Фармакогностическое изучение и стандартизация сырья Malus Sylvestris (L.) Mill

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАУЧНЫЙ ДОКЛАД

«ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ СЫРЬЯ MALUS SYLVESTRIS (L.) MILL»

Направление подготовки: 33.06.01 Фармация

Специальность: 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

НЕСТЕРОВА НАДЕЖДА ВИКТОРОВНА

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

член-корр. РАН, профессор Самылина Ирина Александровна

Москва - 2018

Актуальность

Значительный интерес исследователей привлекают лекарственные растения, традиционно применяемый в народной медицине, включенные в издания Фармакопей прошлых лет, но незаслуженно забытые. Зачастую, к такому сырью относятся растительные объекты, не только обладающие фармакологическим действием, но и применяемые в качестве пищевых, что позволяет предположить безопасность их применения. К такому сырью, на наш взгляд, относятся плоды и листья яблони лесной, применение которых в качестве пищевого и лекарственного сырья насчитывает не одно тысячелетие. Данное сырье с успехом использовалось многими выдающимися врачами древности, о чем в своих научных трудах не раз сообщали Гиппократ, Гален, Диоскорид, Авл Корнелий Цельс и многие другие, применявшие плоды яблони лесной и домашней как диетическое средство, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, диарее, железо-дефицитной анемии, а листья в качестве противовоспалительного, мочегонного, потогонного средства, а также при «моровых поветриях». Великий врач Востока Авиценна более сорока раз ссылался на использование листьев и плодов яблони лесной и домашней в качестве самостоятельного средства и в составе многочисленных прописей. Лекарственные средства на основе плодов яблони лесной (Fructus Mali recentes; Extractum Martis Pomatum) для лечения железодефицитной анемии входили в I-VIII издания Российских Фармакопей. В последние годы в научной литературе появилось значительное количество работ, посвященных как изучению состава биологически активных веществ (БАВ) плодов и листьев яблони, так и их разнообразному фармакологическому действию. Было установлено наличие в сырье разнообразных веществ флавоноидной природы, витаминов, дубильных веществ, пектинов, гидроксикоричных и органических кислот, фенологликозидов, микроэлементов, тритерпеновых сапонинов. Показано наличие у экстрактов плодов и листьев яблони антиоксидантной и противовоспалительной активности, способности значительно снижать окислительный стресс путем ингибирования выработки цитокина Th2. Доказано наличие профилактического эффекта на вызванный действием морфина запор у лабораторных животных, за счет увеличения подвижности эпителия толстой кишки, антидиабетической активности, фунгицидного действия. Однако, несмотря на широкий спектр фармакологического действия, обеспеченность дикорастущим сырьем, а также возможность широкого введения в культуру, плоды и листья яблони лесной не признаны лекарственными и не включены в Государственную Фармакопею, что можно объяснить несистематизированностью данных по изучению фитохимического состава, и как следствие, отсутствием чувствительных и воспроизводимых методик качественного и количественного анализа данного сырья. Комплексное фармакогностическое изучение листьев и плодов яблони лесной, экстракта и настоек матричных гомеопатических на их основе позволит обосновать возможность использования данного перспективного сырья, расширяя ассортимент ЛРС, что является актуальной и перспективной проблемой современной фармации.

Степень разработанности темы

Частная статья на плоды яблони лесной Malus sylvestris Mill (Prunus malus) включена в Pharmacopee Francais. Плоды яблони лесной включены в номенклатуру однокомпонентных (простых) гомеопатических лекарственных средств, разрешенных к медицинскому применению в РФ (Приложение № 2 к приказу №335 Минздравмедпрома России от 28.11.1995). Извлечения из плодов и листьев яблони разных видов включают в состав многих БАДов. Так, экстракт плодов яблони сибирской включен в состав многокомпонентного эликсира «Амрита» (ТУ 407-750-95 пищевая добавка «Elixir Amrita»), рекомендуемого в качестве общеукрепляющего средства при повышенных умственных и физических нагрузках. При этом стандартизация предумотрена для плодов яблони домашней в соответствии с требованиями ГОСТов пищевой промышленности 27572-87 «Яблоки свежие промышленной переработки», 21122-75 «Яблоки свежие поздних сроков созревания», 16270-70 «Яблоки свежие ранних сроков созревания». В отечественной и зарубежной литературе присутствуют сведения об изучении химического состава плодов и листьев яблони. Так, были идентифицированы и количественно определены в плодах яблони домашней хлорогеновая и кумариновая кислоты, процианидин, эпикатехин, кверцитин-3-галактозид, кверцитин-3-глюкозид, флоретин, флоредзин (Schieber A.,Keller P.,Carle R. 2011). Салматовым А.А.(2007) с соавторами проводилось изучение комплекса БАВ яблони для которых установлено наличие желчегонной, гепатопротекторной и гипохолестеринемической активности. Анализ листьев яблони домашней и лесной позволил выявить в них в значительных количествах флоридзин, обеспечивающий антидиабетическую активность (Masumoto S.,Akimoto O. 2009). Выявлено активное торможение полифенольным комплексом плодов яблони выделения токсина холеры и вызванного токсином накопления жидкости у лабораторных животных (Saito T.Miyake 2017).

Несмотря на имеющиеся данные по химическому составу и фармакологическому действию плодов и листьев яблони лесной, вопросы целенаправленного фармакогностического изучения сырья разной степени измельченности и консервации, разработки методик качественного и количественного определения для включения в нормативную документацию, создания на основе сырья экстракта и НМГ не решены в полном объеме, что и обуславливает выбор темы диссертационного исследования.

