Главная Коллекция "Revolution" Медицина Нарушения механизмов регуляции системы иммунитета при остром отравлении метанолом и их коррекция

Нарушения механизмов регуляции системы иммунитета при остром отравлении метанолом и их коррекция

Влияние острой интоксикации метанолом на содержание лимфоцитов в иммунной системе и миграцию колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку. Изменения клеточных иммунных реакций и функции естественных клеток-киллеров после действия метанола.

Рубрика	Медицина
Вид	автореферат
Язык	русский
Дата добавления	06.08.2018
Размер файла	76,0 K

посмотреть текст работы

скачать работу можно здесь

полная информация о работе

весь список подобных работ

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Страница:

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАРУШЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА ПРИ ОСТРОМ ОТРАВЛЕНИИ МЕТАНОЛОМ И ИХ КОРРЕКЦИЯ

03.00.13 - физиология 14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Серов Вадим Вадимович

Саратов 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»; ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ»; ГОУ ВПО «Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты МО РФ».

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Киричук Вячеслав Федорович;

доктор медицинских наук, доцент Громов Михаил Сергеевич.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Пучиньян Даниил Миронович;

доктор медицинских наук, профессор Брилль Григорий Ефимович.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Волгоградский ГМУ Росздрава».

Защита состоится « » 2007 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Автореферат разослан « » 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Бабиченко Н.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение действия ксенобиотиков на иммунный гомеостаз и возможности коррекции его нарушений при помощи перспективных иммуностимуляторов является одной из наиболее актуальных проблем физиологии, токсикологии и иммунологии. Это определяется использованием в Вооруженных Силах Российской Федерации (ВС РФ) разнообразных токсичных химических веществ, в частности, ядовитых технических жидкостей, загрязнением окружающей среды различными соединениями, ростом интоксикаций различными соединениями, вызывающими связанные с вторичными иммунодефицитными состояниями различные инфекционные заболевания [Золотухин А.Н. и соавт., 1982; Александров В.Н., Емельянов В.И., 1990; Бадюгин И.С. и соавт., 1991; Хаитов Р.М. и соавт., 1995; Loose L.D., 1985; Miller K., 1985; Luster M.J. et al., 1987; Sullivan J.B., 1989].

Особую актуальность эта проблема приобрела в связи с тем, что в последнее десятилетие частота острых интоксикаций различными химическими соединениями и, в частности, спиртами существенно увеличилась [Алиев Н.А., 1991; Алиев Н.А., Мустафаев М.А., 1992; Лукомская М.И., 1992; Немцов А.В., 1995]. Зарегистрированное в 2000-2005 годах увеличение частоты острых отравлений алкоголем и ядовитыми спиртами в Российской Федерации, в частности, метанолом, по сравнению с предыдущими пятью годами, имеет тенденцию к дальнейшему увеличению [Нужный В.П. и соавт., 2004].

Метанол (метиловый спирт, карбинол, древесный спирт) применяется в качестве топлива для двигателей, в лабораторной практике, как растворитель в химическом производстве, для денатурирования этилового спирта, входит в состав ряда антифризов. Отравления чаще всего связаны с ошибочным использованием его вместо этилового спирта с целью опьянения. Существуют основания рассматривать метанол в качестве суррогата алкоголя [Лужников Л.А., Костомарова Л.Г., 2000; Нужный В.П. и соавт., 2004].

Отравления метанолом по числу летальных исходов занимают одно из первых мест среди интоксикаций другими спиртами [Кожемякин Л.А. и соавт., 1991; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996; Нужный В.П., 2001; 2005]. Это связано с постоянно увеличивающимся потреблением этилового спирта [Алиев Н.А., 1991, 1992; Нужный В.П., Прихожан Л.М., 1996], которое может сопровождаться в случаях использования вместо него с целью опьянения метанола групповыми и даже массовыми острыми отравлениями.

Одной из причин высокой смертности после острого отравления метанолом [Кожемякин Л.А. и соавт., 1991] могут являться инфекционные осложнения и заболевания, связанные с формированием вторичного иммунодефицита. При этом влияние метанола на систему иммунитета нуждается в дальнейшем изучении [Забродский П.Ф., 1998; Маркизова Н.Ф. и соавт., 2004; Descotes J., 1986; Luster M.I. et al., 1987; Jeya Parthasarathy N. et al., 2005].

Данные о влиянии метанола на гуморальные и клеточные иммунные реакции имеют как теоретическое, раскрывая неизвестные механизмы регуляции иммуногенеза, так и практическое значение, позволяя осуществлять целенаправленную фармакологическую коррекцию нарушений иммунного гомеостаза с целью снижения различных инфекционных осложнений [Хаитов Р.М. и соавт., 1995; Забродский П.Ф., 1998; Descotes J., 1986; Luster M.I. et al., 1987; Georgiev V.S., Yamaguuchi H., 1993].

Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование в промышленности, технике и быту метанола, высокую летальность при отравлении им, недостаточно изученные особенности его действия на физиологические механизмы регуляции системы иммунитета, следует заключить, что проблема изучения нарушения иммунного гомеостаза при остром отравлении метанолом, обоснование фармакологической коррекции его нарушений в постинтоксикационный период важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель работы

Изучение характера изменений механизмов регуляции иммуногенеза при остром отравлении метанолом и разработка патогенетически обоснованных направлений медикаментозной коррекции выявленных нарушений.

Для достижения указанной цели сформулированы следующие задачи исследования: метанол интоксикация клетка иммунный

1. Изучить влияние острой интоксикации метанолом на содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета и миграцию колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку.

2. Исследовать особенности влияния острой интоксикации метанолом на гуморальный иммунный ответ и на кооперацию Т- и В-лимфоцитов, определяющую тимусзависимое антителообразование.

