Особенности иммунного статуса у больных с сочетанными формами хронических вирусных гепатитов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Особенности иммунного статуса у больных с сочетанными формами хронических вирусных гепатитов

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Путилова Е.А.

Владивосток 2013

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тихоокеанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Иванис Виктория Александровна

Официальные оппоненты:

Кузнецова Татьяна Алексеевна, доктор медицинских наук, заведующая отделом иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова» Сибирского отделения РАМН

Калинина Елена Петровна, доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Владивостокского филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института медицинской климатологии и восстановительного лечения (ВФ ДНЦ ФПД СО РАМН-НИИ МКВЛ)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Вирусные гепатиты в современной медицине продолжают сохранять лидирующие позиции среди всех инфекционных заболеваний. Актуальность проблемы обусловлена повсеместным распространением, изменением структуры вирусных гепатитов с тенденцией к росту хронических форм патологии, а также социально-экономическими потерями, связанными с дороговизной курации пациентов. Несовершенства диагностики, терапии и профилактики вирусных гепатитов обусловливают высокие уровни заболеваемости, инвалидизации и летальности населения. Академиком Н.Д. Ющук на IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням данная проблема названа «тяжелым бременем для России».

Ключевыми открытиями второй половины XX века определена самостоятельность вирусов B, C, D и ассоциированных с ними заболеваний, которые имеют особое социальное значение, как основные факторы хронических поражений печени, приводящие к высокому уровню летальности при развитии декомпенсированного цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Отечественные корифеи гепатологии и инфекционной иммунологии: Е.М. Тареев, А.А. Ярилин, В.А. Козлов, В.К. Козлов, А.Ф. Блюгер, С.Н. Соринсон, В.И. Покровский, В.Т. Ивашкин, А.Г. Рахманова, В.В. Малеев, И.С. Фрейдлин, Р.М. Хаитов и др. раскрыли многие принципиальные вопросы этиологии, эпидемиологии, патогенеза, верификации диагноза, течения и исходов хронических вирусных гепатитов (Абдурахманов Д.Т., 2011; Жданов К.В., 2011; Соболевская О.Л., 2011; Ющук Н.Д. с соавт., 2012).

Участие иммунной системы в развитии инфекционного процесса, персистенции вирусов и их мутаций, в формировании исходов и осложнений болезней в настоящее время не подлежит сомнению. Однако нерешенных проблем остается достаточно много.

Одной из современных особенностей вирусных гепатитов, является возможность развития сочетанной (микст) инфекции. Общие эпидемиологические особенности парентеральных гепатитов благоприятствуют сочетанию различных гепатотропных вирусов у одного инфицированного. Имеются данные, что сочетание вирусов В и С наиболее опасно в плане неблагоприятного прогноза заболевания (Афиногенова В.П., 2011; Громова Н.И., 2012; Есмембетов К. с соавт., 2012; Zuberi B.F. et al., 2008).

Эти факты характеризуют особую важность комплексного изучения проблемы микст-гепатитов. Сведения о механизмах взаимодействия гепатотропных вирусов, роли иммунных факторов в развитии основных патогенетических синдромов при сочетанных инфекциях отрывочны и противоречивы. Для более глубокого понимания патогенеза хронических вирусных микст-гепатитов необходимо изучение их клинико-иммунологических особенностей, что позволит уточнить сложные патогенетические механизмы прогрессирования заболевания, оптимизировать существующую диагностику и терапию этой категории пациентов.

Цель исследования: Изучить клинико-иммунологические особенности хронических вирусных гепатитов сочетанной этиологии и обосновать возможность иммунокоррекции выявленных нарушений.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности в функционировании ведущих факторов врожденного и адаптивного иммунитета: клеточного (субпопуляции лимфоцитов периферической крови - CD3⁺, СD4⁺, СD8⁺, CD19⁺, NK, NKT, CD25⁺, CD95⁺, HLA-DR⁺) и гуморального (системные уровни иммуноглобулинов А, М, G, циркулирующих иммунных комплексов - ЦИК, матриксной металлопротеиназы-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором - MMP-9/TIMP-2) у больных хроническими вирусными гепатитами моно- и микст-этиологии.

2. Провести сравнительный анализ сывороточного содержания цитокинов IFNг и TGFв-1 у больных хроническими вирусными гепатитами моно- и микст- этиологии с учетом клинико-биохимических показателей, вирусной нагрузки возбудителей, степени фиброза печени.

3. На основе анализа взаимосвязей ведущих клинико-биохимических и иммунологических показателей изучить дополнительные критерии прогрессирования хронического иммунного воспаления у больных хроническими вирусными гепатитами сочетанной этиологии.

4. Оценить клинико-биохимическую и иммунологическую эффективность препарата из древесины маакии амурской у пациентов хроническими вирусными гепатитами.

Научная новизна:

Выявлены общие закономерности и особенности иммунного ответа и иммунорегуляции в группах пациентов хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) с моноинфекцией и разным сочетанием вирусных агентов. Наибольшие изменения иммунного статуса (недостаточность иммунного ответа по клеточному типу, со снижением ИРИ и повышением содержания CD95⁺, HLA-DR⁺ на фоне активации гуморальных факторов) установлены у пациентов с ХВГ микст-этиологии. Определено значение дисбаланса системы матриксной металлопротеиназы-9 с ее тканевым ингибитором TIMP-2 в сочетании с нарушением продукции цитокинов (IFNг, TGFв-1) в формировании фибротических изменений ткани печени. «Продвинутые» стадии фиброза печени чаще регистрировались при сочетанных формах ХВГ (ч2=11,204; н=1; р=0,000).

