Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндомиокарда при миокардите

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Миокардиты включают большую группу заболеваний сердечной мышцы воспалительного генеза, проявляющихся поражением и нарушением функций миокарда. Частой причиной миокарда являются различные инфекционные заболевания: вирусные (вирусы Коксаки, гриппа, аденовирусы, герпеса, гепатита В и С); бактериальные (каринобактерии дифтерии, стафилококки, стрептококки и т.д.); грибковые (аспергиллы, кандиды); паразитарные (трихинеллы, эхинококки). Миокардит диагностирован в 34.7% взрослых аутопсий в случаях внезапной смерти и в 30-40% образцов биопсии миокарда пациентов с расширенной кардиомиопатией. Самый частый клинический сценарий миокардита - аритмии и сердечная недостаточность. Высокой кардиотропностью обладают вирусы, вызывающие миокардит в 50% случаев. Важную роль в противовирусной защите и патогенезе воспаления играют макрофаги - основные клетки системы врождённого иммунитета- играют важную роль в противовирусной защите, в патогенезе воспаления и развитии фиброза., большая часть причины вероятности болезни. Поэтому кажется важным изучить и сравнить морфологические изменения и профиль выражения вирусных антигенов в миокарде в наиболее распространенных клинических вариантах миокардита.

Иммуногистохимическое исследование при миокардите проводится для: 1) выявления маркеров воспаления и активации иммунитета с антителами к ICAM-1, ICAM-3, IgA, IgG, IgM, C3- компоненту комплемента, C1q- компоненту комплимента, C4d- компоненту комплемента (экспрессия последних 3 антигенов свидетельствует об активации гуморального иммунитета), HLA- DR- антигену гистосовместимости II класса; 2) финотепирование лимфоцитов и макрофагов с антителами к CD-3, CD-4, CD8, CD-68; 3) определение возбудителя вирусной инфекции с антителами к VP-1энтеровируса, LMP вируса Эпстайна- Барра, парвовирусу В19, аденовирусу, цитомегаловирусу, вирусу гепатита С, вирусам простого герпеса 1и 2 типа, вирусу герпеса 6 типа.

Цель: Проанализировать статистические данные иммуногистохимического исследования миокарда, проводимого в патологоанатомическом отделении НИИ кардиологии Томского НИМЦ.

Задачи:

1. Познакомиться с методами иммуногистохимического окрашивания.

2. Оценить значимость иммуногистохимического исследования в диагностике миокардита.

3. Оценить частоту выявления миокардитов по данным исследования эндомиокардиальных биоптатов.

1. Теоретические аспекты миокардита и основы иммуногистохимии

сердечный миокардит иммуногистохимический

1.1 Миокардит. Виды миокардита

Миокардит - это поражение сердечной мышцы, миокарда. Обычно поражение носит воспалительный характер.

В зависимости от источника возникновения миокардиты разделяют на несколько видов:

Чаще всего встречается инфекционно-аллергический миокардит, который может быть осложнением гриппа или ангины.

- Ревматический миокардит - следствие ревматизма

- Неинфекционные миокардиты появляются в результате травм, ожогов, вследствие приема некоторых лекарств и так далее.

- Идиопатические, природа которых неизвестна.

Диффузный миокардит характеризуется дилатацией камер сердца и сердечной недостаточностью.

При инфекционном миокардите обычно доминируют симптомы инфекционного заболевания (лихорадка). Наиболее часто встречающиеся симптомы -- слабость, утомляемость, одышка, сердцебиение, нарушения ритма сердца. Так же часто встречаются дискомфорт и разнообразные боли в грудной клетке. Инфекционный миокардит также может протекать бессимптомно.

Инфекционно-аллергический миокардит (наиболее распространенная форма неревматического миокардита) начинается в отличие от ревматического, как правило, на фоне инфекции или вскоре после неё.

Отмечается недомогание, боль в области сердца, иногда упорная, сердцебиение и «перебои», одышка, в ряде случаев умеренная боль в суставах. Температура тела чаще субфебрильная или нормальная.

Начало заболевания может быть малосимптомным или скрытым. Степень выраженности симптомов в значительной мере определяется распространенностью и остротой прогрессирования процесса. При диффузных формах сравнительно рано увеличиваются размеры сердца.

Важными, но не постоянными признаками миокардита являются нарушения сердечного ритма (тахикардия, реже брадикардия, эктопические аритмии) и внутрисердечной проводимости, а также пресистолический, а в более поздних стадиях протодиастолический ритм галопа.

Идиопатический миокардит отличается более тяжелым, иногда злокачественным течением с развитием кардиомегалии (вследствие резко выраженной дилатации сердца), тяжелых нарушений ритма и проводимости, сердечной недостаточности.

Нередко образуются пристеночные тромбы в полостях сердца с тромбоэмболиями по большому и малому кругам кровообращения.

При миокардитах, связанных с коллагеновыми заболеваниями, вирусной инфекцией (вирусы группы Коксаки и др.), нередко развивается сопутствующий перикардит.

Течение миокардита может быть острым, подострым, хроническим (рецидивирующим).

1.2 Кардиотропные вирусы - возбудители миокардита

По данным СПб ГУЗ «ГПАБ», 2010 года, у жителей Северо -западного региона России среди вирусных возбудителей миокардита преобладает энтеровирус. На втором месте - парвовирус В19, на третьем - аденовирус, на четвертом - герпес 6 типа, на пятом - вирус гепатита С. Цитомегаловиру и вирус Эпстайна-Барр они наблюдали только в миокарде трансплантированного сердца. В большинстве случаев (71%) выявляется сочетание инфекционных агентов: энтеровирусов с вирусом гепатита С или сразу трех вирусов.