3. Определить характер изменения клеточных иммунных реакций и функции естественных клеток-киллеров (ЕКК) после действия метанола.

4. Оценить роль функции коры надпочечников, активности эстераз Т-лимфоцитов, перекисного окисления липидов в нарушении иммунного статуса под влиянием метанола.

5. Оценить влияние антидотов метанола, ингибиторов и индукторов
Р-450-зависимых монооксигеназ на реализацию его иммунотоксических эффектов и обосновать коррекцию иммунодефицитного состояния после острой интоксикации метанолом.

Научная новизна исследования

Экспериментально проведена характеристика иммунотоксических эффектов метанола и обосновано применение перспективных средств медикаментозной коррекции нарушений показателей системы иммунитета. Изучены особенности нарушения физиологических механизмов иммуногенеза при остром воздействии метанола.

В экспериментах на животных показана дозозависимая редукция миграции КОЕс из костного мозга в селезенку после острой интоксикации метанолом. При остром отравлении метанолом снижается содержание Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоцитов в органах системы иммунитета.

Экспериментально показано, что острая интоксикация метанолом в прямой зависимости от дозы снижает гуморальный иммунный ответ более выраженно в продуктивной фазе антителогенеза по сравнению с индуктивной.

Установлено, что метанол в прямой зависимости от концентрации снижает эффект кооперации лимфоцитов, поражая преимущественно В-клетки. Поражающий эффект метаболитов метанола в эквимолярных концентрациях на кооперацию Т- и В-лимфоцитов уменьшался в следующем порядке: муравьиная кислота, формальдегид. Установлено, что действие метанола на исследованный показатель прямо связано с его концентрацией.

В экспериментах на животных выявлено, что острое отравление метанолом снижает функцию Т-клеток, реакцию гиперчувствительности замедленного типа (функцию Тh1-лимфоцитов и макрофагов), характеризующую как первичный, так и вторичный клеточный иммунный ответ. При остром воздействии метанола происходит дозозависимое уменьшение антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) преимущественно в продуктивной фазе иммуногенеза по сравнению с индуктивной фазой. Выявлено выраженное нарастание эффекта супрессии от индуктивной к продуктивной фазе иммунного ответа при остром отравлении метанолом.

Отравление метаноломснижает активность ЕКК в прямой зависимости от дозы. Редуцирующие эффекты метанола на функцию ЕКК in vitro прямо зависят от концентрации. При действии метаболитов метанола установлено снижение их иммунотоксического эффекта в последовательности: муравьиная кислота, формальдегид.

Определена роль кортикостерона, эстераз Т-клеток и перекисного окисления липидов в реализации иммунотропных эффектов метанола. Установлено, что концентрация кортикостерона, соизмеримая с содержанием этого гормона в крови при отравлении метанолом, играет весьма существенную роль в супрессии показателей системы иммунитета. Снижения активности ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах тимуса и селезенки, ?-нафтил-АS-ацетатэстеразы и ?-нафтилбутиратэстеразы в Т-клетках при действии метанола не выявлено.

Впервые доказано, что острое отравление метанолом в дозе 1,0 DL₅₀вызывает редукцию иммунных реакций, обусловленных активностью Th1-лимфоцитов, в меньшей степени по сравнению с иммунным ответом, связанным с функцией Th2-клеток.

В экспериментальных исследованиях показано, что метанол инициирует ПОЛ, что проявляется снижением активности антиоксидантной системы (редукция каталазы и пероксидазы) и увеличением содержания малонового альдегида в плазме крови.

Впервые проведена оценка влияния на формирование постинтоксикационного иммунодефицитного состояния, вызванного метанолом, средств антидотной терапии при отравлении данным спиртом (этанолом и 4-метилпиразолом), фолината кальция, индукторов и ингибиторов Р-450-зависимых монооксигеназ (фенобарбитала и препарата 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетат-SKF-525A) и иммуностимуляторов миелопида (10 мкг/кг) и полиоксидония (100 мкг/кг). Показано, что этанол и фенобарбитал увеличивают иммунотоксичность метанола, а 4-метилпиразол, препарат SKF-525A, а также иммуностимуляторы снижают ее. Полиоксидоний и миелопид обладают выраженной иммуностимулирующей активностью и практически полностью восстанавливают показатели системы иммунитета при интоксикации метанолом. При интоксикации метанолом в дозе 1,0 DL₅₀вусловиях антидотной терапии отравления этанолом введение фолината кальция в комбинации с миелопидом, фолината кальция в комбинации с полиоксидонием, миелопида в комбинации с полиоксидонием обеспечивает полное восстановление всех исследованных параметров системы иммунитета.

Практическая значимость работы заключается в доказательстве того, что в результате острой интоксикации метанолом формирование иммунодефицитного состояния сопровождается преимущественным поражением В-лимфоцитов метаболитом спирта формиатом, а применение в качестве антидота этанола усиливает иммунотоксичность метанола. Это создает возможность использования наиболее эффективных лекарственных средств (ингибиторов Р-450-зависимых монооксигеназ и фолината кальция), а также иммуностимуляторов. Показано, что при остром отравлении метанолом для восстановления наиболее чувствительных к токсиканту В-лимфоцитов целесообразно использование производных фолиевой кислоты (фолината кальция), ингибиторов Р-450-зависимых монооксигеназ, миелопида и полиоксидония.

Положения, выносимые на защиту

1. При остром отравлении метанолом дозозависимо снижается содержание Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета, уменьшаются миграция колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку, Т-зависимое и Т-независимое антителообразование преимущественно в индуктивной фазе антителогенеза по сравнению с продуктивным периодом антителогенеза. При этом в большей степени поражаются Th2-лимфоциты, с функцией которых связан синтез IgG, по сравнению с Th1-клетками, влияющими на продукцию В-лимфоцитами IgM.

