Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Структурно-функциональное исследование механизмов организации веретенообразной активности нейронов бочонка соматической коры крысы

Кириченко Евгения Юрьевна

03.00.13 - физиология

Ростов-на-Дону

2009

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте нейрокибернетики им. А.Б. Когана Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Южный федеральный университет»

Научный руководитель: доктор биологических наук, ст. н. с.

Сухов Александр Георгиевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шульговский Валерий Викторович

доктор медицинских наук

Мационис Александр Эдуардович

Ведущая организация: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии

(РАН, г. Москва)

Защита диссертации состоится « 21 » мая 2009 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д. 212.208.07 по биологическим наукам в Южном федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105/42, ЮФУ, ауд. 203).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148.

Автореферат разослан «___» ________ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Колмакова Т.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из важнейших свойств функциональных групп нейронов мозга является ритмическая активность. Функциональное состояние коры головного мозга отражает баланс между тормозными и возбуждающими процессами в коре и проявляется в смене частотных диапазонов ЭЭГ (Гусельников, 1976; Шевелев с соавт., 1991; Шевелев с соавт., 2001). Так, дельта-ритм наблюдается в состоянии глубокого сна, а альфа-ритм характерен для спокойного и дремотного состояний (Коган, 1964; Нарикашвили с соавт., 1965; Супин, 1968; Фельдман, 1974; Вербицкий, 1980; Буриков, 1985; Ковальзон, 1993; Сухов, 1995). Ритмы тета-диапазона усиливаются в состоянии активного бодрствования при выработке рефлексов (Котляр, 1977; Шульгина, 1978; Кураев, 1982; Кирой, 1998). По данным ряда авторов, тета-ритм также участвует в механизмах квантования сенсорного потока (Гусельников, Супин, 1968; Гусельников, Изнак, 1983; Шульгина, 1978; Симонов, 1979; Данилова, 1985; Сухов, 1995). Согласно многочисленным данным, ритмы ЭЭГ играют важнейшую роль в механизмах восприятия, обработки и передачи информации в мозге и обусловлены множеством механизмов, вклад которых зависит от текущего функционального состояния и частных проявлений ритмической активности (Gray, Singer, 1989).

В классических гипотезах ритмогенеза доминируют представления о ведущей роли подкорковых структур (Буриков, 1971; Нарикашвили, 1975; Вербицкий, 1980; Буриков 1985; Чаянов, 1986; Сунцова, 2000, и соавт.; Andersen, Eccles, 1962; Steriade, et. al., 1984-1991). В настоящее время все больше сторонников приобретают представления о локальном внутрикорковом происхождении ряда проявлений ритмической активности. В частности, ведущими в развитии локальных ритмов корковых колонок рассматриваются не повторные залпы таламокортикальной синаптической активации, а эндогенные волны пейсмекерной активности, обусловленные потенциалзависимыми калиевыми, натриевыми и кальциевыми H-каналами (Семьянов, 2003; McCormick, Pape, 1990; Pape, 1996; Santoro et al., 2000). Как показано при внутриклеточной и внеклеточной регистрации импульсной и фокальной активности, в начальной стадии развития локальных автономных ритмов в корковых структурах, в частности, веретенообразной активности колонок соматической коры крысы в зоне проекции вибрисс, импульсная активность нейронов нередко отсутствует вследствие доминирования процессов гиперполяризации (Сухов, 1995; Бездудная, 2000; Сухов, Сердюк, Коняхина, 2007; Timofeev et al., 2001). Эти данные свидетельствуют о незначительном вкладе процессов, опосредованных химическими синапсами, на ранних этапах формирования этого вида активности нейронов.

В этой связи возникает вопрос относительно механизма синхронизации осцилляторной активности пейсмекерных Н-каналов разных нейронов в начальной стадии веретена. По современным данным, важную роль в электротонической синхронизации этих каналов, активируемых при гиперполяризации мембраны отдельных нейронов одной колонки, могут играть электрические дендро-дендритические синапсы, выявленные в локальных системах тормозных нейронов в разных отделах мозга млекопитающих, в том числе в соматосенсорной коре крыс (Deans et al., 2001; Galarreta, Hestrin, 2002; Fukuda, Kosaka, 2003; Connors, Long, 2004; Gibson et al, 2005). Однако до настоящего времени структурные особенности и механизмы функционирования электрических синапсов, их распределение и роль в центральной нервной системе остаются мало изученными. В частности, несмотря на то, что электрические синапсы были описаны повсеместно в коре и подкорковых структурах мозга млекопитающих, в доступной литературе не удалось обнаружить сведений о количественном соотношении электрических и химических контактов в бочонках на уровне четвертого слоя соматической коры и о возможном вкладе электрических и химических синапсов на разных этапах развития веретенообразной активности в зоне представительства вибрисс.

Целью настоящей работы являлось изучение основных структурно-функциональных закономерностей организации бочонков и возможных механизмов синхронизации фокальной веретенообразной активности в колонках (баррелях) соматической коры крысы.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить особенности пространственно-временной организации фокальной веретенообразной активности в морфофункциональных группировках нейронов четвертого слоя соматической коры крыс - в поле бочонков и в соответствующих баррелоидах таламуса. Исследовать особенности процессов синхронизации фоновой фокальной веретенообразной активности нейронов, отводимой от бочонков одного и разных рядов.