Теоретическая и практическая значимость работы: Установлены различия выраженности иммунного воспаления и степени прогрессирования фиброза печени у пациентов ХВГ сочетанной этиологии по сравнению с моно-инфекцией, что расширяет представление о механизмах иммунопатогенеза поливирусной инфекции. Определены дополнительные прогностические иммунологические критерии развития фиброза печени у пациентов моно- и микст-гепатитами, выражающиеся в дефиците эндопротеазы-9 при усилении продукции ингибитора TIMP-2, более значимые при микст-гепатитах. Обоснована целесообразность применения препарата из древесины маакии амурской в терапии пациентов с ХВГ для коррекции иммунной дисфункции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Нарушения в иммунном гомеостазе у пациентов с ХВГ сочетанной этиологией по сравнению с моно-инфекцией характеризуются более глубокими изменениями параметров клеточного и гуморального факторов иммунитета.

2. Особенности иммунного воспаления у пациентов с ХВГ сочетанной этиологии характеризуются различными нарушениями клеточного иммунитета на фоне активации гуморальных факторов и зависят от доминирования репликации конкретного вирусного агента. Для тройной инфекции B+D+C отклонения в иммунном статусе наиболее выражены, что связано с синергизмом вирусных агентов и подтверждает формирование деструктивного потенциала, ведущего к фиброзу печени при полиинфекции. Гепатиту B+C свойственны умеренные иммунологические сдвиги, отличающиеся от других групп микст-гепатитов повышением активационного маркера CD25⁺, а также СD19⁺ и NKT-клеток, и увеличением продукции IFNг, что свидетельствует о наличии компенсаторных механизмов активации клеточного иммунитета. Выраженность иммунных нарушений в группе больных ХВГ B+D характеризуется значительным угнетением клеточной активации (CD25⁺ и NKT) и связана с доминированием репликационной активности HDV.

3. Дисбаланс в системной продукции цитокинов IFNг, TGFв-1, матриксной металлопротеиназы-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором являются важными звеньями развития хронического иммунного воспаления и прогрессирования фиброза печени.

4. Результаты пилотного исследования гепатопротектора из древесины маакии амурской показали его иммуномодулирующие эффекты и возможность применения препарата для коррекции иммунных нарушений у пациентов с ХВГ.

Апробация материалов работы: Результаты работы были представлены на научно-практических конференциях и симпозиумах международного, российского и регионального уровня: I, II, III, IV и V Ежегодных Всероссийских Конгрессах по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013); VII, XI, XII, XIII, XIV Тихоокеанских научно-практических конференциях студентов и молодых ученых с международным участием (Владивосток, 2006, 2010, 2011, 2012, 2013); VIII Дальневосточном региональном конгрессе с международным участием (Владивосток, 2011); ХVI, XVII, XVIII Российских конгрессах «Гепатология сегодня» (Москва, 2011, 2012, 2013); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Абакан, 2011); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011» (Санкт-Петербург, 2011); 14-ом Международном Конгрессе по Иммунологии (Kobe, Japan, 2010). Материалы диссертации легли в основу двух методических рекомендаций, утвержденных Департаментом здравоохранения Приморского края и ГБОУ ВПО ТГМУ Минздрава России, внедренных в практику работы инфекционной службы края: 1) «Иммунологические методы ранней диагностики фиброза печени при хронических моно- и микст-вирусных гепатитах» / Е.А. Путилова, И.С. Горелова, В.А. Иванис, Л.Ф. Скляр - Владивосток: ВГМУ, 2012. - 20с.; 2) «Хронические вирусные гепатиты сочетанной этиологии: аспекты эпидемиологии, иммунопатогенеза, клиники и диагностики» / И.С. Горелова, Е.А. Путилова, Л.Ф. Скляр, В.А. Иванис - Владивосток: ВГМУ, 2012 - 52с.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 26 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

Личный вклад автора: Анализ данных литературы по теме диссертации, курация, клинико-биохимическое обследование пациентов, лабораторно-иммунологические исследования (70%), статистическая обработка полученных результатов и их анализ, написание диссертации выполнены лично автором.

Объем и структура диссертационной работы: Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 339 источников, из них 253 отечественных и 86 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 44 таблицами и 14 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования: Исследование выполнено на базах кафедр инфекционных болезней и патологической физиологии ГБОУ ВПО TГМУ МЗ РФ (ректор - д.м.н., проф. В.Б. Шуматов). Иммунологические исследования проведены в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН (зав. лабораторией, д.х.н., проф. Лукьянов П.А.). За период 2008-2012 гг., обследовано 120 пациентов с ХВГ: 49 женщин (40,83%) и 71 мужчин (59,16%). Средний возраст больных ХВГ составил 35,0±3,2 года.

Первоначально больные распределены по этиологическому принципу: моно-инфекция ХГВ и ХГС по 30 человек, микст-инфекция ХГВ+С - 28 человек, ХГВ+D и ХГВ+D+C по 16 человек. Диагноз ХВГ включал: 1) этиологическую расшифровку; 2) активность вирусного процесса; 3) степень фиброза печени.

Критерием включения пациентов в настоящее исследование служило наличие верифицированного диагноза хронического вирусного гепатита по выявлению специфических маркеров вирусных гепатитов В, С, D в сыворотке крови.

Критериями исключения из исследования служили: тяжелые соматические и психические заболевания, заболевания эндокринной системы (включая метаболический синдром), онкопатология, ВИЧ-инфекция, другие диффузные заболевания печени, активное потребление психоактивных препаратов в течение последних 6 месяцев и алкогольная зависимость пациентов, декомпенсаторная фаза цирроза печени, возраст до 18 лет и старше 60 лет, отсутствие информированного согласия на обследование.