Цель исследования

Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы является фармакогностическое изучение и научное обоснование характеристик подлинности и показателей качества нового лекарственного растительного сырья -плоды и листья яблони лесной (Malus sylvestris L.), а также фармацевтических субстанций растительного происхождения НМГ и экстракта плодов и листьев яблони лесной.

Для достижения поставленной нами цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Осуществить всесторонний анализ отечественной и зарубежной научной литературы, патентной и нормативной документации, характеризующих современное состояние проблемы исследований состава, фармакологического действия и особенностей стандартизации плодов и листьев яблони лесной, а также перспектив создания на их основе лекарственных препаратов.

2. Провести анализ анатомо-морфологического строения двух видов нового лекарственного растительного сырья - листья яблони лесной (Folia Mali) и плоды (Fructus Mali) (цельных и измельченных) и установить основные диагностические признаки, позволяющие осуществить идентификацию данного сырья;

3. Осуществить определение качественного состава и количественного содержания основных БАВ (флавоноидов, органических и гидроксикоричных кислот, дубильных веществ, суммарного содержания полисахаридов, арбутина, элементного состава);

4. Разработать и апробировать методики подтверждения подлинности и оценки количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на кислоту кофейную, флавоноидов и арбутина в исследуемом сырье;

5. Провести определение показателей качества плодов и листьев яблони лесной, настойки гомеопатической матричной (НГМ), экстракта и установить их нормы для включения в разрабатываемую НД;

6. Провести изучение антимикробного действия исследуемого сырья, экстракта и НМГ плодов и листьев яблони лесной;

7. Изучить адсорбционную способность измельченных плодов яблони лесной, а также выделенного из них пектина.

Научная новизна

Получены новые данные в ходе исследования внешних и микроскопических признаков плодов и листьев яблони лесной, установлены диагностические значимые признаки для включения в соответствующие разделы, разрабатываемой НД. С применением современных инструментальных физико-химических методов (ГХ-МС, ВЭЖХ-УФ, спектрофотометрия, ТСХ и др.) проведено изучение качественного состава и определено содержание основных БАВ: флавоноидов (гликозидов кверцетина, изорамнетина, флоридзина, флоретина, катехина, эпикатехина, виценина, апигенина), органических (яблочной, янтарной, щавелевой) и гидроксикоричных (кофейной, галловой, цикоревой, иэпигалловой,инеохлорогеновой, хлорогеновой) кислот, аминокислот, углеводов, дубильных веществ, фенольного гликозида - арбутина, установлен элементный состав. Разработана ВЭЖХ методика определения арбутина в листьях и плодах яблони лесной, а также НГМ и экстракте. Для данного нового ЛРС адоптирована методика количественного определения флавоноидов методом спектрофотометрии и проведен сравнительный количественный анализ содержания дубильных веществ методом ГФ XIII и по методике Фолина-Чикалтеу. Проведено изучение антимикробной активности извлечений из плодов и листьев яблони лесной на штаммах - Bacillusanthracoides - 1, Bacillus subtilis L2, Escherichia coli 675, Salmonella typhimurium, Shigellasonnei3d, Staphylococcus aureus (209), Staphylococcusaureus (Tupe), Staphylococcus epidermidis Wood - 46. Осуществлен товароведческий анализ плодов и листьев яблони лесной и для данного сырья впервые предложены нормы показателей качества для включения в разрабатываемую НД. С учетом полученных данных по химическому составу исследуемого сырья подобраны оптимальные параметры технологии выделения пектина из плодов яблони лесной, показатели качества которого не уступают пектину пищевому. Проведено изучение адсорбционной способности плодов и пектина яблони лесной, позволяющее расширить ассортимент энтеросорбентов растительного происхождения.

Приоритет проведенных исследований защищен патентом РФ № 2639119 на изобретение «Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью». дата Гос. Регистрации 19.12.2017

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты проведенных нами экспериментальных исследований позволяют значительно расширить представления о химическом составе БАВ, анатомо-морфологических признаках и биологической активности нового ЛРС - плоды и листья яблони лесной. Научно обоснованы характеристики подлинности и показатели качества фармацевтических субстанций растительного происхождения - ЛРС, НГМ, экстракта плодов и листьев яблони лесной (Malus sylvestris Mill.). Предложены методики качественного и количественного анализа основных БАВ в новом ЛРС - плоды и листья яблони лесной, а также экстракте и НМГ, отвечающие базовым принципам унификации, составляющим теоретическую и практическую основу современного фармацевтического анализа (И. А. Самылина и др. 2006). Установлены показатели подлинности, качества и их нормы для листьев и плодов яблони лесной, НМГ и экстракта на их основе, внесенные в разрабатываемую документацию на новые виды лекарственного растительного сырья.

Результаты проведенного исследования использованы в учебном процессе в рамках элективного курса «Химия пищевых и лекарственных растений» Ташкентского фармацевтического института, а также в базовый курс фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии ФГБОУВО «Башкирский государственный медицинский университет» МЗ РФ.

Методология и методы исследования.

Методология исследования основана на проведении информационно-аналитического поиска данных научной литературы и патентной документации, охватывающих данные фармакогностического и фармакологического изучения плодов и листьев яблони лесной, характеристике изученности и актуальности темы, совокупности методов фармакогностического анализа, результату которого могут быть положены в основу разрабатываемой нормативной документации на новые виды сырья- плоды (Fructus Mali) и листья (Folia Mali) яблони лесной.

