Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией

03.00.07-микробиология

Скурихина Юлия Евгеньевна

Владивосток 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Туркутюков Вячеслав Борисович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Тимченко Нелли Федоровна, руководитель лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН», г.Владивосток

кандидат медицинских наук, доцент Кольцов Игорь Петрович, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Дальневосточный государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации», г. Хабаровск

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова» г. Санкт-Петербург

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. По литературным данным, ежегодно в мире от пневмококковых инфекций погибают около 1 млн. детей (Р.С. Козлов 2005, В.К. Таточенко 2007).

Пневмококки (Streptococcus pneumoniae) часто являются составляющей микрофлоры верхних дыхательных путей и встречаются повсеместно. Уровень носительства пневмококков различен у людей разного возраста. У детей до 4,5 лет отмечается наибольшая частота носительства (у 90%), среди взрослых - у 5-10%. Согласно международным и российским данным, на пневмококковую инфекцию приходится до 76% этиологически расшифрованных случаев внебольничной пневмонии у взрослых и до 94% осложнённых случаев - у детей.

Заболеваемость пневмококковыми инфекциями в Европе составляет 16-20‰ (R. Jones 2002). В России заболеваемость колеблется от 5-6‰ до 16-20‰, и регистрируется практически во всех возрастных и социальных группах, при этом 40% населения являются носителями данного микроорганизма (Л.С. Страчунский 1999; А.В. Мартынова 2004, 2007).

Рост резистентности микроорганизмов, в том числе и пневмококков, к антибиотикам является глобальной проблемой для системы общественного здравоохранения. Особое значение рост резистентности имеет для педиатрии. Это связанно с необоснованно частым использованием антибиотиков для лечения обычных детских инфекционных заболеваний в амбулаторных условиях и тяжёлых инфекций в стационарах (А. Tomasz 1995; В.Б. Туркутюков 2003, 2005).

Чаще всего резистентные пневмококки выделяются у детей дошкольного возраста. Наиболее существенными факторами риска для детей являются: пребывание в детских учреждениях, предшествующая госпитализация, недавнее использование антибиотиков (Л.И. Дворецкий 2004).

Несмотря на широкое распространение антибиотикорезистентности, клиническое значение этого явления остается в стадии изучения. До сих пор отсутствуют достоверные данные о проведении эпидемиологического анализа носительства пневмококков в различных группах населения, с учетом сопутствующей патологии, включая данные о серотиповом составе популяции штаммов пневмококков; об уровне устойчивости штаммов пневмококков к антибиотикам, выделенных у больных; о генотипических и фенотипических особенностях выделенных штаммов. Это отрицательно сказывается на возможности назначения и коррекции рациональной антибактериальной химиотерапии (А.В. Мартынова 2005, 2008; В.Б. Туркутюков 2008).

Высокие показатели заболеваемости туберкулезом среди детей, а также интенсивная супрессия иммунной системы организма при инфицировании M. tuberculosis способствуют развитию тяжелых форм пневмококковых инфекций, что свидетельствует об актуальности изучения особенностей носительства пневмококков у детей. Это позволит повысить своевременность диагностики и эффективность лечения, а также послужить основой для совершенствования эпидемиологического надзора и обоснования проведения иммунопрофилактики пневмококковых инфекций у детей с туберкулезной инфекцией.

Цель работы

Совершенствование микробиологической диагностики, обоснование рационального применения антибиотиков и повышения эффективности профилактических мероприятий при пневмококковых инфекциях у детей с туберкулезной инфекцией на основе изучения особенностей микробиологических и молекулярно-генетических характеристик штаммов S. pneumoniae.

Задачи исследования:

1. Изучить частоту регистрации пневмококковых инфекций и носительства штаммов S. pneumoniae у детей с туберкулезной инфекцией.

2. Изучить серотиповой пейзаж и факторы вирулентности у выделенных штаммов S. pneumoniae на основе их генотиповой характеристики.

3. Оценить чувствительность выделенных штаммов S. pneumoniae к антибиотикам фенотипическими методами и установить частоту выявления детерминант резистентности к ним для повышения эффективности антибактериальной химиотерапии у пациентов с туберкулезной инфекцией при сопутствующих пневмококковых инфекциях.

4. Обосновать использование молекулярно-генетических методов в идентификации S. pneumoniae и оценке их этиологической и эпидемиологической значимости.

5. Разработать рекомендации по совершенствованию вопросов специфических профилактических мероприятий у носителей штаммов S. pneumoniae в специализированных противотуберкулезных стационарах.

Научная новизна исследования

Впервые проведена серотиповая характеристика штаммов S. pneumoniae методом multiplex ПЦР, который в отличие от традиционных методов, с использованием специфических сывороток, не дает перекрестных реакций с другими видами микроорганизмов, является более достоверным и экономичным.

Для идентификации пневмококков и оценке их этиологической значимости модифицирована методика постановки ПЦР с праймерами для гена ply, убиквитарного компонента генома S. pneumoniae.

Впервые изучена молекулярно-генетическая характеристика детерминант резистентности штаммов S. pneumoniae к антибактериальным препаратам, в том числе и к рифампицину, антибиотику широкого спектра действия, применяемого для лечения туберкулеза.

Определена генотипическая характеристика типовых факторов вирулентности штаммов пневмококка, циркулирующих в отделениях противотуберкулезной больницы.

Полученные в результате исследования данные вносят вклад в изучение особенностей формирования и циркуляции штаммов Streptococcus pneumoniae в условиях закрытых коллективов среди детей, на фоне тяжелого основного заболевания (туберкулеза), а также молекулярно-генетических особенностей этих штаммов, возникающих под влиянием длительной и интенсивной антибиотикотерапии.