У всех пациентов определяли маркеры вирусных гепатитов: HBsAg, HBeAg, anti-HBcor суммарные, anti-HBcor IgM и IgG, anti-HCVсуммарные, anti-HCV IgM, anti-HCV cor, anti-HCV NS_1-5, anti - HDV IgM и IgG методом ИФА, с помощью тест-наборов «Вектор» (Россия). С целью подтверждения активной репликации вирусов проведена количественная ПЦР в режиме real-time для выявления HCV-РНК, HBV-ДНК, а также генотипирование специфическими праймерами ВГС (АмплиСенс монитор FRT, аналитическая чувствительность 50 МЕ/мл). Уровень виремии оценивали как высокую при РНК HCV более 400000 МЕ/мл и ДНК HBV более 2000 МЕ/мл (таблица 1). Вирусную нагрузку РНК HDV не оценивали в связи с отсутствием количественных методов определения.

Таблица 1

Распределение больных ХВГ по уровню вирусной нагрузки

Этиология	Вирусная нагрузка	Число наблюдений, M±m
		абс.	%
Моно-В n=30	Низкая В	15	50,0±9,3
	Высокая В	15	50,0±9,3
Моно-С n=30	Низкая С	8	26,7±8,2
	Высокая С	22	73,3±8,2
Микст-В+С n=28	Низкая (В) и низкая (С)	12	42,8±9,5
	Низкая (В) и высокая (С)	2	7,1±5,0
	Низкая (С) и высокая (В)	8	28,6±8,7
	Высокая B и высокая С	6	21,4±7,9
Микст-В+D n=16	Низкая В	12	75,0±11,2
	Высокая В	4	25,0±11,2
Микст-В+D+С n=16	Низкая (В) и низкая (С)	4	25,0±11,2
	Низкая (В) и высокая (С)	2	12,5±8,5
	Низкая (С) и высокая (B)	8	50,0±12,9
	Высокая (B) и высокая (С)	2	12,5±8,5

В соответствии с международной классификацией ХВГ (Лос-Анжелес, 1994), в модификации А.Г. Рахмановой с соавторами (2002), у всех больных оценивали цитолиз по ключевому маркеру - АЛТ. Уровень АЛТ считался нормальным при значениях от 10 до 40 Ед/л. Изначально у пациентов с ХВГ в большинстве случаев (71,7%) выявляли повышение активности АЛТ от 2 до 3 норм. Реже (в 19,2% случаев) встречалась гипертрансаминаземия выше 10 норм. У 11 пациентов (9,2%) уровень АЛТ не отличался от нормы.

Учитывая, что ключевым фактором в прогрессировании ХВГ является степень развития фиброза, всем лицам, включенным в исследование, проведена эластометрия печени на аппарате FibroScan («EchoSens», Франция). Результаты оценивались по шкале METAVIR,что позволяло оценить стадию фиброза от F0 до F4 (кПa). Группу контроля составили 30 практически здоровых добровольцев, сопоставимых по полу и возрасту с контингентом больных с ХВГ.

Иммунологическое исследование пациентов включало определение в сыворотке крови: - субпопуляционного состава ЛПК (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺, CD25⁺, CD56⁺, HLA-DR⁺, CD95⁺) на проточном цитометре «Epics-XL» (Германия); иммунитет вирусный гепатит

- концентрации основных классов иммуноглобулинов (А, M, G) в сыворотке крови на автоматическом анализаторе «Turbox» (Финляндия) методом радиальной иммунодиффузии в геле по методу Mancini G. et al., 1965;

- концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови методом селективной преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ) (в модификации Гриневича Ю.А., Алферова А.Н., 1981). Размер ЦИК оценивали по методу Стручкова П.В. с соавт. (1985);

- уровней цитокинов (IFNг, ТGFв-1), а также компонентов внеклеточного матрикса (MMP-9, MMP-9/TIMP-2) с использованием специфических тест-систем «R&D Diagnostics Inc.» (USA) сэндвич-варианта твердофазного ИФА с учетом результатов на иммуноферментоном анализаторе «Multiscan» (Финляндия). Расчет количественных параметров проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы.

В работе использовались методы описательной статистики (W-критерий Шапиро-Уилка), параметрической статистики (t-критерий Стьюдента, Пирсона), непараметрической статистики (Колмогорова-Смирнова, Манна-Уитни, Уилкоксона, Спирмена, ч2), ROC- анализ.

Результаты исследования и их обсуждение:

В нашем исследовании все клинико-лабораторные особенности ХВГ рассмотрены с позиций клинической иммунологии (иммунного ответа макроорганизма) во взаимосвязи с ведущими синдромами вирусного поражения печени и критериями прогрессирования заболевания. Клиника ХВГ у обследованных больных характеризовалась значительным полиморфизмом. Установлено, что микст-гепатиты протекали с более значимыми объективными и субъективными изменениями по сравнению с моно-инфекциями (таблица 2). Доминирующими в клинической картине микст-гепатитов являлись: астеновегетативный (94,6±1,5%), гепатолиенальный синдром (58,3±6,4%) и симптомы холестаза (55,4±9,1%). Болевой абдоминальный синдром, артралгический и диспептический синдромы встречались примерно с одинаковой частотой при моно- и микст-гепатитах (p<0,05).

Таблица 2

Клиническая характеристика пациентов хроническими вирусными гепатитами

Клинический Синдром	Частота встречаемости, M±m (%)
	ХВГ общая группа (n=120)	Моно-гепатиты (n=60)	Микст-гепатиты (n=60)
Астеновегетативный	80,8±3,6	61,7±7,4*#	94,6±1,5*#
Гепатолиенальный	44,2±4,5	30,6±6,0*#	58,3±6,4#
Диспептический	78,3±3,8	86,8±3,6	75,6±4,4
Болевой абдоминальный	65,8±4,4	61,6±4,9	73,9±7,5
Холестатический	32,5±4,3	15,0±3,3*#	55,4±9,1*#
Артралгический	54,2±4,6	50,0±5,0	65,8±10,0

Примечание: статистическая достоверность различий:

*- с общей группой ХВГ (p<0,05); # - между группами моно и микст-гепатитов (p<0,05).

