Морфофункциональная характеристика яичников при хемоиндуцированном стрессе

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯИЧНИКОВ ПРИ ХЕМОИНДУЦИРОВАННОМ СТРЕССЕ

Денисов Алексей Геннадьевич

Волгоград - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Росздрава, ГУ «Волгоградский научный центр» РАМН и Администрации Волгоградской области

Научный руководитель - доктор медицинских наук, доцент Смирнов Алексей Владимирович

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор Должиков Александр Анатольевич;

доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

Защита состоится « ____» ___________ 2008 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан « ____» ___________ 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Григорьева Н. В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

На сегодняшний день одним из актуальных вопросов морфологии является исследование структурных преобразований в органах и тканях млекопитающих под влиянием изменяющихся условий существования [Пальцев М.А., 2007; Пшенникова М.Г. с соавт., 2007; Kumar V. et al., 2005; Webster Marketon J.I., Glaser R., 2008]. Воздействие любого чрезвычайного фактора, в том числе различных компонентов клеточной стенки бактерий, вызывает генерализованную неспецифическую реакцию организма, или стресс-реакцию, включающую активацию нейро-гуморальной регуляции [Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003; Судаков К.В. 2005; Литвицкий П.Ф., 2007; Wagner D. et al., 2000; Bult A. et al., 2001; Danilczuk Z. et al., 2005; Bernuci M.P. et al., 2008]. Морфофункциональные изменения, возникающие под влиянием стрессовых факторов на различных уровнях регуляции в нервной, эндокринной, иммунной системах, носят стадийный характер и способствуют повышению резистентности организма [Акмаев И.Г., Гриневич В.В., 2003; Бажанова Е.Д., Теплый Д.Л., 2004; Писарев В.Б. с соавт., 2006; Капитонова М.Ю. с соавт., 2007; Потемина Т.Е., 2008; Mitchell E.S. et al., 2002; Irifune T. et al., 2004; Turner-Cobb J.M. et al., 2004; Brunton P.J. et al., 2008].

Изменения нейро-гуморальной регуляции при стрессе неизбежно отражаются на структурно-функциональной организации систем, компоненты которых традиционно не относят к стресс-реализующим или стресс-лимитирущим [Писарев В.Б. с соавт., 2006; Судаков К.В., 2007]. Накопленные экспериментальные и клинические материалы свидетельствуют об актуальности изучения баланса половых гормонов при стрессе и стресспротекторных эффектов некоторых гормонов в женском организме [Яковлев М.Ю., 2006; Rivier C.L. et al., 2003; Ayala A.R. et al., 2004; Chida D. et al., 2005; Mitchell J.C. et al., 2005; Li X. F. et al., 2007; Xiao E. et al., 2007; Schirman - Hildesheim T.D. et al., 2008; Vulliemoz N. R. et al., 2008]. Особую актуальность имеет поиск адекватных экспериментальных моделей, позволяющих исследовать закономерности морфофункциональных изменений в органах женской половой системы в условиях хемоиндуцированного стресса, обусловленного попаданием в организм соединений бактериального происхождения [Бакуридзе Э.М. с соавт., 2001; Макацария А.Д. с соавт., 2006; Dunn A.J. et al., 2003; Damti O.B. et al., 2008]. Токсические продукты, образовавшиеся в результате повреждения или инфицирования тканей, инициируют сложную и многокомпонентную последовательность реакций, которые опосредованы провоспалительными цитокинами, продуцируемыми макрофагами, нейтрофильными лейкоцитами, некоторыми другими клетками, и направлены на изоляцию, уничтожение патогенного агента, а также на активацию репаративных процессов [Заратьянц О.В., 2002; Мишнев О.Д. с соавт., 2005; Макацария А.Д. с соавт., 2006; Abraham E. et al., 2003; Bucala R., 2004; Kajantie E. et al., 2006; Carr D.L. et al., 2008].

Вместе с тем, несмотря на определенный прогресс в исследовании основных механизмов адаптации к действию бактериального эндотоксина, некоторые аспекты структурных изменений в яичниках до сих пор остаются неизученными [Боровая Т.Г., Волкова О.В., 2001; Курляндский Б.А., Филов В.А., 2002; Новочадов В.В. с соавт. 2007; Писарев В.Б. с соавт., 2008; Fitzgerald S.M. et al., 2003; Xiao E. et al., 2007].

Цель исследования - выявить закономерности морфофункциональных изменений яичников в различные сроки хемоиндуцированного стресса.

Задачи исследования.