На основании проведенного исследования определена структура носительства условно-патогенных микроорганизмов в верхних дыхательных путях (ВДП) у детей с туберкулезной инфекцией. Оценено влияние возникновения сопутствующих инфекций ВДП на течение основного заболевания - туберкулеза. Исследована общность структуры носительства пневмококков у пациентов и медицинского персонала противотуберкулезной больницы (специализированный стационар), а также контрольной группы (соматический стационар).

Практическая значимость

Предложенные современные и экономичные молекулярно-генетические методы для идентификации чистой культуры S. pneumoniae и изучения факторов патогенности позволяют ускорить индикацию возбудителя, значительно повысить её достоверность, и оценить степень вирулентности пневмококка.

Проведенный мониторинг антибиотикорезистентности выделенных штаммов пневмококка обосновывает эффективную этиотропную антибактериальную химиотерапию при присоединении пневмококковых инфекций.

Метод ПЦР, применяемый для определения устойчивости к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, дает значительно более достоверные результаты, чем традиционные фенотипические методы, так как такие штаммы подвергались активному селективному давлению антибактериальными химиопрепаратами.

Для определения серотиповой структуры выделенных штаммов предложен модифицированный метод multiplex ПЦР с праймерами для генов, специфичных основным серотипам, имеющий высокую достоверность и позволяющий при необходимости определить наибольшее количество известных серовариантов.

Данные о структуре носительства условно-патогенных микроорганизмов в ВДП и сопутствующей заболеваемости среди детей с туберкулезной инфекцией позволили получить представление об эпидемиологической ситуации по носительству пневмококка и других микроорганизмов в такой специфической группе, как пациенты, находящиеся на длительном лечении в противотуберкулезной больнице.

Обоснована необходимость проведения специфической иммунопрофилактики пневмококковых инфекций у пациентов с туберкулезной инфекцией и медицинского персонала специализированных лечебно-профилактических учреждений.

Результаты исследования внедрены в работу детской краевой клинической противотуберкулезной больницы, детской городской клинической больницы №3, Центре фармако-технической информации и клинической фармакологии департамента здравоохранения Администрации Приморского края, Приморском краевом центре иммунопрофилактики департамента здравоохранения Администрации Приморского края.

Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры эпидемиологии и военной эпидемиологии ВГМУ; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ВГМУ; кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава (Благовещенск), кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО ДГМУ Росздрава (Хабаровск).

Изданы методические рекомендации «Прогнозирование тяжести течения пневмококковых инфекций с помощью серотипирования методом Multiplex ПЦР» (2009), информационное письмо «Рациональная антибиотикотерапия пневмококковых инфекций у пациентов специализированного противотуберкулезного стационара» (2009). Оформлены рационализаторские предложения: «Идентификация Streptococcus pneumoniae с помощью ПЦР» (2009); «Прогнозирование течения пневмококковой инфекции с помощью серотипирования методом полимеразной цепной реакции» (2009). Определенные последовательности гена rpoB S.pneumoniae зарегистрированы в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI/GenBank) под номерами GQ336504, GQ336505, GQ336506, GQ336507.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Пациенты противотуберкулезных стационаров и медицинский персонал составляют группы риска по развитию пневмококковых инфекций дыхательных путей, что связано с действием на организм туберкулезной инфекции, длительным нахождением в закрытом коллективе в процессе лечения, преобладанием в структуре носительства микроорганизмов S. pneumoniae, обладающих полирезистентностью к различным современным антибактериальным препаратам широкого спектра действия, таким как макролиды, фторхинолоны и рифампицин.

2. Для микробиологической диагностики S. pneumoniae при возникновении заболевания предположительно пневмококковой этиологии необходимо комплексное обследование, методом ПЦР с праймерами для гена ply, обладающим высокой чувствительностью и достоверностью. Для прогнозирования течения инфекционного процесса рекомендуется использовать серотипирование S. pneumoniae методом Multiplex ПЦР, который является экономичным и имеет высокую специфичность.

3. Серотиповой состав штаммов S. pneumoniae среди детей с туберкулезной инфекцией и пациентов детских соматических стационаров существенно различается. Так в первой из них доминирует серотип 3 и 19А, а во второй - серотип 6В. Серотип 3 является высоковирулентным, чаще вызывает осложненные формы пневмококковой инфекции и поэтому является клинически значимым, так как позволяет прогнозировать степень и интенсивность инфекционного процесса, а также обосновывает необходимость проведения специфической иммунопрофилактики пневмококковых инфекций в группах риска.

Личный вклад автора в исследование

Автором проведена систематизация и анализ материалов по заболеваемости пневмококковыми инфекциями в специализированном и соматическом стационарах. Лично автором проведено выделение, идентификация и оценка чувствительности к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, полученных в ходе исследования. При непосредственном участии автора подготовлены и проведены молекулярно-генетические методы исследования штаммов S. pneumoniae. Все методы статистической обработки результатов исследования выполнены автором лично.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены и обсуждены на Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых учёных с международным участием (Владивосток, 2005, 2006, 2007, 2008); XV Европейском Конгрессе по Клинической Микробиологии и Инфекционным Заболеваниям (Копенгаген, 2005); XVI Европейском Конгрессе по Клинической Микробиологии и Инфекционным Заболеваниям (Франция, Ницца, 2006); 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases (Australia, 2006); IX съезде Всероссийского Научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Дальневосточном региональном конгрессе «Человек и лекарство» (Владивосток, 2007, 2008, 2009). Работа обсуждена на заседании проблемной комиссии по инфекционным болезням эпидемиологии, микробиологии и иммунологии Владивостокского государственного медицинского университета (2009).