2. Острое отравление метанолом дозозависимо уменьшает функцию Т-лимфоцитов, реакцию гиперчувствительности замедленного типа (функцию Th1-клеток и макрофагов), антителозависимую клеточную цитотоксичность и активность естественных клеток-киллеров.

3. Нарушение механизмов регуляции иммунного гомеостаза при действии метанола связано с иммуносупрессивным эффектом кортикостерона вследствие активации гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, а также инициацией перекисного окисления липидов.

4. Применение 4-метилпиразола (антидота метанола), фолината кальция и иммуностимуляторов миелопида и полиоксидония увеличивает показатели иммунного статуса после отравления метанолом.

Апробация и реализация работы, публикации

Результаты исследований были доложены на межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Иркутск, 2006); на межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием (Саратов, 2006); заседаниях секции прикладных проблем безопасности хранения и уничтожения химического оружия Поволжского отделения АВН (октябрь 2005 г., май 2006 г., январь 2007 г.); совместных научных конференциях кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»; технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты МО РФ»; военной психофизиологии ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ» (декабрь 2005 г., апрель 2006 г., май 2007 г.); научно-практических конференциях ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт РФ МО» (апрель 2006 г., апрель 2007 г.) и внедрены в педагогический процесс кафедр нормальной физиологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава»; технологий уничтожения химического оружия и токсичных веществ ГОУ ВПО «Саратовский военный институт радиационной, химической и биологической защиты МО РФ»; токсикологии и медицинской защиты ГОУ ВПО «Саратовский военно-медицинский институт МО РФ».

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, материалов и методов исследований, трех глав собственных экспериментальных и клинических исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 43 таблицами; Библиографический указатель включает 266 источников отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований

Исследования проводились на 723 беспородных крысах, крысах Вистар и на 72 беспородных белых мышах и мышах линии СВА обоего пола. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180-240 и 18-22 г.

Метанол вводили внутрь в виде 40%-ного раствора в дозах 0,25; 0,50 и 0,75 DL₅₀(DL₅₀для крыс и для мышей составляла 10,7+0,9 и 8,9+0,8 г/кг соответственно).

При изучении влияния антидотной терапии этанолом [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000] при остром отравлении метанолом (1,0 DL₅₀) на показатели иммунной системы этанол вводили внутрибрюшинно (15%-ный водный раствор в дозе 3 мл/кг 2 раза в сутки). Антидот метанола 4-метилпиразол [ICN Phamaceuticals, Inc.] - бесконкурентный ингибитор алкогольдегидрогеназы - вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг через 10 мин после введения метанола и в последующем через каждые 6 ч в течение суток. Обратимый ингибитор цитохрома Р-450, участвующего в биотрансформации метанола, 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетат (SKF-525A) вводили внутри-перитонеально в дозе 50 мг/кг за 1 сут до применения метанола. Фолинат кальция вводили внутримышечно в дозе 3 мг/кг трехкратно с 12-ти часовым интервалом. Первая доза фолината кальция вводилась через 10 мин после введения метилового спирта.

Содержание в селезенке продуктов биотрансформации метанола определяли через 1 сут после интоксикации при помощи спектрофотометра «Hewlett Packard» 5890С с масс-селективным детектором (МСД HP 5072) с колонкой HP 5 MS.

В качестве иммуностимуляторов использовали миелопид и полиоксидоний внутримышечно (ежесуточно) однократно в течение 4 сут в дозах соответственно 10 и 100 мкг/кг. Первую дозу вводили через 5-30 мин после применения метанола.

Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).

Лимфоидный индекс тимуса и селезенки вычисляли общепринятым методом [Сидельникова Н.М., 2004]. Содержание Т-клеток в тимусе определяли путем подсчета ядросодержащих клеток в органе, учитывая, что данные клетки в вилочковой железе представлены практически только Т-популяцией [Delves P.J., Roitt I.M., 2000]. Действие метанола на содержание лимфоцитов в органах иммунной системы определяли общепринятыми методами, а миграцию колониеобразующих единиц (КОЕс) из костного мозга в селезенку - методом эндогенного колониеобразования [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1972; Till J.E., Mc Culloch E.A., 1961].

Исследование показателей Т-зависимого и Т-независимого гуморального иммунного ответа проводили через 5, 8 и 13 сут после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) и Vi-антигеном (Vi-Ag). Титры антител к ЭБ определяли в реакции гемолиза эритроцитов в присутствии комплемента. Кроме того, гуморальную иммунную реакцию к Т-зависимому и Т-независимому антигенам оценивали также через 5 сут по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [Белокрылов Г.А. и соавт., 1980; Забродский П.Ф. и соавт., 2005; Jerne N.K., Nordin A.A., 1963] после иммунизации крыс. Иммунизацию осуществляли путем внутрибрюшинного введения ЭБ в дозе 210⁸ клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и Vi-Ag в дозе 8 мкг/кг при изучении действия метанола в индуктивную фазу гуморального иммунного ответа (иммунизацию проводили одновременно с их введением). Изучение острого действия метанола на продуктивную фазу антителопродукции проводили, применяя его через 3 сут после иммунизации.

Эффект кооперации Т- и В-лимфоцитов под влиянием метанола для оценки роли Т- и В-лимфоцитов в обеспечение антителопродукции оценивали по методу J.K. Thomas, T. Imamura [1986].

Для оценки состояния клеточного звена системы иммунитета определялись функция Т-лимфоцитов по секреции ими фактора, ингибирующего миграцию лейкоцитов [Гембицкий Е.В. и соавт., 1987]; реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и показатель антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) [Зимин Ю.И., Ляхов В.Ф., 1985]; естественная цитотоксичность (ЕЦ), характеризующая функцию естественных клеток-киллеров (ЕКК) [Гордиенко С.М., 1984].