1. Изучить гистологическое строение яичников крыс в норме и при экспериментальном моделировании хемоиндуцированного стресса.

2. Выявить количественные структурные изменения в яичниках экспериментальных животных в разные сроки хемоиндуцированного стресса.

3. Охарактеризовать морфофункциональные особенности эндокринного аппарата яичников крыс в норме и при экспериментальном моделировании хемоиндуцированного стресса.

4. На основании комплексного морфологического анализа полученных данных определить направленность тенденций структурных преобразований яичников с позиций стадийности общего адаптационного синдрома.

Научная новизна.

Впервые с использованием комплекса гистологических, морфометрических и иммуногистохимических методов в сочетании с определением уровня половых и гонадотропных гормонов в периферической крови проведено исследование структурных преобразований в яичниках крыс на моделях хемоиндуцированного стресса. Показано, что морфофункциональные изменения в яичниках носили стадийный характер и соответствовали этапам общего адаптационного синдрома. В работе проведена сравнительная характеристика морфологических изменений в яичниках крыс при использовании различных моделей хемоиндуцированного стресса.

Установлены морфологические изменения яичников в ранние сроки хемоиндуцированного стресса, которые проявляются нарушениями кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла при наличии признаков повреждения эндотелиоцитов, резким снижением пролиферативно-апоптозного индекса зернистых лютеоцитов и фолликулярных эпителиоцитов.

Выявлено прогрессивное увеличение удельного количества зернистых лютеоцитов и фолликулярных эпителиоцитов с признаками апоптоза, определяемого по экспрессии каспазы 3, а также увеличение количества CD-68-позитивных гистиоцитов в строме яичников под влиянием хемо-индуцированного стрессового воздействия, что сопровождается значимым снижением уровней прогестерона и эстрадиола в периферической крови.

Научно-практическая значимость.

Результаты исследования существенно уточняют данные об особенностях микроскопического строения яичников млекопитающих, что имеет значение для оценки состояния женской половой системы в норме и при патологических воздействиях. Продемонстрированы механизмы элиминации клеточных элементов яичников на разных стадиях хемоиндуцированного стресса. Результаты морфометрического анализа, дополненные определением уровня половых и гонадотропных гормонов в периферической крови, могут быть использованы при проведении дифференциальной диагностики при исследовании биопсийного материала в клинике.

Положения, выносимые на защиту.

1. Морфофункциональные изменения в яичниках при моделировании хемоиндуцированного стресса носят стадийный характер и в целом соответствуют этапам общего адаптационного синдрома.

2. В ранние сроки хемоиндуцированного стресса в яичниках преобладают нарушения кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла в сочетании с признаками повреждения эндотелия, фолликулярных эпителиоцитов и зернистых лютеоцитов.

3. Структурные изменения в яичниках в поздние сроки хемоиндуцированного стресса характеризуются значимыми изменениями ряда количественных морфологических параметров, демонстрирующих снижение размерных характеристик желтых тел, лютеоцитов, формированием кистозно измененных фолликулов на фоне увеличения количества эндокриноцитов с признаками апоптоза, определяемого по экспрессии каспазы 3, что сопровождается снижением концентраций женских половых гормонов в периферической крови.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на Х-XI-XII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2005, 2006, 2007); IV Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика, принципы коррекции» (Волгоград, 2005); 5-й Международной конференции «Гомеостаз и эндоэкология» (Хургада, 2006), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), II съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006).

Апробация работы осуществлена на расширенном заседании сотрудников кафедры патологической анатомии Волгоградского государственного медицинского университета 29 апреля 2008 года.

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них одна в журнале из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Реализация и внедрение результатов исследования.

Работа выполнена на базе кафедры патологический анатомии Волгоградского государственного медицинского университета (ректор - академик РАМН В.И. Петров), отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс на кафедрах гистологии, цитологии, эмбриологии анатомии человека и патологической анатомии, акушерства и гинекологии ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета. Практические рекомендации используются в лечебно-диагностической работе Окружной больницы г. Салехарда (Ямало-ненецкий автономный округ), ГУЗ «Волгоградское областное патолого-анатомическое бюро», г.Волгоград и научно-исследовательской работе Волгоградского научного центра РАМН и Администрации Волгоградской области.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, иллюстрирована 41 рисунком. Она состоит из введения, четырех глав (обзор литературы - 1; материал и методы исследования - 2; результаты собственных исследований - 3; обсуждение полученных результатов- 4), выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 296 источников, в том числе - 133 отечественных и 163 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа носила экспериментальный характер, выполнена на 72 белых беспородных крысах-самках, массой 180-200 г в возрасте 6 месяцев. Протокол экспериментов был согласован с Локальным независимым этическим комитетом по экспертизе диссертационных исследований.