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 25 научно - исследовательских работ, из них 5 в иностранной печати, 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 4 электронных публикации; 1 методические рекомендации, 2 рационализаторских предложения.

Структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 156 страницах машинописного текста, иллюстрированы 30 таблицами, 27 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав собственных исследований, общих выводов, рекомендаций для внедрения в медицинскую науку и практическое здравоохранение. Библиографический указатель включает 235 источник литературы, из них 112 отечественных и 123 иностранных авторов. Диссертационная работа выполнена по плану НИР ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава, номер государственной регистрации 01.2.006.13618.

Содержание, результаты и обсуждение работы

Материал и методы исследования. При выполнении работы был проведен анализ многолетней заболеваемости инфекциями дыхательных путей среди детей с туберкулезной инфекцией, находившихся на лечении в детской краевой противотуберкулезной больнице (ДККПТБ) с 1999 по 2008 годы. Проанализированы клинические, рентгенографические и лабораторные данные этих пациентов. Проведена оценка носительства S. pneumoniae у детей, находившихся на лечении в Детской краевой клинической противотуберкулезной больнице (специализированный стационар), и у детей, находившихся на лечении в городской детской клинической больнице №3 (соматический стационар).

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разрешения Комитета по биомедицинской этике ГОУ ВПО ВГМУ Росздрава (протокол №15 дело №7 от 02 октября 2006 года).

Из клинического материала были выделены и идентифицированы штаммы S. pneumoniae. Одним из направлений проведенных исследований было изучение данных штаммов, их серотиповой, генотиповой характеристик и оценка антибиотикорезистентности (табл.1).

микробиологическая диагностика streptococcus pneumoniae

Таблица 1

Направления, методы и объем исследований

№ п/п	Направления исследований	Методы исследования	Объём
I	Клинико-анамнестический анализ	1. Анализ данных по заболеваемости. 2. Изучение амбулаторных карт. 3. Опрос и обследование детей специализированного стационара. 4. Опрос и обследование медицинского персонала на носительство S. pneumoniae. 5. Опрос и обследование носителей S.pneumoniae среди пациентов соматического стационара.	300 85 25 72
II	Микробиологические исследования	1. Взятие клинического материала. 2. Микроскопия мазка с окраской по Граму 3. Получение чистой культуры S. pneumoniae	182 182 182
III	Определение факторов патогенности	Метод полимеразной цепной реакции с праймерами для генов: 1. ply (пневмолизин) 2. lytA (аутолизин) 3. psaA (адгезин А) 4. cpsA (полисахарид капсулы)	50 50 50 50
IV	Определение серотипов	1.Multiplex ПЦР с праймерами для генов 3capB, 4wzy, 6Bwzy, 14cpsH, 19AcpsK, 19FcpsI, 23FcpsG	50
V	Исследование устойчивости к антибиотикам	1. Диско-диффузионный метод 2. Метод серийных разведений (МПК50; МПК90)	50 50
VI	Определение детерминант резистентности к антибиотикам	ПЦР с праймерами для генов: 1. rpoB3 (рифампицин) 2. ermB, mefE (макролиды) 3. gyrA, gyrB, parC, parE (фторхинолоны)	50 50 50
VII	Определение нуклеотидной последовательности	Секвенирование участка гена rpoB	4
VIII	Статистическая обработка полученных данных	1.Ретроспективный и оперативный эпидемиологический анализ. 2.Методы описательной и параметрической статистики с использованием программы Statistica 6.0 (средняя арифметическая М, ее ошибка m, доверительный коэффициент t, коэффициент корреляции Пирсона r, критерий ч2).	Все данные

Устойчивость к антибиотикам изучалась с помощью диско-диффузионного метода, метода серийных разведений и полимеразной цепной реакции с праймерами для генов резистентности к антибиотикам: рифампицину (rpoB), макролидам (ermB, mefE), фторхинолонам (gyrA, gyrB, parC, parE) (Nagai, 2001; Chen 2004). Для определения факторов патогенности использовался методом ПЦР. Использовались праймеры ply (пневмолизин), lytA (аутолизин), psaA (адгезин А), cpsA (полисахарид капсулы).

Изучение серотиповых характеристик выделенных штаммов проводилось методом Multiplex ПЦР (праймеры 3capB, 4wzy, 6Bwzy, 14cpsH, 19AcpsK, 19FcpsI, 23FcpsG) (Brito et al, 2003). Все праймеры были синтезированы ООО «Синтол» г. Москва (табл. 2).