Активность ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в Т-лимфоцитах крыс определяли методом G.M. Ellman et al. [1961], выделяя клетки по методике С.В. Ширшева [1998]. Активность ?-нафтил-АS-ацетатэстеразы и ?-нафтил-бутиратэстеразы спленоцитов крыс изучали гистохимическим методом [Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д., 1983].

Для определения уровня кортикостерона в плазме крови крыс использовали флюорометрический метод определения уровня неконъюгированных 11-оксикетостероидов [Moor P. de et al., 1962, 1976] в модификации В.В. Давыдова [1970]. Состояние перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по активности каталазы и пероксидазы, содержанию малонового диальдегида общепринятыми методами [Валеева И.Х. и соавт., 2002].

Полученные данные обрабатывались с использованием общепринятых статистических методов. Расчеты проводились на персональном компьютере с использованием пакета программ Statgraphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние метанола на механизмы регуляции системы иммунитета

Нами установлено, что при действии метанола (0,75 ЛД₅₀) через 1 и 3 сут лимфоидный индекс тимуса существенно снижался соответственно в 1,52 и 1,40 раза (р<0,05), а селезенки - в 1,30 и 1,25 раза (р<0,05) соответственно. Через 6 сут лимфоидные индексы тимуса и селезенки после отравления метанолом практически полностью восстанавливались. Оценка лимфоидного индекса тимуса и селезенки крыс после острого отравления метанолом показала наличие дозозависимого действия этого спирта через 1 сут после отравления.

Под влиянием метанола (0,75 ЛД50) снижалось число Т-лимфоцитов в тимусе через 1 и 3 сут соответственно в 1,64; 1,94 раза (р<0,05), а количество лимфоцитов в селезенке - в 1,30 и 1,45 раза (р<0,05) соответственно. В костном мозге и лимфоузлах количество лимфоцитов через 1 и 3 сут уменьшалось несущественно. Восстановление числа Т-лимфоцитов показателей практически до контрольного значения было зарегистрировано через 6 сут после отравления.

Исследование содержания лимфоцитов в тимусе и селезенке после острого отравления метанолом показало дозозависимое снижение их количества через 1 сут.

Метанол через 2 сут уменьшал содержание Т-лимфоцитов в тимусе и В-клеток в селезенке. При этом в селезенке содержание В-клеток уменьшается в 1,35 раза, а Т-лимфоцитов - в 1,16 раза. Отмечалась тенденция к снижению содержания данных популяций лимфоцитов в других органах системы иммунитета. Через 6 сут исследованные показатели восстанавливались до контрольных значений.

Проведенные нами исследования показали, что острое отравление метанолом существенно уменьшает миграцию КОЕс из костного мозга в селезенку на 38,3% (p<0,05).

Исследование КОЕс при остром отравлении метанолом в различных дозах показало прямо связанное с дозой снижение данного параметра. Так, при дозах 0,25; 0,50 и 0,75 DL₅₀ число КОЕс уменьшалось соответственно в 1,18; 1,50 и 1,62 раза (р<0,05).

Проведенные нами опыты показали, что после острой интоксикации метанолом (0,75 ЛД₅₀) в индуктивной и продуктивной фазах антителогенеза отрицательный двоичный логарифм титра антител (ОДЛТА) к эритроцитам барана (ЭБ) в циркулирующей крови через 5 и 8 сут существенно снижался.

Нами установлено уменьшение числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке к ЭБ у крыс после острой интоксикации метанолом (0,75 ЛД₅₀) через 5 сут в индуктивной и продуктивной фазах иммуногенеза соответственно в 1,53 и 2,07 раза (р<0,05).

Исследование тимусзависимого гуморального иммунного ответа после острого отравления метанолом показало прямо связанное с дозой его снижение (табл. 1).

Таблица 1

Изменение содержания числа антителообразующих клеток к эритроцитам барана (·10³), синтезирующим IgM, в селезенке белых крыс через 5 сут после острого отравления метанолом в зависимости от дозы в продуктивной фазе иммуногенеза (M+m; n=9-10)

Доза, DL₅₀	АОК, 10³
Контроль	45,6+4,0
0,25	37,6+3,4
0,5	29,1+2,5*
0,75	22,0+2,5*

Примечание: * - различие с контролем достоверно р0,05

Метанол (0,75 ЛД₅₀) вызывал уменьшение числа АОК в селезенке мышей, синтезирующих IgG, через 8 сут после иммунизации в индуктивной и продуктивной фазах антителогенеза соответственно в 1,87 и 2,46 раза (р<0,05).

Нами показано, что метанол в концентрациях 1, 10 и 50 мМ в прямой зависимости от концентрации уменьшает кооперацию Т- и В-клеток. В большей степени поражались под влиянием метанола В-клетки. Так, при концентрации 50 мМ метанол снижал активность В- и Т-клеток соответственно в 2,59 и 1,76 раза (р<0,05).

При исследовании кооперации Т- и В-клеток после выделения их у мышей через 1 сут после введения им метанола в дозах 0,25 и 0,75 DL₅₀ установлено (табл. 2), что в прямой зависимости от дозы метанол поражал в большей степени В-клетки по сравнению с Т-лимфоцитами. Зарегистрировано существенное снижение активности В-лимфоцитов в эффекте кооперации клеток после действия метанола в дозе 0,75 DL₅₀в 3,01 раза, а Т-клеток - в 1,63 раза.

Воздействие in vitro метанола и его метаболитов (формальдегида и формиата) в прямой зависимости от концентрации вызывает редукцию кооперации Т- и В-лимфоцитов, приводящую к ингибированию антителопродукции. Выявленный феномен связан с нарушением функции как Т-, так и В-клеток, причем активность В-лимфоцитов снижалась в большей степени. По степени редукции функции В- и Т-клеток в эффекте кооперации лимфоцитов метаболит метанола формиат обладал большей токсичностью, чем формальдегид. Формиат оказывал больший супрессирующий эффект на функцию В-лимфоцитов, чем метанол и формальдегид в эквимолярных концентрациях.

