Фотофизические аспекты лазерной терапии гипербилирубинемии новорожденных детей

Размещено на http://www.allbest.ru/

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

ФОТОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛАЗЕРНОЙ ТЕРАПИИ ГИПЕРБИЛИРУБИНЕМИИ НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ

Плавский Виталий Юльянович

по специальности 01.04.21 - лазерная физика

Минск, 2010

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Институт физики имени Б. И. Степанова Национальной академии наук Беларуси».

Научный руководитель -

Мостовников Василий Андреевич,

кандидат физико-математических наук,

старший научный сотрудник,

заведующий лабораторией лазерных систем и

приборов ГНУ «Институт физики имени

Б.И. Степанова НАН Беларуси».

Официальные оппоненты:

Зенькевич Эдуард Иосифович,

доктор физико-математических наук, профессор, профессор кафедры технической физики факультета информационных технологий и робототехники Белорусского национального технического университета;

Самцов Михаил Петрович,

доктор физико-математических наук, доцент

главный научный сотрудник НИУ «Институт

прикладных физических проблем им. А.Н. Севченко» Белорусского

государственного университета

Оппонирующая организация -

УО «Гродненский государственный университет имени Янки Купалы»

Защита состоится 26 февраля 2010 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите диссертаций Д 02.01.17 при Белорусском государственном университете по адресу: 220030, Минск, ул. Ленинградская, 8 (корпус юридического факультета), ауд. 407; тел. ученого секретаря: 209-57-09.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Белорусского государственного университета.

Автореферат разослан 25 января 2010 г.

Ученый секретарь совета по защите диссертаций

доктор физ.-мат. наук, профессор И.М. Гулис

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертации определяется с одной стороны высокой вероятностью развития гипербилирубинемии (желтухи) у новорожденных детей (она регистрируется у 50-60 % доношенных и у 80 % преждевременно родившихся младенцев), а с другой стороны - недостаточной эффективностью существующих методов лечения и вызываемых ими побочных неблагоприятных эффектов. Данное неинфекционное заболевание обусловлено избыточным накоплением в крови, а также в подкожно-жировой клетчатке желчного пигмента - Z,Z-билирубина IX, придающего коже характерный золотисто-желтый цвет. В случае непринятия экстренных мер, высокая концентрация пигмента в организме младенца может сказаться на его физическом и нервно-психическом развитии, а также быть непосредственной причиной смерти.

Основным и наиболее распространенным методом лечения желтухи является фототерапия, заключающаяся в тотальном воздействии на поверхность тела ребенка светом специальных флуоресцентных или галогенных ламп с плотностью мощности P = 0,3-2,0 мВт/см2, спектральный состав которых соответствует длинноволновой полосе поглощения билирубина ( = 400-520 нм). Определяющую роль в снижении уровня билирубина в организме новорожденных при проведении фототерапии играют процессы фотоизомеризации пигмента - образование его конфигурационных (Z,E-билирубин IXб, E,Z-билирубин IXб, E,Е-билирубин IXб) и структурных (Z-люмирубин и E-люмирубин) изомеров.

Несмотря на определенные практические успехи в разработке метода фототерапии, аппараты на основе ламповых источников света не обеспечивают снижения уровня билирубина до безопасных концентраций. При этом кардинальное повышение эффективности светолечения путем совершенствования ламп сопряжено с рядом принципиально непреодолимых трудностей, а именно, невозможностью получения высокой интенсивности света в узком спектральном диапазоне. Следовательно, разработка новых высокоэффективных методов и аппаратуры для фототерапии гипербилирубинемии новорожденных является актуальной и своевременной. Однако прогресс в данном направлении не может быть достигнут без детального изучения механизма фотофизических и фотохимических процессов, лежащих в основе рассматриваемого метода терапии, поскольку невыясненными оставались вопросы, имеющие фундаментальное значение: причины зависимости квантового выхода фотоизомеров от длины волны воздействующего излучения и микроокружения Z,Z-билирубина IXб; причины сильно выраженной селективности процесса цис-транс и структурной фотоизомеризации Z,Z-билирубина IXб, заключающейся в преимущественном образовании Z,E-билирубина IXб и низком выходе люмирубина; роль билирубина и его фотопродуктов в сенсибилизированном повреждении биологически важных соединений (ферментов и гормонов). Эти и другие задачи решаются в рамках данной диссертации.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Связь работы с крупными программами и темами

Тема диссертации соответствует утвержденному научному плану работ Института физики НАН Беларуси и приоритетным направлениям

а) фундаментальных и прикладных научных исследований (см. постановление Совета Министров РБ от 17 мая 2005 г. № 512), таких как:

1. Разработка новых лечебных, диагностических, профилактических и реабилитационных технологий, приборов и изделий медицинского назначения, лекарственных и иммунобиологических препаратов, клеточных и молекулярно-биологических технологий:

фундаментальные научные исследования

- новые методы диагностики, профилактики и лечения заболеваний человека.

прикладные научные исследования

- новые технологии профилактики, диагностики, лечения и реабилитации;

- медицинская техника, изделия медицинского назначения, включая молекулярно-генетические разработки;

б) научно-технической деятельности (см. Указ Президента Республики Беларусь от 6 июля 2005 г. № 315), таких как:

1. Научно-исследовательские и опытно-конструкторские работы, направленные на разработку и обеспечение критических технологий: Разработка новых опто- и радиоэлектронных приборов для промышленности, медицины, экологии, систем обработки данных, систем управления качеством, метрологии и сертификации.

Исследования по диссертационной работе проводились в рамках следующих государственных программ, тем и инновационных проектов:

- Государственная программа ориентированных фундаментальных исследований «Проблемы лазерной физики и использования оптического излучения», шифр «Когерентность». Задание “Когерентность 41” «Исследование закономерностей и механизмов взаимодействия лазерного излучения с биологическими структурами, разработка фотофизических основ лазерных медицинских и сельскохозяйственных технологий». Номер госрегистрации 2003424. Срок выполнения: 1 кв. 2001 г. - 4 кв. 2005 г.