Таблица 2

ДНК-праймеры, использованные для ПЦР анализа штаммов S.pneumoniae

Праймеры	Последовательность нуклеотидов	Размер продукта амплификации (п.н. - пар нуклеотидов)
1	2	3
ply	F R	5'-ATTTCTGTAACAGCTACCAACGA-3' 5'-GAATTCCCTGTCTTTTCAAAGTC-3'	329
lytA	F R	5'-CCGTACAGAATGAAGCGG-3' 5'-TTATTCGTGCAATACTCGTGCG-3'	308
psaA	F R	5'-CTTTCTGCAATCATTCTTG-3' 5'-GCCTTCTTTACCTTGTTCTGC-3'	838
cpsA	F R	5'-GGTGTTCTCTATCCTTGTCAGCTCTGTGTCGCTC-3' 5'-GTGTGAATGGTCGAATCAACTCTATAAATGCC-3'	657
3capB	F R	5'-TTGTTTTTTGTCTTTATTCTTATTCGTTGG-3' 5'-TACTGAGAACCTTCTGCCCACCTTAGTTGC-3'	818
4wzy	F R	5'-CTGTAACTTGTTCTGGACTCTCGTTAATTGG-3' 5'-GCCCACTCCTGTTAAAATCCTACCCGCATTG-3'	430
6Bwzy	F R	5'-CGACGTAACAAAGAACTAGGTGCTGAAAC-3' 5'-AAGTATATAACCACGCTGTAAAACTCTGAC-3'	220
14cpsH	F R	5'-GTCTGTTAATTCTATATACAAAGAGGCTCC-3' 5'-GCATTGCTACAATCGCTATACTAGATATGC-3'	268
19FcpsI	F R	5'-CACCTAATTTTAATACTGAGGTTAAGATTGC-3' 5'-CATAGGCTATCAGAATTTTAATAATATCTTGC-3'	408
19AcpsK	F R	5'-GTTAGTCCTGTTTTAGATTTATTTGGTGATGT-3' 5'-GAGCAGTCAATAAGATGAGACGATAGTTAG-3'	478
23FcpsG	F R	5'-GTAACAGTTGCTGTAGAGGGAATTGGCTTTTC-3? 5?-CACAACACCTAACACACGATGGCTATATGATTC-3?	384
mefE	F R	5'-ATGGAAAAATACAACAATTGGAAACGA-3' 5'-TTATTTTAAATCTAATTTTCTAACCTC-3'	540
ermB	F R	5'-GAAAAGGTACTCAACCAAATA-3' 5'-ATGAACGGTACTTAAATTGTTTAC-3'	224
gyrA	F R	5'-TAAAAAACTTTGTCACGAATATGCC-3' 5'-AAC GATACGCTCACGACCAGT-3'	353
gyrB	F R	5'-TGAAGGACAAACCAAGACCAAA-3' 5'-GTCCATTTCACCTAGCCCCTTATA-3'	510
parC	F R	5'-AAACCTACTCTACATTCTTTGAAAGGAG-3' 5'-CAGTTGGGTGGTCAATCATGTAAA-3'	367
parE	F R	5'-ACCAAGGATAAACATGGAAGCC-3' 5'-CATTCATCTCACCAAGTCCTTTGTA-3'	290
rpoB3	F R	5'-GTTCAAACACCATACCGTAAG-3? 5?-CAATGAACCATCTTCACGACG-3?	402

Секвенальную реакцию проводили в условиях, рекомендованных производителем, с использованием набора BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США). ПЦР, Multiplex ПЦР и секвенирование были выполнены в лаборатории генетики ИБМ ДВО РАН (зав. лабораторией д.б.н. Брыков В.А.).

Результаты исследования и их обсуждение

На основе данных историй болезней пациентов ГУЗ «Приморская детская краевая клиническая туберкулезная больница» (ПДККТБ) был проведен ретроспективный анализ заболеваемости туберкулезом и сопутствующими инфекциями у детей, находящихся на лечении. Максимальные показатели заболеваемости наблюдались в 2002 и 2004 годах, как по всем формам туберкулеза (138,5⁰/₀₀ и 137,5⁰/₀₀), так и при внелегочной локализации туберкулезной инфекции (0,39⁰/₀₀ и 0,43⁰/₀₀). В целом динамика заболеваемости по этим показателям имеет общие черты, подъемы и спады наблюдаются синхронно.

При анализе сопутствующей инфекционной заболеваемости дыхательных путей (рис. 1), выявлено, что у 31,9% детей с внелегочной формой туберкулеза наблюдались сопутствующие заболевания: острый ринит в 39,1%, острый ринофарингит в 28,3%, оcтрый фарингит в 4,5%, острый трахеит 5,3%, хронический тонзиллит и острый средний отит - по 8,7%, лакунарная ангина в 1,1%, гнойный этмоидит в 1,1% (рис.1).

За этот же период нами проанализирована сопутствующая заболеваемость инфекциями предположительно пневмококковой этиологии всех детей, находившихся на лечении в ПДККТБ. 30,1% пациентов имели такие сопутствующие заболевания: острый ринит в 40% случаев, острый ринофарингит в 26, 7%, хронический тонзиллит в 10%, острый средний отит в 9,5%, острый трахеит в 4,9%, острый фарингит в 5,1%, пневмония в 0,5% случаев.

Структура сопутствующих заболеваний у двух исследуемых групп очень схожа, колебания в ту или иную сторону незначительные, различия статистически не значимые (рис.1). Исходя из этого факта, для дальнейшего микробиологического анализа использовалась группа детей с любыми формами туберкулеза, независимо от локализации. Для определения этиологии сопутствующих заболеваний и исследования структуры носительства микроорганизмов ВДП нами было обследовано 85 детей, находящихся на лечении в ПДККТБ.



Рис. 1. Структура сопутствующих заболеваний дыхательных путей у детей больных различными формами туберкулеза.

Доминирующим микроорганизмом в структуре носительства у пациентов с туберкулезной инфекцией является S. pneumoniae. Он присутствовал в 30,3% образцов. Streptococcus spp. - в 20,8%, Staphylococcus spp. - в 15,3%, Candida spp. - в 19,4%, Acinetobacter baumannii - в 7,0%, H.influenzae - в 7,0%, а также - ассоциации микроорганизмов - S. pneumoniae и S.pyogenes в 35,5% случаев. У персонала данного стационара S. pneumoniae был выделен у 36,4%, Streptococcus spp. - у 27,3%, Staphylococcus spp. у 27,3% и Candida spp. у 9% обследованных. В целом, в специализированном стационаре чаще выделяли микроорганизмы рода Streptococcus spp., среди которых доминировали S. pneumoniae (табл. 3).

