмерным накоплением МДА и ДК, подавлением активности СДГ и активацией гликолиза.

5. На фоне применения цитофлавина и пирацетама в условиях локальной циркуляторной гипоксии мозга и последующей реперфузии достигнуты реактивация СОД, СДГ, подавление процессов липопероксидации, интенсивности гликолитических реакций и увеличение уровня восстановленного глутатиона в гомогенатах коры головного мозга.

6. В динамике ишемического поражения миокарда возникают локальная и системная активация процессов липопероксидации на фоне недостаточности ферментного и неферментного звеньев антирадикальной защиты миокардиоцитов, коррелирующие с подавлением активности СДГ гомогенатов миокарда, прогрессирующим снижением содержания в миокарде АТФ, КФ, избыточным накоплением лактата. Достигнуты положительные метаболические эффекты цитофлавина и неотона в динамике экспериментальной ишемии миокарда.

7. Установление патогенетической значимости активации процессов липопероксидации и недостаточности антирадикальной защиты биосистем в механизмах развития острых гипоксических состояний свидетельствует о целесообразности мониторинга показателей активности СОД, каталазы крови, уровня восстановленного глутатиона, SH-групп в крови, витамина Е, промежуточных продуктов липопероксидации (МДА), а также МСМ в качестве дополнительных объективных критериев оценки тяжести течения гипоксии различного генеза и эффективности медикаментозной коррекции метаболических расстройств.

Практические рекомендации

1. Результаты исследований позволяют рекомендовать апробацию в комплексной терапии локальных ишемических состояний, а также системной циркуляторной и гипоксической гипоксии использование антиоксидантов и антигипоксантов субстратного и регуляторного действий, в частности, цитофлавина, реамберина, неотона, пирацетама, оксибутирата натрия.

2. В основе интенсификации процессов липопероксидации при гипоксических состояниях различного генеза лежит недостаточность активности СОД, что свидетельствует о необходимости дальнейшей апробации в экспериментальной медицине фармакологических препаратов СОД и церулоплазмина, обладающего активностью СОД, в комплексной терапии локальных и системных гипоксических состояниях.

3. Результаты диссертационной работы позволяют рекомендовать и ряд новых диагностических и прогностических критериев оценки тяжести течения гипоксических состояний и эффективности медикаментозной терапии, в частности, определение содержания в крови промежуточных продуктов липопероксидации - МДА, ДК, уровня активности СОД, содержания витамина Е, МСМ, SH-групп в крови.

Список принятых сокращений

АОС - антиоксидантная система

АсАт - аспартатаминотрансфераза

ВГ - восстановленный глутатион

ГПЛ - гидроперекиси липидов

ДК - диеновые конъюгаты

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛПС - липополисахарид

МДА - малоновый диальдегид

МСМ - молекулы средней массы

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПРЭ - перекисная резистентность эритроцитов

СДГ - сукцинатдегидрогеназа

СОД - супероксиддисмутаза

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бизенкова, М.Н. Антиоксидантные свойства цитофлавина в условиях гипоксической гипоксии / М.Н. Бизенкова, М.Г. Романцов, Н.Ю. Стукова // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы 3-й осенней научно-практической конференции. - Саратов, 2005. - С. 24-25.

2. Бизенкова, М.Н. Сравнительная оценка энергообеспечения миокарда в норме и в динамике экспериментальной острой ишемии / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №1. - С. 21-28.

3. Бизенкова, М.Н. О роли активации процессов липопероксидации в механизмах ишемического повреждения миокарда / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №2. - С. 26-32.

4. Бизенкова, М.Н. Особенности нарушений энергообеспечения ишемизированного миокарда и возможности их коррекции при использовании цитофлавина / М.Н. Бизенкова, М.Г. Романцов, К.А. Бизенков // Молодые ученые - здравоохранению региона: Материалы 67-й весенней научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМУ. - Саратов, 2006. - С. 116.

5. Бизенкова, М.Н. Динамика метаболических расстройств при экспериментальной ишемии головного мозга и в процессе его реперфузии / М.Н. Бизенкова, М.Г. Романцов, К.А. Бизенков // Молодые ученые - здравоохранению региона: Материалы 67-й весенней научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМУ. - Саратов, 2006. - С. 115-116.

6. Бизенкова, М.Н. Особенности нарушений энергообеспечения головного мозга в условиях экспериментальной ишемии и реперфузии / М.Н. Бизенкова, К.А. Бизенков // Молодежь и наука: итоги и перспективы: Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Саратов, 2006. - С. 58.

7. Бизенкова, М.Н. Современные представления о патогенезе гипоксий. Классификация гипоксий и пусковые механизмы их развития / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №5. - С. 23-28.

8. Бизенкова, М.Н. Источники образования свободных радикалов и их значение в биологических системах в условиях нормы / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №6. - С. 28-34.

9. Бизенкова, М.Н. Цитофлавин как препарат эффективной коррекции метаболических расстройств при гипоксии различного генеза / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов, Г.А. Афанасьева // Успехи современного естествознания. - 2006. - №4. - С. 28.

10. Бизенкова, М.Н. Антиоксидантные свойства неотона - донатора макроэргических фосфатных связей при ишемическом повреждении миокарда / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №7. - С. 46-48.

11. Бизенкова, М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы цитотоксического действия гипоксии. Патогенез гипоксического некробиоза / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные наукоемкие технологии. - 2006. - №7. - С. 31-39.

12. Бизенкова, М.Н. Метаболические эффекты цитофлавина в нервной ткани в условиях острой экспериментальной ишемии и реперфузии мозга / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Современные проблемы науки и образования. - 2006. - №4. - С. 93.

13. Бизенкова, М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы индукции свободнорадикального окисления в условиях патологии / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Современные проблемы науки и образования. - 2006. - №6. - С. 22-27.

14. Бизенкова, М.Н. Принципы медикаментозной коррекции метаболических расстройств при ишемическом повреждении миокарда / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Успехи современного естествознания. - 2006. - №5. - С. 9-13.

15. Бизенкова, М.Н. Общая характеристика источников образования свободных радикалов и антиоксидантных систем / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи современного естествознания. - 2006. - №7. - С. 37-41.

16. Бизенкова, М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова // Успехи современного естествознания. - 2006. - №7. - С.29-36.

17. Бизенкова, М.Н. Возможности эффективного использования антиоксидантов и антигипоксантов в экспериментальной и клинической медицине / Н.П. Чеснокова, Е.В. Понукалина, М.Н. Бизенкова, Г.А. Афанасьева // Успехи современного естествознания. - 2006. -№ 8. - С. 18-25.

18. Оценка метаболических сдвигов при гипоксии на молекулярно-клеточном уровне и возможности их медикаментозной коррекции / В.В. Бульон, Н.П. Чеснокова, М.Н. Бизенкова и др. // Успехи современного естествознания. - 2006. - №12. - С. 29-32.

19. Бизенкова, М.Н. Метаболические эффекты антиоксидантов в условиях острой гипоксической гипоксии / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Фундаментальные исследования. - 2006. - №1. - С. 17-22.

20. Бизенкова, М.Н. Патогенетическое обоснование целесообразности использования цитофлавина при ишемическом повреждении миокарда / М.Н. Бизенкова, Н.П. Чеснокова, М.Г. Романцов // Фундаментальные исследования. - 2006. - №4. - С. 20-25.

...