- Республиканская программа фундаментальных исследований «Физические основы лазерной техники и использование оптического излучения», шифр «Квант», задание «Квант - 34» «Разработка физических основ взаимодействия лазерного излучения различных параметров с биообъектами (молекулами, клетками, тканями, организмами). Выработка физических принципов создания технологии и аппаратуры повышенной эффективности для медицины (терапии, хирургии, диагностики) на основе лазерных источников излучения» Номер госрегистрации 19963780. Срок выполнения 1 кв. 1996 г. - 4 кв. 2000 г.

- Республиканская комплексная программа фундаментальных исследований «Разработка проблем генерации, взаимодействия с веществом и использования лазерного излучения» («Лазер-3»). Задание 3.22 «Исследование механизмов взаимодействия лазерного излучения с биообъектами и разработка на этой основе новых медицинских методов и аппаратуры для диагностики, терапии и хирургии». Срок выполнения 1 кв. 1991 г. - 4 кв. 1995 г.

- Республиканская государственная программа «Оптика» 1986-1990 гг. Задание Оптика-2.49 «Разработка методов и аппаратуры регулирования биологических процессов с помощью импульсного и непрерывного лазерного излучения различных длин волн». Номер госрегистрации 01860010407. Срок выполнения 1 кв. 1986 г. - 4 кв. 1990 г.

- Республиканская научно-техническая программа «Медицина» 1986-1990 гг. Задание Медицина 28Z «Создание источников монохроматического излучения для фототерапии гемолитической болезни новорожденных». Номер госрегистрации 01870027655. Срок выполнения 1987-1990 гг.

Цель и задачи исследования

Целью работы является установление механизма и динамики фотофизических процессов в молекулах Z,Z-билирубина IXб, лежащих в основе терапевтического действия лазерного излучения при лечении желтухи новорожденных детей, для создания лазерной медицинской аппаратуры и оптимизации технологий фототерапии неонатальной гипербилирубинемии.

В связи с этим были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать спектральные и поляризационные характеристики флуоресценции Z,Z-билирубина IXб при комнатной температуре в хлороформе и в водной буферной среде в составе равновесного комплекса с сывороточными альбуминами различного видового происхождения, а также в изобутиловом спирте в условиях низких температур (t = - 100 C).

2. Изучить спектрально-флуоресцентные и абсорбционные характеристики люмирубина - структурного фотоизомера Z,Z-билирубина IXб, ответственного за эффективность фототерапии гипербилирубинемии новорожденных детей. Разработать спектрально-флуоресцентный метод определения концентрации люмирубина в смеси фотопродуктов билирубина без хроматографического разделения облученного раствора на компоненты.

3. Выяснить причины зависимости квантового выхода фотоизомеризации Z,Z-билирубина IXб и степени селективности данного процесса от микроокружения пигмента и от длины волны воздействующего лазерного излучения.

4. Выяснить роль билирубина и его фотопродуктов в сенсибилизированном повреждении биологически важных соединений на модельных растворах и в крови; сопоставить побочные эффекты, вызываемые воздействием на растворы светом широкополосных ламповых и лазерных источников; разработать методы и подходы, направленные на снижение побочного неблагоприятного действия при проведении фототерапии гипербилирубинемии.

5. Разработать медико-технические требования и создать лазерную установку; апробировать метод лазерной фототерапии в клинической практике и провести сравнительный анализ ее эффективности в сопоставлении с действием традиционно используемых флуоресцентных ламп; сформулировать требования к нелазерным источникам излучения, перспективным для фототерапии желтухи новорожденных детей.

Предметом исследования являлось: спектрально-флуоресцентные и поляризационные характеристики Z,Z-билирубина IXб и люмирубина; фотофизические и фотохимические процессы, определяющие селективность и спектральную зависимость фотоизомеризации Z,Z-билирубина IXб, а также сенсибилизированное повреждение биологически важных соединений; технологии и лазерная аппаратура повышенной терапевтической эффективности. Объектом исследования являлись: Z,Z-билирубин IXб и продукты его цис-транс- и структурной фотоизомеризации; фермент лактатдегидрогеназа в растворе; кровь, полученная в ходе заменного переливания; новорожденные дети с синдромом коньюгационной желтухи и гемолитической болезнью; оптико-механические модули и узлы лазерной медицинской установки.

Положения, выносимые на защиту

1. Закономерности протекания фотофизических и фотохимических процессов в молекуле Z,Z-билирубина IXб, связанной с альбумином крови, лежащие в основе терапевтического действия лазерного излучения при лечении гипербилирубинемии (желтухи) новорожденных детей, обусловлены: (а) бихромофорным характером поглощения (и испускания) света указанной молекулой, (б) различием спектров образующих ее хромофоров, вызванным несимметричностью строения и гетерогенностью окружения в белковой матрице; (в) наличием межхромофорного внутримолекулярного переноса энергии, вероятность которого зависит от длины волны возбуждения в пределах длинноволновой полосы поглощения пигмента и от его конформации, определяемой типом белка-носителя.

2. Наличие в молекуле люмирубина кроме основных полос поглощения (макс 460 нм) и флуоресценции (макс 530 нм), типичных для всех фотоизомеров билирубина, дополнительных полос поглощения (макс 592 нм) и флуоресценции (макс 650 нм), обусловленных присутствием в структуре одного из хромофоров пигмента семичленного цикла, позволяет контролировать относительную концентрацию люмирубина в облученной смеси билирубин-альбуминового комплекса без ее хроматографического разделения на фракции, и спектральными методами подтвердить увеличение квантового выхода образования люмирубина при переходе от длины волны лазерного излучения, соответствующей максимуму полосы поглощения билирубина, на ее длинноволновый склон.

3. Причинами существенного преобладания в состоянии динамического равновесия Z,E-билирубина IXб среди продуктов цис-транс фотоизомеризации билирубина при его облучении в составе комплекса с альбумином человека являются: (а) при возбуждении на длинноволновом краю полосы поглощения в условиях отсутствия межхромофорного переноса энергии - больший вклад в общее поглощение света билирубином хромофора II, ответственного за образование Z,E-изомера, по сравнению с вкладом хромофора I, цис-транс фотоизомеризация которого приводит к образованию E,Z-изомера; (б) при коротковолновом возбуждении - эффективный внутримолекулярный «приток» энергии электронного возбуждения (с хромофора I на хромофор II), компенсирующий более низкое (по сравнению с хромофором I) поглощение света в данной области спектра хромофором II.