Парвовирус В19 - (от латинского parvum - маленький) был открыт в 1975 году. Состоит из одноцепочной ДНК, заключенной в белковый капсид. Вирус патогенен только для человека. Клеточный мембранный рецептор для парвовируса - Р- антиген или Gb4- агликосфинголипид. Gb4 экспрессируется на эритроцитах, тромбоцитах, лейкоцитах, синовиальной оболочке, коже,эндотелии, гладкомышечных клетках, альвеолоцитах, гепатоцитах, кардиомиоцитах. Он реплецируется в клетках с быстрым делением, например, в клетках костного мозга и переферической крови, и персистирует в эритробластах, мегокариоцитах, гранулоцитах, лимфоцитах, макрофагах, гепатоцитах, синовеальной оболочке, эндотелиоцииах. Парвовирус19 вызывает аутоиммунные реакции, является триггером аутоиммунных заболеваний соединительной ткани, доказана перекрестная аутоиммунная реакция с аутоантителами к коллагену II типа, кератину, тиреоглобулину, кардиолипину. Последний является ингибитором ДНК- полимеразы, регулирует активность РНК-полимеразы. Кардиолипин содержится в мембранах метохондрии, в ядре- в ДНК и ядерном матриксе. Это фосфолипид, контролирующий синтез белка. При его ингибировании ДНК - полимераза перестает подавляться. Что ведет к гипертрофии миокарда.

Парвовирус В19 вызывает: 1) « синдром пощечин» или « пятую болезнь» у детей с характерной эритематозной сыпью и «заразным апластическим кризом», особенно при иммунодефиците и гемолитической анемии; 2) миокардит, 3) васкулит, 4) пневмонию,5) фульминантный гепатит, 6) менингоэнцефалит. При миокардитах вирус локализуется на мембране саркоплазмы, мембране ядер и в самих ядрах кардиомиоцитов, в эндотелии сосудах и в клетках инфильтрата. К особенностям парвовирусного миокардита относят очаговые кровоизлияния и мелкоочаговые инфаркты миокарда вследствие поражения эндотелия с последующим некрозом сосудистой стенки и тромбозом. Вирус может вызывать диффузный и очаговый миокардит, является триггером реакции отторжения при пересадке сердца. Очаговый миокардит чаще выявляют в субэпикардиальных отделах заднебоковой стенки левого желудочка при магнитно- резонансной томографии. Вирус может вызывать перикардит и пилисерозит. Его нередко обнаруживают в перикардиальной жидкости. NS1 - протеин парвовируса В19 считается основным белком, играющим лидирующую роль в патогенезе миокарда. Он активирует вирусную репликацию, экспрессию интерлейкина 6, фактора некроза опухоли a, инициирует апоптоз через активацию каспаз 3 и 9, VP1- через активацию цитотоксических Т- лимфоцитов.

Вирус герпеса 6 типа был обнаружен в миокарде недавно. Как и все вирусы в герпетической группы, он представлен ДНК и в белковом копсиде. Считается что вирус поражает нервные волокна и ганглии, а так же клетки проводящей системы сердца, реплицируется в лимфоцитах, преимущественно в Т - лимфоцитах, макрофагах, астроцитах, олигодендроцитах, нейронах, глиальных клетках. Герпес 6 типа может вызвать миокардит, гепатит, пневмонию, менингоэнцифолит, гистиоцитарный некротизирующий лимфаденит Кикучи, злокачественные лимфомы, мононуклеозоподобный синдром, синдром хронической усталости, является кофактором для развития ВИЧ - инфекции. При миокардитах вирус обнаруживают в ядрах кардиомиоцитах, эндотелии сосудов и клетках инфильтрата.

Цитомегаловирус выявляется в миокарде у больных с ослабленным иммунитетом, особенно часто после пересадки сердца. Определяется в резко гипертрофированных ядрах кардиомиоцитов, имеющих вид совиного глаза, что особенно хорошо прослеживается при иммуногистохимическом исследовании с антителами к этому вирусу и не всегда видно в гистологических препаратах. Вирус так же обнаруживается в эндотелии сосудов и клетках инфильтрата. Цитомегаловирус широко распространен. Наиболее часто инфицирование происходит в детском возрасте, и к сроку полового созревания IgG к цитомегаловирусу выявляются у большинства детей. Во взрослом возрасте IgG к цитомегаловирусу определяется более чем у 90% людей. Цитомегаловирусное инфекция может протекать как острое респираторное заболевание, осложняться пневмонией, артритом, энцефалитом. Виру способен поражать множество тканей и органов, включая печень, почки, селезенку, надпочечники, поджелудочную железу, кишечник, органы мочеполовой системы, кожу, слюнные железы, бронхи, легкие, сосуды глаз, головной мозг, нервную систему. Цитомегаловирусная инфекция - одна из причин выкидышей на ранних сроках беременности. Вирус персистирует в слюнных железах человека.

Вирус Эпстайна - Барр один из более распространенных вирусов, был открыт в 1964 году, так же как цитомегаловирус и герпес 6 типа, относится к герпетической группе. Он обладает тропизмом к В- лимфоцитам. Местом персистенции вируса может быть костный мозг, реплицируется в лимфоцитах. Вирус Эпстайна - Барр вызывает инфекционный мононуклеоз, гепатит, ассоциируется с лимфомой Беркитта, назофаренгиальной карциномой, лимфогранулематозом, посттрансплантационными лимфопрлиферативными заболеваниями, первичной церебральной лимфомой, герпетической ангиной, множественным склерозом, волосяной лейкоплакией. Он обнаруживается при миокардах и трансплантации сердца в кардиомиоцитах, лимфоцитах и эндотелии сосудов. Вирус вызывает апоптоз Т- лимфоцитов.