2. Провести электронномикроскопическое исследование функционально идентифицированных при микроэлектродной регистрации бочонков соматической коры крыс с целью определения ультраструктурных характеристик электрических и химических синапсов в бочонках баррельной коры крыс. Провести ультраструктурное исследование особенностей взаимного пространственного расположения электрических и химических синапсов на серийных срезах.

3. Выполнить иммуногистохимическое исследование экспрессии антигенов к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глиальному фибриллярному кислому белку (Synaptophysin, Mielin Basic Protein, Glial Fibrillar Protein, Neurofilament), которые позволяют выявить особенности пространственного распределения химических синапсов, глиальных клеток и аксонов нейронов в баррельной коре крыс.

4. Сформулировать теоретически и экспериментально обоснованную гипотезу о роли электрических и химических синапсов в локальной эндогенной генерации разных фаз веретенообразной активности в корковых бочонках с использованием собственных и литературных данных.

Научная новизна работы.

Разработан новый метод комплексного электрофизиологического, электронномикроскопического и иммуногистохимического исследования функционально и морфологически идентифицированных бочонков баррельной коры.

Впервые проведено иммуногистохимическое исследование баррельной коры с использованием антител к синаптофизину, миелину, нейрофиламентам и глиальному фибриллярному кислому белку, которое позволило обнаружить некоторые особенности структурной организации бочонков с помощью реакции «антиген - антитело».

Получены оригинальные данные об особенностях пространственно-временной организации веретенообразной активности в разных бочонках баррельной коры, идентифицированных функционально по представительству вибрисс. Показано, что медленная электрическая активность в гомологичных зонах представительства вибрисс коры и таламуса формируется более или менее независимо.

Впервые проведено исследование электрических синапсов на серийных срезах бочонков баррельной коры, оценена частота встречаемости электрических и химических синапсов и их взаимное пространственное расположение.

Сформулирована новая гипотеза о роли электрических и химических синапсов в локальном ритмогенезе в бочонках баррельной коры на разных фазах развития веретенообразной активности. Предполагается, что электрические синапсы обусловливают локальную (внутри одного бочонка) электротоническую синхронизацию начальных фаз формирования веретена, в то время как химические синапсы вносят основной вклад в дистантную синхронизацию активности различных корковых бочонков.

Научно-практическая значимость работы. На основании полученных результатов сформулирована гипотеза, согласно которой в качестве водителя ритма веретенообразной активности баррельной коры могут выступать пейсмекерные Н-каналы гиперполяризации. Синхронизацию начальной подпороговой активности пейсмекерных Н-каналов в отдельном бочонке могут обеспечивать щелевые контакты или электрические синапсы. В дальнейшем, когда ритмические потенциалы достигают порога импульсной активности, в процесс синхронизации ритма в разных бочонках включаются химические синапсы.

Полученные результаты и разработанные методы комплексного морфофункционального исследования могут быть использованы как студентами и аспирантами-физиологами, так и морфологами при исследовании механизмов синхронизации и структурной организации баррельной коры крыс, а также для подробного изучения ультраструктуры электрических и химических синаптических контактов.

Основные положения, выносимые на защиту:

В пределах таламокортикальной системы крыс в гомологичных зонах представительства вибрисс наблюдается относительно независимое формирование медленной электрической активности в коре и таламусе.

Генерация веретенообразной активности имеет локальный эндогенный характер в каждом бочонке баррельной коры крыс без закономерного разделения соседних бочонков на ведущие или ведомые, без фиксированной последовательности их вовлечения в ритмогенез.

Бочонки баррельной коры имеют особую клеточную и синаптическую организацию, а ультраструктура, количество и локализация электрических синапсов в баррелях позволяет рассматривать их как структуры, обеспечивающие электротонический этап синхронизации локального эндогенного ритмогенеза.

Ведущую роль в локальной внутриколончатой синхронизации фокальной веретенообразной активности играют электрические дендро-дендритические синапсы, которые обеспечивают электротоническую синхронизацию гиперполяризационной активности нейронов одного бочонка, особенно в начальной нарастающей фазе веретена, когда импульсная активность еще подавлена и химические синапсы не активизированы.

Предложена новая гипотеза о механизме развития начальных фаз веретенообразной активности в поле бочонков соматической коры крыс, в которой ведущая роль отводится электротонической синхронизации активности нейронов одного бочонка и формированию элементарного ансамбля тормозных нейронов, объединенных электрическими дендро-дендритиче-скими синапсами.

Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2006» (Москва, Россия, 2006), на 10-й Школе-конференции молодых ученых «Биология XXI века» (Пущино, Россия, 2006), на 5-й Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, Россия, 2006), на 18-м Конгрессе ESRS (Европейское общество изучения сна) (Инсбрук, Австрия, 2006), на XX Конгрессе Общества физиологов имени Павлова (Москва, Россия, 2007), на Третьем Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2007), на Научно-практической школе по конфокальной и флуоресцентной микроскопии «Горизонты современной микроскопии» (Leica) (Пущинский научный центр РАН, Россия, 2007), а также на конференции «Структурно-функциональные нейро-химические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (отдел исследования мозга ГУ НИИ неврологии РАМН) (2007), на 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Функциональное состояние и здоровье человека» (Ростов-на-Дону, ЮФУ, 2008), на заседании ученого совета НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана ЮФУ.