4. Регистрируемое фотодинамическое повреждение молекул ферментов, присутствующих в растворе при облучении Z,Z-билирубина IXб, локализованного в участках сильного связывания макромолекулы сывороточного альбумина человека, обусловлено сенсибилизацией со стороны фотоизомеров билирубина (прежде всего, люмирубина), характеризующихся более низкими константами ассоциации с альбумином и расположенными на поверхности его белковой глобулы.

5. Оптимальные спектральные ( = 475-515 нм) и энергетические (плотность мощности 2-5 мВт/см2) характеристики лазерного излучения для лечения гипербилирубинемии новорожденных детей, позволяющие в 3-4 раза снизить продолжительность сеансов фототерапии, избежать побочных неблагоприятных эффектов, и резко сократить необходимость заменных переливаний крови (по сравнению с традиционно используемыми ламповыми источниками света).

Личный вклад соискателя

Содержание диссертации отражает личный вклад автора в исследование фотофизических и фотохимических процессов, определяющих терапевтическое и побочное действие света при лечении гипербилирубинемии новорожденных детей; разработку медико-технических требований и принципов построения лазерной аппаратуры медицинского назначения, и ее приборную реализацию. Все основные результаты, определяющие научную и практическую значимость работы, проведение исследований, статистическую обработку данных и их интерпретацию, получены автором или при его непосредственном участии. Все приведенные с участием автора в диссертации публикации подготовлены либо лично автором, либо по его инициативе и непосредственном участии.

Научному руководителю, заведующему лабораторией лазерных систем и приборов к.ф.-м.н. Мостовникову В.А. принадлежит выбор темы исследования и обсуждение полученных результатов. Специалисты-химики (ведущий научный сотрудник к.х.н. Мостовникова Г.Р. и научный сотрудник Третьякова А.И.) принимали участие в исследованиях сенсибилизирующего действия билирубина и его фотопродуктов на скорость ферментативных биохимических реакций, а также в расшифровке структуры фотопродуктов билирубина. Другие соавторы принимали участие в разработке конструкторской документации на лазерный терапевтический аппарат (Андреев С.П., Леусенко И.А, Рябцев А.Б., Третьяков С.А.) или в медицинских исследованиях (д.м.н., профессор Зубович В.К., Качан С.Э, к.м.н. Новаковский А.Л., д.м.н., профессор Скобелкин О.К., к.м.н. Устинович А.К.), не вошедших в диссертационную работу.

Апробация результатов диссертации

Результаты диссертации представлялись в докладах на следующих научных конференциях, школах-семинарах и симпозиумах: международная конференция «Новое в лазерной медицине и хирургии» (Переславль-Залесский, 1990); всесоюзная конференция «Актуальные проблемы применения магнитных и электромагнитных полей в медицине» (Ленинград, 1990); международная конференция «Новое в лазерной медицине» (Брест, 1991); V съезда Белорусского научного медицинского общества акушеров-гинекологов и неонатологов (Брест, 1991); международная конференция «Применение низкоинтенсивного лазерного излучения в педиатрии» (Кобулети, 1991); международная конференция «Перспективные направления лазерной медицины» (Москва, 1992); международная конференция «Оптика лазеров» (С.-Петербург, 1993); I съезд Белорусского общества фотобиологов и биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 1994); 5th International Conference «Laser Applications in Life Sciences» (Minsk, 1994); международная конференция «Лазеры в медицине» (Вильнюс, 1995); International Conference «Light and biological systems» (Wroclaw, Poland, 1995); 6th European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules (Villeneuve D'Ascq, France, 1995); международный семинар в рамках деятельности МНТЦ «Конверсия научных исследований в Беларуси» (Минск, 1999); международная конференция «Лазеры для медицины, биологии и экологии» (С.-Петербург, 2002); международная конференция «Лазерная физика и применение лазеров» (Минск, 2003); международная конференция «Лазерная физика и оптические технологии» (Гродно, 2006); международная научная конференция, VIII съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2008).

Отдельные разделы работы доложены на совместном заседании Ученого медицинского совета Министерства здравоохранения РБ и Бюро Отделения медицинских наук НАН Беларуси «Состояние и перспективы развития лазерной медицины в Республике Беларусь» (Минск, 9 июля 2008 г.).

Опубликованность результатов диссертации

Результаты диссертации опубликованы в 32 научных работах; из которых 7 статей в соответствии с п. 18 Положения о присуждении ученых степеней и присвоении ученых званий в Республике Беларусь (общим объемом 5,0 авторских листов); 1 статья в журнале «Здравоохранение Беларуси»; 6 статей в сборниках материалов научных конференций и 14 тезисов. По материалам диссертации получено 1 авторское свидетельство и 3 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 161 странице и состоит из оглавления, введения, общей характеристики работы, 4 глав, заключения, библиографического списка. Библиографический список состоит из 254 наименований, включая собственные публикации автора. Материал иллюстрирован 6 таблицами (7 страниц) и 41 рисунком (25 страниц).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ

лазерный терапия гипербилирубинемия новорожденный

Глава 1 посвящена анализу литературных данных по использованию оптических технологий в лечении желтухи новорожденных детей. В разделе 1.1 показано, что фототерапия является наиболее распространенным методом лечения указанного синдрома, основная задача которой - снижение до безопасного уровня концентрации билирубина в крови, не прибегая к методам инвазивной терапии. В разделе 1.2 проведен анализ спектральных и энергетических характеристик источников излучения, применяемых для фототерапии неонатальной гипербилирубинемии: флуоресцентных ламп, металлогалоидных газоразрядных ламп и галогенных ламп накаливания; вскрыты причины их низкой эффективности. В разделе 1.3 обсуждаются факторы и фотохимические процессы, лежащие в основе побочных неблагоприятных эффектов на организм новорожденного, вызываемых длительным воздействием ламповых источников света. В разделе 1.4 показано, что при проведении фототерапии основную роль в снижении уровня билирубина играют процессы его фотоизомеризации (рисунок 1), а вклад фотоокисления пигмента в снижение его концентрации в крови незначителен.