Таблица 3.

Распространенность носительства штаммов среди пациентов и персонала специализированного стационара (при p<0,05 r=0,87, P=0,024)

Вид микроорганизма	M±m
S. pneumoniae	33,5±4,3
Streptococcus spp.	24,1±4,6
Staphylococcus spp.	21,3±4,2
Candida spp.	14,2±3,5
Acinetobacter baumannii	3,5±4,94
Haemophilus influenzae	3,5±4,94

В качестве контрольной группы были взяты пациенты гастроэнтерологического отделения детской городской клинической больницы № 3 (соматического стационара). Для исследования структуры носительства микроорганизмов верхних дыхательных путей было обследовано 72 ребенка, находящихся на лечении в этом отделении. По нашим данным, S.pneumoniae присутствовал в 20,8% образцов. Streptococcus spp. - в 21,2%, Staphylococcus spp. - в 19,7%, Candida spp. - в 13,6%, A.baumannii - в 7,6%, H.influenzae - в 6,1%. Ассоциации микроорганизмов Streptococcus spp., Candida spp. и Staphylococcus spp. выявлялись в 36,4%.

При сравнении частоты носительства различных микроорганизмов во всех исследуемых группах выявлено, что наибольшие показатели по носительству S.pneumoniae, Streptococcus spp. и Staphylococcus spp. наблюдаются у медицинского персонала ПДККТБ.

Во всех трех исследованных группах в структуре носительства лидирует S.pneumoniae. Чаще он выделяется у медперсонала - 36,4% и у пациентов специализированного стационара - 30,3% (ч²=5,1, P=0,04), что еще раз подтверждает необходимость специфической профилактики у этих групп.

В данном исследовании с помощью метода ПЦР были определены детерминанты факторов патогенности, такие как пневмолизин, аутолизин и psaA; а с помощью метода multiplex ПЦР - генетические детерминанты белка cpsA (соответственно, и наличие полисахаридной капсулы у пневмококка), и изучена серотиповая характеристика штаммов. Все штаммы, определенные как S. pneumoniae по микробиологическим признакам, имели ген ply, показывающий наличие пневмолизина у выделенных штаммов (рис.2).



Рис. 2. Электрофореграмма результатов ПЦР препаратов ДНК S. pneumoniae. Гены: ply (размер амплифицированного фрагмента составляет 329 п.н.), lytA (308 п.н.), psaA (838 п.н.). 1 - маркер молекулярной массы, кратный 100 п.н., 2-4 - исследуемые образцы ДНК.

У штаммов, выделенных у детей с туберкулезной инфекцией, наличие аутолизина (ген lytA) выявлено в 91% случаев, а у штаммов, выделенных у медперсонала ПДККТБ, в 87,5%. В контрольной группе детерминанта аутолизина присутствовала у 95% штаммов.

Частота выявления неизмененного гена адгезина (psaA) в исследуемых группах была различной. В геноме пневмококков, выделенных у пациентов ПДККТБ, мутировавший ген присутствовал в 22,7%. Среди штаммов, выделенных у медперсонала, этот показатель составлял 25%. В контрольной группе мутации гена присутствовали лишь в 10% случаев.

Для определения серотипов исследуемых штаммов и гена cpsA, ответственного за синтез полисахарида капсулы, был использован метод Multiplex ПЦР. Были применены праймеры к серотипам 3, 4, 6, 14, 19A, 19F, 23F, входящим в состав как отечественной 23-валентной, так и зарубежной 11-валентной вакцины. Праймеры, специфичные для гена cpsA, убиквитарного компонента генома капсульного типа пневмококка, включались во все реакции Multiplex ПЦР.

При изучении серотипового состава штаммов, выделенных у детей, больных туберкулезом, выявлено, что среди них преобладают серотипы 3, 19А (по 22,7%) и серотип 6 (13,6%), реже встречается серотип 23F (9,1%) и серотипы 4, 14 и 19F (по 4,6%). 18,1% штаммов относились к иным серотипам, исследование которых не входило в план данного исследования.

При исследовании штаммов стрептококка, выделенных у персонала противотуберкулезной больницы, было установлено, что 25,0% штаммов имеют серотип 3 и 19А, 12,5% - серотип 6 и 23F, серотип 25% штаммов определить не удалось. Как и в первой группе преобладают серотипы 3 и 19А, составляя 45,4% от всего числа исследованных штаммов.

На рисунках 3 и 4 представлены данные по серотиповой характеристике штаммов пневмококков, выделенных у всех трех исследуемых групп. Видны различия в составе серовариантов первой группы (штаммы, выделенные у детей с туберкулезной инфекцией) и третьей группы (штаммы, выделенные у здоровых носителей). В первой и второй группе превалирует серотип 3 и 19А (22,7-25,0%), в третьей - серотип 6В (25%).

Рис. 3. Серотиповая характеристика штаммов пневмококка, выделенных у пациентов соматического и специализированного стационаров.

При проведении метода ПЦР с праймерами для гена cps установлено, что из 50 изученных штаммов амплификация не прошла в 4,0% случаев, что означает наличие мутации гена или отсутствие всего локуса cps. Поскольку видовая принадлежность этих штаммов доказана другими молекулярно-генетическими методами, можно утверждать, что эти пневмококки принадлежат к безкапсульному типу.

Рис. 4. Распространение серотипов пневмококков в исследованных группах. I - дети с туберкулезной инфекцией, II - медицинский персонал ПДККТБ, III - контрольная группа (соматическая патология).