Найдена зависимость частоты выявления спленомегалии от степени фиброза печени (по данным эластометрии) при микст-гепатитах (r=0,9; p<0,05).

Наибольший практический интерес представляли уровни тромбоцитов, АЛТ, билирубина и ферментов холестаза ЩФ и ГГТП. Более низкие уровни тромбоцитов зафиксированы при микст-гепатитах (188,0±20,6·10⁹/л). В общей группе пациентов с ХВГ уровень АЛТ составил 98,2±7,4 Ед/л, что почти в 3 раза выше содержания фермента в контрольной группе (27,3±0,3 Ед/л, p<0,05). Уровень АЛТ более 3-х норм встречался у 28,3% больных микст-гепатитами, а нормальный уровень фермента у единичных больных. Тройная инфекция B+D+C характеризовалась максимальным повышением АЛТ (168,3±30,9 Ед/л).

Несмотря на отсутствие достоверных различий в группах с моно- и микст-гепатитами, уровень общего билирубина при микст-гепатите B+D+C оказался в 3 раза выше, по сравнению с общей группой больных ХВГ (p<0,001). Наряду с повышением уровня АЛТ у пациентов с ХВГ часто повышался уровень АСТ (rS=0,8, p<0,05).

Среди микст-гепатитов ХГВ+С характеризовался более мягким течением и имел больше сходства с моно-ХГС. Напротив, микст-гепатит В+D отличался частотой холестаза (87,5±8,5%), артралгических проявлений (93,8±6,2%). Наиболее значимые изменения клинико-лабораторных показателей выявлены у пациентов с полиинфекцией В+D+C. Установлена высокая частота встречаемости «продвинутых» стадий фиброза при сочетанных формах инфекции (таблица 3).

Таблица 3

Зависимость частоты выявления стадий фиброза от этиологии ХВГ, абс./%

Группы	Стадия фиброза (F)
	F0	F1	F2	F3	F4
ХВГ общ. n=120	20/16,7±3,4 pF0-F1>0,05 pF0-F2>0,05	24/20,0±3,7 pF1-F2>0,05 pF1-F3>0,05	31/25,8±4,0 pF2-F3>0,05 pF2-F4<0,001	33/27,5±4,0 pF0-F3<0,05 pF3-F4<0,01	12/10,0±2,8 pF0-F4>0,05 pF1-F4<0,05
Моно-гепатиты n=60	14/23,3±5,5* pF0-F1>0,05 pF0-F2>0,05	13/21,7±5,4 pF1-F2>0,05 pF1-F3>0,05	16/26,7±5,8 pF2-F3>0,05	17/28,3±5,9 pF0-F3>0,05	0/0,0±0,0
Микст-гепатиты n=60	6/10,0±3,9*# pF0-F1>0,05 pF0-F2<0,05	11/18,3±5,0 pF1-F2>0,05 pF1-F3>0,05	15/25,0±5,6 pF2-F3>0,05 pF2-F4>0,05	16/26,7±5,8 pF0-F3<0,05 pF3-F4>0,05	12/20,0±5,2 pF0-F4>0,05 pF1-F4>0,05

Примечание: Достоверность различий (p?0,05): с общей группой пациентов с ХВГ- *; между группами с моно- и микст-инфекцией - #.

Установлены взаимосвязи величины вирусной нагрузки HBV и стадии фиброза. При высокой вирусной нагрузке HBV в сочетании с любой (высокой или низкой) виремией HCV обнаружена четкая тенденция к прогрессированию фибротических изменений печени. Обнаруженный факт согласуется с данными современных исследователей (Громова Н.И., 2012; Chen G. et al., 2006; Chen С. J. et al., 2006; Zacharakis G. et al., 2008; Uchenna H. Iloeje. et al., 2009).

Иммунологическая характеристика пациентов с ХВГ

Полученные данные анализировали с учетом нормальных иммунологических параметров здоровых лиц. Норму определяли как интервал исследуемого признака, включающего по два стандартных отклонения от среднего значения. Узкий нормативный диапазон соответствовал значениям, не выходящим за пределы одного стандартного отклонения от среднего значения, широкий нормативный диапазон соответствовал значениям двух стандартных отклонений.

Все показатели, входящие в эти пределы являлись нормальными.

Хронические вирусные микст-гепатиты (особенно полиинфекция) отличались снижением показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, NK), за счет чего изменялась их функциональная активность и способность к продукции основных иммунорегуляторных цитокинов. Особо значимые изменения среди параметров клеточного иммунитета претерпевали активационные лимфоциты CD25⁺, CD95⁺ и HLA-DR, величины которых испытывали высокие коррелятивные связи с количеством тромбоцитов и степенью фиброза (таблица 4).

Наблюдаемое снижение уровней CD25 было ассоциировано с повышением уровней CD95 и HLA-DR.

Таблица 4

Уровни активационных лимфоцитов при ХВГ разной этиологии, M±у

Группы/показатели	CD25+	CD95+	HLA-DR+
Контроль (n=30)	0,18±0,004 8,60±0,17	0,40±0,02 19,04±0,37	0,33±0,015 15,70±0,45
Моно-гепатиты (n=60)	0,24±0,005* 9,94±0,41	0,49±0,013* 22,31±0,97	0,40±0,011* 19,43±0,48*
Микст-гепатиты (n=60)	0,09±0,014* 5,52±0,57	0,65±0,028*& 30,05±0,95*	0,56±0,011 29,43±0,50*

Примечание: в числителе - относительное содержание (%), в знаменателе - абсолютные значения (х10⁹/л). Достоверность различий (p<0,05) с: * - группой контроля; & - группой с моно-гепатитами.