Общая схема методологического подхода проводимого исследования представлена на рис. 1

Степень достоверности. Достоверность полученных результатов анализа плодов и листьев яблони лесной подтверждена проведением достаточного количества экспериментальных исследований с использованием традиционных и современных аналитических методов (тонкослойная хроматография, ВЭЖХ, спектрофотометрия, потенциометрия, гравиметрический и титриметрический анализ, хромато-масс-спектрометрия, микроскопия), позволяющих получать воспооизводимые и достоверные результаты.

Статистическая обработка результатов анализа изучаемого сырья осуществлялась в соответствии с требованиями ГФ РФ ХIII издания с применением программного обеспечения «Statistica 8,0»; «Microsoft Excel 2016»

Личный вклад аспиранта в проведенное исследование

Автору принадлежит основополагающая роль в проведении экспериментальных анализов, интерпретации, критическом изучении и обобщении полученных данных. На всех этапах исследования, начиная от информационно-аналитического поиска, охватывающего проработку научной литературы, патентной и нормативной документации, постановки задач, их экспериментальной реализации, теоретического обобщения и анализа до обсуждения результатов, в представленных докладах и научных публикациях - вклад автора является основным.

яблоня лесной медицина народный

Рис.1 Схема проведения исследований листьев и плодов яблони лесной



Основное содержание работы

Объекты и методы исследования.

Объектом исследования служили плоды и листья яблони лесной, заготовленные от дикорастущих растений в подлеске смешанного леса в Истринском и Чеховском районах Московской области в августе-сентябре 2015-2017 г., а также образцы любезно предоставленные Ботаническим садом Петра Великого им. В. Л. Комарова, для ряда сравнительных анализов использовались листья и плоды яблони домашней позднеспелых сортов Антоновка и Ренет Симиренко, широко культивируемых на территории РФ, соответствующие требованиям ГОСТ 21122-75 «Яблоки свежие поздних сроков созревания». Отобранные образцы использовались для исследований в свежем, замороженном и высушенном виде. Искусственную сушку сырья осуществляли в сушильных шкафах при температурном режиме не выше 50 С. Консервацию образцов замораживанием осуществляли в соответствие с требованиями ГОСТ РФ 53956-2010 «Фрукты быстрозамороженные», путем ускоренного понижения температуры ниже криоскопической с сопровождением льдообразования до достижения внутри сырья в термическом центре температуры минус 18°С со средней скоростью не ниже 0,5 см/ч (скорость замораживания - отношение толщины замороженного слоя, см, ко времени ч, в течение которого он образовался)

Внешние признаки ЛРС исследовались невооруженным глазом и с помощью 3D-лазерного сканирующего микроскопа OLYMPUSOLS 4100, при увеличении 20х. Анатомо-диагностические признаки ЛРС установлены с помощью микроскопа NIKON ECLIPSE LV100N POL в проходящем и поляризованном свете.

Настойки матричные гомеопатические получали согласно правилам гомеопатической технологии (Проект ОФС «Настойки гомеопатические матричные») по способу 3 а с использованием в качестве экстрагента 73% этилового спирта (по массе). Для приготовления спирта требуемой концентрации по массе использовали указания Проекта ОФС «Растворы и жидкие разведения гомеопатические», водно-спиртовой экстракт получали методом модифицированной мацерации.

Обнаружение БАВ в исследуемом сырье осуществляли с помощью качественных реакций, методами тонкослойной хроматографии, ВЭЖХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSON», ГХ-МС на приборе «Agilent Technologies».

Определение количественного содержания суммы флавоноидов, арбутина, осуществляли с помощью спектрофотометра SPEKORD при соответствующей длине волны, определение содержания дубильных веществ проводили в сравнении методом рекомендуемым ГФ XIII и методом Фолина-Чикалтеу, количественную оценку содержания арбутина и суммарного содержания гидроксикоричных кислот в сырье и НМГ осуществляли методом ВЭЖХ, была выбрана колонка металлическая Kromasil C18 размером 4,6 х 250 мм , размер частиц 5 микрон, используемая система метанол- вода- кислота фосфорная концентрированная в соотношении 400 : 600 : 5 в условиях физиократического элюирования. Анализ осуществляли при комнатной температуре при скорости подачи элюента 0,8 мл/ мин. Продолжительность анализа 70 мин. Детектирование проводилось с использованием УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS МОДЕЛЬ 151 при длине волны 280 нм, содержание полисахаридного комплекса и пектинов осуществляли гравиметрическим методом после соответствующей пробоподготовки, была выбрана колонка металлическая Kromasil C18 разм.

Содержание полисахаридного комплекса и пектинов осуществляли гравиметрическим методом после соответствующей пробоподготовки.

В качестве стандартных образцов применяли коммерчески доступные индивидуальные вещества-стандарты производства компаний «Sigma-aldrich» и «Fluca».

Изучение антимикробной активности проводили в отношении штаммов патогенных и условно-патогенах микроорганизмов методом двукратных серийных разведений.

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных осуществляли в соответствии с требованиями ГФ РФ ХIII с применением программного обеспечения «Statistica 8.0» « Microsoft Excel 2016». Результаты считали достоверными при вероятности 95% (р<0,05).

Макроскопический и микроскопический анализ лекарственного растительного сырья листьев и плодов яблони лесной.