Такой тип редко выделяется из клинического материала, однако, учитывая, что оба безкапсульных штамма получены от детей, болеющих туберкулезом и принимающих большое количество антибактериальных препаратов, можно предположить, что данный вид мутации возник именно под воздействием антибиотиков, используемых в химиотерапии данных пациентов.

С целью возможного выявления штаммов, циркулирующих в специализированном стационаре, был проведен анализ распределения генетических вариантов исследованных штаммов возбудителя на основе сочетания генов, обеспечивающих факторы патогенности (табл. 4).

Таблица 4

Геноварианты сочетания детерминант факторов патогенности у штаммов S.pneumoniae и частота их встречаемости.

Геноварианты	Набор генов, кодирующих факторы патогенности	Пациенты ПДККТБ (число штаммов)	Медперсонал ПДККТБ (число штаммов)	Пациенты ДГКБ №3 (число штаммов)
1	ply, lytA, psaA, cpsA	13	5	19
2	ply, lytA, psaA	1	0	0
3	ply, lytA, cpsA	3	1	1
4	ply, psaA, cpsA	2	1	0
5	ply, lytA	3	1	0
6	ply, psaA	0	0	1
7	ply, cpsA	0	0	1
	Всего	22	8	20

Примечание: при р<0,05 r(1-2)=0,99, t=20,8, P=0,0001; r(1-3)=0,9, t=6,8, P=0,001.

Из приведенных данных видно, что самым распространенным геновариантом во всех исследуемым группах является первый, содержащий все детерминанты факторов патогенности. Но есть и различия между группами в составе геновариантов: как среди штаммов от пациентов, так и от медицинского персонала специализированного стационара встречаются 4 и 5 генотипы пневмококков, полностью отсутствующие в контрольной группе. Геноварианты 6 и 7, наоборот, присутствуют только в группе штаммов, выделенных от пациентов соматического стационара. Полиморфизм геновариантов, сочетания исследованных генов, гораздо выше в группах штаммов, выделенных в специализированном стационаре, что возможно обусловлено индукцией изменчивости под влиянием применяемых антибактериальных препаратов в данном стационаре.

Учитывая факт постоянного применения антибиотиков в основной исследуемой группе, проводилось определение устойчивости к этим препаратам у выделенных штаммов пневмококка. В популяции штаммов S. pneumoniae, полученных от детей, больных туберкулезом, значительную долю занимают штаммы, устойчивые к макролидам: эритромицину (40,9%), кларитромицину (36,3%). Обращает на себя внимание формирование штаммами S. pneumoniae резистентности к высоким дозам фторхинолонов. Также необходимо отметить выявление трёх штаммов (13,6%), имеющих устойчивость к такому антибиотику, как рифампицин (рис. 5). Процент выявления таких штаммов по данным мировой литературы невелик и составляет около 0,1-1,4%.

Рис. 5. Электрофореграмма ПЦР гена rpoB3 препаратов ДНК S. pneumoniae. 1 - маркер молекулярной массы pUC19/MspI, 2-10 - исследуемые образцы, 11 - отрицательный контроль. Размер амплифицированного фрагмента составляет 402 п.н.

Чувствительность пневмококков к антибиотикам у персонала противотуберкулезной больницы имеет общие черты с аналогичными показателями у детей, находящихся на лечении в данной клинике.

Среди штаммов S. pneumoniae, выделенных из клинического материала от пациентов соматического стационара, определялся довольно низкий уровень резистентности к макролидам и цефалоспоринам.

С целью оценки достоверности данных, полученных микробиологическими методами, было проведено молекулярно-генетическое исследование, которое позволяет с высокой точностью определить наличие генов, отвечающих за устойчивость микроорганизма к определенным группам антибиотиков (рис. 6).

Рис. 6. Электрофореграмма результатов ПЦР генов gyrA и gyrB препаратов ДНК S. pneumoniae. 1 - маркер молекулярной массы pUC19/MspI, 2-11 - исследуемые образцы ДНК, 12 - отрицательный контроль; 4 - положительный контроль. Размер амплифицированных фрагментов составляет 353 п.н. и 510 п.н.

Генотипическая картина устойчивости к макролидам не соответствует фенотипической картине, нами выявлено гораздо больше устойчивых штаммов, что говорит о большом количестве ложноотрицательных результатов. Частота выявления модификаций генов gyrA, gyrB, parC и parE примерно соответствовала результатам изучения фенотипической картины антибиотикоустойчивости исследованных штаммов (фторхинолоны), такие же результаты наблюдаются и при оценке чувствительности к рифампицину.

При проведении анализа распространения различных геновариантов сочетания генов резистентности было выделено 9 геновариантов. Среди пациентов специализированного стационара, по нашим данным, циркулирует 8 клонов с резистентностью к разным группам антибиотиков, среди медперсонала - 4 клона, а среди пациентов соматического стационара - 6 клонов. Особую опасность представляют геноварианты 1 и 2, имеющие высокий уровень устойчивости ко всем изучаемым нами антибиотикам, в том числе и к рифампицину. Эти геноварианты присутствуют только среди штаммов, выделенных от детей с туберкулезной инфекцией.

Для выявления возможных закономерностей и обобщения всех полученных результатов был проведен анализ совокупности изученных генетически детерминированных признаков (серотипы, факторы патогенности, чувствительность к антибиотикам) у штаммов S. pneumoniae во всех исследованных группах в специализированном и соматическом стационарах.

На основе данных, полученных с помощью молекулярно-генетических методов, были составлены комбинированные геноварианты всех исследованных штаммов (рис. 7).

Рис. 7. Распространение комбинаций геновариантов штаммов пневмококков, выделенных у обследованных в специализированном и соматическом стационарах. Обозначение: I - дети с туберкулезной инфекцией, II - медицинский персонал ПДККТБ, III - контрольная группа (пациенты соматического стационара).