На основе анализа литературных данных сформулированы основные цели и задачи диссертации.

В Главе 2 изучены фотофизические и фотохимические механизмы терапевтического действия лазерного излучения при лечении желтухи новорожденных детей. Раздел 2.1 содержит методики приготовления исследуемых образцов, основные характеристики объектов исследования, а также описание экспериментального оборудования и спектральных методов исследований.

Рисунок 1 - Схема фотоизомеризации Z,Z-билирубина IXб

В разделе 2.2 изучены спектрально-флуоресцентные и поляризационные характеристики Z,Z-билирубина IXб при комнатной температуре в хлороформе и при t = -100 C в изобутиловом спирте. Показано, что при изменении длины волны возбуждения (возб) в пределах длинноволновой полосы поглощения Z,Z-билирубина IXб (от 400 до 500 нм) наблюдается батохромное смещение максимума спектра флуоресценции пигмента (макс 3 нм). При этом вследствие чрезвычайно малой длительности затухания флуоресценции пигмента при комнатной температуре (пикосекундный диапазон) при возбуждении поляризованным излучением процессы вращательной деполяризации не успеют развиться, и удается зарегистрировать поляризационные спектры даже в невязких растворах хлороформа: для возб = 453 нм p = 0,24±0,03. Однако очень низкий квантовый выход флуоресценции (фл 10-4) и слабая фотохимическая устойчивость пигмента в хлороформе не позволяют надежно исследовать его поляризационные спектры во всем спектральном диапазоне флуоресценции и длинноволнового поглощения билирубина. Указанные измерения выполнены в изобутиловом спирте в условиях низких температур (t = -100 C), когда растворитель находится в вязком состоянии и квантовый выход флуоресценции увеличивается в 500 раз (фл = 0,10). Измерения показали, что при длинноволновом краевом возбуждении степень поляризации флуоресценции р = 0,47 близка к предельной (р = 0,50) по всему спектру испускания пигмента, а при уменьшении длины волны возбуждения наблюдается монотонное снижение до р = 0,12. При возбуждении билирубина на высокие колебательные подуровни S1-состояния (коротковолновый склон полосы поглощения) р = 0,120,11 по всему диапазону спектра флуоресценции. Полученные данные интерпретированы с позиций бихромофорного характера поглощения и испускания света молекулами Z,Z-билирубина IXб, с учетом спектральной неидентичности хромофоров, конформационной гетерогенности пигмента в растворе, вклада во флуоресценцию молекул, не завершивших колебательную релаксацию в S1-состоянии («горячая флуоресценция») и наличия внутримолекулярного переноса энергии, эффективность которого изменяется при варьировании длины волны излучения в пределах длинноволновой полосы поглощения билирубина. В разделе 2.3 изучено влияние сывороточных альбуминов различного видового происхождения (сывороточный альбумин человека, САЧ и быка, САБ) на закономерности дезактивации энергии электронного возбуждения Z,Z-билирубина IXб. Отмечается, что при встраивании пигмента в указанные белковые структуры квантовый выход флуоресценции Z,Z-билирубина IXб увеличивается от фл = 210-5 для водной среды до фл = 310-3 для комплекса с САЧ и до фл = 8.510-4 для комплекса с САБ. Спектрально-флуоресцентные и поляризационные характеристики пигмента, встроенного в центры сильного связывания указанных белков, представлены на рисунке 2. Видно (кривые 4-6), что для Z,Z-билирубина IXб в составе комплекса с белками значительно увеличивается (по сравнению с органическими растворителями) величина батохромного смещения максимума полосы флуоресценции при изменении возб в пределах длинноволновой полосы его поглощения: макс= 7 нм для комплекса с САЧ и макс= 11 нм для комплекса с САБ. Увеличение спектральных различий между хромофорами связывается с гетерогенностью их микроокружения, создаваемого различными участками полипептидной цепи, и с «зарядовым эффектом». При длинноволновом возбуждении степень поляризации флуоресценции Z,Z-билирубина IX в составе его комплексов с САЧ и САБ (t = 20 C) близка к предельной (кривые 8), что обусловлено чрезвычайно короткой длительностью затухания флуоресценции ( << 1 нс), отсутствием внутри- и межмолекулярного переноса энергии, а также жесткой фиксацией пигмента в белковой матрице. При коротковолновом возбуждении Z,Z-билирубина IXб (кривые 7) регистрируется внутримолекулярный перенос энергии, вероятность которого сильно зависит и от конформации билирубина, определяемой типом белка-носителя. Более высокая эффективность безизлучательного переноса для комплекса билирубин-САЧ коррелирует с более высокой (по сравнению с билирубин-САБ) селективностью процесса фотоизомеризации Z,Z-билирубина IXб, заключающейся в преимущественном образовании Z,Е-билирубина IXб в состоянии динамического равновесия между изомерами.



1-3 - спектры возбуждения флуоресценции при рег = 500, 535, 580 нм соответственно; 4-6 - спектры флуоресценции при возб = 400, 460 и 500 нм; 7 - поляризационный спектр флуоресценции по возбуждению при рег = 535 нм; 8, 9 - поляризационный спектр флуоресценции по испусканию при возб = 500, 400 нм, а - САЧ; б - САБ

Рисунок 2 - Спектры возбуждения флуоресценции, спектры флуоресценции, поляризационный спектр флуоресценции по возбуждению и по испусканию билирубина в комплексе с САЧ и САБ при t = 20 C