Второй важной закономерностью больных микст-гепатитами явилась активация гуморальных факторов иммунитета: гиперпродукция иммуноглобулинов всех классов и ЦИК (рисунок 1).

Рисунок 1. Концентрация ЦИК и их размеры у больных с ХВГ микст-этиологии (Ме), условные единицы (у.е).

Максимальные концентрации IgА, IgM и IgG отмечались у больных с микст-гепатитами (3,88±0,066 г/л; 3,60±0,02 г/л и 36,00±0,63 г/л, соответственно) - таблица 5.

Таблица 5

Содержание основных классов иммуноглобулинов

Группы	Показатели, (М±m), г/л
	IgA	IgM	IgG
Контроль (n=30)	1,62±0,05	1,42±0,06	12,30±0,20
ХВГ общ. (n=120)	3,46±0,04*	3,10±0,02*	30,80±0,80*
Моно-гепатиты (n=60)	2,90±0,07*#	3,60±0,02*#	20,90±0,50*#
Микст-гепатиты (n=60)	3,88±0,066*&#	4,70±0,02*&	36,00±0,63*#&

Примечание: * - статистическая достоверность различий с: группой контроля (p=0,000);

#- общей группой больных ХВГ (p?0,001-0,05); & - группой моно-гепатитов (p=0,000).

Обнаружены достаточно сильные обратные взаимосвязи между процентным содержанием CD3⁺-клеток, CD4⁺-клеток и концентрацией IgG (rS=-0,86, p=0,001; rS=-0,67, p=0,025, соответственно), что косвенно подтверждает подавление клеточных реакций иммунитета.

Установлено значение системы MMP-9, MMP-9 и ее комплекса с TIMP-2 в формировании фиброза печеночной ткани, ассоциированного с воспалительным ответом и с изменением состава экстрацеллюлярного матрикса. Выявлено снижение уровней MMP-9 с одновременным ростом уровней комплекса MMP-9/TIMP-2, наиболее значительное при микст-инфекциях (таблица 6).

Таблица 6

Уровни ММP-9 и MMP-9/TIMP-2 в сыворотке крови больных ХВГ в зависимости от этиологии, (М±у)

Группы	Показатели
	MMP-9, пкг/мл	MMP-9/TIMP-2, пкг/мл	ММР-9 MMP-9/TIMP-2
Контроль (n=30)	276500±45530	19±2	14552,3
ХВГ общ. (n=120)	215000±44270*	1268±694*	169,5*
Моно-гепатиты (n=60)	245900±36220*,#,&	762±507*,#,&	322,7*,#,&
Микст-гепатиты (n=60)	187100±35790*,#	1962±158*,#	95,4*,#

Примечание: * - статистическая достоверность различий с: группой контроля (p=0,000);

Обнаружены связи уровней ММP-9 с прогрессированием стадии фиброза печени (rS=-0,95, p=0,002) и уровнями вирусной нагрузки HBV (rS=-0,70, p=0,012). Изучение комплекса MMP-9/TIMP-2 оказалось более перспективным для диагностики фиброза печени, его уровни повышались по мере прогрессирования стадии фиброза печени (rS=0,98, p=0,000) - рисунок 2.

Наивысшие диагностические характеристики начального фиброза печени по уровням ММP-9/TIMP-2 выявлены при ХГВ, ХГВ+D, ХГВ+D+C.

моно-В моно-С

микст-В+С микст-В+D

микст-В+D+C

Рисунок 2. ROC-кривые сывороточного уровня комплекса MMP-9 с ингибитором TIMP-2 (MMP-9/TIMP-2) для диагностики раннего фиброза печени у пациентов с ХВГ.

Выявлены связи высокой степени между уровнями вирусной нагрузкой HBV и MMP-9 (rS=-0,70; p=0,012) и комплекса MMP-9/TIMP-2 (rS=0,90; p=0,000).

Анализ сывороточного содержания IFNг показал разнонаправленные изменения в продукции данного цитокина как у пациентов с ХВГ, так и у здоровых лиц (таблица 7).

Таблица 7

Сывороточное содержание IFNг, пкг/мл

Группы	Me (LQ-UQ)
Контроль	13,93 (0,27--27,5)
Моно-B	17,10 (2,23-43,3)
Моно-C	7,30 (3,67-11,63)*
Микст-B+C	19,90 (5,80-33,00)*
Микст-B+D	5,09 (0,29-8,21)*
Микст-B+D+C	17,22 (0,29-29,70)

Примечание: *- достоверность различий с группой контроля (p<0,05).

Высокая степень корреляции отмечена между содержанием IFNг и уровнями билирубина (rS=0,76, p=0,000), активностью АЛТ (rS=0,73, p=0,006), вирусной нагрузкой HBV (rS=-0,98; p=0,000) и стадией фиброза (rS=-0,94, p=0,001).

Кроме того, выявлена зависимость сывороточной концентрации IFNг от стадии фиброза печени. Содержание IFNг у пациентов с «продвинутыми» (Лопаткина Т.Н., 2010, 2011) степенями фиброза (F3-4) характеризовалось более низкими концентрациями (рисунок 3).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 3. Уровни IFNг в зависимости от прогрессирования фиброза (пкг/мл).