Контрольные животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Синхронизацию эструса проводили двукратным введением прогестерона внутрибрюшинно в дозе 10 мкг/кг массы тела животного за две недели до начала эксперимента. Контроль за фазами эстрального цикла осуществляли по результатам исследования влагалищных мазков.

Моделирование острого хемоиндуцированного стресса (модель 1) проводили путем введения бактериального липополисахарида (ЛПС) по 1мг/кг массы тела троекратно с интервалом в 30 минут [Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005]. Животных выводили из эксперимента через 24 часа путем декапитации под нембуталовым наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Хронический хемоиндуцированный стресс моделировали путем многократного введения с пищей бактериального липополисахарида (ЛПС) и умеренных доз тетрахлорметана (ТХМ) по 0,5 мл/кг массы 5 раз в неделю с введением на 6-й день ЛПС внутрибрюшинно в дозе 0,2 мг/кг массы тела (модель 2). Кроме того, была использована модель сочетанного внутрибрюшинного введения ЛПС в дозе 0,2 мг/кг массы тела 1 раз в неделю и гентамицина в дозировке 20 мг/кг массы тела ежедневно (модель 3) [Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005]. Животных выводили из эксперимента на 30, 60 и 90 сутки.

Определение концентрации плазменного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеонизирующего гормона (ЛГ), пролактина, прогестерона и эстрадиола проводилось в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием системы Stat Fax 2100/2600 (AWARENESS Technology, USA) наборами тест-систем «Вектор-Бест» (СПб, Россия).

Яичники фиксировали в нейтральном забуференном 10%-ном формалине, материал заливали в парафин по стандартной методике. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996].

Иммуногистохимические исследования проводили пероксидазо-антипероксидазным методом по стандартным диагностическим протоколам. Демаскировку антигенов осуществляли по протоколу HIER путем температурной обработки в Трис-ЭДТА буфере (pH 9,0) при 95° в течение 40 минут. Использованы первичные моноклональные антитела фирмы «Novocastra» (Великобритания) к каспазе 3 (СРР32, клон JHM62), лиганду, индуцирующему ФНО-зависимый апоптоз, TRAIL (TNF-related Apoptosis-Inducing Ligand, клон 27В12), нитрооксидсинтазе- 3 (эндотелиальная нитрооксидсинтаза, клон RN5), к маркёру пролиферации Ki-67 (клон MМ1), моноклональные антитела фирмы «DAKO» (Дания) к CD68 (клон КР1).

Морфометрическое исследование проводили при помощи программы «Видеотест-Морфо-4» (Россия), измеряли следующие параметры: количество и среднюю площадь желтых тел, среднюю площадь клеток (зернистых эпителиоцитов, лютеоцитов), их ядер и цитоплазмы, рассчитывали ядерно-цитоплазматическое отношение, а также использовали стереологические методы, основанные на подсчете числа точек тестовой системы, попавших на профиль исследуемой структуры [Автандилов Г.Г., 2006]. Вариационно-статистическую обработку полученных данных проводили на ЭВМ IBM-Intel-Centrino-Due с использованием пакета анализа данных в программе Excel Microsoft Office XP и программы STATISTICA 6.0 (Statsoft, USA). При проведении дисперсионного анализа для сравнения нормальных распределений пользовались критерием Стьюдента [Гланц С., 1999; Автандилов Г.Г., 2006]. Значимыми считали различия, если вероятность ошибки Р была меньше 0,05.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У контрольных крыс обнаружены циклические морфологические изменения в яичниках в соответствии с фазами эстрального цикла.

Под влиянием острого хемоиндуцированного стресса в яичниках уже через 24 часа наблюдались признаки нарушения кровообращения в виде выраженного полнокровия, преимущественно в сосудах венозного типа.