Таблица 2

Влияние острого отравления метанолом через 1 сут на кооперацию Т- и В-лимфоцитов мышей еx vivo (число АОК на 10⁶ В-клеток) [М+m, n=7-8]

Серии опытов	Доза метанола, DL₅₀
	0,25	0,75
В⁰+Т	180+19*	138+20*
В+Т⁰	286+27*є	255+23*є

Примечание: контроль: В-клетки - 63+ 7 на 10⁶ В-клеток; В+Т - 415+35 на 10⁶ В-клеток; В⁰, Т⁰ - В⁰, Т⁰-клетки получали через 1 сут от мышей, подвергавшихся действию метанола; * - различие с контролем (В+Т) достоверно - p<0,05; є - p<0,05 по сравнению с В⁰+Т

Нами установлено, что при оценке содержания АОК к Vi-Ag в селезенке у крыс после острой интоксикации метанолом в индуктивной и продуктивной фазах антителогенеза через 5 сут после иммунизации данный показатель снижался соответственно в 1,56 и 2,31 раза (р0,05).

Исследование тимуснезависимого гуморального иммунного ответа после острого отравления метанолом в продуктивной фазе иммуногенеза показало прямо связанное с дозой его снижение (табл. 3).

Таблица 3

Изменение содержания числа антителообразующих клеток к Vi-Ag (·10³), синтезирующим IgM, в селезенке белых крыс через 5 сут после острого отравления метанолом в зависимости от дозы в продуктивной фазе иммуногенеза, (M+m; n=7-10)

Доза, DL₅₀	АОК к Vi-Ag,·10³
Контроль	24,5+1,9
0,25	19,1+1,6
0,5	14,2+1,5*
0,75	10,6+1,1*

Примечание: *- различие с контролем достоверно, р0,05

Установлено, что после острой интоксикации метанолом (0,75 ЛД₅₀) происходит снижение функции Т-клеток у крыс до 9 сут.

В экспериментах на крысах популяции Вистар нами показано, что при острой интоксикации метанолом (0,75 ЛД₅₀) происходит снижение реакции ГЗТ (без переноса клеток, первичный клеточный ответ) в 1,49 раза (p<0,05), а при переносе спленоцитов крысам-реципиентам от крыс-доноров (вторичный клеточный иммунный ответ) - в 1,30 раза (p<0,05).

Оценка реакции ГЗТ после острого отравления метанолом показала прямо связанное с дозой ее снижение.

Нами установлено, что при действии метанола в дозе 0,75 ЛД₅₀ на АЗКЦ селезенки крыс при иммунизации ЭБ одновременно с интоксикацией происходило статистически значимое уменьшение активности данного параметра в 1,53 раза (р<0,05) через 5 сут после иммунизации. При введении метанола через 3 сут после иммунизации АЗКЦ снижалась в 2,44 раза (р<0,05).

Исследование АЗКЦ после острого отравления метанолом в продуктивной фазе иммуногенеза показало прямо связанное с дозой ее снижение.

Изучение влияния метанола на ЕКК показало, что происходило статистически значимое уменьшение их активности через 1, 3 и 6 сут соответственно в 1,96; 1,72 и 1,38 раза (р<0,05). Через 9 сут исследованный показатель практически не отличался от контрольного уровня.

Исследование активности ЕКК после острого отравления метанолом в различных концентрациях (0,25; 0,50 и 0,75 DL₅₀) через 3 сут показало прямо связанное с дозой ее снижение.

In vitro концентрации метанола, составляющие 10, 100 и 500 мМ, снижали активность ЕКК крыс соответственно в 1,58; 2,18; 3,19 (р<0,05) раза. Метаболиты метанола формальдегид и формиат вызывали прямо связанную с концентрацией редукцию их активности. При этом иммунотоксичность формиата превышала иммунотоксичность формальдегида. Так, при концентрации 10 мМ формальдегида и формиата активность ЕКК снижалась соответственно в 2,63 и 3,22 раза (р0,05), при концентрации 100 мМ - в 3,33 и 4,81 раза (р0,05), а при концентрации 500 мМ - в 4,21 и 6,31 раза (р0,05) соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют, что механизм супрессии активности ЕКК in vivo под влиянием метанола обусловлен преимущественно взаимодействием с ферментными системами ЕКК высокотоксичных продуктов биотрансформации метанола - формальдегида и формиата (муравьиной кислоты).

Нами установлено, что под влиянием метанола (спирт вводился в дозе 1,0 DL₅₀белым крысам на 3 сут после введения им эритроцитов барана в дозе 2·10⁸ клеток) происходило снижение гуморального иммунного ответа через 4 сут после иммунизации к тимусзависимому антигену, характеризующему синтез В-клетками IgM и функцию Th1-лимфоцитов, по сравнению с контрольным уровнем в 1,91 раза (p<0,05). Через 7 сут после иммунизации отмечалось уменьшение продукции IgG (по числу АОК в селезенке) в 2,51 раза (p<0,05), свидетельствующее о супрессии преимущественно функции Th2-лимфоцитов, а также В-клеток. При отравлении метанолом отмечалась существенная редукция активности ЕКК и реакции ГЗТ соответственно в 2,09 раза (p<0,05) и в 1,66 раза (p<0,05).

Показатели, характеризующие различные иммунные реакции и связанную с ними функцию Th1- и Th2-лимфоцитов, при действии метанола в среднем снижались соответственно в 1,90 и 2,51 раза. Это свидетельствует о том, что метанол в большей степени поражает функцию Th2-лимфоцитов или связанную с ними продукцию В-клетками IgG по сравнению с действием яда на Th1-лимфоциты и/или на В-лимфоциты, синтезирующие IgM, а также на ЕКК.