Причины селективности процесса фотоизомеризации и зависимости квантового выхода образования фотопродуктов от длины волны воздействующего излучения проанализированы в разделе 2.4. Показано, что в основе данной зависимости лежит изменяющийся вклад в общее поглощение света билирубином хромофора I, ответственного за образование люмирубина и изменение эффективности внутримолекулярного «оттока» энергии электронного возбуждения с указанного хромофора на хромофор II, неспособный в силу структурных особенностей к фотоциклизации. В разделе 2.5 приведены и обсуждаются результаты спектрополяриметрических и спектрофотометрических исследований, свидетельствующие, что процессу межхромофорного переноса энергии электронного возбуждения в условиях аномально короткой длительности затухания флуоресценции билирубина (пикосекундный диапазон) способствуют резонансные диполь-дипольные экситонные взаимодействия между хромофорами. Наличие экситонных взаимодействий между хромофорами Z,Z-билирубина IXб в составе комплекса с САЧ подтверждается: (а) расщеплением спектра кругового дихроизма на две компоненты противоположных знаков в области длинноволновой полосы поглощения билирубина; (б) значительным уширением спектра поглощения билирубина и его смещением в длинноволновую область относительно монохромофорного аналога (ксантабилирубиновой кислоты). В соответствие с теорией экситонных взаимодействий в зависимости от угла между хромофорами () результирующий спектр поглощения бихромофора может смещаться как в длинноволновую, так и в коротковолновую стороны по отношению к спектрам поглощения составляющих хромофоров. Направленность смещения определяется энергией резонансного диполь-дипольного взаимодействия Vдд = [12(cos - 3 cos 1 cos 2)]/40R3, где 1 и 2 - дипольные моменты хромофоров; 0 - диэлектрическая постоянная; - угол между диполями; 1 и 2 - угол между радиус-вектором, соединяющим центры диполей, и каждым диполем. При Vдд < 0 должен наблюдаться длинноволновый сдвиг, а при Vдд > 0 - коротковолновый. Оценка величины Vдд, проведенная на основании литературных данных о возможных вариантах конформации Z,Z-билирубина IXб в составе комплекса с САЧ, показала, что во всех случаях Vдд< 0. Следовательно, результирующий спектр поглощения бихромофора должен быть смещен в длинноволновую область по отношению к монохромофорному аналогу, что соответствует результатам эксперимента.

Глава 3 посвящена изучению закономерностей действия излучения ламп и лазерных источников на биологически важные соединения в модельных средах и крови с повышенным содержанием билирубина с целью выяснения механизмов побочных эффектов, вызываемых светом различного спектрального диапазона, и разработки комплекса мер и подходов, направленных на исключение (снижение) неблагоприятного действия света при проведении фототерапии желтухи новорожденных детей. Раздел 3.1 содержит описание экспериментального оборудования и спектральных методов контроля биологической активности ферментов в растворе, а также концентрации гормонов и билирубина в крови. В разделе 3.2 исследован вклад различных фотоизомеров Z,Z-билирубина IXб, а также продуктов его фотоокисления в изменение абсорбционных характеристик Z,Z-билирубина IXб, связанного с САЧ, при воздействии лазерного излучения различного спектрального диапазона (He-Cd-лазер с  = 441,6 нм, P = 4 мВт/см2 и Ar-лазер с  = 514,5 нм, P = 35,4 мВт/см2) в условиях одинакового исходного количества (N = 1,661015 кв./см2с) поглощаемых билирубином квантов света (рисунок 3). Наблюдаемые различия в регистрируемых суммарных спектрах поглощения смеси фотопродуктов объясняются зависимостью квантового выхода образования фотоизомеров от длины волны лазерного излучения. Показано, что при соотношении концентраций билирубин/САЧ Cбр/ССАЧ = 2 и времени облучения, индуцирующем снижение оптической плотности в синей области спектра в 2,0 раза, основной вклад в обесцвечивание раствора вносит люмирубин, характеризующийся в области  = 450 нм более низким (примерно в 2 раза) молярным коэффициентом экстинкции, чем Z,Z-билирубин IX. Кроме того в указанных условиях облучения концентрация люмирубина превышает таковую для любого из цис-транс-изомеров билирубина. В разделе 3.3 изучены спектрально-флуоресцентные характеристики люмирубина. Показано, что указанный фотоизомер билирубина характеризуется флуоресценцией с максимумом при макс = 650 нм. На основании изучения спектров возбуждения люмирубина сделан вывод, что наряду с ранее известным поглощением в области 455 нм, он имеет поглощение в ультрафиолетовом диапазоне (макс = 337 нм), а также в области макс = 592 нм. Разработан флуоресцентный метод контроля относительного уровня люмирубина в смеси фотопродуктов билирубина без ее разделения на компоненты. С его использованием получены экспериментальные подтверждения зависимости квантового выхода образования люмирубина от длины волны воздействующего лазерного излучения. Закономерности воздействия излучения специальной флуоресцентной лампы (рисунок 4), широко применяемой для фототерапии желтухи новорожденных детей, и лазерных источников различного спектрального диапазона на молекулы ферментов в модельных растворах в присутствии ZZ-билирубина IXб исследованы в разделе 3.4. Исследования показали, что длительное облучение растворов, содержащих наряду с комплексом билирубин-САЧ (Cбр = 4 мкМ, ССАЧ = 2 мкМ) молекулы фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ, СЛДГ =810-9 М), приводит, наряду с фотодеструкцией билирубина, к снижению биохимической активности фермента за счет снижения концентрации его нативной формы. При одинаковом времени облучения при вышеуказанных условиях наибольшая инактивация фермента наблюдается при воздействии излучения = 441,6 нм, наименьшая - при  = 514,5 нм; излучение с = 457,9 нм по сенсибилизирующей активности в отношении ЛДГ занимает промежуточное значение. Фотохимическое повреждение фермента происходит с участием синглетного кислорода. Обосновано, что фотосенсибилизатором в отношении ЛДГ выступает не билирубин, а один из его фотопродуктов - и, прежде всего, люмирубин, концентрация которого растет по мере увеличения времени облучения. Кроме того, константа связывания люмирубина с САЧ на два порядка ниже соответствующей величины для Z,Z-билирубина IXб, и в отличие от билирубина люмирубин расположен на поверхности белковой глобулы САЧ. Следовательно, если фотохимически активные интермедиаты, образующиеся при поглощении света билирубином, практически не имеющим в участках сильного связывания САЧ контакта с водным окружением, в первую очередь взаимодействуют с аминокислотными остатками белка, то люмирубин может сенсибилизировать как процесс фотодеструкции САЧ, так и ЛДГ.