Публикации. По теме диссертации было опубликовано 11 печатных работ, из них две статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и одна статья в журнале Neuroscience and Behavioral Physiology, общим объемом 1,524 п.л., личный вклад автора - 62,5%.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, методика, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 204 отечественных и зарубежных источника. Работа иллюстрирована 48 рисунками и двумя таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

нейрон соматический крыса

Постановка экспериментов. Объектом исследования являлись бочонки соматической коры головного мозга беспородных лабораторных белых крыс. Представленные в работе результаты были получены в опытах на 30 животных обоего пола, весом 150-200 г, которые содержались в виварии в стандартных лабораторных условиях при оптимальном температурном режиме и стандартном питании. При постановке экспериментов соблюдались «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные директором НИИ НК РГУ имени А.Б. Когана, с учетом рекомендаций ученого совета НИИ нейрокибернетики РГУ им. А.Б. Когана и заключения комиссии по биомедицинской этике Российской академии наук, а также в соответствии с международными регламентациями экспериментов на животных (Копаладзе, 1998).

Трепанацию черепа проводили под эфирным наркозом ручным трепаном диаметром 3 мм, края кожных разрезов дополнительно инфильтрировали 1%-м раствором новокаина. После трепанации подачу эфирного наркоза останавливали, крыс обездвиживали введением d-тубокурарина внутримышечно (2 мг на 1 кг веса) и затем переводили на искусственное дыхание, обеспечивая частоту дыхания один раз в секунду.

Электрофизиологические методы исследования. Для отведения фокальной активности отдельных бочонков и баррелоидов таламуса использовали стеклянные капиллярные микроэлектроды, заполненные 2,5 М раствором NaCl, сопротивлением 2-5 МОм и диаметром кончика менее 1 мкм. Для регистрации активности соседних баррелей использовались склейки из четырех-шести микроэлектродов с расстоянием между кончиками 200-400 мкм. Микроэлектроды погружали в мозг с помощью микроманипуляторов ММ-1 с шагом погружения 10 мкм под контролем микрометра. Колонки коры определяли по первичному ответу при отклонении соответствующей вибриссы, а также оценивали на слух нейронную активность, трансформированную в звуковые сигналы. Регистрация фоновой активности производилась через АЦП L-205 (аналологово-цифровой преобразователь LCard, Россия). После регистрации электрической активности кончики регистрирующих микроэлектродов обрезали и оставляли в ткани мозга для определения расположения микроэлектродов в конкретном барреле по локализации их треков при последующем гистологическом контроле.

Морфологические методы исследования. В конце эксперимента крысам вводили нембутал в дозе 60 мг/кг и проводили транскардиальную перфузию головного мозга вначале изотоническим раствором фосфатного буфера, затем раствором 4%-го параформальдегида (Sigma) на 0,1-молярном фосфатном буфере (рН 7,2-7,3). Скорость перфузии соответствовала скорости движения крови по сосудам. После окончания перфузии головной мозг извлекали, далее на вибратоме VT 1000E (Leica, Германия) изготавливали тангенциальные срезы толщиной 100 мкм по ходу микроэлектродного трека. Срезы просматривали под световым микроскопом, баррели обычно обнаруживали на глубине 400-800 мкм от поверхности коры. В дальнейшем толстые срезы c идентифицированной баррельной корой использовали для светооптического и иммуногистохимического (10 животных) и электронно-микроскопического (10 животных) исследования.

Обработку материала для электронной микроскопии проводили по общепринятой методике (Robenson, Gray, 1990; Bozzola, Russell, 1992). Одиночные и серийные ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме Ultracut-E (Leica, Германия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе EM-208 (Philips, Нидерланды).

Для иммуногистохимического исследования баррельной коры использовали первичные мышиные моно- и кроличьи поликлональные антитела против нейрофиламентов (Neurofilament), основного белка миелина (Mielin Basic Protein), глиального фибриллярного кислого белка (Glial Fibrillar Acid Protein), синаптофизина (Synaptophysin) и систему визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (AEC) (antirabbit, antimouse), Dako (Германия).

Методы анализа биоэлектрической активности. Для анализа фоновой фокальной активности длительностью 30-60 секунд использовался метод статистического анализа временных рядов - спектральный анализ Фурье из пакета Statistica 5.0 Stat Soft. Средние спектры мощности, спектры когерентности и фазовые спектры с шагом по частоте 1 Гц изучали с помощью программы Spectrum.

Морфометрические методы исследования. Для морфометрического анализа ультраструктуры электрических и химических синапсов при помощи системы ввода и анализа изображений электронного микроскопа EM-208 производилась запись изображений с исходным увеличением 8900 и 44000 в графическом формате .tif. Морфометрию проводили на IBM PC/AT-486 с использованием входящего в систему лицензированного программного пакета AnalySis (Нидерланды). Результаты исследований обрабатывались статистически и представлялись в виде таблиц и графиков. Для статистической обработки использовали пакет программ Statistica for Windows 6.0 (Боровиков, 2001).

Результаты исследования

Организация веретенообразной активности в моносинаптически связанных бочонках и соответствующих им баррелоидах коры и таламуса.

При визуальном анализе полученных в экспериментах записей фокальной биоэлектрической активности коры и таламических ядер обнаружено, что веретена коры имели различную форму и длительность, которая колебалась от одной до нескольких секунд. При этом, как правило, наблюдались существенные расхождения во времени начала и окончания веретен в коре и таламусе, а также различия в частотных и амплитудных характеристиках внутриверетенных волн в этих структурах.