В отдельных случаях в венулах и мелких венах мозгового вещества отмечено краевое стояние сегментоядерных нейтрофильных лейкоцитов, их диапедез в периваскулярные ткани и стенки сосудов. В этот период отчетливо проявлялись морфологические признаки повреждения эндотелия сосудов микроциркуляторного русла и повышения проницаемости сосудистой стенки, что можно рассматривать с позиций проявления эндотелиальной дисфункции, происходящей под действием широкого спектра медиаторов воспаления. В фазу диэструса было отмечено особенно выраженное очаговое полнокровие в капиллярах желтых тел, а также в сосудах венозного типа в строме коркового вещества и желтых телах. Обнаруживаемое краевое стояние и диапедез нейтрофильных лейкоцитов в сосудах микроциркуляторного русла яичников рассматриваются нами как проявления процессов активации экспрессии лейкоцитарных и эндотелиальных молекул адгезии при хемоиндуцированном стрессе, продукции эндотелиоцитами хемокинов, способствующих миграции форменных элементов крови в периваскулярные ткани. Считается, что под действием цитокинов происходит избыточная продукция NO различными клетками за счет увеличения активности NO-синтазы [Макацария А.Д. с соавт., 2006; Abraham E. et al., 2003]. При иммуногистохимическом исследовании с использованием моноклональных антител к эндотелиальной NO-синтазе (eNOS или NOS III) выявлено небольшое увеличение количества NOS III -иммунореактивных эндотелиоцитов, которое было более выражено в строме яичников и в капиллярах теки фолликулов, что, по-видимому, указывает на селективное увеличение экспрессии эндотелиальной NO-синтазы не только в различных органах, но внутри одного органа.

Обнаруженные морфологические изменения в сосудах микроциркуляторного русла свидетельствуют также об изменении регуляции сосудистого тонуса при остром стрессе вследствие неспецифической активации симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой систем, включения механизмов срочной адаптации, обозначаемых собственно как стресс-реакция [Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003; Судаков К.В. 2005; Пшенникова М.Г. с соавт., 2007; Bernuci M.P.et al., 2008; Brunton P.J. et al., 2008]. Возникающая в ранние сроки воздействия хемоиндуцированного стресса системная воспалительная реакция в ответ на введение липополисахарида (ЛПС) может рассматриваться как компонент активации функциональных систем, обеспечивающих специфическую адаптацию по отношению к чрезвычайному фактору [Литвицкий П.Ф., 2007].

Наблюдаемое при количественном гистологическом исследовании уменьшение средней площади зернистых лютеоцитов на срезе сочеталось с увеличением среди них количества клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, что в сочетании с возрастанием уровня экспрессии Ki-67 в лютеоцитах (на 19,7%, при Р< 0,05) и фолликулярных эпителиоцитах (на 11,5%) свидетельствует о возрастании пролиферативной активности эндокриноцитов яичников при остром хемоиндуцированном стрессе, что отмечено также в паренхиме некоторых других эндокринных органов, например надпочечников, при введении ЛПС [Востриков С.М., 2005]. гистологический яичник хемоиндуцированный стресс

Выявлено увеличение числа каспаза-3-иммунореактивных лютеоцитов на 12,5% (Р< 0,05) и фолликулярных эпителиоцитов на 12,9% (Р< 0,05), что привело к резкому снижению пролиферативно-апоптозного индекса зернистых лютеоцитов на 64% (Р< 0,05) и фолликулярных эпителиоцитов на 75,2 % (Р<0,01). Обнаружение более высокой цитоплазматической экспрессии TRAIL-лиганда при остром стрессе свидетельствует, на наш взгляд, об увеличении TRAIL-индуцированного апоптоза в лютеоцитах, который запускается путем связывания лиганда (TRAIL) с соответствующими рецепторами смерти - TRAIL-R [Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007; Manabe N. et al., 2008].

При исследовании влияния длительных сроков хемоиндуцированного стресса (модель 2) на 30 сутки в корковом веществе большинство примордиальных и первичных фолликулов имели характерное строение. В отдельных фолликулах отмечались признаки вакуольной дистрофии в клетках фолликулярного эпителия. Отмечены умеренно выраженные признаки полнокровия в сосудах микроциркуляторного русла, которые были более выражены в периферических отделах желтых тел. Кроме того, в строме коркового вещества в ряде случаев обнаруживалась умеренно выраженная лимфоидная инфильтрация.

На 60 сутки воздействия в корковом веществе яичников отмечено снижение числа примордиальных и первичных фолликулов. Во вторичных фолликулах определялась более выраженная по сравнению с контролем пролиферативная активность фолликулярных эпителиоцитов зернистого слоя подтвержденная при иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к Ki67, отмечена вакуолизация в клетках внутренней теки. В третичных фолликулах между слоями фолликулярного эпителия выявлены широкие межклеточные промежутки. Происходило уменьшение количества и размеров желтых тел по сравнению с предыдущим сроком исследования. Было отмечено уменьшение размеров зернистых лютеоцитов за счет уменьшения количества цитоплазмы, в которой определялись признаки вакуольной дистрофии. Обнаруженные морфологические изменения в гормон-продуцирующих клетках фолликулов и желтых тел позволяют обозначить субстрат нарушения эндокринных функций и подчеркнуть меньшую выраженность на данном сроке экспериментального воздействия сосудистых изменений, а также отметить появление очаговой, преимущественно периваскулярной, лимфоидной инфильтрации и увеличение количества CD-68-иммунореактивных гистиоцитов.