Обращают на себя внимание общие черты состава и генотиповых характеристик штаммов пневмококка в двух изучаемых группах - детей с туберкулезной инфекцией и медицинского персонала, что свидетельствует о формировании в данном стационаре госпитальных штаммов. Они характеризуются высокой степенью вирулентности и резистентности к антибиотикам, в том числе и к рифампицину (сочетания геновариантов 1119А и 1219А).

Такие штаммы в первую очередь опасны для детей, пациентов противотуберкулезных стационаров, у которых нарушены факторы защиты организма. Это может привести к развитию тяжелых инфекций, не поддающихся лечению современными антибактериальными препаратами. Все эти факторы окончательно подтверждают необходимость назначения антибактериальных препаратов, основанную на результатах микробиологического мониторинга, и коррекции в дальнейшем антибактериальной химиотерапии на основании результатов микробиологического исследования. Полученные данные обосновывают необходимость проведения специфической иммунопрофилактики групп риска, в частности пациентов и персонала специализированного стационара.

Выводы

1. В этиологической структуре носительства микроорганизмов у детей с туберкулезной инфекцией доминирующим видом является S. pneumoniae. Данные пациенты являются группой риска в развитии пневмококковых инфекций на фоне туберкулеза.

2. Обнаружение генов mefE и ermB у выделенных представителей рода Streptococcus, свидетельствует о высоких темпах формирования резистентности к антибиотикам группы макролидов. Выявлена различная степень устойчивости к фторхинолонам, а у 13,6% штаммов пневмококков обнаружен в составе генома ген резистентности к рифампицину.

3. Для идентификации пневмококков и оценке их этиологической значимости модифицирована методика постановки ПЦР с праймерами для гена ply, убиквитарного компонента генома S. pneumoniae.

4. Эффективно прогнозировать степень и тяжесть проявления пневмококковых инфекций у детей с туберкулезной инфекцией по результатам молекулярно-генетического типирования антигенных типов S. pneumoniae позволяет метод Multiplex ПЦР, который является более достоверным и финансово доступным, чем типирование с помощью серологических сывороток.

5. Среди пациентов и персонала противотуберкулезной больницы циркулируют высоковирулентные штаммы S. pneumoniae серотипов 3 и 19А, обладающие полирезистентностью к антибиотикам. У пациентов соматических стационаров доминирующими являются пневмококки серотипа 6, обладающие низким уровнем резистентности к антибактериальным химиопрепаратам. Полученные данные обосновывают необходимость проведения специфических профилактических мероприятий - вакцинации выявленных групп риска.

Рекомендации для внедрения результатов исследования в медицинскую науку и здравоохранение

1. Для серотипирования S. pneumoniae рекомендуется использовать метод Multiplex ПЦР, который является более экономичным и имеет более высокую специфичность, чем типирование с помощью серотиповых сывороток.

2. В качестве основы для эмпирической этиотропной терапии пневмококковых инфекций рекомендуется использовать Я-лактамные антибиотики или фторхинолоны нового поколения. Следует ограничить применение макролидов и исключить тетрациклин при лечении заболеваний пневмококковой этиологии у пациентов с туберкулезной инфекцией.

3. Применение рифампицина должно быть клинически обосновано, и, по-видимому, он должен назначаться лишь при выделении резистентных штаммов M. tuberculosis к другим противотуберкулезным антибиотикам.

4. Из-за сложности микробиологической диагностики S. pneumoniae рекомендуется комплексное обследование при возникновении заболевания предположительно пневмококковой этиологии, в том числе при возможности необходимо использовать и метод ПЦР с праймерами для гена ply, обладающий высокой чувствительностью и достоверностью.

5. Доминирование в структуре носительства среди пациентов и персонала специализированного стационара полирезистентных высоковирулентных штаммов S. pneumoniae серотипов 3 и 19А свидетельствует о необходимости проведения специфических профилактических мероприятий, вакцинации выявленных групп риска.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Особенности носительства возбудителей инфекций дыхательных путей у детей с пониженным иммунным статусом / Ю.Е.Скурихина, А.А.Шепарев, Л.Б.Чудная и др. // Тезисы докладов VI Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - 2005. - С.147.

2. Скурихина, Ю.Е. Oсoбенности носительства возбудителей верхних дыхательных путей у детей с хроническими бронхо-легочными заболеваниями / Ю.Е.Скурихина // Тезисы докладов VI Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - 2005. - С. 144.

3. Шепарёв, А.А. Заболеваемость болезнями органов дыхания у жителей приморского края в 2002-2003 гг./ А.А Шепарёв, Ю.Е. Скурихина, Э.В. Слабенко // Вестник РГМУ. - 2005. - № 3/42. - С.31.

4. Шепарев, А.А. Анализ заболеваемости взрослого населения г. Владивостока и Приморского края в 2002-2003 гг. / А.А. Шепарев, Ю.Е.Скурихина, С.Н. Чуриков // Вестник РГМУ. - 2005. - №3/42. - С.149.

5. Прушинский, А.П. Особенности организации и проведения инфекционного контроля в детской туберкулезной больнице / А.П. Прушинский, Ю.Е. Скурихина // Тихоокеанский Медицинский Журнал. - 2006. - №3. - С. 255.

6. Прушинский, А.П. Сопутствующие инфекционные заболевания среди пациентов ПДККТБ / А.П. Прушинский, Ю. Е. Скурихина, В.Б.Туркутюков // Юбилейный сборник, посвященный 60-летию Приморской детской краевой клинической туберкулезной больницы. - 2007. - С.7

7. Заболеваемость инфекциями верхних дыхательных путей и носительство возбудителей у детей с внелегочным туберкулезом / Ю.Е.Скурихина, А.В.Мартынова, А.П.Прушинский и др. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. - 2008. - №3. - С. 145-151.