Поскольку листья и плоды яблони лесной не являются официнальным сырьем, в литературе отсутствует подробная характеристика морфологических и анатомо-диагностических признаков данного сырья, выполненная в соответствии с требованиями статей ГФ ХIII «Fructus» и «Folia». Имеются общие сведения преимущественно для различных сортов яблони домашней, но они не могут быть использованы в фармакогностическом анализе. Нами был проведен анализ морфологических и анатомо-диагностических признаков цельных плодов и листьев яблони лесной и их порошка. Характеристика внешних признаков цельных и измельченных плодов и листьев яблони лесной представлена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика внешних признаков цельного и измельченного сырья плоды и листья яблони лесной.

Исследуемое сырье	Описание внешних признаков
Цельное сырье-листья яблони лесной	Листья цельные или частично измельченные черешковые, с опадающими прилистниками, широко-яйцевидные или удлиненно-яйцевидные, реже широко-эллиптические или почти округлые, у основания закруглены или постепенно клиновидно сужены, на верхушке суженные в треугольный, заостренный, слегка направленный в бок зубец, который в длину достигает 7-10 мм, по краю мелко пильчато-зубчатые или городчато-пильчатые, иногда дважды пильчато-зубчатые, с заостренными зубчиками, с блеском или только с верхней, реже и с нижней поверхности, по жилкам встречается незначительное опушение; сверху темно-, снизу -- бледно-зеленые, черешки 1-3,5 см длиной.
Измельченное сырье-листья яблони лесной	Кусочки листьев различной формы, проходящие сквозь сито с отверстиями 7 мм. Цвет темно-зеленый. Возможно незначительное опушение на участках вдоль жилок, запах слабый травянистый. Вкус горьковато-вяжущий.
Цельное сырье-плоды	Плод -- яблоко, 3-4 см в диаметре, шаровидной или округло-яйцевидной формы твердые, морщинистые, желто-зеленого цвета, иногда с одной стороны красноватые. В мякоти плодов находится около 10 семян яйцевидной формы, около 7 мм длиной, буроватого цвета с блестящей поверхностью. Запах приятный яблочный. Вкус очень кислый.
Измельченное сырье-плоды	Кусочки плодов зеленовато-желтого цвета с морщинистой поверхностью. Запах слабый яблочный. Вкус очень кислый

При определении анатомо-диагностических признаков плодов и листьев яблони лесной микропрепараты готовили в соответствии с общепринятыми методиками (ГФ ХIII). При рассмотрении микропрепаратов измельченных плодов выявлены обрывки эпидермы, окончатость клеток, обрывки мезокарпия, паренхимные клетки разнородные, неправильной формы, рыхлорасположенные в очертании округлые, как бы смятые. Каменистые клетки отдельно и в кусочках мезокарпия, обрывки механических волокон с кристаллами оксалата кальция. При рассмотрении микропрепарата измельченных листьев яблони обнаружены извилистые клетки эпидермиса, в фрагментах верхнего и нижнего эпидермиса встречается аномоцитный тип устьичного комплекса, устьица округлой или овальной формы, замыкающие клетки обладают почковидной формой, длина устьиц составляет до 28 мкм, ширина 18-22 мкм, многочисленные простые многоклеточные волоски, заостренные на конце, несколько расширенные у основания, с тонкими стенками и гладкой поверхностью; жилка листа с кристаллоносной обкладкой; обнаружены друзы кальция оксалата в мезофилле листа. Полученные результаты определения анатомо-диагностических признаков включены в раздел «Микроскопия» разрабатываемой нормативной документации.

Фитохимический анализ листьев и плодов яблони лесной

В ходе фитохимического изучения листьев и плодов яблони лесной установлено наличие дубильных веществ, флавоноидов, полисахаридов, пектинов, гидроксикоричных кислот и арбутина.

Для проведения исследований химического состава плодов и листьев яблони лесной мы получали водные и водно-спиртовые извлечения из сырья в соответствии с рекомендациями ГФ XI и XIII изданий. С полученными извлечениями проводились качественные реакции для идентификации основных групп БАВ. Результаты фитохимического анализа, проводимого по известным методикам, подтвердили присутствие флавоноидов (цианидиновая проба), дубильных веществ (реакция с железоаммонийными квасцами, раствором желатина), полисахаридов (реакция «смены растворителя»). Учитывая литературные данные, подтверждающие наличие в листьях яблони домашней арбутина мы сочли целесообразным осуществить идентификацию арбутина в извлечениях из сырья яблони лесной с использованием специфических качественных реакций (с натрием фосфорномолибденовокислым, 4-аминоантипирином и реактивом Паули) и спектрофотометрически при определении УФ-спектров спиртового извлечения из листьев и плодов яблони лесной и арбутина (СО). Результаты представлены в таблице 2.



Таблица 2. Подбор оптимальной длины волны для анализа

Образец	лmax для СО	лmax для опытного образца
		Свежее сырье	Высушенное сырье
Арбутин	221 нм 285 нм	285,5 нм	286 нм

Рис.13 УФ-спектр арбутина-стандарта Рис.14 УФ-спектр спиртового извлечения

Присутствие арбутина было подтверждено также методом ВЭЖХ в ходе которого был определен состав ряда флавоноидов.

Рис.15 - Хроматограмма спиртового извлечения из листьев яблони лесной методом ВЭЖХ.

Таблица 3. Результаты исследования фенольных соединений в сухом и свежем сырье - листья яблони лесной, методом ВЭЖХ.