Вирус простого герпеса 1 и 2 типа проникает в организм человека через поврежденные кожные покровы и слизистые, инфицируют эпителиальные и эндотелиальные клетки, фибробласты, гладкомышечные клетки, нервные клетки, макрофаги, вызывая изменение их функциональных и антигенных свойств, стимулируя иммунный ответ. При миокардах они чаще выявляются в фибробластах и эндотелиоцитах сосудов, реже в кардтомиоцитах. Вирусы простого герпеса реплицируются в клетках эпителия и нейронах. В паравертебральных ганглиях возбудитель в латентном состоянии сохраняется в течении всей жизни человека, а при реактивации размножения, перемещается по нервным волокнам к месту первичного вхождения. Вирусы попадают в сердце через межпредсердную перегородку, особенно богатую сенсорными окончаниями, нервными волокнами и ганглиями. Они могут изолированно определяться либо в предсердиях, либо в желудочках, что свидетельствует о возможности данного вируса вызывать изолированное поражение этих отделов при распространении инфекции по нервным волокнам. Морфологические изменения сводятся к увеличению размеров ядра клетки, периферическому расположению хроматина с дальнейшим исчезновением (эффект пустого ядра), фрагментации ядрышек, формированию множественных полисом в цитоплазме, к повышению проницаемости для макромолекул, агрегированию клеток. Обнаруживается гигантоклеточный метаморфоз. При инфицировании вирусами простого герпеса в клетках стромы и в клетках воспаления обнаруживают экспрессию ММР-2, ММР-8,ММР-9 и их ингибиторов TIMP-1, TIMP-2. В строме снижается количество экстрацеллюлюрного фибронектина и коллагена IV типа, стимулируется тромбоз и некроз стенки сосуда. Герпесвирусы индуцируют апоптоз, обусловленный активацией каспаз 8 и 9.

Аденовирусы содержат ДНК. В настоящее время известны 32 типа аденовирусов, выделенных от человека и различающихся в антигеном отношении. Вспышки заболеваний чаще обусловлены типами аденовирусов 3,4,7,14 и 21. Тип 8 вызывает эпидемический кератоконъюктивит. Для всех типов аденовирусов характерно наличие общего комплемент связывающего антигена. Вирусы вызывают острое респираторное заболевание, характеризующееся поражением лимфоидной ткани, слизистых оболочек дыхательных путей, глаз, кишечника и умеренно выраженными симптомами интоксикации. Вирус может вызывать пневмонию и миокардит, репродуцируется в эпителии дыхательных путей, кишечника, конъюнктивите, роговице глаз и лимфоцитах с увеличением лимфатических узлов. Как и энтеровирусы, обладает прямым цитопатическим эффектом на кардиомиоциты. При миокардите он обнаруживается в ядрах кардиомиоцитов и клетках инфильтрата. Различные протеины этого вируса, стимулируют апоптоз кардиомиоцитов.

Энтеровирусы состоят из РНК. Они обладают широким спектром патогенности, что объясняется способностью репродуцироваться в нервных клетках, клетках соединительной ткани, эндотелии, эпителии, миоцитах и кардиомиоцитах, а так же большой изменчивостью. Наиболее часто вирусы персистируют в миоцитах, кардиомиоцитах и лимфоидной ткани. В настоящее время выделено 87 серотипов, 64 из них потагенны для человека. 2В - протеин вирусов изменяет пронецаемость клеточной мембраны, что приводит к повышению концентрации интрацеллюлярного кальция, стимулируя активацию синтеза кальцинерона с последующим синтезом проапоптозных членов Вс1-2 семейства. Энтеровирусы так же стимулируют апоптоз клеток через каспазный механизм. Дефективные вирусные частицы могут приводить к процессии миокардита и перехода его в дилатационную кардиомиопатию. Известна высокая инфицированность вирусами Коксаки лиц с миокардитами и кардиомиацитами. В основном это вирусы Коксаки А9, А13, А18, В3, В4. При миокардитах инфицированность вирусами составляет от 73% до 82% больных, при дилатационной кардиопатии- 38-75%. Экспрессию антигена VP-1 при миокардитах находят в цитоплазме кардиомиоцитов, эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток сосудов, фибробластов и клетках инфильтрата.

1.3 Диагностика миокардитов

Диагностика миокардита проводится на основании характерных жалоб, анамнеза, клинической картины, результатов физического обследования, лабораторных исследований, данных ЭКГ, ЭхоКГ, рентгенографии органов грудной клетки, иногда сцинтиграфии миокарда и инвазивных методов -- катетеризации левых отделов сердца и эндомиокардиальной биопсии с гистологическим и иммуногистологическим исследованием.

Инструментальные методы диагностики.

ЭКГ и суточное мониторирование по Холтеру.

Даже при бессимптомном течении миокардита практически всегда имеются изменения ЭКГ, обычно исчезающие в течение нескольких дней.

ЭхоКГ.

Чаще всего изменения отсутствуют (при легком и большинстве случаев среднетяжелого течения миокардита). Возможно неравномерное сокращение левого желудочка, диффузное снижение сократимости миокарда, расширение полостей сердца, прежде всего левого желудочка. Также можно выявить сопутствующий экссудативный перикардит.

Рентгенография органов грудной клетки.

При тяжелом течении миокардита с дилатацией камер сердца и сердечной недостаточностью можно увидеть расширение тени сердца и признаки застоя в легких.

Сцинтиграфия миокарда.

Данные радионуклидного исследования сердца с Тс-пирофосфатом и моноклональными антителами к актомиозину, часто отличаются от нормы. При своей высокой чувствительности сцинтиграфия является неспецифичным методом диагностики миокардита: аномальное распределение изотопов отмечается не только при миокардите, но и при инфаркте миокарда и в 1/3 случаев при ДКМП.