1 - необлученный раствор; 2, 3 - растворы, облученные t = 30 мин с  = 441,6 нм, P = 4,0 мВт/см2 и  = 514,5 нм, P = 34,5 мВт/см2 соответственно

Рисунок 3 - Изменения спектра поглощения Z,Z-билирубина IXб, связанного с САЧ, при облучении

1 - спектр поглощения билирубина; 2 - спектр излучения лампы Westinghouse F20T12; 3 - спектр светопропускания полиметилметакрилата

Рисунок 4 - Спектральные характеристики Z,Z-билирубина IXб, флуоресцентной лампы и материала кювеза

Показано, что негативное влияние света на биохимическую активность ЛДГ еще больше усиливается при переходе к широкополосному источнику излучения - флуоресцентной лампе, почти половина интенсивности которой сосредоточена в фиолетовой области спектра (рисунок 4). Указанная полоса испускания лампы перекрывается с интенсивной полосой поглощения люмирубина, один из их максимумов которой расположен в ультрафиолетовой области (макс = 337 нм). Минимальное побочное действие оказывает излучение в зеленой области спектра (аргоновый лазер), соответствующее длинноволновому склону полосы поглощения билирубина. Исходя из полученных результатов, предложены методы снижения побочных неблагоприятных эффектов при проведении фототерапии. В разделе 3.5 проведена сравнительная характеристика влияния лазерного излучения и света специальной флуоресцентной лампы на фотолиз гормонов (тироксин Т4; тиронин, Т3; эстрадиол, Е2) в плазме крови с повышенным содержанием билирубина, полученной в ходе заменного переливания крови у новорожденных. Показано, что в этом случае в качестве фотосенсибилизатора выступает как сам билирубин, так и другие эндогенные пигменты (прежде всего, рибофлавин), имеющие полосы поглощения в УФ и синей области спектра. Фотоповреждение гормонов происходит с участием как синглетного кислорода, так и радикальных реакций. При дозовой нагрузке, вызывающей одинаковое снижение уровня общего билирубина в плазме крови, максимальное неблагоприятное действие оказывает флуоресцентная лампа, ртутные линии которой с длиной волны 313 и 365 нм соответствуют длинноволновой полосе поглощения тироксина и способны вызывать его фотодеструкцию. Минимальное побочное действие оказывает лазерное излучение, соответствующее длинноволновому склону полосы поглощения билирубина.

Глава 4 посвящена разработке лазерной аппаратуры и технологий фототерапии желтухи новорожденных детей. В разделе 4.1 проведено обоснование выбора спектрального диапазона излучения, оптимального для лечения неонатальных желтух. Показано, что использование излучения фиолетовой и синей областей спектра для фототерапии малоперспективно из-за сильного экранирующего действия со стороны основных эндогенных пигментов: меланина кожи и гемоглобина крови. Экранирующее действие указанных соединений в отношении билирубина наименее выражено в области длин волн, соответствующих длинноволновому склону его полосы поглощения (л = 475-515 нм). В разделе 4.2 обосновываются технические принципы создания фототерапевтического аппарата на базе аргонового лазера с моноволоконной и зеркально-призменной транспортировкой излучения. Световое пятно протяженной формы для воздействия на поверхность тела ребенка формируется призмой-зеркалом оригинальной конструкции, заключающейся в том, что на отражающей грани призмы выполнена вогнутая сфера, выполняющая функцию выпуклого отражающего зеркала. Произведен расчет оптической схемы, обеспечивающей получение светового пятна заданных размеров. При этом отражение падающего излучения сферическим зеркалом осуществляется за счет полного внутреннего отражения излучения на границе раздела двух сред: стекло/воздух без нанесения отражающих покрытий. В разделе 4.3 рассмотрены принципы аппаратурной реализации лазерной установки для лечения желтухи новорожденных детей с транспортировкой излучения по системе волоконно-оптических световодов, обеспечивающих возможность: (а) воздействия отдельными световыми пучками, оптическая ось которых образует угол, близкий к прямому, с различно расположенными участками поверхности тела, на которые производится воздействие; (б) независимого линейного и углового перемещения (позиционирования) световых пятен, создаваемых каждым световодом; (в) снижения тепловой нагрузки на входной и дистальный торцы световодной системы за счет распределения излучения между всеми световодами, используемыми в аппарате. В разделе 4.4 дана сравнительная оценка эффективности фототерапии гипербилирубинемии у экспериментальных животных при использовании лазерных и ламповых источников света. Показано, что принципиальных различий в действии света флуоресцентных ламп и неполяризованного излучения аргонового лазера (аппарат «Малыш») на организм животных с искусственно вызванной гипербилирубинемией не обнаруживается. При этом использование аппарата «Малыш» позволяет значительно интенсифицировать процесс экскреции билирубина. В разделе 4.5 приводятся результаты клинических испытаний аппарата, которые показали ряд преимуществ разработанной лазерной технологии терапии по сравнению с традиционным методом лечения, основанным на использовании флуоресцентных ламп; проанализированы факторы, определяющие повышенную эффективность разработанного метода лазерной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные научные результаты диссертации

Научная новизна полученных результатов заключается в следующем.

1. Впервые получены экспериментальные подтверждения, что молекула Z,Z-билирубина IX, избыточное накопление которого в организме новорожденного ребенка приводит к развитию синдрома желтухи, представляет собой соединение, состоящее из двух взаимодействующих хромофоров (бихромофор), вклад каждого из которых в общее поглощение и испускание света пигментом, а также в его геометрическую (цис-транс) и структурную фотоизомеризацию определяется длиной волны возбуждения и микроокружением [2, 3, 12].

2. Установлено, что причинами изменения количественного соотношения между фотопродуктами (Z,E-билирубин IX, E,Z-билирубин IX, E,Z-люмирубин) Z,Z -билирубина IX, связанного с альбумином крови, при изменении длины волны лазерного излучения в пределах длинноволновой полосы поглощения тетрапиррола являются: (а) спектральная неидентичность образующих молекулу пигмента хромофоров, вызванная несимметричностью их строения и гетерогенностью окружения в белковой матрице; (б) наличие межхромофорного внутримолекулярного переноса энергии, вероятность которого сильно зависит от длины волны излучения [6].

3. Показано, что зависимость квантового выхода образования люмирубина от длины волны воздействующего лазерного излучения в пределах длинноволновой полосы поглощения билирубина определяется: (а) изменяющимся вкладом в общее поглощение света билирубином хромофора I, ответственного за процесс фотоциклизации (образование люмирубина); (б) изменением эффективности внутримолекулярного «оттока» энергии электронного возбуждения с указанного хромофора на хромофор II, неспособный в силу структурных особенностей к фотоциклизации [7, 13, 23, 26].