На 90 сутки экспериментального воздействия в корковом веществе яичников отмечено значительное снижение количества вторичных и третичных фолликулов, увеличение числа атретических фолликулов, появление кистозно измененных фолликулов. В строме коркового вещества обнаружены кровоизлияния диапедезного характера, а также кровоизлияния в полость фолликулов. Количество и размеры желтых тел по сравнению с предыдущим сроком исследования снижались. При этом обнаруживалось уменьшение размеров как зернистых лютеоцитов, так и текалютеоцитов, располагавшихся в периферических отделах. Вышеописанные структурные преобразования в паренхиме яичников рассматриваются нами как атрофические изменения.

В строме коркового и мозгового вещества отмечались признаки нарушения кровообращения в виде полнокровия, явлений стаза в сосудах микроциркуляторного русла, выявлялись слабо выраженные склеротические изменения. Отмечено очаговое увеличение количества CD-68-иммунореактивных гистиоцитов в строме, что свидетельствует о процессе накопления мононуклеарных фагоцитов в яичниках в ответ на длительное введение липополисахарида, который способен связываться с мембранными рецепторами CD14, экспрессируемыми клетками миелоидного ряда [Amesfoort E.S. et al., 2003].

Во все сроки длительного воздействия хемоиндуцированного стресса было отмечено увеличением уровня экспрессии Ki-67 в фолликулярных эпителиоцитах по сравнению с контролем на 15,8% (Р< 0,01), 9,5% (Р< 0,05), 6,1% на 30, 60 и 90 сутки, соответственно (рис. 1). Признаки увеличения пролиферативной активности в текальных эндокриноцитах были менее выражены. Количественные изменения Ki67-позитивных зернистых лютеоцитов желтых тел носили двухфазный характер (рис. 2). Обнаружено прогрессивное увеличение количества Ki67-иммунореактивных зернистых лютеоцитов в желтых телах к 30-м и 60-м суткам на 32,5% (Р< 0,01) и 35,5% (Р< 0,001) с последующим снижением роста на 90-е сутки на 22,1% (Р< 0,01) по сравнению с контролем, что свидетельствует о динамичном изменении пролиферативной активности лютеоцитов, отражающем стадийный характер структурной перестройки некоторых эндокринных органов при длительных сроках введения бактериального липополисахарида [Новочадов В.В., Писарев В.Б. 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2008]. Отмечено также менее выраженное увеличение количества Ki67-позитивных текалютеоцитов и более высокая экспрессия Ki67 в соединительнотканных клетках стромы коркового вещества, которая носила очаговый характер.

При иммуногистохимическом исследовании обнаружено увеличение количества каспаза-3-позитивных фолликулярных эпителиоцитов на 16,1% (Р< 0,01), 18,3% (Р< 0,01), 19% (Р< 0,01) на 30, 60, 90 сутки опыта, преимущественно, в фолликулах, подвергшихся атрезии на различных стадиях развития (рис. 1). При этом среди текальных эндокриноцитов не происходило значимого увеличения клеток с признаками апоптоза. В желтых телах также отмечено прогрессивное возрастание количества каспаза-3-иммунореактивных зернистых лютеоцитов с увеличением продолжительности стрессового воздействия на 14,8% (Р< 0,01), 15,3% (Р< 0,01), 21,9% (Р< 0,01) на 30, 60, 90 сутки опыта, соответственно, по сравнению с контролем, что свидетельствует о нарастании степени повреждения и появлении большего числа клеток с признаками необратимых изменений, апоптоза (рис. 2) [Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003; Князькин И.В., Цыган В.Н., 2007]. Увеличение количества текалютеоцитов с признаками апоптоза носило менее выраженный характер.

Для сравнительной оценки процессов пролиферации и клеточной гибели при хемоиндуцированном стрессе произведено изучение динамики изменения пролиферативно-апоптозного индекса в фолликулах и желтых телах, рассчитанного как отношение удельного количества Ki67-позитивных эндокриноцитов к удельному количеству каспаза-3-позитивных эндокриноцитов. Отмечено достоверное прогрессивное снижение этого показателя во все сроки экспериментального воздействия, что свидетельствует, на наш взгляд, о преобладании процессов повреждения эндокринного аппарата яичников на фоне реактивного возрастания пролиферативной активности.