Катетеризация левых отделов сердца с эндомиокардиальной биопсией.

Катетеризация сердца позволяет провести гистологическое и иммуногистологическое исследование миокарда для выявления признаков воспаления и диагностики миокардита.

Гистологические характеристики миокардита включают в себя 5 групп.

Признаки активного миокардита (лимфоцитарные инфильтраты в сочетании с разрушением кардиомиоцитов; возможно обнаружение также фиброза и отека интерстициальной ткани), иногда выявление вирусной РНК, антител класса М и компонентов комплемента (в частности, С3).

Пограничные признаки миокардита (единичные лимфоцитарные инфильтраты), обусловливающие необходимость в контрольной биопсии, которую проводят через несколько недель. Ее результаты позволяют подтвердить или отвергнуть диагноз миокардита, определить его характер (острый или хронический), оценить прогноз больных. Устанавливают следующие гистологические диагнозы.

Персистирующий миокардит (сохранение изменений, выявленных при первой биопсии); наличие признаков фиброза и гипертрофии мышечных волокон указывает на неблагоприятный прогноз.

Миокардит в фазе заживления -- уменьшение числа лимфоцитарных инфильтратов по сравнению с их числом при первой биопсии, признаки восстановления структуры ткани.

Разрешившийся миокардит (отсутствие клеток воспаления и очагов некроза).

Точная дифференциальная диагностика миокардита чрезвычайно трудна и нередко невозможна без биопсии миокарда.

1.4 Антитела

Иммуноглобулины.

Антитела - это белки плазмы крови. Существует пять видов Ig - IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.

Структура IgG такова, что молекула этого белка состоит из двух легких (L) и двух тяжелых (H) полипептидных цепей. Как тяжелые, так и легкие цепи имеют два функционально различных участка или фрагмента - Fv и Fc. Fv- это вариабельный участок, отвечающий за связывание с определенным антигеном. Fv легкой цепи и Fv тяжелой цепи образуют Fab (fragment antigen binding) - это тот участок молекулы Ig, который связывается с АГ. Одна молекула Ig G имеет два Fab и может провзаимодействовать с двумя антигенами детерминантами. Fc- постоянный участок молекулы Ig, определяющий видовую специфичность Ig, что весьма важна для иммуногистохимии.

Поликлональные и моноклональные антитела.

Схема получения поликлональных антител:

1) Иммунизация лабораторного животного.

На введенный антиген в организме кролика вырабатываются антитела. Причем эти антитела могут быть к различным участкам молекулы белка и вырабатываются различными клонами плазматических клеток. То есть антитела работают против белка, которым был иммунизирован кролик, но (а) связываются с различными участками этого белка и (б) они различны, так как вырабатываются разными клонами плазматических клеток и поэтому называются поликлональными.

2) у иммунизированного животного берут кровь, и, после удаления форменных элементов, поликлональные антитела могут быть получены из сыворотки путем отчистки последней от других сывороточных протеинов.

Поликлональные антитела могут быть получены не только из сыворотки крови. Так, Фей с коллегами описал очень оригинальный способ получения большого объема поликлональных антител путем иммунизации беременных коров. Это процедура безвредна для плода. После удается получить несколько литров молозива, в котором содержание антител в несколько раз превышает их концентрацию в сыворотки крови. Данный метод с успехом используется для получения большого количества антител к H- антигену сальмонелл, IgG кролика и человека.

Схема получения моноклональных антител:

Процедура получения моноклональных антител более трудоемкая, но позволяет получить Ig, которые специфично связываются лишь с одним антигеном, и все Ig идентичны по своему строению.

1) Иммунизация мыши антигеном

2) Выделение из селезенки иммунизированной мыши лимфоцитов и слияние их с клетками плазмоцитами

3) Культивирование гибридом in vitro и отбор нужной гибридомы (выявление клона, который продуцирует антитела против нужного нам белка.

4) После селекции нужный клон можно хранить в замороженном состоянии, а антитела этого клона можно получить в больших количествах либо из асцитической жидкости после внутрибрюшного введения клеток гибридами мышам, либо культивируя клетки гибридами in vitro.

1.5 Методы выявления комплекса антиген-антитело на гистологических препаратах

Для визуализации мест взаимодействия антител с антигеном необходимо пометить антитела.

(А) Антитела можно «снабдить» электронно -непрозрачной меткой (ферритин, коллоидное золото) и под электронным микроскопом увидеть места локализации антигена.

(Б) Антитела можно пометить флюрохромом. После образования комплекса антиген - антитело соответствующее место будет светиться при просмотре ультрафиолетовом свете. Однако иммунофлюоресцентный метод имеет два существенных недостатка:

1) трудность морфологического анализа

2) сложности, связанные с плохой сохранностью препаратов при их длительном хранении. Эти два недостатка стали определяющими факторами почему большее распространение получил иной подход для визуализации мест локализации комплекса антиген - антитело, который основан на гистохимических реакциях и потому названный иммуногистохимическим.

(В) В иммуногистохимических методах в качестве метки выступает фермент, после выявления активности который становятся видны места локализации антигена.

Гистохимические реакции в иммуногистологии.

Иммуногистохимическое окрашивание основано на взаимодействии фермента, которым помечены антитела, с субстратом и образовании окрашенного конечного продукта реакции. Ферменты, которые используют в иммуногистохимии в качестве метки для антитела, должны отвечать ряду требований:

- возможность получения фермента в больших количествах по недорогой технологии

- после коньюгации с антителами фермент не должен терять своей активности

- фермент должен быть стабилен в растворе

- эндогенная активность фермента в тканях не должна быть очень высокой

- конечный продукт ферментативной реакции должен быть стабильным и хорошо видимым.