4. На основании впервые полученных и исследованных спектров поляризации флуоресценции по возбуждению и испусканию Z,Z -билирубина IX в состоянии комплекса с альбуминами различного видового происхождения сделан вывод, что вероятность внутримолекулярного межхромофорного синглет-синглетного переноса энергии сильно зависит от конформации билирубина, определяемой типом белка-носителя (САЧ или САБ) [7, 27].

5. Показано, что процессу межхромофорного переноса энергии электронного возбуждения в условиях аномально короткой длительности затухания флуоресценции билирубина (пикосекундный диапазон) способствуют резонансные диполь-дипольные экситонные взаимодействия между хромофорами [5, 7, 13].

6. Разработан люминесцентный метод контроля уровня люмирубина в смеси фотопродуктов билирубина без хроматографического разделения компонент по фракциям. С его использованием получены экспериментальные подтверждения, что при одинаковом количестве поглощенных билирубином фотонов концентрация люмирубина (характеризующегося наиболее высокой среди фотопродуктов скоростью экскреции и ответственного за эффективность фототерапии гипербилирубинемии) увеличивается при смещении возбуждения на длинноволновый склон полосы поглощения пигмента [5, 32].

7. Показано, что побочные неблагоприятные эффекты, вызываемые светом сине-зеленой области спектра при проведении фототерапии гипербилирубинемии, кроме билирубина могут инициироваться его фотопродуктами, а также присутствующими в плазме крови эндогенными фотосенсибилизаторами. Минимальное побочное действие оказывает лазерное излучение, соответствующее длинноволновому склону полосы поглощения билирубина, максимальное - широкополосное излучение лампового источника [8, 14 - 18, 29].

8. На основании выявленных закономерностей протекания фотофизических и фотохимических процессов в молекулах Z,Z-билирубина IXб предложены оптимальные параметры лазерного излучения ( = 475-515 нм, плотность мощности Р = 2-5 мВт/см2) и режимы воздействия для проведения фототерапии, разработаны эффективные технологии лечения желтухи новорожденных детей, реализованные с использованием созданного лазерного терапевтического аппарата «Малыш» [1, 5, 9, 19 - 22, 25, 28, 30, 31, 33].

9. Существенное снижение побочных неблагоприятных эффектов при использовании разработанной аппаратуры на основе аргонового лазера для лечения гипербилирубинемии новорожденных детей достигнуто за счет отсутствия в спектре испускания лазера ( = 475-515 нм) УФ и ИК составляющих, а также видимого излучения, не соответствующего спектру поглощения билирубина [2, 4, 10, 11].

Рекомендации по практическому использованию результатов

1. Выявленные в ходе выполнения данной работы закономерности протекания фотофизических и фотохимических процессов в молекулах Z,Z-билирубина IXб, лежащих в основе терапевтического действия света при лечении гипербилирубинемии новорожденных детей, использованы при создании лазерных фототерапевтических аппаратов «Малыш», поставленных в медицинские учреждения Республики Беларусь, России и Украины (10 аппаратов).

2. Разработанные оригинальные технические решения по формированию светового пятна протяженной формы, основанные на использовании призмы-зеркала, отражающая грань которой выполнена в виде вогнутой сферы или цилиндра, могут использоваться в терапевтических аппаратах с зеркальной (шарнирной) транспортировкой излучения для воздействия на очаги поражения наружной локализации.

3. Полученные результаты показали перспективность применения для лечения желтухи новорожденных детей нового источника квазимонохроматического излучения - сверхъярких светодиодов, отсутствовавших на момент создания лазерного аппарата. В настоящее время разработанные фототерапевтические аппараты на основе светоизлучающих диодов для лечения желтухи новорожденных детей серийно производятся в Республике Беларусь и в медучреждения страны поставлено более 400 таких аппаратов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Экспериментальное обоснование лечения гипербилирубинемии лазерным излучением / В.К. Зубович, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Здравоохранение Беларуси. - 1993. - № 11. - С. 28-31.

2. Mostovnikov, V.A. Spectral and photochemical parameters, which define laser phototherapy hyperbilirubinemia of newborn higher efficacy / V.A. Mostovnikov, G.R. Mostovnikova, V.Yu. Plavski // Proc. SPIE. Laser Applications in Life Sciences. / Eds. P.A. Apanasevich, N.I. Koroteev, S.G. Kruglik, V.N. Zadkov - 1994. - Vol. 2370. - P. 558-561.

3. Plavski, V.Yu. Bichromophoric character of the absorption and emission of light by molecules of bilirubin / V.Yu. Plavski, V.A. Mostovnikov, G.R. Mostovnikova // Spectroscopy of Biological Molecules / Eds. J.C. Merlin, S. Turrell and J.P. Huvenne. - Dordrecht, Boston, London: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 271 -272.

4. Mostovnikov, V.A. Spektroskopowe i fotochemiczne dowody na podwyzszona efektywnosc laserowej terapii hiperbilirubinemii noworodkow (Spectroscopic and photochemical proofs for enhanced efficacy of laser therapy for neonatal hyperbilirubinemia) / V.A. Mostovnikov, G.R. Mostovnikova, V.J. Plawski // Acta Bio-Optica et Informatica Medica. - 1995. - Vol. 1, № 1. - P. 3-6.

5. Фототерапевтический аппарат на основе аргонового лазера для лечения гипербилирубинемии у новорожденных детей / Г.Р. Мостовникова, В.А. Мостовников, В.Ю. Плавский, А.И. Третьякова, А.Б. Рябцев, С.П. Андреев // Оптический журнал. - 2000. - Т.67, № 11. - С. 60-63.

6. Спектрально-флуоресцентные и поляризационные характеристики Z,Z-билирубина IX / В.Ю. Плавский, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.И. Третьякова // Журн. прикл. спектр. - 2007. - T. 74, № 1. - С. 108-119.