Учитывая, что в яичниках контрольных крыс в гормон-продуцирующих клетках не обнаружено экспрессии лиганда, индуцирующего ФНО-зависимый апоптоз, TRAIL, появление экспрессии данного медиатора при хемоиндуци-рованном стрессе рассматривается нами в качестве одного из механизмов повреждающего воздействия, способствующего элиминации эндокриноцитов яичников при активации системной воспалительной реакции. Этот процесс имеет определенные гистотопографические особенности в яичниках и преобладает в зернистых лютеоцитах желтых тел.

Продемонстрированная в наших исследованиях внутриклеточная цитоплазматическая экспрессия TRAIL в лютеоцитах указывает на их участие в механизмах реализации эффектов хемоиндуцированного стресса в яичниках. Появление экспрессии данного проапоптозного лиганда в условиях воспалительного стресса может способствовать индукции TRAIL-опосредованного апоптоза, в первую очередь, в лютеоцитах по паракринному и аутокринному механизмам, а также в других клетках яичников. Данное предположение подтверждается наличием у экспериментальных животных статистически значимого увеличения количества каспаза-3-позитивных клеток именно в желтых телах по сравнению с другими структурными элементами яичников на фоне достоверного снижения уровня прогестерона в крови.

При хемоиндуцированном стрессе было выявлено увеличение количества иммунореактивных эндотелиоцитов в сосудах стромы и капиллярах желтых тел при обработке срезов моноклональными антителами к эндотелиальной NO-синтазе (eNOS или NOS III), что, по-видимому, указывает на селективное увеличение экспрессии NO-синтазы в различных сосудах и определенную роль образующегося в сосудах яичников оксида азота эндотелиального происхождения в генезе гемодинамических нарушений при воспалительном ответе.

Под влиянием хронического хемоиндуцированного стресса отмечалось значимое снижение площади жёлтых тел по сравнению с контрольной группой на 35% на 30-е сутки, на 23% на 60-е сутки и на 36% на 90-е сутки (табл.1). При анализе площади зернистых лютеоцитов отмечалась её прогрессивное снижение, максимально выраженное на 90-е сутки на 21,4%. Отмечалось значительное снижение средней площади ядер и цитоплазмы зернистых лютеоцитов (табл.1).

Рис. 1. Изменение удельного количества каспаза-3+ и Ki67+ фолликулярных эпителиоцитов яичников крыс при хемоиндуцированном стрессе (%).

Рис. 2. Изменение удельного количества каспаза-3+ и Ki67+ зернистых лютеоцитов в желтых телах яичников крыс при хемоиндуцированном стрессе (%).

Несмотря на то, что уже через два месяца экспериментально моделируемой эндогенной интоксикации у самцов было отмечено увеличение объемной доли стромы в некоторых эндокринных органах [Писарев В.Б. с соавт., 2008], в нашем исследовании значимое повышение относительной плотности стромы на 15,3% в яичниках по сравнению с контролем происходило на 90 сутки воздействия, что может указывать на важную роль стресспротекторных влияний женских половых гормонов, например прогестерона [Brunton P.J. et al., 2008; Parker V., Douglas A., 2008], в морфогенезе структурных изменений в органах-мишенях.

При хемоиндуцированном стрессе происходило уменьшение концентрации эстрадиола в периферической крови в 3 раза на 30-е сутки в 3,7% на 60-е сутки в 4,7 раза на 90-е сутки. Концентрация прогестерона снижалась

почти в 2 раза к 60-м суткам эксперимента, в 2,6 раза на 90-е сутки. При этом снижение уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в крови не достигало достоверных различий с контролем. Происходило уменьшение концентрации лютеонизирующего гормона (ЛГ), достигающее значимых различий на 12% (Р < 0,05) на 90-е сутки эксперимента. Концентрация пролактина в крови с 30-х суток оставалась почти в 2 раза выше контроля (Р < 0,01).

Учитывая важнейшую роль кортиколиберина (КЛ), медиирующего угнетение ритма выделения гонадотропных гормонов, и способного прямо модулировать овариальный стероидогенез [Xiao E. et al., 2007], результаты наших исследований указывают на значимость нарушения гипоталамо-гипофизарной регуляции и на формирование гормонального дисбаланса, способствующего морфогенезу изменений в яичниках при хемоиндуцированном стрессе. Обнаруженное нами при хроническом хемоиндуцированном стрессе прогрессирующее снижение концентраций в крови женских половых гормонов было более выражено, чем уменьшение уровней гонадотропных гормонов. Результаты нашего исследования согласуются с данными, продемонстрировавшими снижение выработки прогестерона и ЛГ при моделировании хемоиндуцированного стресса путем введения липополисахарида [Xiao E. et al., 2007], и подтверждают данные об ингибирующем влиянии кортиколиберина на циклическую выработку гонадотропин-рилизинг гормона и ЛГ при эндотоксин-индуцированном стрессе [Battaglia D.F. et al., 1998; Li X.F. et al., 2007].