Так, в случае, представленном на рисунке 1, начальная стадия коркового веретена характеризовалась двумя медленными отрицательными потенциалами, в таламусе же начало веретена сопровождалось одним положительным пиком, ассоциированным с торможением импульсной активности нейронов (рис. 1). Проведенный анализ частотной сонастройки в процессе формирования веретен в коре и таламусе показал, что при формировании более частых колебаний (17-18 Гц) в коре подобных частот в таламических ядрах не наблюдается. Отражение в таламусе находят только более низкие (8-9 Гц) частотные колебания. К примеру, на рисунке 1 в таламусе веретено начинается с положительной волны гиперполяризации без предшествующего возбуждения импульсной активности. Первая положительная волна ассоциирована с торможением импульсной активности нейронов, активация импульсной активности наблюдается только в середине развития веретена.

В различных экспериментах рассчитанные значения коэффициентов корреляции между ритмической активностью коры и ядер таламуса были менее 0,45, что значительно ниже коэффициентов корреляции между фоновой ритмической активностью таламических ядер, значения которых близки к единице (>0,85). Анализ спектров мощности показал, что в таламусе преобладают частоты 1-3 Гц, тогда как в коре - 1-11 Гц. Анализ спектров когерентности выявил большую когерентность между ядрами таламуса, чем между корой и таламусом, что может свидетельствовать в пользу более выраженной синхронизации внутри таламических структур, по сравнению с таламокортикальными. Фазы усредненного кросспектра показали противофазное развитие веретенообразной активности в коре и таламусе и, наоборот, синфазное развитие веретенообразной активности внутри таламуса практически на всех частотах.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об относительно независимом характере формирования фоновой веретенообразной активности в бочонках коры и баррелоидах таламуса.

Рис. 1. Индивидуальные особенности развития веретенообразной активности в коре (3) и таламусе (1, 2) в состоянии спокойного бодрствования; Условные обозначения: 1 - релейное ядро таламуса - баррелоид D3, 2 - релейное ядро таламуса - баррелоид D2, 3 - соматическая кора, стрелкой обозначена импульсная активность, пунктирные линии показывают частотную сонастройку коры и таламуса, звездочкой обозначена противофазность активности коры и таламуса

Пространственно-временная организация веретенообразной активности в баррельной коре.

Исследование фокальной фоновой биоэлектрической активности, одновременно регистрируемой от разных бочонков четвертого слоя первичной соматосенсорной коры крыс S1, выявило во всех экспериментах периодически возникающую волновую веретенообразную активность с длительностью веретен от 500 мс до 24 секунд, чаще 1-2 секунды. Однако, когда в бочонке одного ряда гранулярного слоя S1 регистрировались высокоамплитудные ритмичные потенциалы, модулированные в характерные «веретена», в бочонке другого ряда могли наблюдаться меньшие по амплитуде ритмичные осцилляции (рис. 2). На приведенном рисунке 2 веретена, регистрируемые в бочонке C3, начинались только на третьем пике внутриверетенных потенциалов, зарегистрированных в бочонке D2. На шестнадцатом пике у веретен бочонка C3 уменьшалась амплитуда, в то время как в бочонке D2 она оставалась прежней. Кроме того, веретена, регистрируемые в одном бочонке, могли заканчиваться и начинаться раньше, чем регистрируемые в другом бочонке.

Рис. 2. Фоновая веретенообразная активность двух соседних баррелей

На рисунке 3 представлен один из примеров фоновой веретенообразной активности, регистрируемой тремя микроэлектродами, расстояние между кончиками которых было не более 200 мкм. Проведенный после данного эксперимента гистологический контроль локализации микроэлектродов позволил установить, что два микроэлектрода из склейки были погружены в один бочонок ряда С (полость - 1, стенка - 2), а третий микроэлектрод отводил ритмическую активность от бочонка соседнего ряда D (рис. 3, б). Поскольку в данном случае все три микроэлектрода находились на достаточно близком расстоянии друг от друга, можно было ожидать веретена одинаковой длительности, амплитуды с одинаковым количеством пиков внутриверетенных потенциалов. Однако даже при визуальном анализе приведенных на рисунке 3 записей веретенообразной активности очевидно, что веретено на третьем канале, отводимое от бочонка ряда D, начинается позже, имеет меньшую длину и амплитуду, по сравнению с веретеном бочонка ряда С. Корреляционный анализ показал, что коэффициент корреляции данных, полученных от бочонка ряда C, составил 0,92, тогда как коэффициенты корреляции данных от разных бочонков (D и С) составили 0,56 и 0,65 соответственно. Полученные данные свидетельствуют о достоверно более высокой синхронизации внутриверетенных потенциалов внутри одного бочонка, по сравнению с бочонками различных рядов.

Таким образом, результаты спектрального анализа фоновой биоэлектрической активности, зарегистрированной в разных бочонках различных рядов четвертого слоя соматической коры крыс, показали возможность асинхронного развития веретенообразной активности в разных бочонках, различия в степени выраженности веретенообразной активности в разных баррелях соматической коры крыс.

Анализ когерентности фокальной биоэлектрической активности, зарегистрированной в двух бочонках одновременно, показал более высокую согласованность изменения потенциалов внутри одного бочонка, чем между двумя баррелями, т.е. выявил большую синхронизацию активности внутри одного бочонка. Согласно проведенному статистическому анализу фаз усредненного кросспектра, наблюдается согласование фазовых отношений в пределах одного бочонка поля баррельной коры. Вместе с тем у разных бочонков наблюдаются значимые различия.