Содержание цитокина TGFв-1 оказалось сниженным у больных всех исследуемых групп. Наиболее низкие показатели TGFв-1 отмечены при начальных стадиях фиброза печени, что характеризует данный цитокин как маркер раннего фиброза (рисунок 4). ROC-анализ также установил, что низкие уровни TGFв-1 являются важным диагностическим маркером раннего фиброза печени при ХВГ.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 4. Уровни TGFв-1 у лиц из группы контроля и у пациентов с ХВГ в зависимости от стадии фиброза печени (пкг/мл).

Таким образом, установлено, что гиперпродукция иммуноглобулинов всех классов, снижение активации Т-лимфоцитов и нарушение выработки IFNг, повышение уровня ЦИК и дефицит MMP-9, на фоне усиления продукции ингибитора TIMP-2 являются общими закономерностями для микст-гепатитов.

Особой клинико-иммунологической характеристикой отличался микст ХВГВ+С, при котором, несмотря на клиническую «мягкость» течения, по величине виремии доминировал вирус «В» и величина цитолиза была умеренной (2-3 нормы у 64,3%, >3-х норм у 28,6%). Клеточная защита отличалась низкими значениями CD4⁺, CD8⁺, CD25⁺, а комплекс MMP-9/TIMP-2, уровни CD95⁺ и IgM более высокими значениями по сравнению с другими микст-инфекциями. Однако при этом обнаружена усиленная вдвое продукция IFNг, что свидетельствует о доминировании HBV над HCV в сочетанном инфекционном процессе и может расцениваться как феномен интерференции проявлений вирусов B и С. В группе больных с наличием ДНК HBV (B+C, B+D, B+D+C) зарегистрированы наиболее низкие значения CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, NK что создает условия для формирования персистенции вирусов. Полученные данные свидетельствуют, что наиболее выраженное ослабление клеточного иммунитета наблюдается в случаях инфицирования тремя вирусами (B+D+C).

Первое ранговое место по выраженности фибротических изменений в печени занимают гепатиты, в этиологической структуре которых есть вирус HDV. При этом, учитывая преимущественно низкую виремию HBV, косвенно можно судить о развитии вирусной конкуренции, с доминированием вируса D.

По мере прогрессирования фиброза печени при ХВГ микст-этиологии наблюдалось некоторое снижение клеточной защиты макроорганизма и компенсаторная активация гуморальных факторов иммунитета (рисунок 5).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 5. Иммунологические критерии фиброза при микст-гепатитах.

Выявленные отличия моно- и сочетанных этиологических форм хронических вирусных гепатитов связаны с особенностью биологии возбудителей при взаимодействии и репликации отдельных вирусов и различиями в механизмах иммунопатогенеза HBV и HCV-инфекций. Лидирующими в развитии иммунного воспаления при ХВГ микст-этиологии можно считать гуморальные реакции.

Применение препарата из древесины маакии амурской в комплексном лечении пациентов с ХВГ

Несмотря на успехи комбинированной терапии препаратами рекомбинантных интерферонов и аналогов нуклеозидов, остается достаточно многочисленная группа пациентов, вообще или частично не отвечающих на лечение, сохраняющих персистенцию вируса и темпы прогрессирования фиброза. Ключевое значение иммунных реакций в патогенезе микст-ХВГ диктует необходимость использования препаратов с иммуномодулирующей активностью. Это обстоятельство предопределяет возможность использования препарата, разработанного в ТИБОХ ДВО РАН и рекомендованного Фармакологическим комитетом МЗ РФ в качестве гепатопротектора. Действующее вещество (МНН): Маакии амурской древесины экстракт. Лекарственная форма: таблетки покрытые пленочной оболочкой. Регистрационное удостоверение ? P №003294/01. Применение препарата маакии амурской древесины экстракта внутрь, в дозе 60 мг 3 раза в день до еды курсом 4 недели (в комплексе с базисным лечением) у 41 пациента с ХВГ приводило к снижению биохимических показателей крови, а также нормализации размеров печени, что согласуется с данными авторов и разработчиков препарата (Гайсаев Р.О., Белобородова Э.И., Саратиков А.С., 2001; Стоник В.А., Толстиков Г.А., 2008; Карева Е.Н., Федореев С.А., 2012).

Группу сравнения составили 47 пациентов, которым на фоне базисной терапии назначали известный препарат из плодов расторопши пятнистой внутрь в дозе 0,7 мг 3 раза в день до еды курсом 4 недели.

Результаты наших исследований показали позитивные изменения в иммунном статусе пациентов, применяющих экстракт древесины маакии амурской (нормализация СD3⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD25⁺- лимфоцитов, CD4⁺/CD8⁺, повышение содержания CD56⁺-лимфоцитов, тенденция к нормализации уровней основных классов иммуноглобулинов, усиление синтеза IFNг, снижение уровней MMP-9/TIMP-2). Также под влиянием препарата происходило изменение качественного состава ЦИК в сторону их укрупнения (рисунок 6).

Рисунок 6. Состав ЦИК (у.е.) до и после лечения.

Вирусная нагрузка у пациентов до- и после лечения не показала достоверных различий, что свидетельствует об отсутствии влияния препарата из древесины маакии амурской на процессы репликации вирусов гепатита.

Хорошая переносимость препарата, удобная лекарственная форма и отсутствие побочных эффектов при применении позволяет рекомендовать экстракт древесины маакии амурской с целью иммунокоррекции в комплексном лечении пациентов с ХВГ.

ВЫВОДЫ

1. Установлены общие закономерности дисфункции иммунной системы у пациентов с хроническими вирусными гепатитами сочетанной этиологии, выражающиеся в преимущественной активации гуморальных факторов иммунитета (повышение системных уровней иммуноглобулинов основных классов, циркулирующих иммунных комплексов), на фоне недостаточности иммунного ответа по клеточному типу (CD3+, СD4+, CD8+, NК, CD25+ при одновременном повышении CD95+ и HLA-DR+). Большая выраженность и особенности иммунного ответа при микст-гепатитах, по сравнению с моно-инфекцией, связаны со сложными взаимодействиями вирусных агентов и преобладанием репликации конкретного вируса.