Изменения гормонального профиля носили несбалансированный характер, были связаны с нарушением эндокринной регуляции центрального генеза, о чем свидетельствует увеличение уровня пролактина в крови, и могли способствовать снижению выработки прогестерона и элиминации лютеоцитов. Сохраняющаяся воспалительная реакция, сопровождавшаяся увеличением количества CD68+ гистиоцитов, способствовала преобладанию апоптоза над пролиферацией эндокриноцитов в яичниках и в условиях снижения выра-

Таблица 1 Изменение некоторых морфометрических параметров яичников крыс при моделировании хронического хемоиндуцированного стресса

Примечание: * Р < 0,05 по сравнению с контролем,

** Р < 0,01 по сравнению с контролем,

*** Р < 0,001 по сравнению с контролем.

ботки гонадотропных гормонов могла служить дополнительным фактором, ведущим к уменьшению числа растущих фолликулов, количества и размеров желтых тел и гормон-продуцирующих клеток.

При исследовании влияния длительных сроков хемоиндуцированного стресса на модели введения ЛПС и гентамицина (модель 3) в целом отмечена сходная динамика морфофункциональных изменений в яичниках. Обнаруженные признаки структурных повреждений клеток паренхимы желтых тел и фолликулов носили менее выраженный характер и сочетались с изменением гормонального профиля. Учитывая роль повышения уровня ЛГ для наступления овуляции, возрастание количества кистозно измененных фолликулов в поздние сроки эксперимента на фоне значимого снижения ЛГ в периферической крови (максимально на 90 сутки), по нашему мнению, отражает негативное влияние длительного хемоиндуцированного стресса на овуляторную способность яичников и репродуктивную функцию в целом.

Таким образом, на основании результатов собственных исследований, учитывая стадийность морфофункциональных изменений в эндокринных органах при эндогенной интоксикации [Писарев В.Б. с соавт., 2008], можно заключить, что при остром хемоиндуцированном стрессе в яичниках выявляются структурные преобразования в ответ на изменение нейрогуморальной регуляции. При этом ЛПС-индуцированные и цитокин-опосредованные воспалительные изменения были слабо выражены и характеризовались взаимодействием лейкоцитов с эндотелием сосудистой стенки и их миграцией в субэндотелиальные отделы. В поздние сроки стрессового воздействия на фоне возрастающей активности стресс-лимитирующих систем и уменьшении концентраций кортиколиберина, адренокортикотропного гормона и глюкокортикоидов в крови [Xiao E. et al., 2007; Vulliemoz N. R. et al., 2008] наблюдавшиеся структурные преобразования в яичниках отражали комплекс реакций, характеризующихся преобладанием процессов элиминации лютеоцитов и фолликулярных эпителиоцитов на фоне увеличения содержания CD-68-позитивных гистиоцитов в строме. Возникающая системная воспалительная реакция может рассматриваться как компонент активации функциональных систем, обеспечивающих специфическую адаптацию по отношению к чрезвычайному фактору [Макацария А.Д. с соавт., 2006; Hirose M. et al., 2007].

ВЫВОДЫ

1. Морфофункциональные изменения в яичниках в ранние сроки хемоиндуцированного стресса проявляются, преимущественно, нарушениями кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла при наличии признаков повреждения эндотелиоцитов, резким снижением пролиферативно-апоптозного индекса зернистых лютеоцитов на 64% и фолликулярных эпителиоцитов на 75,2% по сравнению с контролем.

2. При моделировании хронического хемоиндуцированного стресса морфологические преобразования в яичниках характеризуются прогрессирующим снижением количества растущих фолликулов, увеличением относительной плотности стромы, что сопровождается увеличением количества атретических фолликулов, их кистозной трансформацией и снижением концентраций женских половых гормонов в периферической крови.

3. При длительном воздействии хемоиндуцированного стресса происходит уменьшение размеров желтых тел, сопровождающееся снижением средней площади зернистых лютеоцитов, максимально выраженным на 90-е сутки (на 21,4%), на фоне прогрессивного уменьшения концентрации прогестерона и менее выраженного снижения уровня лютеонизирующего гормона в периферической крови, что свидетельствует о формировании гормонального дисбаланса на различных уровнях гуморальной регуляции овариальных функций.