Рис. 3. Ритмическая активность двух колонок соматической коры крысы.

Макро- и микроскопическая организация баррельной коры и экспрессия основных антигенов, специфичных для нервной ткани.

При исследовании тангенциальных серийных срезов соматической коры головного мозга толщиной 100 мкм, сделанных на вибротоме, структуры баррелей обнаруживаются на глубине 400-600 мкм от поверхности коры независимо от выбранного (левого или правого) полушария. Баррельная кора идентифицируется на срезах в виде компактных ячеистых структур, названных из-за своей формы бочонками или баррелями, стенки ячеек оптически более плотные, нежели середина. Результаты морфологического и иммуногистохимического исследования показали, что баррельную кору невозможно идентифицировать на тонких срезах, применяя стандартные гистологические методы, такие как окраска гематоксилином и эозином.

Изучение экспрессии основных нейроспецифичных антигенов позволило установить, что в стенках баррелей наблюдается повышенная по сравнению с центральной частью экспрессия белка синаптофизина, что позволяет после проведения иммуногистохимической реакции идентифицировать характерное сетчатое строение баррельной коры даже на срезах, толщина которых не превышает 4 мкм, чего ранее в литературе никем не отмечалось (рис. 4). Это свидетельствует о большем содержании синаптических везикул и, следовательно, химических синапсов в стенках баррелей.

Изучение серийных срезов баррельной коры после проведения иммуногистохимической реакции с моноклональными антителами к нейрофиламентам показало, что характерный ячеистый рисунок выявляется очень слабо, в отличие от реакции на синаптофизин. Наблюдаются небольшие колебания плотности, однако четко идентифицировать стенки и среднюю часть отдельных баррелей практически невозможно.

Иммуногистохимическая реакция с первичными антителами к синаптофизину.

Условные обозначения: ПК - просветы капилляров, звездочками обозначены менее интенсивно окрашенные полости бочонков, пунктирными линиями обведены границы бочонка. Увел. 100

Изучение срезов баррельной коры после проведения иммуногистохимической реакции с антителами против глиального фибриллярного кислого белка показало, что в центральной части каждого барреля располагается скопление астроцитов и их отростков, благодаря чему баррели легко идентифицировать. Выявленные в нашем исследовании особенности расположения этих глиальных клеток в баррельной коре свидетельствуют об особом значении астроглии для обеспечения структурно-функциональной организации колонок. Изучение экспрессии основного белка миелина показало, что этот антиген распределен в баррельной коре равномерно. На больших увеличениях визуализируются многочисленные окрашенные миелинизированные мелкие аксоны, срезанные в продольном и поперечном направлении. В целом распределение миелинизированных нервных волокон, по-видимому, относительно равномерно как в стенках, так и в центральной части бочонков.

Рис. 4. Экспрессия синаптофизина в срезах баррельной коры неокортекса крыс

Электронномикроскопическое исследование синаптической организации баррельной коры и ультраструктурных особенностей электрических синапсов.

Проведенное электронномикроскопическое исследование синаптической организации отдельных бочонков корковых колонок показало, что как в стенке, так и в центральной части баррелей кроме типичных химических синапсов обнаруживаются электрические синапсы или щелевые контакты, как правило, между тонкими отростками, имеющими ультраструктуру мелких дендритов, шипиков, а иногда и аксонов.

Чаще всего электрические синапсы расположены рядом с химическими - аксошипиковыми или аксодендритическими. При этом, если щелевой контакт находится в плоскости среза, то щель химического синапса нередко не попадает в плоскость, что, по-видимому, связано с особенностями расположения этих контактов на дендритах. В отдельных случаях в отростках, формирующих электрические синапсы, обнаруживаются синаптические везикулы, и эти отростки, судя по всему, являются аксонами, нередко один из отростков можно идентифицировать как шипик или дендрит. Некоторые электрические синапсы сформированы теми же отростками, что и химические.

Как правило, химические и электрические синапсы расположены настолько близко, что наблюдается контакт плазмалемм одного из отростков, формирующих электрический синапс, с отростком, являющимся постсинаптической или, гораздо реже, пресинаптической частью химического синапса, при этом обе синаптические щели могут находиться строго в плоскости среза, о чем свидетельствует ультраструктура их синаптической щели.

Все обнаруженные нами электрические синапсы были строго прямой формы, т.е. не имели кривизны, характерной для активной зоны химических синапсов. В зоне стенок бочонков встречаются щелевые контакты с подобием перфорации активной зоны. К особенностям электрических контактов стенок бочонков также можно отнести наличие двойных щелевых контактов, в центральной части баррелей они не встречались. Двойные щелевые контакты имеют характерное строение: это две активные зоны, которые всегда расположены под углом друг к другу, при этом такие контакты образованы не двумя, а тремя отростками. В месте перегиба активной зоны контакт прерывается, обе синаптические щели всегда находятся в плоскости среза. Практически все двойные щелевые контакты, которые нам удалось обнаружить, были локализованы в постсинаптической части химического синапса.