2. Дисбаланс цитокинов (IFNг, TGFв-1) более выражен в группе пациентов с микст-гепатитами, что свидетельствует о более глубоких изменениях иммунной регуляции у этой категории пациентов. Установлены корреляционные связи уровней IFNг и TGFв-1 со стадией фиброза печени (rS=-0,9, p=0,001; rS=0,69, p=0,01), уровнем цитолиза (rS=0,73, p=0,006; rS=-0,72, p=0,01) позволяют считать их маркерами активности иммунного воспаления и ранних фибротических изменений в печени.

3. Дефицит матриксной металлопротеиназы-9 в сочетании с гиперпродукцией ее тканевого ингибитора (MMP-9/TIMP-2) подтверждает участие системы эндопротеазы в механизмах фиброгенеза в печеночной ткани. Дисбаланс системы MMP-9 с ингибитором у больных сочетанными формами ХВГ по сравнению с группой больных моногепатитами характеризуется более значимыми изменениями.

4. Препарат из древесины маакии амурской у пациентов с хроническими вирусными гепатитами способствует усилению синтеза IFNг, нормализации уровней основных классов сывороточных иммуноглобулинов и ЦИК, а также восстановлению баланса в системе MMP-9/TIMP-2, что позволяет характеризовать его как иммуномодулятор.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ

1. Выявление при скрининговом обследовании отдельных маркеров ХВГ диктует необходимость более расширенного обследования пациентов на наличие репликативных маркеров всех вирусных гепатитов для исключения сочетанной их этиологии.

2. Рекомендовать включение всех нозоформ ХВГ сочетанной этиологии в статистические формы учета, стандарты диагностики и терапии и регистр инфекционной заболеваемости.

3. Для диагностики ранних стадий фиброза печеночной ткани в качестве дополнительных иммунологических тестов рекомендовать определение в сыворотке крови уровней матриксной металлопротеиназы-9, ее комплекса с ингибитором (MMP-9/TIMP-2), а также цитокинов:TGFв-1 и IFNг.

4. Препарат из древесины маакии амурской может быть использован в качестве препарата с двойным действием (гепатотропным и иммуномодулирующим) у пациентов с ХВГ. Режим приема: 60 мг 3 раза в день до еды курсом 4 недели.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Путилова, Е. А. Состояние системы иммунитета в зависимости от этиологического агента при хронических вирусных гепатитах / Е. А. Путилова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова [и др.] // Рос. иммунологический журн. - 2011. - Т. 5, № 1. - С. 69-74.

2. Путилова, Е. А. Клинико-иммунологическая эффективность максара при хронических вирусных гепатитах / Е. А. Путилова, Л. Ф. Скляр, В. А. Иванис // Фундаментальные исследования. - 2011. - № 9. - С. 484-487.

3. Значение матриксной металлопртеиназы-9 в диагностике фиброза печени у больных хроническими моно- и микст-вирусными гепатитами / Е. А. Путилова, И.С. Горелова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Тихоокеанский мед. журн. - 2012. - № 4. - С. 74-78.

4. Роль препарата максар в лечении хронических вирусных гепатитов / Е. А. Путилова, C. А. Федореев, В. А. Иванис [и др.] // Дальневосточный журн. инфекционной патологии. - 2011. - № 18. - С. 34-41.

5. Оценка сывороточного уровня матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9) у пациентов с хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) / И. С. Горелова, Ю. А. Ли, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова, Е. А. Путилова // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2011. - Т. XXI, № 5. Приложение № 38. - С. 83.

6. Путилова, Е. А. Клиническая картина хронических вирусных гепатитов (ХВГ) микст-этиологии / Е. А. Путилова, В. А. Иванис // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2013. - Т. XXIII, № 1. Приложение № 40. - С. 40.

7. Путилова, Е. А. Отечественный гепатопротектор - Максар® в лечении хронических форм вирусных гепатитов / Е. А. Путилова // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2011. - Т. XXI, № 1. Приложение № 37. - С. 118.

8. Иммунологические показатели при хронических вирусных гепатитах разной этиологии / Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова, С. П. Кругляк, И. С. Горелова, Ю. А. Ли, Н. П. Саргсян, Е. А. Путилова // Мед. иммунология. - 2011. - Т. 13, № 4-5. - С. 408-409.

9. Putilova, E. A. Role of cytokines in a pathogenesis of chronic virus hepatitises of a mixt-genesis : abstract of 14 th International Congress of Immunology, Kobe (Japan): August 26, 2010 (Day 4) / E. A. Putilova, V. Ivanis // International immunology, 2010. - Vol. 22, № 1, Pt. 4. - P. 71-72.

10. Putilova, E. A. Clinical presentation in chronic viral hepatitis (CHV) of mixed etiology / E. A. Putilova, V. A. Ivanis // Rus. J. Gastroenterol., Hepatol., Coloproctol. - 2013. - Vol. ХХIII, № 1. - P. 123.

11. Путилова, Е. А. Современный взгляд на проблемы сочетанных вирусных гепатитов в г. Владивостоке / Е. А. Путилова, В. А. Иванис, М. В. Павлюк // Мат. II ежегодного Всероссийского конгр. по инфекционным болезням, Москва, 29-31 марта 2010 г. - М., 2010. - С. 256.

12. Применение нового гепатопротектора Максара в лечении хронических форм вирусных гепатитов / Е. А. Путилова, В. А. Иванис, С. А. Федореев, Е. Ю. Добряков // Человек и лекарство : мат. VII Дальневост. регион. конгр. с междунар. участием, Владивосток, 30 сентября - 1 октября 2010 г. - Владивосток : Медицина ДВ, 2010. - С. 86-87. - (Тихоокеанский мед. журн., № 3. Приложение).