В настоящий момент в иммуногистохимии используют ряд ферментов, которые отвечают вышеперечисленным критериям. Это пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза, бета- галактозидаза и уреаза.

Пероксидаза хрена.

Этот фермент выделен из корня хрена, он расщепляет перекись водорода. Метод выявления активности пероксидазы основан на окрашивании хромогена, который выступает в роли донора электронно, в присутствии перекиси водорода. В качестве хромогена могут быть использованы:

3-диаминобензидин тетрахлорид (ДАБ) - продукт реакции коричневого цвета, нерастворим в органических растворителях, однако требует осторожного обращения, поскольку является канцерогеном.

3- амино-9-этилкарбазол (АЭК)- продукт реакции красного цвета, растворим в спиртах, поэтому окрашивание ядер надо проводить не спиртовыми красителями и заключать срезы лучше всего в глицерин - желатину.

4-хлоро-1-нафтол - конечный продукт синего цвета, растворим в спиртах и других органических растворителях.

П-фенилендиамин дигидрохлорид - продукт реакции темно синего цвета, нерастворим в органических растворителях.

Щелочная фосфатаза.

Методы выявления активности щелочной фосфатазы основаны на использовании искусственных субстратов (фосфаты нафтолов) с добавлением в инкубационную среду солей диазония. Локализация фермента после гидролиза субстрата становиться видимой в результате образования из солей диазония нерастворимых азокрасителей.

В качестве субстрата могут быть использованы нафтол АS-MX фосфат, нафтол AS-BI фосфат, нафтол AS-TR фосфат или 5- бромо- 4- хлоро-3 - индиксил фосфат. В качестве хромогена можно выбрать следующие красители: прочный красный TR, прочный синий ВВ, «новый фуксин» (New Fuchsin), нитро синий тетразолин.

1.6 Методы окраски

Существует много различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена.

Иммуногистохимия - это один из методов окраски биологических объектов, изучаемых под микроскопом. Их суть заключается в определении локализации антигенов с помощью специфических антител.

Прямой метод.

В случае прямого иммуногистохимического метода используют меченные первичные антитела. Недостатком является то, что продукт гистохимической реакции имеет слабую интенсивность окраски.

Непрямой метод.

Непрямые методы основаны на использовании немеченых первичных антител, которые после связывания с антигеном тканей будут выступать в роли антигена для вторичных (третичных) конъюгированных с ферментом антител.

Двухшаговый непрямой метод.

Первый вариант:

(1) Инкубация с первичными моноклональными (мышиными) антителами против искомого антигена; промыть в ТБС (забуференный физиологический раствор на Трис-НСI буфере pH 7,4), (три смены по 3мин).

(2) Инкубация со вторичными (против мышиных Ig) конъюгированными антителами; промыть в ТБС.

(3) Гистохимические выявления фермента, которым помечены вторичные антитела; промыть в воде, доксарить ядра.

Второй вариант:

1) Инкубация спервичными поликлональными (кроличьими) антителами против искомого антигена; промыть в ТБС (три смены по 3 минуты).

2) Инкубация со вторичными конъюгированными антителами; промыть в ТБС.

3) Выявление продукта гистохимической реакции. Промыть водой, докрасить ядра.

Трехшаговый непрямой метод.

Первую и вторую инкубацию проводят как в двухшаговом методе, а затем проводят третью инкубацию с третичными конъюгированными антителами, которые « работают» против вторичных антител.

(1) Инкубация с первичными моноклональными (мышиными) антителами против искомого антигена. Промыть в ТБС (три смены по 3 мин.).

(2) Инкубация со вторыми (кроличьими Ig против Ig мыши), конъюгированными с пероксидазой хрена, антителами; промыть в ТБС.

(3) Инкубация с третичными (свиные Ig против Ig кролика), конъюгированные с пероксидазой хрена, антителами; промыть в ТБС

(4) Гистохимическое выявление пероксидазой активности.

(5) Промыть в воде, докрасить ядра.

Преимущество непрямых методов по сравнению с прямыми связано с интенсификацией окраски мест локализации антигена.

Методы с использование фирменных иммунных комплексов.

Эти методы иногда называют методом немеченых антител, предварительно формирующих фермент- антифермент иммунные комплексы. Этот тип иммунных комплексов состоит из фермента (антиген) и антител против этого фермента. Стадии окраски включают первичные и вторичные немеченые антитела. А на третьем этапе используют растворимый иммунный комплекс фермент- антифермент. В ферментных иммунных комплексах содержится « излищек» фермента и антитела против фермента, которые связываются с ферментом через Fab. Первичные антитела и антитела иммунных комплексов должны быть получены от одного вида животных, в этом случае вторичные (связующие) антитела, « подвязывают» антитела иммунных комплексов. Методы с использованием иммунных ферментных комплексов более чувствительны, чем прямой и непрямые методы, в которых фермент ковалентно связан с антителами, что не позволяет создать такую высокую концентрацию фермента, как в ферментных иммунных комплексах.

ПАП (пероксидаза антипероксидаза) метод.

1) Инкубация с кроличьими (мышиными) первичными антителами; промыть в ТБС (три смены по три мин).

2) инкубация со вторичными антикроличьими антителами; промыть в ТБС.

3) Инкубация с иммунным комплексом ; пероксидаза хрена + кроличьи антипероксидазные антитела; промыть в ТБС.

4) гистохимическое выявление активности пероксидазы; промыть водой, докрасить ядра.

ЩФАЩФ (щелочная фосфатаза антищелочная фочфатаза)

(1) и (2) Инкубация, как в ПАП методе;

После каждого шага промыть в ТБС.