Анализ ультраструктуры двойных и одинарных щелевых контактов при большом увеличении показал, что контакт имеет семь слоев: это две трехслойные мембраны, между которыми имеется узкая электронно-прозрачная щель. Ширина синаптической щели составляет около 3 нанометров, в ней определяются электронно-плотные поперечные тяжи или скопления электронно-плотного материала в виде ячеек (рис. 5). На цитоплазматической стороне мембран, формирующих электрический синапс, также имеются небольшие скопления хлопьевидного электронно-плотного материала, «опушающего» контактирующие мембраны с обеих сторон. Все обнаруженные нами щелевые контакты имели одинаковую ультраструктуру, независимо от того, где они располагались и какие отростки (нервных или глиальных клеток) их образовывали. На телах нейронов щелевые контакты не обнаружены.

Рис. 5. Ультраструктура синаптической щели электрического синапса (указан стрелкой).

Увеличение 131 500

Проведенное морфометрическое исследование показало, что обнаруженные нами щелевые контакты по своим основным ультраструктурным параметрам соответствуют описанным в литературе. Ширина синаптической щели электрических синапсов колеблется от 2,9 до 4,4 нм и в среднем составляет 3,5 нм. В среднем площадь отростков, формирующих щелевые контакты, составила 0,7 мкм2. Достоверных различий в количественных характеристиках между электрическими синапсами центральной части баррелей и их стенок не обнаружено. Подсчет числа электрических и химических синапсов показал, что количество электрических синапсов составляет 7% от общего числа синаптических контактов в бочонке.

Для подробного изучения особенностей расположения электрических синапсов относительно химических синаптических контактов был проведен анализ серийных срезов баррельной коры. С этой целью были изготовлены несколько серий, состоящих из 6-12 последовательных срезов толщиной 50-60 нм, что позволяет проанализировать определенные ультраструктуры (в нашем случае - электрические и химические синапсы) в трехмерном пространстве. Такой анализ дает представление о расположении и строении исследуемых объектов в объеме. Всего на различных сериях просмотрено семь электрических синапсов. Анализ начинали с центрального среза каждой серии, на нем находили щелевой контакт, который потом исследовали и на других срезах серии. Серии получены как со стенок, так и с центральной части баррелей.

Проведенный анализ показал, что все электрические синапсы, включая те, которые на одиночных срезах не имеют связи с химическими синаптическими контактами, при анализе их локализации в объеме на самом деле контактируют с одним или с обоими отростками, формирующими химический аксошипиковый или аксодендритический синапс. Причем хотя бы на одном из срезов серии можно наблюдать близкое расположение щелевого контакта и щели химического синапса. В некоторых случаях щелевой контакт расположен так, что находится в непосредственной близости от активной зоны химического синапса, в других случаях наблюдается только контакт плазмалемм отростков синапсов различного типа. Интересно, что в одной из анализированных серий срезов в объеме выявлено два аксошипиковых синапса на одном аксоне, которым соответствуют два различных по локализации щелевых контакта, из чего можно сделать заключение, что каждый щелевой контакт каким-то образом связан только с одной активной зоной химического синапса.

Таким образом, взаимное расположение химических и электрических синаптических контактов может говорить об их кооперированной деятельности, в частности, об осуществлении функции синхронизации ритмической активности. Электрические синапсы могут синхронизировать подпороговый сигнал, обеспечивая локальную синхронизацию, а многочисленные химические синапсы, в том числе перфорированные, могут осуществлять дистантную синхронизацию сигнала, достигшего порогового значения, итогом чего может быть появление первичного спайка. Благодаря взаимной кооперированной деятельности обоих типов синаптических контактов, осуществляющих синхронизацию ритмической активности, и возможно полноценное формирование веретена.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Существующие гипотезы ритмогенеза веретенообразной активности выдвигают на роль генераторов ритма различные подкорковые и корковые структуры. В классических гипотезах центральную роль в ритмогенезе веретен отводят таламическим структурам, при этом кора является ведомой, вторично вовлекаемой в ритмическую активность (Нарикашвили, 1975; Буриков с соавт., 1985; Andersen, Eccles, 1962; Andersen, Andersson, 1968). В соответствии с другими гипотезами, не только таламус, но и целый ряд подкорковых структур может участвовать в процессе формирования ритма веретен (Могилевский, Романов, 1989; Сунцова, 2000; Sterman, Clemente, 1961 и др.). Имеются также работы, посвященные изучению способности неокортекса к самостоятельной осцилляторной активности (Серков с соавт., 1963; Дуринян, 1975; Кратин, Сотниченко, 1987; Lopes de Silva, 1978; Contreras et al., 1996; Fuentealba et al., 2004 и др.). Однако, несмотря на многочисленные гипотезы, не существует единой теории происхождения ритмической веретенообразной активности в головном мозге млекопитающих.

В наших экспериментах по отведению фокальной биоэлектрической активности из одного и нескольких бочонков баррельной коры были выявлены заметные отличия в характеристиках веретенообразной активности. Так, если в одном бочонке наблюдались высокоамплитудные продолжительные веретена, то в другом бочонке одновременно могли регистрироваться веретена меньшей амплитуды и длительности, позднее формирующиеся и раньше заканчивающиеся. Амплитуда внутриверетенных потенциалов могла по-разному варьироваться в разных бочонках. Подобные отношения наблюдались и в пределах таламических структур. Эти результаты не соответствуют гипотезе о наличии единого водителя ритма, локализованного либо в коре, либо в подкорковых структурах, и свидетельствуют о наличии независимого, автономного локального генератора веретен в отдельных бочонках.