13. Клинико-эпидемиологические особенности вирусных гепатитов у медицинских работников по данным центра вирусных гепатитов Городской клинической инфекционной больницы № 1 г. Владивостока / С. А. Петухова, Г. М. Шкляр, М. В. Маковкина, А. В. Невзоров, О. Н.Черевко, А. В. Кузьмина, Т. С. Кузнецова, Е. А. Путилова // Мат. II ежегодного Всероссийского конгр. по инфекционным болезням, Москва, 29-31 марта 2010 г. - М., 2010. - С. 241-242.

14. Особенности клинического течения хронических форм вирусных микст-гепатитов (тезисы) / Е. А. Путилова, Т. В. Палащенко // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XIII Тихоокеан. научно-практич. конф. студентов и молодых ученых с международ. участием, Владивосток, 21-22 апреля 2010 г. - Владивосток, 2010. - С. 326.

15. Интерферон Гамма в патогенезе вирусных гепатитов (тезисы) / Е. А. Путилова, В. А. Иванис, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова // Человек и лекарство : мат. VII Дальневост. регион. конгр. с междунар. участием, Владивосток, 30 сентября - 1 октября 2010 г. - Владивосток : Медицина ДВ, 2010. - С. 85-86. - (Тихоокеанский мед. журн., № 3. Приложение).

16. Путилова, Е. А. Клиника хронических вирусных гепатитов микст-этиологии (тезисы) / Е. А. Путилова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XIV Тихоокеан. научно-практич. конф. студентов и молодых ученых с международ. участием, Владивосток, 18-19 апреля 2013 г. - Владивосток : Медицина ДВ, 2013. - С. 21.

17. Путилова, Е. А. Гепатопротектор отечественного происхождения для лечения хронических гепатитов вирусной этиологии (тезисы) / Е. А. Путилова, В. А. Иванис, С. А. Петухова, И. А. Пожидаева // Мат. III ежегодного Всероссийского конгр. по инфекционным болезням, Москва, 28-30 марта 2011 г. - М., 2011. - С. 303.

18. Путилова, Е. А. Иммунопатогенетические нарушения у больных хроническими вирусными гепатитами микст-этиологии (тезисы) / Е. А. Путилова, В. А. Иванис // Мат. V ежегодного Всероссийского конгр. по инфекционным болезням, Москва, 25-27 марта 2011 г. - М., 2013. - С. 330.

19. Путилова, Е. А. Иммунный и цитокиновый статус при хронических вирусных гепатитах различной этиологии (тезисы) / Е. А. Путилова, Ю. А. Ли, И. С. Горелова // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XIII Тихоокеан. научно-практич. конф. студентов и молодых ученых с международ. участием, Владивосток, 21-22 апреля 2010 г. - Владивосток, 2010. - С. 330.

20. Иммунитет при хронических вирусных гепатитах / Е. А. Путилова, Л. Ф. Скляр, Е. В. Маркелова, В. А. Иванис, Ю. А. Ли // Дни иммунологии в Сибири : мат. Всероссийской научн.-практич. конф. с междунар. участием, посвященной
35-летнему юбилею НИИ Медицинских проблем севера СО РАМН и 30-летнему юбилею НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, Абакан, 27-28 апреля 2011 г. - Абакан, 2011. - С. 153-155.

21. Путилова, Е. А. Исследование иммуннокоригирующих свойств максара при хронических вирусных гепатитах (тезисы) / Е. А. Путилова // Человек и лекарство : мат. VII Дальневост. регион. конгр. с междунар. участием, Владивосток, 30 сентября - 1 октября 2010 г. - Владивосток : Медицина ДВ, 2010. - С. 118. - (Тихоокеанский мед. журн., № 3. Приложение).

22. Клинико-иммунологические параллели при хронических вирусных гепатитах (тезисы) / Е. А. Путилова, В. Н. Галай, Р. П. Галай // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины : тез. докл. XIII Тихоокеан. научно-практич. конф. студентов и молодых ученых с международ. участием, Владивосток, 19-20 апреля 2012 г. - Владивосток, 2012. - С. 52-53.

23. Путилова, Е. А. Иммунологические аспекты формирования фиброза печени при хронических вирусных гепатитах сочетанной этиологии (тезисы) / Е. А. Путилова, В. А. Иванис // Гепатология сегодня : конкурс молодых ученых в рамках конгресса РОПИП, Москва, 19-21 марта 2012 г. - М., 2012. - С. 36-37.

24. Иммунологические методы ранней диагностики фиброза печени при хронических моно- и микст-вирусных гепатитах : методические рекомендации / Е. А. Путилова, И. С. Горелова, В. А. Иванис, Л. Ф. Скляр. - Владивосток : ВГМУ, 2012. - 20 с.

25. Хронические вирусные гепатиты сочетанной этиологии: аспекты эпидемиологии, иммунопатогенеза, клиники и диагностики : методические рекомендации / И. С. Горелова, Е. А. Путилова, Л. Ф. Скляр, В. А. Иванис. - Владивосток : ВГМУ, 2012. - 52 с.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХВГ - хронические вирусные гепатиты

ХГВ - хронический вирусный гепатит В

ХГС - хронический вирусный гепатит С

ЦП - цирроз печени

HBsAg, HBеAg - антигены вируса гепатита В

HBV, HCV, HDV - вирусы гепатита В, С, D

IFNг - интерферон гамма

Ig - иммуноглобулины

MMP-9 - матриксная металлопротеиназа - 9

TIMP - тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ

Размещено на Allbest.ru

...