(3) Инкубация с иммунным комплексом: щелочная фосфатаза+ антитела против щелочной фосфатазы (от того же вида животного, что и первичные антитела) ; промыть в ТБС

(4) Гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы; промыть в воде, докрасить ядра.

Авидин - биотиновые методы.

Биотин является низкомолекулярным витамином, который способен связываться в высокой пропорции с высокомолекулярными соединениями (Ig, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). Авидин- это гликопротеин, получаемый из яичного белка. Было замечено,что нарушения,наступающие в организме при потреблении больших количеств яичного белка, являются следствием биотиновой недостаточности, вызванной авидином, который имеет высокое сродство к биотину. С одной молекулой авидина могут связываться четыре молекулы биотина. Авидин-биотиновые иммуногистохимические методы основаны на способности авидина или стрептавидина связываться с биотином, а биотина, в свою очередь, с иммуноглобулинами и ферментными маркероми. В качестве вторичных антител в этих методах используют биотинилированные антитела.

АБС (авидин- биотин- пероксидазный комплекс) метод.

(1) Инкубация с первичными кроличьими антителами; промыть в ТБС (три смены по 3 мин.).

(2) Инкубация со вторичными биотинилированными антикроличьими антителами; промыть в ТБС.

(3) Инкубация с авидин-биотин- пероксидазным комплексом; промыть в ТБС

(4) выявление активности пероксидазы; промыть в воде, докрасить ядра.

Новые высокоэффективные методы (EPOS, ENVISION).

Методы основаны на том, что к длинной молекуле полимера (декстран) « пришиты» как антитела, так и ферменты. За счет увеличения концентрации фермента усиливается генерируемый в результате гистохимической реакции сигнал и, следовательно, повышается чувствительность метода.

Одношаговый - EPOS.

Принцип метода основан на том, что с полимером (декстраном) связаны как первичные антитела, так и молекулы фермента.

Двухшаговый - EnVision.

В этом случае полимер конъюгирован со вторичными антителами и ферментом.

Метод CSA.

Другим высокоэффективным методом является набор CSA (Catalyzed Signal Amplification). Принцип системы CSA заключается в увеличении числа молекул биотина, связывающихся с комплексом стрептавидин- пероксидаза.

Далее приводится пример иммуногистохимического окрашивания лаборатории НИИ кардиологии с использованием системы визуализации REVEAL Polyvalent HRP- DAB Detection System.

ь Промывка срезов в 3х буферах по 5 мин.

ь Срезы обводят гидрофобным карандашом, инкубируют с перкосидазным блоком в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы.

ь Для подавления фонового окрашивания срезы инкубируют 20 мин. с протеиновым блоком.

ь Промывка в буфере 1-2 раза.

ь Наносим первичные антитела в соответствии с протоколом, 30 мин.

ь Промывка в 3х буферах.

ь Наносим комплимент на срезы, на которых были нанесены мышиные антитела. Стекла со срезами на которых были нанесены кроличьи, АТ комплимент не наносим и оставляем в 3-ем буфере.

ь Промывка в 2х буферах.

ь Нанесение HRP коньюгат(пероксидаза хрена) на все стекла- 15 мин.

ь Промывка в 4х буферах.

ь Разводим ДАВ (1 капля субстрата на 1,5 мл буфера), 1,5 мин.

ь Промывка в 4х буферах.

ь Докрашивание гематоксилином 1 мин.

ь Промываем срезы в воде.

ь Дегидротирование в спиртах (4шт) и ксилолах (4шт), по 2 мин в каждой баночке.

ь Заключение под бальзам и покровное стекло.

Результат окрашивания: выявляемый антиген - коричневый, ядра сине-фиолетовые.

2. Материалы и методы иммуногистохимического исследования биоптатов эндомиокарда

Базой исследования являлось патологоанатомическое отделение НИИ кардиологии Томского НИМЦ. Материалом исследования послужили биоптаты эндомиокарда пациентов с необъяснимыми аритмиями и сердечной недостаточностью.

Эндомиокардиальная биопсия (ЭМБ) является золотым стандартом для диагностики патологии сердца, в т.ч. криза отторжения при его трансплантации и методом выбора диагностики при миокардите. Исследование биоптатов позволяет оценить степень активности воспаления, выраженность фиброза миокарда, установить этиологию заболевания

В большинство случаев осуществляется биопсия сердечной мышцы правого желудочка, левого - значительно реже. Выбор места биопсии миокарда зависит от цели исследования.

Биопсию миокарда выполняют биоптомом. Биоптом - небольшой катетор с захватом на конце. Длина биоптома зависит от доступа, а диаметр - от диаметра катетера. Используют:

· при доступе через внутреннюю яремную и подключичную вены - биоптомы 50 см

· при доступе через бедренную вену - биоптомы 95 и 105 см

Используют биоптомы двух основных типов:

· жесткие (для установки не требуют проводникового катетера)

· гибкие (устанавливаются через проводниковый катетер).

Забирают 3 фрагмента эндомиокарда, полученные с помощью биоптома (BiPAL 7, Cordis Corporation, USA) трансвенозными доступом (через бедренную вену) из правого желудочка фиксируют в 10% забуференом формалине при комнатной температуре не более 24часов.

Успешная фиксация исследуемого объекта -- лишь первое условие, необходимое для приготовления качественных микропрепаратов. Однако для того, чтобы добиться получения тонких срезов (в тысячные доли миллиметра), зафиксированный материал необходимо соответствующим образом подготовить: сделать достаточно плотным и в то же время нехрупким. Нужно придать ему такое состояние, чтобы при резке он не крошился и не деформировался, срезался тонкими ровными слоями, для этого ткань следует освободить от излишков фиксатора, обезвредить, пропитать и залить уплотняющей средой.