2. Механизмы нарушения регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении метанолом

Проведенные нами опыты показали, что под влиянием метанола активность ацетилхолинэстеразы в Т-лимфоцитах тимуса и селезенки, а также активность a-нафтил-АS-ацетатэстеразы и a-нафтилбутиратэстеразы в селезенке у крыс через 3 сут существенно не меняется.

При определении концентрации кортикостерона (КС) в плазме крови крыс при остром отравлении метанолом (0,75 ЛД₅₀) установлено (табл. 4) существенное увеличение его концентрации через 2 и 6 ч. При этом максимальное увеличение концентрации гормона отмечалось через 2 ч. Через 12 ч концентрация КС при действии метанола существенно не отличалась от контрольного значения.

Таблица 4

Концентрация кортикостерона в плазме крови крыс при остром отравлении метанолом в дозе 0,75 ЛД50, нг/мл (М+m, n = 8-11)

Серии опытов	Время исследования после введения, ч
	2	6	12
Контроль	35,1+5,1	40,2+6,1	38,8+5,9
Метанол	170,3+17,5*	63,0+8,0*	40,0+5,2

Примечание: * - различие с контролем достоверно, p<0,05

Наши эксперименты позволили установить, что под влиянием экзогенного КС, концентрации которого в целом соответствовали содержанию кортикостерона в плазме крови после острой интоксикации метанолом в дозе 0,75 ЛД₅₀, основные показатели системы иммунитета существенно снижаются.

При вычислении коэффициента корреляции между концентрацией КС в крови и АОК к ЭБ при остром отравлении крыс метанолом установлено, что он составляет -0,708 (p<0,05). Коэффициент корреляции при остром отравлении метанолом между концентрацией КС в крови и реакцией ГЗТ составляет -0,712 (p<0,05).

Проведенные опыты доказывают существенную роль кортикостерона в супрессии основных иммунных реакций при остром отравлении метанолом. Нами показано, что редукция гуморальных и клеточных показателей системы иммунитета при интоксикации метанола обусловлена не только эффектом кортикостерона, но и действием токсиканта и его метаболитов на лимфоциты. Так, редукция тимусзависимого, тимуснезависимого антителообразования, реакции ГЗТ, активности ЕКК и АЗКЦ при остром действии метанола (без учета эффекта кортикостерона) составляет соответственно 49,1; 53,2; 69,7; 58,3 и 50,9% от общего супрессирующего эффекта (принятого за 100%). Данный вывод подтверждается данными, полученными в опытах ex vivo и in vitro.

Нами установлено, что действие острого отравления метанолом вызывало инициацию ПОЛ. Это характеризовалось уменьшением под влиянием яда активности каталазы и пероксидазы, характеризующей антиоксидантную систему, соответственно в 1,6 и 1,56 раза (p<0,05). Основной продукт ПОЛ малоновый диальдегид (МДА) при остром отравлении метанолом существенно повышался в 1,36 раза (p<0,05).

При вычислении коэффициентов корреляции между числом АОК к ЭБ, реакцией ГЗТ при остром отравлении метанолом и содержанием каталазы в крови установлено, что они составляли соответственно 0,715 (p<0,05) и 0,742 (p<0,05) [n=9]. Коэффициенты корреляции между содержанием МДА в крови и показателями иммунного статуса при действии метанола составляли от -0,707 до -0,781.

3. Коррекция нарушений механизмов регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении метанолом

Установлено, что метанол (1,0 DL₅₀) вызывал снижение числа АОК к ЭБ и Vi-Ag cоответственно в 2,02 и 2,07 раза (p<0,05). Применение после отравления метанолом этанола (конкурентный ингибитор алкогольдегидрогеназы) приводило к супрессии данных параметров в 2,70 и 2,85 раза (p<0,05) соответственно.

Применение этанола усиливало супрессию реакции ГЗТ под влиянием острой интоксикации метанолом. Так, метанол снижал показатель в 1,63 раза (p<0,05), а комбинированное действие спиртов приводило к редукции формирования ГЗТ в 2,33 раза (p<0,05). Аналогичные изменения отмечались при изолированном действии метанола и его комбинации с этанолом на активность ЕКК и АЗКЦ.

При исследовании влияния антидота метанола 4-метилпиразола (бесконкурентный ингибитор алкогольдегидрогеназы) при острой интоксикации метанолом в дозе 1,0 DL₅₀на показатели системы иммунитета установлено, что 4-метилпиразол снижал супрессию гуморального иммунного ответа к тимусзависимому (ЭБ) и к тимуснезависимому (Vi-Ag) антигенам, уменьшал редукцию АЗКЦ и реакции ГЗТ, обусловленные иммунотоксическим эффектом метанола. Так, метанол приводил к снижению АОК к ЭБ и Vi-Ag, АЗКЦ и формирование ГЗТ соответственно в 1,86; 1,52; 1,78 и 1,59 раза (p<0,05), а после применения 4-метилпиразола данные показатели оставались ниже, чем в контроле в 1,40 (p<0,05); 1,25; 1,37 (p<0,05) и 1,26 раза соответственно. При этом только тимусзависимая гуморальная иммунная реакция и АЗКЦ достоверно отличались от контрольного уровня. Применение только 4-метилпиразола практически не влияло на параметры иммунного ответа.