Выявленные в настоящей работе щелевые контакты баррельной коры имели ультраструктуру типичных электрических синапсов, которые описаны в работах других авторов (Galarreta, Hestrin, 2002; Fukuda, Kosaka, 2003). Как показано в этих и других исследованиях, щелевые контакты, имеющие описанную специфическую ультраструктуру, могут выполнять роль специализированных межклеточных каналов коммуникации, в состав которых входят трансмембранные канальные белки коннексины, обеспечивающие электрическую связь между цитоплазмами соседних нейронов. Наличие электрических дендро-дендритических синапсов у звездчатых нейронов бочонков соматической коры крысы, выявленное в настоящем исследовании, согласуется с результатами исследований, выполненных рядом других авторов, преимущественно на переживающих срезах других отделов мозга крыс (Beierlein et al., 2000; Deans et al., 2001; Amitai et al., 2002; Connors, Long, 2004). В этих работах было установлено наличие электротонической связи между нейронами за счет электрических синапсов, что позволило предполагать их участие в синхронизации ритмической активности мозга, которая, однако, отсутствует при работе со срезами коры.

Установленный в наших экспериментах на целом мозге локальный характер ритмогенеза веретен, индивидуальный для каждой колонки, свидетельствует об участии электрических синапсов между дендритами звездчатых нейронов одного бочонка в электротонической синхронизации пейсмекерных гиперполяризационных потенциалов нейронов этого бочонка в начальной нарастающей фазе развития веретена, когда вследствие гиперполяризации мембраны еще отсутствуют импульсные разряды нейронов. Импульсная активность нейронов появляется только на вершине веретена за счет посттормозной активации низкопороговых кальциевых каналов, что показано при внутриклеточном исследовании веретенообразной активности (Timofeev et al., 2001) и наблюдалось нами при внеклеточной регистрации импульсной активности. Появление этой импульсной активности на вершине веретена способствует не только локальной, как у электрических синапсов, но и более дистантной синхронизации веретенообразной активности между удаленными корковыми колонками за счет аксонных связей и химических синапсов, что и отмечалось в наших опытах.

Полученные нами в морфологической части работы результаты позволяют сделать вывод об особой синаптической организации баррельной коры, отражением которой является, в первую очередь, выявленная разница в плотности химических синапсов между стенками и центром отдельных бочонков. Установленное в настоящем исследовании при анализе серийных срезов близкое расположение и даже контакт химических и электрических синапсов, а также наличие этих синаптических контактов на одном отростке нервной клетки баррельной коры крыс также может говорить об их совместном участии в процессах синхронизации ритмической активности разных корковых колонок.

Ранее методом окрашивания по Гольджи был выявлен асимметричный характер ориентации дендритов звездчатых нейронов, направленный в полость соответствующего бочонка, причем у 85% клеток дендриты и их отростки не выходили за пределы соответствующего бочонка (Сухов, 1992). Позднее эти результаты были подтверждены и данными зарубежных исследований (Lubke et al., 2000). Для локального ритмогенеза это является важной особенностью структурной организации колонок нейронов, так как создает оптимальные предпосылки для формирования электрических дендро-дендритических синапсов нейронов одного бочонка. По-видимому, именно поэтому в работах на срезах мозга электротонические связи между парами внутриклеточно регистрируемых нейронов наблюдались на близких расстояниях между клетками, не превышавшими 200 мкм, что соответствует среднему размеру одного бочонка, выявленному в целом ряде работ (Beierlein et al., 2000; Amitai et al., 2002; Connors, Long, 2004).

Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют в пользу наличия элементарного ансамбля тормозных интернейронов бочонка четвертого слоя соматической коры. По нашему мнению, такой ансамбль интернейронов участвует в механизмах генерации и развития веретенообразной активности в поле бочонков соматической коры крыс с ведущей ролью электротонической синхронизации эндогенной осцилляторной активности нейронов одного бочонка. Одну из главных ролей в локальной (внутри колонок) синхронизации фокальной веретенообразной активности играют электрические дендро-дендритные синапсы, которые, по нашим данным, составляют около 7% от общего числа синаптических контактов в баррельной коре и расположены в непосредственной близости от химических синапсов. Электрические синапсы обеспечивают электротоническую синхронизацию гиперполяризационной осцилляторной активности нейронов одного бочонка, особенно в начальной нарастающей фазе веретена, когда импульсная активность еще подавлена и химические синапсы не активизируются. Эти результаты свидетельствуют в пользу гипотезы об эндогенном происхождении веретенообразной активности внутри каждого отдельного бочонка.

ВЫВОДЫ

1. С использованием методов спектрального и корреляционного анализа фокальной электрической активности, регистрируемой одновременно в зонах представительства вибрисс в таламусе и соматической коре белых крыс, показано, что фоновая веретенообразная активность внутри баррелоидов и бочонков развивается относительно независимо. Полученные данные указывают на возможность индивидуального развития ритмической активности на уровне таламуса и соматической коры.

2. При одновременном отведении активности от бочонков разных рядов соматосенсорной коры обнаружена более высокая степень синхронизации фокальной веретенообразной активности в бочонках одного ряда, тогда как фазовые сдвиги колебаний, регистрируемых от бочонков разных рядов, могли достигать 1800. Полученные результаты указывают на важную роль синхронизации активности в структурно-функциональных группах нейронов соматической коры - бочонках.