4. Структурные преобразования в яичниках во все сроки хемоиндуцированного стрессового воздействия характеризуются изменениями в сосудах микроциркуляторного русла, увеличением удельного количества зернистых лютеоцитов и фолликулярных эпителиоцитов с признаками апоптоза, определяемого по экспрессии каспазы 3, появлением цитоплазматической экспрессии проапоптозного лиганда TRAIL в лютеоцитах, а также увеличением количества CD-68-позитивных гистиоцитов в строме яичников, которое максимально выражено на 90-е сутки воздействия.

5. Морфофункциональные изменения в яичниках при хемоиндуцированном стрессе в целом отражают этапы протекания общего адаптационного синдрома при сохранении в течение длительного периода адаптационных возможностей, позволяющих поддерживать функционирование органов на более низком уровне за счет возросшей пролиферативной активности фолликулярных эпителиоцитов и зернистых лютеоцитов максимально на 15,8% и 35,5%, соответственно, по сравнению с контролем.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные о морфофункциональных изменениях в яичниках в условиях хемоиндуцированного стресса можно использовать в учебном процессе для преподавания гистологии, цитологии, патологической анатомии, акушерства и гинекологии в медицинских высших учебных заведениях.

2. Результаты количественного и качественного морфологического анализа с использованием иммуногистохимических методов, в частности определение пролиферативно-апоптозного индекса, могут быть использованы для улучшения качества дифференциальной диагностики при патогистологическом исследовании в клинике и для оценки состояния яичников при проведении научно-исследовательских работ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Морфология и липидный спектр тканей яичников крыс при хроническом эндотоксикозе // Новые технологии в медицине: Труды ВолГМУ. - Т. 61, Вып. 1. - Волгоград: Изд-во ВолГМУ. - 2005. - С. 286-287. (соавт. С.А. Калашникова).

2. Токсический компонент в формировании структуры склерокистоза яичников: подходы к моделированию // Морфология процессов индивидуального развития, адаптации и компенсации: Труды ВолГМУ. - Т. 62, вып.1. - Волгоград, 2005. - С. 66-69.

3. Патология со стороны яичников при хроническом эдотоксикозе: клинико-анатомические наблюдения // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. - 2005. - №1. - С. 44-45. (соавт. С.А. Калашникова).

4. Морфометрическое исследование надпочечников, щитовидной железы и яичников кошек при хроническом эндотоксикозе // Совр. наукоемкие технологии. - 2005. - №2. - C. 35-36. (соавт. С.А. Калашникова, А.А. Зарипова, С.М. Востриков).

5. Морфометрические критерии повреждения яичников при хронической эндогенной интоксикации. // Усп. современного естествознания. - 2005. - №10. - С. 50-51. (соавт. А.Н. Горячев).

6. Иммуногистохимическая характеристика стромальной пролиферации в яичнике при хроническом эндотоксикозе. // Совр. наукоемкие технологии. - 2006. - №2. - С. 35-36.

7. Морфогенез полигландулярной эндокринопатии при бактериальном эндотоксикозе // Материалы II съезда Российского об-ва патологоанатомов. - М., 2006. - Т. 2. - С. 185-187. (соавт. С.А. Калашникова, В.В. Новочадов, Полякова Л.В.).

8. Гормональный статус крыс с хронической эндогенной интоксикацией // Фундаментальные исследования. - 2006. - №5. - С. 96-97. (соавт. В.В. Новочадов, Л.В. Полякова, С.А. Калашникова, А.Н. Горячев).

9. Компьютерный анализ в оценке нейроэндокринной дизрегуляции как компонент органопатологии при хроническом эндотоксикозе. // Бюллетень ВНЦ РАМН - 2006. - №2. - С.42-43. (соавт. С.А. Калашникова, Л.В. Полякова, А.В. Волков, Н.В. Ермолаев, И.М. Кузнецов).

10. Морфологические особенности периферических органов эндокринной системы при хронической интоксикации.// Верхневолжский мед. журн. - 2006. - сп. вып. - С. 58-59. (соавт. Л.В. Полякова, С.А. Калашникова).

11. Морфологическая характеристика яичников при хемоиндуцированном стрессе // Вестник Волгоградского гос. мед. ун-та. - 2008.- №3 (27) - С. 46-49. (соавт. А.В. Смирнов). (Журнал перечня ВАК).

Размещено на Allbest.ru