8. Изучение механизмов формирования актуальной инфекционной и неинфекционной заболеваемости в Дальневосточном регионе / В.Б.Туркутюков, А.А.Яковлев, Г.Т.Дзюба и др. // Тихоокеанский Медицинский Журнал. - 2008. - №3. - С. 46-49.

9. Скурихина, Ю.Е. Эпидемиология носительства заболеваний ВДП у детей с хроническими бронхо-лёгочными заболеваниями / Ю.Е.Скурихина // Тезисы докладов VII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - 2006. - С. 167.

10. Скурихина, Ю.Е. Сопутствующие инфекции дыхательных путей у детей с внелегочным туберкулезом / Ю.Е.Скурихина // Человек и лекарство. Материалы IV Дальневосточного регионального конгресса с международным участием. - 2007. - С.74.

11. Эффективность иммунизации против «управляемых» инфекционных заболеваний среди населения Приморского края / Ю.Е.Скурихина, Н.С.Шитер, А.Г.Ненахов и др. // Материалы IX съезда Всероссийского Научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - 2007. - Т.1. - С. 103.

12. Скурихина, Ю.Е. Сопутствующие инфекционные заболевания у детей с внелегочным туберкулезом / Ю.Е.Скурихина, А.П. Прушинский // Тезисы докладов VIII Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - 2007. - С. 233.

13. Скурихина, Ю.Е. Особенности носительства возбудителей инфекций дыхательных путей у пациентов и персонала детской туберкулезной клиники / Ю.Е.Скурихина, А.В.Мартынова // Человек и лекарство. Материалы V Дальневосточного регионального конгресса с международным участием. - 2008. - С.73.

14. Скурихина, Ю.Е. Структура носительства возбудителей инфекций верхних дыхательных путей у пациентов и персонала детской противотуберкулезной больницы / Ю.Е.Скурихина, В.Б. Туркутюков // СПб Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - №2 (22), - С. 400-401.

15. Обеспеченность факторами вирулентности штаммов Streptococcus pneumoniae, выделенных от пациентов специализированных стационаров / Ю.Е.Скурихина, Л.А.Скурихина, В.Б.Туркутюков и др. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии.- 2009.- №1(14). - С.42-45.

16. Молекулярно-генетический мониторинг за формированием резистентности к антибиотикам штаммов микроорганизмов, выделенных у пациентов специализированных стационаров / В.Б.Туркутюков, Ю.Е.Скурихина, Л.А.Скурихина и др. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии.- 2009.- №1(14). - С.46-50.

17. Emergence of antimicrobial resistance at the Eastern part of Russia / A.V.Martynova, V.B.Turcutycov, Yu.E.Skurikhina et al. // Programme and Abstract Book Europneumo (7^th European Meeting of the Molecular Biology of Pneumococcus). - 2005. - p.408.

18. Emergence of floroguinolone-resistant clones of Streptococcus Pneumonia in far eastern Russia / A.Martynova, V. Turkyukov, Y. Scurichina et al. // European Societi of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: 15^th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clinical Microbiology and Infection, Copenhagen (Denmark). - 2005. - Vol. 11. - Sup.2. - Р. 663.

19. The pharmaepidemiological analysis of out-patient treatment of children with upper respiratory tract infections / V.Ivashuk, V.Luchaninova, V.Turcutjucov et al. // China-Russia International Conference on Pharmacology. - 2005. - P.22.

20. Epidemiology of community-acquired pneumoniae caused by Streptococcus pneumoniae / A.Martynova, V.Turkutjukov, Y.Skurikhina et al. // The Proceedings of the 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases, Alice Springs (Australia). - 2006. - P.180.

21. Evaluation of co-morbidity on the incidence of pneumococcal infection in the Far East of Russia / A.Martynova, V.Turkutjukov, Y.Skurikhina et al. // The Proceedings of the 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases, Alice Springs (Australia). - 2006. - p.192.

22. Kukhlevskiy, A.D. GQ336504 Streptococcus pneumoniae strain 4 RNA polymerase beta subunit (rpoB) gene, partial cds / A.D. Kukhlevskiy, Y.E. Skurikhina // NCBI - GenBank, 2009. - Режим доступа http://www.ncbi.nlm.nih.gov

23. Kukhlevskiy, A.D. GQ336505 Streptococcus pneumoniae strain 5 RNA polymerase beta subunit (rpoB) gene, partial cds / A.D. Kukhlevskiy, Y.E. Skurikhina // NCBI - GenBank, 2009. - Режим доступа http://www.ncbi.nlm.nih.gov

24. Kukhlevskiy, A.D. GQ336506 Streptococcus pneumoniae strain 6 RNA polymerase beta subunit (rpoB) gene, partial cds / A.D. Kukhlevskiy, Y.E. Skurikhina // NCBI - GenBank, 2009. - Режим доступа http://www.ncbi.nlm.nih.gov

25. Kukhlevskiy, A.D. GQ336507 Streptococcus pneumoniae strain 16 RNA polymerase beta subunit (rpoB) gene, partial cds / A.D. Kukhlevskiy, Y.E. Skurikhina // NCBI - GenBank, 2009. - Режим доступа http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Список сокращений

ВДП - верхние дыхательные пути

ПЦР - полимеразная цепная реакция

п.н. - пар нуклеотидов

NCCLS - National Committee of Clinical Laboratory Standards

Размещено на Allbest.ru

...