№	Время, мин	Площадь, mV*сек	Площадь, %	Название
1	5,274	399.03	6.42	Арбутин
2	6,70	225.92	3.63	Неидентифициров
3	7,24	136.68	2.20	Неидентифициров
4	8,61	29.03	0.47	Неидентифициров
5	11,23	365.61	5.88	Неидентифициров
6	13,66	719.04	11.56	Неидентифициров
7	14,09	990.92	15.94	Изорамнетин-3-гал
8	16,96	295.70	4.76	Неидентифициров
9	20,07	994.15	15.99	Кверцетин-3-глюк
10	21,45	1546.10	24.87	Кверцетин-3-рут
11	24,09	37.73	0.61	Флоридзин
12	30,53	61.80	0.99	Флоретин
13	35,22	415.72	6.69	Кверцетин

Эти же соединения в меньшем количестве обнаружены в плодах яблони лесной.

Также методом ВЭЖХ в извлечениях из плодов и листьев проведена идентификация гидроксикоричных кислот, детектирование которых осуществляли с помощью УФ-детектора «GILSON» UV/ VIS модель 151 при длине волны 370 нм. Хроматографический анализ этанольных извлечений из листьев яблони лесной, заготовленных в различные фазы вегетации, показал идентичность биологически активных веществ, состав которых представлен в таблице 1 и на рисунке 16.

Рис.16 - Хроматограмма спиртового извлечения из листьев яблони лесной методом ВЭЖХ

Таблица 4. Результаты исследования фенольных соединений в сухом и свежем сырье - листья яблони лесной, методом ВЭЖХ.

№	Время, мин	Площадь	Площадь	Название
1	4.464	86.71	0.12	Кофейная к-та
2	4.945	52.11	0.07	Неидентифицирован
3	5.317	64.34	0.09	Галловая к-та
4	5.624	2088.28	2.90	Цикориевая к-та
5	7.161	1741.89	2.42	Катехин
6	7.695	2093.01	2.91	Эпикатехин
7	8.507	331.60	0.46	Хлорогеновая к-та
8	9.063	582.90	0.81	Виценин
9	9.594	152.45	0.21	Неохлорогеновая к-та
10	10.22	908.78	1.26	Рутин
11	11.84	87.84	0.12	Кумарин
12	12.56	94.00	0.13	ЭГКГ
13	14.4	438.15	0.61	Неидентифицирован
14	14.86	588.03	0.82	Неидентифицирован
15	17.9	217.32	0.30	Кверцетин
16	18.14	90.67	0.13	Флоретин
17	21.1	186.74	0.26	Неидентифицирован
18	21.22	262.50	0.36	Флоридзин
19	21.32	205.58	0.29	Неидентифицирован
20	21.95	2.27	0.00	Неидентифицирован
21	22.63	7422.06	10.31	Неидентифициров
22	23.65	19.94	0.03	Коричная к-та
23	23.86	14.28	0.02	Неидентифицирован
24	24.07	2.96	0.00	Неидентифицирован
25	24.49	6.54	0.01	Апигенин
26	24.58	12.90	0.02	Неидентифицирован
27	27.67	0.00	0.00	Неидентифицирован
28	28.74	25.73	0.04	Неидентифицирован
29	37.49	54243.52	75.31	Неидентифицирован

Также идентификацию флавоноидов в сырье плоды и листья яблони лесной осуществляли методом тонкослойной хроматографии, используя систему растворителей БУВ (4:1:2), позволяющую добиться оптимального разделения компонентов смеси. В качестве стандарта использовали СО рутина.

Учитывая полученные данные качественного анализа групп БАВ в исследуемом сырье, а так же данные научной литературы, было проведено количественное определение суммарного содержания полисахаридов, флавоноидов, дубильных веществ, органических кислот, а также фенолгликозида арбутина по известным фармакопейным методикам. Определение данных групп БАВ осуществляли для свежих, замороженных и высушенных образцов сырья. Результаты количественного определения представлены в таблице 5.

Таблица 5. Содержание БАВ в исследуемых листьях яблони лесной и домашней

Исследуемое ЛРС	Содержание %
	Полисахариды	Сумма органичес-ких кислот	Арбутин	Дубильные вещества	Флавоноиды
Листья Яблони Лесной (Инстрин-ский район)	свежие	5,34	1,51	3,89	9,57	2,51
	заморожен-ные	5,20	1,35	3,54	9,23	2,31
	высушенные	4,87	0,98	2,38	7,25	1,15
Листья Яблони Лесной (Чехов-ский район)	свежие	5,22	1,48	4,02	9,64	2,48
	заморожен-ные	5,15	1,29	3,68	9,37	2,15
	высушенные	4,77	0,96	2,51	7,40	1,05
Листья Яблони Домаш-ней (Антонов-ка)	свежие	5,75	1,46	3,65	8,75	2,01
	заморожен-ные	5,30	1,20	3,38	8,24	1,97
	высушенные	4,98	0,90	2,18	6,60	1,03
Листья Яблони Домаш-ней (Пепин)	свежие	5,25	1,45	3,20	8,34	2,24
	заморожен-ные	5,10	1,30	2,91	8,10	2,05
	высушенные	4,25	0,93	1,89	6,32	1,15
Листья Яблони Домаш-ней (Ренет)	свежие	5,53	1,47	3,34	8,44	2,00
	заморожен-ные	5,25	1,36	3,01	8,20	1,96
	высушенные	4,28	0,94	2,15	6,12	1,10

Количественную оценку содержания арбутина ((2R,3S,4S,5R,6S)-2-гидроксиметил-6-(4-гидроксифенокси)оксан-3,4,5-триол) в сырье проводили, используя также метод ВЭЖХ, условия проведения анализа изложены в статье () Расчёт количественного содержания арбутина осуществляли методом абсолютной калибровки с использованием компьютерной программы Мультихром Windows по формуле:

; где

- площадь пика в исследуемом растворе;

- площадь пика раствора арбутина СО;

С (%) - содержание арбутина, %;

- масса навески арбутина СО;

б- масса сырья, взятого на анализ, г;

W - потеря в массе при высушивании в %;

Метрологические характеристики методики количественного определения арбутина в спиртовых извлечениях из листьев яблони лесной в пяти независимых повторностях представлены в таблице 6.