После острого отравления метанолом при трехдневном введении индуктора Р-450-зависимых монооксигеназ фенобарбитала (ежедневно, однократно, 50 мг/кг) до интоксикации отмечалась статистически значимая редукция показателей системы иммунитета по сравнению с контролем и параметрами иммунного статуса только после интоксикации метанолом без применения индуктора Р-450-зависимых монооксигеназ фенобарбитала (p<0,05). При этом метанол, метаболизирующийся до более токсичных формальдегида и формиата [Маркизова Н.Ф. и соавт., 2004], после применения фенобарбитала вызывал супрессию антителопродукции к тимусзависимому и тимуснезависимому антигенам, активности ЕКК, уменьшение АЗКЦ и реакции ГЗТ соответственно в 2,99; 2,54; 2,80; 2,48 и 2,93 раза (p<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что редукция параметров иммунного статуса под влиянием ферментиндуцирующего средства фенобарбитала после острой интоксикации метанолом, метаболизирующегося до более токсичных соединений (феномен «летального синтеза»), более выражена, чем при изолированном действии метанола.

После использования обратимого ингибитора цитохрома Р-450 2-диэтиламиноэтил-2,2-дифенилпропилацетата (SKF-525A) внутриперитонеально в дозе 50 мг/кг за 1 сут до введения метанола иммуносупрессивные эффекты спирта статистически значимо уменьшались (p<0,05). Так, острое отравление метанолом после введения SKF-525A приводило к увеличению тимусзависимой и тимуснезависимой гуморальной иммунной реакции, ЕЦ, АЗКЦ и формированию ГЗТ по сравнению с показателями после действия токсиканта соответственно в 1,36; 1,31; 1,40; 1,24 и 1,27 раза (p<0,05). При этом все показатели оставались существенно ниже, чем в контроле (p<0,05), за исключением тимуснезависимой иммунной реакции и АЗКЦ. Препарат SKF-525A на исследованные показатели системы иммунитета существенного влияния не оказывал (табл. 5).

Таблица 5

Влияние SKF-525A при остром отравлении метанолом в дозе 1,0 DL₅₀на показатели системы иммунитета у крыс (М+m;n=7-11)

Серии опытов

АОК к ЭБ,

·10³

АОК к Vi-Ag, ·10³

ЕЦ,

%

АЗКЦ,

%

ГЗТ,

%

Контроль

1

31,4 + 3,2

23,4+2,3

28,0+2,1

12,5+1,3

32,3+2,2

SKF-525A

2

27,1 + 3,0

20,3+2,0

25,3+2,3

10,1+1,4

29,2+2,8

Метанол

3

16,2+2,1

14,7+1,7

12,3+1,8

8,2+1,1

17,2+1,6

SKF-525A + метанол

4

22,0+1,2

19,2+1,3

17,2+1,4

11,4+1,0

21,9+1,3

Различия

р0,05

1-3, 1-4,

3-4

1-3, 3-4

1-3, 1-4,

3-4

1-3, 3-4

1-3, 1-4,

3-4

Использование SKF-525A до введения метанола приводило к снижению концентрации формиата через 1 сут в селезенке в 1,56 раза (p<0,05). Это свидетельствует о том, что редукция иммунотоксичности метанола, связанная с действием SKF-525A, обусловлена снижением его метаболизма Р-450-зависимыми монооксигеназами.

Нами установлено, что использование фолината кальция в дозе 3 мг/кг трехкратно с 12-часовым интервалом после отравления метанолом в дозе 1,0 DL₅₀приводило к увеличению гуморального иммунного ответа к тимусзависимому (ЭБ) и тимуснезависимому (Vi-Ag) антигенам, активности ЕКК, АЗКЦ и реакции ГЗТ по сравнению с показателями при интоксикации. Так, фолинат кальция увеличивал число АОК к ЭБ и Vi-Ag, ЕЦ, АЗКЦ и формирование ГЗТ соответственно в 1,74; 1,98; 2,06; 1,24 и 1,68 раза (p0,05) по сравнению с параметрами при отравлении метанолом. При этом показатели системы иммунитета существенно не отличались от контрольных параметров.

При изучении иммуностимулирующих свойств миелопида и полиоксидония в опытах на крысах после острого отравления метанолом в дозе 1,0 DL₅₀установлено, что применение данных иммуностимуляторов приводило к увеличению гуморального иммунного ответа к тимусзависимому (ЭБ) и тимуснезависимому (Vi-Ag) антигенам, повышало активность ЕКК, АЗКЦ и реакцию ГЗТ по сравнению с показателями при интоксикации. Так, миелопид в дозе 10 мкг/кг при ежедневном однократном введении в течение 4 сут увеличивал число АОК к ЭБ и Vi-Ag, ЕЦ, АЗКЦ и формирование ГЗТ соответственно в 1,72; 1,71; 1,95; 1,28 и 1,64 раза (p0,05) по сравнению с параметрами при отравлении метанолом. При этом показатели системы иммунитета существенно не отличались от контрольных значений.

Использование полиоксидония в дозе 100 мкг/кг однократно, ежедневно в течение 4 сут полностью восстанавливало показатели системы иммунитета после отравления метанолом в дозе 1,0 DL_50.Так, иммуностимулятор увеличивал число АОК к ЭБ и Vi-Ag, ЕЦ, АЗКЦ и формирование ГЗТ соответственно в 1,81; 1,52; 2,50; 1,71 и 1,93 раза (p0,05) по сравнению с параметрами при отравлении метанолом. В целом эффективность полиоксидония превышала стимулирующий эффект миелопида. Так, в среднем миелопид увеличивал исследованные показатели в 1,68 раза по сравнению с параметрами при интоксикации метанолом, а полиоксидоний - в 1,89 раза.