Начиная с этого этапа и до самого конечного момента приготовления гистологического препарата, следует строго придерживаться правилам постепенного воздействия применяемых веществ на исследуемые ткани.

Для эндомиокардиальной биопсии используют ручную проводку, которая включает в себя 4 спирта в каждом по 30 мин, и 3 ксилола, по 20 мин. Для получения тонких срезов кусочки материала помещаю в банки с расплавленным парафином в термостат, где температура 60С, на 3 часа.

Традиционный этап проводки имеет ряд существенных недостатков: трудоемкость, длительность (до четырех суток), испарение реагентов в воздух лаборатории (что небезопасно для сотрудников лаборатории, так как ксилолы образуют взрывоопасные паровоздушные смеси, вызывают острые и хронические поражения кроветворных органов, при контакте с кожей - дерматиты), а также нестабильное качество получаемой ткани, зависящее от человеческого фактора, а именно действий лаборанта. Для решения проблем такого рода лаборатории используют альтернативные реагенты, такие как изопропанол, являющийся нетоксичным, а также аппараты - гистопроцессоры, имеющие закрытый контур и таким образом не допускающие испарений в воздух лаборатории. Путем использования гистопроцессоров также можно значительно уменьшить время проводки по сравнению с ручным методом (до одного часа).

В настоящее время современные многие лаборатории оснащены специальным аппаратом гистопроцессором "SHANDON EXCELSIOR ES", с автоматическими этапами проводки материала.

Парафин при комнатной температуре -- твердое гомогенное вещество. Существует несколько сортов парафина: мягкие (точка плавления 45-54С) и твердые (точка плавления 58-60С).

В большинстве случаев для заливки применяют парафин с точкой плавления 54-56"С. Если резка предполагается при низкой температуре окружающей среды, то лучше применять парафин с более низкой точкой плавления (48--50°С). Нужная степень твердости парафина достигается смешиванием в различных комбинациях мягких и твердых сортов.

Следует помнить, что обычный продажный парафин часто содержит газообразные примеси, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повышенную ломкость и значительно ухудшающие качество резки материала. Для избавления от этих примесей свежий парафин следует на длительное время оставить в расплавленном виде в плоских чашках (чтобы увеличить площадь для выделения газов) при температуре 70°С (для этого можно приспособить сушильный шкаф). Можно также подвергать парафин частому расплавлению и нагреванию (до появления дыма) с последующим быстрым охлаждением.

Если парафин, несмотря на соответствующую подготовку, сохраняет жесткость, к нему следует добавить чистый пчелиный воск в количестве 2--5%, что придаст парафину большую эластичность.

Заливка в парафин требует тщательного соблюдения двух основных условий:

1) препарат должен быть полностью обезвожен,

2) не должен содержать спирт.

Первое условие, как мы уже знаем, обеспечивается в процессе обезвоживания и уплотнения в батарее спиртов повышающейся концентрации.

По окончанию проводки кусочки материала ложатся приготовленные деревянные брусочки и сверху заливаются. После того как блок застыл, приступают к приготовлению срезов с помощью микротома.

Техника приготовления и наклеивание срезов.

Для приготовления срезов используются специальные приборы - микротомы.

Методика приготовления срезов из парафинового блока для ИГХ практически не отличается от обычного их изготовления для гистологической окраски. Однако есть ряд требований. Срез должен быть ровным, тонким 3-5 мкм, расправлять срез желательно в теплой дистиллированной воде (+25+28 С) или над спиртовкой, но не перегревать, выше +56С, так как высокая температура может разрушить антиген и результат реакции может быть отрицательным.

Наклеенный на кассету парафиновый блок прочно закрепляют в зажиме микротома, расположив длинной осью параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляют винтовыми зажимами и располагают над блоком. После этого, регулируя винтами, механизм подачи, блок устанавливают таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась в горизонтальном положении и не доходила до лезвия ножа на 0,5--1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, устанавливают микрометрическую шкалу на получение толстых (25--30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начинают подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производят моделирование блока: срезают скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2--З мм, и придают блоку прямоугольную форму. После этого устанавливают микрометрическую шкалу на нужную толщину среза(от 0 до 6) и приступают к окончательной резке материала.

Правильно залитые небольшие кусочки органов и тканей при оптимальном температурном режиме в помещении режутся хорошо, и срез, как правило, ложится на нож в расправленном состоянии (угол резания прямой). При резке больших блоков и твердого материала срезы часто закручиваются. Однако этого можно избежать путем придерживания и приподнимания среза кисточкой за передний его край в процессе резки. Готовый срез осторожно снимают с ножа влажной кисточкой, (в направлений от спинки к лезвию) и переносят либо на подготовленное предметное стекло, либо в ванночку с теплой (З5--40°С) дистиллированной водой. Воду предварительно кипятят, чтобы предупредить появление на нижней поверхности срезов пузырьков воздуха (который может быть растворен в воде), мешающих равномерному приклеиванию срезов к стеклу. Помещают срезы на воду (предметное стекло) обязательно поверхностью, прилежащей к ножу, определить которую можно по характерному блеску (верхняя сторона всегда матовая).

При резке надо следить, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия.

Серийные микротомные срезы с парафиновых блоков толщиной 3-4мкм перемещают на поверхность теплой воды (70С) для расправления, а затем на предметное стекло с полилизиновым покрытием.

Окрашивание и заключение срезов в бальзам.

Независимо от выбранного метода иммуногистохимического окрашивания перед окраской парафиновые срезы обязательно депарафинируются. Для этого их проводят по батарее из 3 ксилолов, 3 спиртов, в каждом по 5 минут и промывают в дистиллированной воде. Затем в водяной бане проводиться высокотемпературная демаскировка антигенов в демаскировочном буфере (чаще всего используют цитратный или Tris-EDTA) в течение 20 мин при температуре 97С.