Таблица 6. Метрологические характеристики методики количественного определения арбутина в спиртовых извлечениях из листьев яблони лесной

n	f				P, %	t (P, f)
Свежее сырье - Листья яблони лесной
5	4	0,972	0,00005	0,0071	95	2,78	0,00883	0,908
Высушенное сырье - Листья яблони лесной
5	4	0,7406	0,0000282	0,00531	95	2,78	0,0066	0,890

Относительная ошибка методики определения содержания арбутина с 95%-ой вероятностью составляет ±0,908% для свежего сырья и ± 0,890% для высушенного сырья.

Следует отметить, что при количественном определении арбутина в сухом и свежем сырье листья яблони лесной методом йодометрического титрования, его содержание составляет около 3%, что выше, чем предлагаемая нами методика ВЭЖХ. Увеличенный выход арбутина в методике йодометрического титрования может быть объяснен незначительной примесью соединений фенольной природы, что, соответственно, увеличивает выход при титровании.

Определение количественного содержания гидроксикоричных кислот в листьях яблони лесной осуществляли методом спектрофотометрии в пересчете на кислоту кофейную (3,4-диоксикоричная кислота, 3-(3,4-дигидрофенил)-2-пропеновая кислота). Пробоподготовка сырья описана в предыдущих публикациях. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 325 нм, поскольку данное значение является аналитическим для кислоты кофейной. В качестве раствора сравнения использовали 20% спирт этиловый.

Содержание суммы гидроксикоричных кислот (Х, % ) в листьях яблони лесной в пересчете на кислоту кофейную вычисляли по формуле:

где Ах - оптическая плотность исследуемого раствора

- удельный показатель поглощения кислоты кофейной при 325 нм, составляющий 782

m - масса навески измельченных листьев яблони лесной

- объем аликвоты, мл

W - влажность ,%

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли в соответствии с требованиями ОФС 42-0111-09 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента».

Валидация методики количественной оценки гидроксикоричных кислот в листьях яблони лесной проводили в соответствии с рекомендациями по следующим показателям: правильность, прецизионность, специфичность, линейность, аналитическая область (диапазон применения).

Таблица 7. Результаты количественного определения гидроксикоричных кислот в листьях яблони в пересчете на кислоту кофейную в разные фазы вегетации

№ образца	Исследуемый объект	Содержание гидроксикоричных кислот в пересчете на кислоту кофейную, %
		в период цветения	в период плодоношения	в осенний период опадания и сбора плодов
1	Листья яблони лесной, заготовленные в Истринском районе московской области	1,881±0,96	1,9644±0,91	1,3182±0,95
2	Листья яблони лесной, заготовленные в Чеховском районе московской области	2,340±0,74	2,7480±0,75	1,4050±0,81
3	Листья яблони домашней сорта Антоновка	1,794±0,92	1,8706±0,84	1,2430±0,97
4	Листья яблони домашней сорта Ренет Семиренко	1,657±0,72	1, 8076±0,73	1,1250±0,79

Таблица 8. Метрологические характеристики методики количественного определения гидроксикоричных кислот в спиртовых извлечениях из листьев яблони лесной, заготовленной в Истринском районе Подмосковья

n	f				P, %	t (P, f)
Листья яблони лесной (Истринский район), собранные в фазу цветения
5	4	1,881	0,0002115	0,00145	95	2,78	0,01808	0,96
Листья яблони лесной (Истринский район), собранные в фазу плодоношения
5	4	1,9644	0,0002072	0,0144	95	2,78	0,017896	0,91
Листья яблони лесной (Истринский район), собранные в фазу опадания плодов
5	4	1,6182	0,0001535	0,01238	95	2,78	0,015400	0,95

Статистическая обработка данных пяти параллельных измерений показала, что количественное содержание гидроксикоричных кислот в листьях яблони лесной в пересчете на кофейную кислоту в период цветения составило - 1,881±0,96 (Истринский район), 2,340±0,74 (Чеховский район), в период плодоношения - 1,9644±0,91 (Истринский район), 2,7480±0,75 (Чеховский район), и период опадания плодов - 1,3182±0,95 (Истринский район), 1,4050±0,81 (Чеховский район), для листьев яблони сортов Антоновка обыкновенна и Ренет Семиренко колебалось содержание от 1,8706±0,84 до 1,1250±0,79.