7. Фотофизические процессы, определяющие селективность фотоизомеризации Z,Z-билирубина IX в комплексах с альбуминами / В.Ю. Плавский, В.А. Мостовников, А.И. Третьякова, Г.Р. Мостовникова // Оптический журнал. -2007. - Т 74,№ 7, - С - 11-21.

8. Сенсибилизирующее действие Z,Z-билирубина IXa и его фотопродуктов на ферменты в модельных растворах / В.Ю. Плавский, В.А. Мостовников, А.И. Третьякова, Г.Р. Мостовникова // Журн. прикл. спектр. - 2008. - T. 75, № 3. - С. 384-394.

Материалы конференций

9. Лазерная фототерапия - новый метод консервативной терапии синдрома гипербилирубинемии у новорожденных детей / В.К. Зубович, С.Э. Качан, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, А.Б. Рябцев, О.К. Скобелкин, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Перспективные направления лазерной медицины: материалы Межд. конф., Одесса, 18-20 ноября 1992 г. / НИИ лазерной медицины; под ред. О.К. Скобелкина. - Москва, 1992. - С. 406 - 409.

10. Мостовников, В.А. Фотофизические аспекты лазерной терапии гипербилирубинемиии новорожденных / В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, В.Ю. Плавский // Лазеры в медицине: сборник статей и тезисов Межд. конф., 15 - 17 мая 1995 г. - Вильнюс, 1995. - С. 7-16.

11. Лазерная фототерапия гипербилирубинемии у новорожденных детей. / Г.Р. Мостовникова, В.А. Мостовников, В.Ю. Плавский, А.И. Третьякова, А.Б. Рябцев, С.П. Андреев // Конверсия научных исследований в Беларуси: материалы Международного семинара в рамках деятельности МНТЦ, Минск, 17-22 мая 1999 г.: в 2 ч. / Институт физики им. Б.И. Степанова НАН Беларуси; под ред.А.П. Войтовича. - Минск, 1999. - Ч. II. - С. 82-85.

12. Селективная фотоизомеризация билирубина / В.Ю. Плавский, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.И. Третьякова // Лазерная физика и применение лазеров: материалы Междунар. конф., Минск, 14-16 мая 2003 г. / Институт физики им. Б.И. Степанова НАН Беларуси; редкол.: Н.С. Казак, В.А. Савва, А.П. Низовцев, Г.Р. Мостовникова. - Минск, 2003. - С. 309-312.

13. Экситонные межхромофорные взаимодействия в молекуле Z,Z-билирубина IX / В.Ю. Плавский, В.А. Мостовников, А.И. Третьякова, Г.Р. Мостовникова // Лазерная физика и оптические технологии: материалы Междунар. конф., Гродно, 25-29 сентября 2006 г.: в 2 ч. / Институт физики им. Б.И. Степанова НАН Беларуси, Гродн. гос. ун-т; редкол.: Н.С. Казак, В.А. Орлович, С.С. Ануфрик. - Гродно, 2006. - Т. 2. - С. 336-339.

14. Сенсибилизирующее действие Z,Z-билирубина IX и его фотопродуктов на белки в модельных растворах / В.Ю. Плавский, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.И. Третьякова // Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем: сборник статей междун. конф., VIII съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков, Минск, 25-27 июня 2008 г. в 2 ч. / Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, под ред. И.Д. Волотовского, С.Н. Черенкевича. - Минск: Изд. Центр БГУ, 2008. - Ч. 2. - С. 231-233.

Тезисы докладов

15. О механизме сенсибилизированного повреждения белков при фотолизе билирубина / В.К. Зубович, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, О.К. Скобелкин, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Новое в лазерной медицине и хирургии: тезисы Международной конференции, Переславль-Залесский, 17 - 19 октября 1990 г.: в 2 ч. / Государственный научный центр лазерной медицины; под ред. О.К. Скобелкина. - Москва, 1990. - Ч. 2. - С. 40-41.

16. Побочные неблагоприятные эффекты при фотолизе билирубина излучением флуоресцентных ламп и лазерных источников света в плазме крови / В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, В.Ю. Плавский, А.Л. Новаковский // Актуальные проблемы применения магнитных и электромагнитных полей в медицине: тез. докл. Всес. конф., Ленинград, 5 - 7 декабря 1990 г. / Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова; под ред. М.А. Никулина. - Ленинград, 1990. - С. 112-113.

17. Сенсибилизированное повреждение гормонов при фототерапии гипербилирубинемии. / В.К. Зубович, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, О.К. Скобелкин, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Тез. V съезда Белорусского научного медицинского общества акушеров-гинекологов и неонатологов, Брест, 17 - 18 сентября 1991 г. / Белорусское научное медицинское общество акушеров-гинекологов и неонатологов; под ред. И.Г. Герасимовича. - Брест, 1991. - С. 275-277.

18. Роль рибофлавина в сенсибилизированном повреждении гормонов при фототерапии гипербилирубинемии. / В.К. Зубович, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, О.К. Скобелкин, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Применение низкоинтенсивного лазерного излучения в педиатрии: матер. конф., Кобулети, 17 - 20 октября 1991 г. / Тбилисский гос. мед. ин-т, Педиатрический лазеротерапевтический центр; под ред. К. Пагава. - Тбилиси, 1991. - С. 93-94.

19. Лазерная терапия гипербилирубинемии новорожденных - новый высокоэффективный метод лечения / В.К. Зубович, С.Э. Качан, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, О.К. Скобелкин, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Новое в лазерной медицине: тезисы Международной конференции, Брест, 13 - 15 ноября 1991 г. / Научно-исследовательский институт лазерной медицины Минздрава СССР; под ред. О.К. Скобелкина. - Москва, 1991. - С. 163.

20. Лазерная фототерапия - как эффективный метод лечения гипербилирубинемии новорожденных / В.К. Зубович, В.А. Мостовников, Г.Р. Мостовникова, А.Л. Новаковский, В.Ю. Плавский, О.К. Скобелкин, С.А. Третьяков, А.К. Устинович // Тез. V съезда Белорусского научного медицинского общества акушеров-гинекологов и неонатологов, Брест, 17 - 18 сентября 1991 г. / Белорусское научное медицинское общество акушеров-гинекологов и неонатологов; под ред. И.Г. Герасимовича. - Брест, 1991. -

...