В опытах на белых крысах нами установлено, что применение фолината кальция в дозе 3 мг/кг трехкратно с 12-часовым интервалом после отравления метанолом в дозе 1,0 DL₅₀вусловиях терапии интоксикации этанолом,миелопида в дозе 5 мкг/кг, полиоксидония в дозе 100 мкг/кг частично восстанавливало тимусзависимое и тимуснезависимое антителообразование, активность ЕКК и реакцию ГЗТ. Так, фолинат кальция увеличивал данные показатели соответственно в 1,51 (p0,05), 2,22 (p0,05), 1,49 (p>0,05) и 1,15 раза (p>0,05), миелопид - в 1,79 (p0,05), 2,45 (p0,05), 2,43 (p0,05) и 1,22 раза (p>0,05) соответственно, а полиоксидоний - соответственно в 2,12; 2,66; 3,33 и 1,77 раза (p0,05) по сравнению с показателями при интоксикации. Введение фолината кальция в комбинации с миелопидом, фолината кальция в комбинации с полиоксидонием, миелопида в комбинации с полиоксидонием обеспечивало полное восстановление всех исследованных параметров системы иммунитета.

Выводы

1. Нарушения механизмов регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении метанолом в условиях эксперимента на животных характеризуются дозозависимым снижением содержания лимфоцитов в органах системы иммунитета, тимусзависимой и тимуснезависимой антителопродукции, кооперации Т- и В-лимфоцитов, редукцией клеточных иммунных реакций. Этанол, фенобарбитал увеличивают вызванную метанолом редукцию гуморальных и клеточных иммунных реакций, а 4-метилпиразол, фолинат кальция, препарат SKF-525A, миелопид и полиоксидоний уменьшают их. При отравлении метанолом и применении его антидота этанола введение фолината кальция в комбинации с миелопидом, фолината кальция в комбинации с полиоксидонием, миелопида в комбинации с полиоксидонием обеспечивает полное восстановление всех исследованных параметров иммунной системы.

2. Под влиянием острой интоксикации метанолом отмечается прямо связанное с дозой снижение лимфоидных индексов тимуса и селезенки, содержания Т- и В-лимфоцитов в органах системы иммунитета, миграции колониеобразующих единиц из костного мозга в селезенку.

3. Острая интоксикация метанолом вызывает дозозависимое снижение тимусзависимого и тимуснезависимого антителообразования, более выраженное в продуктивной фазе антителогенеза, нарушение функции Т- и В-лимфоцитов в эффекте кооперации клеток. При этом в большей степени поражаются В-клетки по сравнению с Т-лимфоцитами, а также Th2-лимфоциты, с функцией которых связан синтез IgG, по сравнению с Th2-клетками, влияющими на продукцию В-лимфоцитами IgM. Метаболит метанола формиат в эквимолярных концентрациях оказывал более выраженный редуцирующий эффект, прямо связанный с концентрацией, на кооперацию Т- и В-лимфоцитов по сравнению с формальдегидом.

4. Под влиянием острого отравления метанолом в прямой зависимости от дозы снижаются функция Т-лимфоцитов, формирование гиперчувствительности замедленного типа в первичном и вторичном клеточном иммунном ответе, активность естественных клеток-киллеров, антителозависимая клеточная цитотоксичность. Метаболит метанола формиат в эквимолярных концентрациях оказывал более выраженный супрессирующий эффект, прямо связанный с концентрацией, на функцию естественных клеток-киллеров по сравнению с формальдегидом.

5. Редукция иммунных реакций при остром отравлении метанолом прямо связана с концентрацией кортикостерона в плазме крови и показателями перекисного окисления липидов. Ингибирование эстераз Т-лимфоцитов токсикантом не выявлено.

6. Антидот метанола этанол, индуктор Р-450-зависимых монооксигеназ фенобарбитал увеличивают вызванную метанолом редукцию гуморальных и клеточных иммунных реакций, а 4-метилпиразол, фолинат кальция, ингибитор цитохрома Р-450 препарат SKF-525A, иммуностимуляторы миелопид и полиоксидоний уменьшают их. При интоксикации метанолом в дозе 1,0 DL₅₀(вусловиях антидотной терапии отравления этанолом) введение фолината кальция в комбинации с миелопидом, фолината кальция в комбинации с полиоксидонием, миелопида в комбинации с полиоксидонием обеспечивает полное восстановление всех исследованных параметров системы иммунитета.

Практические рекомендации

1. В экспериментах на животных наиболее информативными показателями для оценки иммуносупрессивных эффектов метанола являются тесты, характеризующие функцию В-лимфоцитов и активность Th2-клеток.

2. После острого отравления метанолом возникает супрессия показателей системы иммунитета, требующая применения медикаментозных средств для ее устранения с целью профилактики и лечения возможных инфекционных осложнений и заболеваний.

3. После острого отравления метанолом для восстановления иммунных реакций целесообразно применение фолината кальция и иммуностимуляторов миелопида и полиоксидония.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

* - публикации в печатных изданиях, входящих в перечень ВАКа РФ.

1. *Серов, В.В. Супрессия иммунных реакций, связанных с функцией Th1- и Th2-лимфоцитов и продуцируемых ими цитокинов, при остром отравлении метанолом / В.В.Серов, П.Ф. Забродский, В.Ф. Киричук // Вестник новых медицинских технологий. 2006. Т. XIII. № 4. С. 173.

2. Серов, В.В. Коррекция нарушений иммунного гомеостаза при остром отравлении антихолинэстеразными токсичными химикатами / В.В. Серов, А.В. Полников, Д.Ю. Иванов // Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. Саратов, 2006. С. 103.

3. Серов, В.В. Снижение иммунотоксичности метанола применением фолиевой кислоты / В.В.Серов, П.Ф. Забродский // Актуальные вопросы военной медицины и медицинского образования: Сборник научных работ / Под общ. ред. М.С. Громова. Саратов: Сарат. воен.-мед. ин-т, 2006. С. 125-126.

4. Серов, В.В. Влияние этанола и 4-метилпиразола на изменения иммуноток-сичности метанола / В.В.Серов, П.Ф. Забродский, А.В. Полников // Актуальные вопросы военной медицины и медицинского образования: Сборник научных работ / Под общ. ред. М.С. Громова. Саратов: Сарат. воен.-мед. ин-т, 2006. С. 126-128.

...