3. Иммуногистохимическое исследование баррельной коры крыс показало, что в стенках баррелей наблюдается повышенная, по сравнению с центральной частью, экспрессия белка синаптофизина. Это свидетельствует о большем количестве в стенках баррелей химических синапсов и позволяет идентифицировать баррельную кору даже на тонких срезах. В отдельных баррелях определяются группы астроцитов, что может указывать на структурно-функциональную неоднородность поля бочонков. При маркировании нейрофиламентов выявлена интенсивная реакция как на телах, так и на отростках нейронов.

4. При ультраструктурном исследовании поля баррельной коры крыс обнаружены многочисленные щелевые контакты, имеющие ультраструктуру типичных электрических синапсов. Морфометрическое исследование показало, что электрические синапсы составляют около 7% от общего числа идентифицированных синапсов, они встречаются равновероятно в полости и в стенке бочонка и располагаются на отростках мелких дендритов, тогда как на телах клеток отсутствуют. На серийных элекроннограммах обнаружено, что в большинстве случаев щелевые контакты расположены в непосредственной близости и нередко контактируют с химическими синапсами.

5. Результаты проведенного комплексного исследования позволяют сформулировать предположение о том, что локальную подпороговую (до генерации импульсов) синхронизацию активности нейронов в пределах одного бочонка в период первых фаз веретена обеспечивают электрические синапсы, более поздние этапы синхронизации обеспечиваются химическими синапсами. Возрастание гиперполяризации мембраны нейронов с участием электрических синапсов приводит к активации калиевых и кальциевых Н-каналов, а этот процесс, в свою очередь, инициирует активацию химических синапсов и формирование полного цикла веретена. Существенный вклад в локальный эндогенный ритмогенез в отдельных баррелях соматической коры вносит пространственная близость электрических и химических синапсов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В ЖУРНАЛАХ, РЕКОМЕНДОВАННЫХ ВАК РФ

Кириченко, Е.Ю. Роль электрических синапсов в электротонической синхронизации веретенообразной активности в корковых колонках / Е.Ю. Кириченко, А.К. Логвинов // Валеология. - 2008. - № 3. - С. 57-62 (0,375 п.л., личный вклад - 50%).

Кириченко, Е.Ю. Роль щелевых контактов в локальном ритмогенезе корковых колонок / Е.Ю. Кириченко, П.Е. Повилайтите, А.Г. Сухов // Морфология. - 2008. - Т. 133, № 1. - C. 31-34 (0,25 п.л., личный вклад - 30%).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Kirichenko, E.Yu. The role of electrical synapses in the organization of spindle activity on the rat barrel cortex / E.Yu. Kirichenko, P.E. Povilaitite, A.G. Sukhov // Journal of Sleep Research. - 2006. - V. 15. - P. 105 (0,025 п.л., личный вклад - 30%).

Сухов, А.Г. Структурные предпосылки внурикорковой организации фокальной веретенообразной активности колонок соматосенсорной коры / А.Г. Сухов, П.Е. Повилайтите, Е.Ю. Кириченко // Морфология (спец. вып.). - 2006. - С. 103 (0,025 п.л., личный вклад - 30%).

Кириченко, Е.Ю. К вопросу о механизмах генерации и синхронизации веретенообразной активности / Е.Ю. Кириченко // Материалы конференции «Биология XXI века» (Москва, Россия, 2006). - М., 2006. - С. 23-24 (0,125 п.л., личный вклад - 100%).

Кириченко, Е.Ю. Возможная роль электрических синапсов в ритмической активности соматической коры крысы / Е.Ю. Кириченко // Материалы конференции «Ломоносов - 2006» (Москва, Россия, 2006). - М., 2006. - С. 90 (0,025 п.л., личный вклад - 100%).

Кириченко, Е.Ю. Иммуногистохимическое исследование баррельной коры крыс / Е.Ю. Кириченко // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Структурно-функциональные, нейрохимические и иммунохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга» (Москва, Россия, 2007). - М., 2007. - С. 291-295 (0,312 п.л., личный вклад - 100%).

Кириченко, Е.Ю. Ультраструктурное исследование электрических синапсов баррельной коры крысы / Е.Ю. Кириченко // Материалы конференции «Ломоносов - 2007» (Москва, Россия, 2007). - М., 2007. - С. 37 (0,0625 п.л., личный вклад - 100%).

Кириченко, Е.Ю. Ультраструктурное и иммуногистохимическое исследование синаптоархитектоники баррельной коры крысы / Е.Ю. Кириченко, А.Г. Сухов, П.Е. Повилайтите // Материалы Третьего Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Крым, Украина, 2007). - Судак, 2007. - С. 64-65 (0,025 п.л., личный вклад - 30%).

Кириченко, Е.Ю. Морфофункциональное исследование электрических синапсов баррельной коры головного мозга крыс / Е.Ю. Кириченко, П.Е. Повилайтите // Материалы Конгресса Общества физиологов (Москва, Россия, 2007). - М., 2007. - С. 115 (0,025 п.л., личный вклад - 50%).

Kirichenko, E.Yu. Role of gap junctions in local rhythmogenesis in cortical columns / E.Yu. Kirichenko, P.E. Povilaitite. A.G. Sukhov // Neuroscience and Behavioral Physiology. - 2008. - V. 39, № 2. - P. 199-202 (0,25 п.л., личный вклад - 30%).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭЭГ - электроэнцефалограмма

ЦНС - центральная нервная система

H-каналы - каналы, активируемые на гиперполяризацию

М - молярность

Работа поддержана грантом РФФИ № 07-04-00424 и грантом Минобразования № 2.1.1/1129

Размещено на Allbest.ru