Для стандартизации и оценки качества плодов и листьев яблони лесной были определены товароведческие показатели и проведена оценка микробиологической чистоты. Результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9. Определение числовых показателей и микробиологической частоты в плодах и листьях яблони лесной

Анализ	Показатели	Содержание
		Листья яблони лесной, %	Плоды яблони лесной, %
Числовые показатели	Влажность	9,70 - 10,80	14,2 - 15,9
	Зола общая	2.80 - 3,10	3,50 - 3,80
	Зола, нерастворимая в 10% HCl	0,80 - 1,10	1,5 - 1,9
	Экстрактивные вещества, извлекаемые водой	17,40 - 18,10	32,8 - 34,5
	Экстрактивные вещества, извлекаемые 70% этиловым спиртом	19,82 - 21,40	23,3 - 25,3
Микробиологическая чистота	Аэробные бактерии	1,2 Ч	1,9 Ч
	Дрожжевые и плесневые грибы	0,9 Ч	1,2 Ч
	Escherichia coli	Отсутствует	Отсутствует
	Семейства Enterobacteriacea	Отсутствует	Отсутствует
	Pseudomonas aeruginosa	Отсутствует	Отсутствует
	Staphylococcus aureus	Отсутствует	Отсутствует
	Salmonella	Отсутствует	Отсутствует

Поскольку известно, что плоды яблони домашней являются источником получения пищевого пектина, мы сочли целесообразным провести оценку его количественного содержания в сырье, а также оценить адсорбционную способность измельченных плодов и листьев яблони лесной Адсорбционная способность определялась для измельченного сырья по методике, предложенной для стандартизации препарата «Полифепан».

С целью сравнения полученных результатов проведено определение адсорбционной активности препарата «Полифепан» (АО «Сайнтек»), «Фильтрум - сти» (АВВА РУС), действующим началом которых является лигнин гидролизный, а также микрокристаллической целлюлозы. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 10.

Таблица 10. Сравнительный анализ адсорбционной способности жома плодов яблони и энтеросорбентов

Объект исследования	Адсорбционная способность, г на 1 г сорбента.
Порошок плодов яблони лесной	0,059
Порошок листьев яблони лесной	0,044
Полифепан	0,075
Фильтрум-сти	0,068
Микрокристаллическая целлюлоза	0,017

Как видно из таблицы исследуемые объекты обладают достаточно высоким показателем адсорбционной способности, что дает основание для дальнейшего изучения листьев и плодов яблони лесной, с целью получения на их основе эффективного энтеросорбента.

Проведенные нами исследования доказывают перспективность получения водно-спиртовых извлечений из сырья яблони лесной. В ходе эксперимента нами подобраны оптимальные параметры экстракции: степень измельчения - 1-3 мм; соотношение сырье-экстрагент 1:10, метод экстрагирования-мацерация, экстрагент 70% спирт этиловый. Так же получены настойки матричные гомеопатические на основе свежего и высушенного сырья. Для всех предлагаемых средств разработаны технологические схемы получения. С учетом единства подходов к стандартизации исходного ЛРС, получаемой на его основе субстанции и, наконец, лекарственного средства (реализация принципа «сквозной стандартизации», предложенного И. А. Самылиной) для исследования экстракта и НМГ использованы методики качественного и количественного анализа, применяемые для листьев и плодов яблони лесной.

Учитывая имеющиеся литературные данные, а также опыт применения НМГ плодов яблони лесной в Европе, нами были проведены исследования антимикробной активности сырья и НМГ методом диффузии в агар на плотной питательной среде. Результату анализа были использованы при оформлении патента на изобретение (Патент №2639119 Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью. Нестерова Н.В, Самылина И.А., дата Гос. Регистрации 19.12.2017)

Таблица 11. Определение антимикробной активности

Тест-культуры микроорганизмов	Диаметр зоны задержки роста тест-культур микроорганизмов, мм
	Извлечение из листьев яблони лесной	Настойка календулы
Bacillusanthracoides - 1.	17±1	11±2
Bacillus subtilis L2	18±1	11±1
Escherichia coli 675	10±1	9±1
Salmonella typhimurium	11±1	10±1
Shigellasonnei3d	14±1	9±1
Staphylococcus aureus (209)	27±2,5	9±1
Staphylococcusaureus (Tupe)	22±1,5	8±1
Staphylococcus epidermidis Wood - 46	23±1	8±1



Выводы

1. Проведен анализ анатомо-морфологического строения цельного и измельченного ЛРС - плоды и листья яблони лесной и установлены основные диагностические признаки, позволяющие осуществить идентификацию данного сырья и подготовлены рекомендации для включения в раздел «Определение подлинности», планируемой НД;

2. Проведено определение качественного состава и количественного содержания основных БАВ (флавоноидов, органических и гидроксикоричных кислот, дубильных веществ, суммарного содержания полисахаридов и пектинов, арбутина, элементного состава);

3. Разработаны и апробированы методики подтверждения подлинности и оценки количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на кислоту кофейную, флавоноидов и арбутина в исследуемом сырье;

4. Проведено определение показателей качества плодов и листьев яблони лесной, НГМ, экстракта и установить их нормы для включения в разрабатываемую НД;

5. Проведено изучение антимикробного действия исследуемого сырья, экстракта и НМГ плодов и листьев яблони лесной, на основании которого получен Патент №2639119 Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью;

6. Изучена адсорбционная способность измельченных плодов яблони лесной, а также выделенного из них пектина.



Практические рекомендации и предложения

Результаты проведенной экспериментальной работы расширяют спектр представлений о представителях рода Malus и позволяют эффективно и рационально использовать в научной медицине и фармацевтической практике новое ЛРС - листья и плоды яблони лесной.

Разработанные в ходе проведенных экспериментальных исследований подходы к стандартизации сырья могут быть использованы в учебном процессе по курсу «Фармакогнозия» для высших учебных заведений, в элективном курсе естественно-научных дисциплин в РЦ «Медицинский Сеченовский предуниверсарий», а также в центрах сертификации и контроля качества лекарственных средств.

Полученные результаты позволяют разработать и внедрить отечественные импортозамещающие средства, обладающие антимикробной активностью, а также растительные энтеросорбенты.

Особо важным представляется, приводимое автором научное обоснование введение в отечественную номенклатуру листьев и плодов яблони лесной, что позволит расширить ассортимент российского ЛРС.



Список литературы

1. Нестерова Н.В. «Разработка показателей подлинности и доброкачественности жома плодов яблони» /материалы республиканской научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы образования науки и производства в фармации», Ташкент, ноябрь, 2015. С 56-58.

2. Самылина И.А., Нестерова Н.В. «Исторический опыт и перспективы использования сырья яблони в медицине и фармации» /журнал «Здоровье и образование в XXI веке» 2015, №4, т 17, с. 251-258

3. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Перспективы использования лекарственного растительного сырья Malus Sylvestris в гомеопатии. / «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» СБОРНИК МАТЕРИАЛОВ XXVI Московской международной гомеопатической конференции

4. Н.В.Нестерова, И.А.Самылина Изучение качественного состава и показателей качества листьев яблони лесной и домашней. журнал «Здоровье и образование в XXI веке» 2015, №4, т 17, с. 251-258

5. Нестерова Н.В. Изучение адсорбционной способности и возможности совершенствоанания рецептуры коктейлей для здорового питания Magic of life. Инновационные технологии в науке и образовании. VII международная научно-практическая конференция, Чебоксары. 2016

6. Нестерова Н.В. Анатомо-диагностические признаки жома и порошка жома плодов яблони лесной Malus Sylvestris L. И домашней Malus Domestica Borkh. Инновационные технологии в науке и образовании. VI международная научно-практическая конференция, Чебоксары. 2016, С. 92-95

7. Нестерова Н.В., Абизов Е.А. Изучение сорбционной способности и фитохимический анализ жома плодов яблони лесной и домашней. Вопросы обеспечения качества лекарственных средств, Москва. №4. 2015. С.40-47

8. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Идентификация арбутина в листьях яблони домашней и лесной. Материалы республиканской Научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации, Ташкент, 2016. С 34-47.

9. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Разработка показателей качества настойки гомеопатической матричной плодов яблони лесной, Сборник материаловXXVII Московской международной гомеопатической конференции 27-28 января 2017 г.

10. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Идентификация фенольных соединений в листьях яблони лесной (Malus sylvestris Mill.) Материалы V научно-практической конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине»

11. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Изучение зависимости количественного содержание биологически активных веществ листьев яблони лесной и домашней от способов консервации. журнал «Здоровье и образование в XXI веке» ТОМ 19 (№8, 2017)

12. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Сравнительная оценка суммарного содержания дубильных веществ в листьях яблони лесной и домашней зимних сортов. Международная научно-практическая конференция «Научные исследования:теория,методика и практика», Чебоксары 2017, С 94-96

13. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Влияние способа консервации на содержание биологически-активных веществ плодов яблони, Журнал «Фармация» 2017, т. 66, №3

14. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Влияние условий экстракции на выход фенольных соединений листьев яблони лесной и домашней. Международная научно-практическая конференция «Научные исследования: векторы развития», с 11-14, Чебоксары 2017

15. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Разработка потенциометрического метода определения дубильных веществ настойки матричной гомеопатической плодов яблони лесной, «Развитие гомеопатического метода в современной медицине» Сборник материалов XXVIII Московской международной гомеопатической конференции, 26-27 января 2018 г

16. Нестерова Н.В., Самылина И.А., Матюшин А.А. Изучение показателей качества пектина, получаемого из плодов яблони лесной (Malus sylvestris Mill.), материалы республиканской Материалы республиканской Научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации, Ташкент, 2017. С.45-48

17. Нестерова Н.В., Самылина И.А. Анализ содержания фосфолипидв в плодах яблони лесной. Материалы республиканской Материалы республиканской Научно-практической конференции (с международным участием) «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации, Ташкент, 2017. С. 64-66

18. Нестерова Н.В., Аглушевич А.В. Идентификация ионов железа в фармакопейной прописи «Экстракт железа яблочнокислого», полученного из плодов яблони лесной и домашней. НАУКА, ОБРАЗОВАНИЕ, ОБЩЕСТВО: ТЕНДЕНЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ Сборник материалов IX Международной научно-практической конференции, с.61-63, 2018

19. Патент №2639119 Способ получения средства, обладающего антимикробной активностью. Нестерова Н.В, Самылина И.А., дата Гос. Регистрации 19.12.2017

20. Нестерова Н.В., Самылина И.А., А.Н.Кузьменко, И.И.Краснюк (мл.), Вестник московского университета. серия 2: химия ИФ (2016) - 0.521; SJR= 0.187 Количественное определение арбутина в листьях яблони лесной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. (принята в печать)

21. Нестерова Н.В., Самылина И.А., Бобкова Н.В., А.Н.Кузьменко, И.И.Краснюк (мл.), Вестник московского университета. серия 2: химия ИФ (2016) - 0.521; SJR= 0.187. Количественное определение гидроксикоричных кислот и анализ динамики их накопления в листьях яблони лесной. (принята в печать)

22. Нестерова Н.В., Самылина И.А Исторический опыт и перспективы совершенствования методов анализа арбутина в лекарственном растительном сырье. Журнал «Фармация», выпуск 3., 2018 (принята в печать)

23. А.Н.Кузьменко, И.И.Краснюк (мл.), Н.В. Нестерова,И.А. Самылина «Изучение химического состава плодов яблони домашней методом рентгенофлуоресцентного анализа» (принята в печать)

Размещено на Allbest.ru

...