После остывания срезов и промывки срезов, срезы обводят гидрофобным карандашом, инкубируют с перкосидазным блоком в течение 10 мин для блокирования эндогенной пероксидазы, для подавления фонового окрашивания срезы инкубируют 20 мин с протеиновым блоком.

Срезы инкубируют при комнатной температуре 30 минут с первичными антителами, Для иммуногистохимического окрашивания использовали антитела для иммунофенотипирования клеток инфильтрата - CD3 (маркер Т-лимфоцитов), CD45 (общий лейкоцитарный антиген), CD68 (маркер макрофагов); и антитела к вирусным антигенам - вирусу герпеса 1,2,6 типов, LMP антигену вируса Эпштейн-Барр, цитомегаловирусу, аденовирусу, парвовирусу В19, энтеровирусному антигену VP-1. Далее срезы инкубировали 15 минут с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Затем наносят раствор хромогена DAB на 1 минуту. Между всеми этапами иммуногистохимического окрашивания, начиная с демаскировки антигенов, срезы промывают в PBS буфере (рН 7,2).

Ядра докрашивают гематоксилином в течение 1 минуты. Срезы промываются в воде, регидратируют в спиртах и ксилолах по 2 минуты, заключают под покровное стекло.

Результат окрашивания: в клетках содержащих исследуемый маркер определяется коричневое гранулярное окрашивания цитоплазмы и /или ядра (в зависимости от типа маркера), ядра синие. Миокардит диагностировался при условии (СD45+)+(4CD68+)?14 клеток в 1мм2. (

3. Результаты исследований и обсуждение полученных результатов

Базой для написания дипломной работы послужила патологоанатомическое отделение НИИ кардиологии Томского НИМЦ с октября 2016 года по 1 июня 2017 года. За этот период были подготовлены к исследованию биоптаты миокарда от 62 пациентов. Из них 47 мужчин и 15 женщин в возрасте от 28 до 65 лет. Было установлено, что у мужчин частота выявления миокардитов по данным исследования эндомиокардиальных биоптатов, больше чем у женщин.

Более частое выявление миокардита у мужчин по данным биопсии миокарда в НИИ кардиологии можно объяснить тем, что у мужчин чаще встречаются клинически более тяжелые, требующие лечения в стационаре, формы миокардита.

Рисцнок 1. Оценка степени активности воспаления и выраженность фиброза при миокардите

Оценка биопсийного материала производилась на серийных гистологических срезах. В соответствии с консенсусом Всемирной Федерации Сердца 1997г для установления диагноза миокардит количество клеток воспаления должно быть не менее 14 на площади 1 мм2, из них должно быть не менее 10 лейкоцитов CD 45+ и не более 4 макрофагов CD 68+. Для оценки степени активности воспаления использовались следующие критерии: количество Т- лимфоцитов CD 3+ в 1мм2, некроз кардиомиоцитов и воспалительная инфильтрация эндокарда (таблица 1). Степень активности оценивают для выбора правильной терапевтической стратегии, решения вопроса о назначении иммуносупрессивных препаратов. Выраженность фиброза определяли по площади интерстициального фиброза, наличию субэндокардиального фиброза и фиброза эндокарда (таблица 1). Выраженность фиброза характеризует стадию хронизации воспаления и коррелирует с развитием тяжёлых аритмий и сердечной недостаточности.

Таблица 1. Оценка активности миокардита и степени выраженности фиброза (Cristina Basso et all 2012г)

	Параметры	0 [баллов]	1 [балл]	2 [балла]	3 [балла]
Grading [max балл - 5]	Некроз/дегенерация миоцитов	нет	очаговое	многоочаговое
	Интерстициальное воспаление	<7 [CD3+/ммІ]	7 - 14 [CD3+/ммІ]	>14 [CD3+/ммІ]
	Вовлечение эндокарда(воспаление и/или тромбоз)	нет	есть
Staging [max балл - 5]	Интерстициальный/заместительный фиброз	нет	10-20 % [площади среза]	20-40 % [площади среза]	>40% [площади среза]
	Субэндокардиальный фиброз	нет	есть
	Фиброэлестоз эндокарда	нет	есть

Кроме иммунофенотипирования клеток инфильтрата, иммуногистохимическое исследование позволяет выявить наличие вирусных антигенов в миокарде. В НИИ кардиологии для этой цели используют антитела к вирусам герпеса 1, 2, 6 типов, вирусу Эпштейн-Барр, цитомегаловирусу, аденовирусу, парвовирусу В19, энтеровирусному антигену VP1. В зависимости от разновидности вируса, вызвавшего миокардит назначаются специфические противовирусные препараты, либо иммуномодулирующая терапия.

Заключение

Опираясь на изученную литературу и проанализировав данные иммуногистохимического исследования биоптатов миокарда проводимых в патологоанатомическом отделении НИИ кардиологии Томского НИМЦ, можно сделать следующие выводы:

Иммуногистохимическое исследование эндомиокардиальной биопсии занимает основное место в диагностике миокардита. Исследование биоптатов позволяет оценить степень активности воспаления, выраженность фиброза миокарда, наличие вирусного генома в миокарде, установить этиологию заболевания.

Иммуногистохимическое исследование с выявлением специфических маркеров, таких как общий лейкоцитарный антиген (CD45), маркер Т-лимфоцитов (CD3), общий маркер макрофагов (CD68), увеличивает чувствительность выявления миокардита до 50%, т.е. значительно больше, чем обычные гистологические методы.

Окончательный, достоверный диагноз миокардита может быть установлен только по результатам гистологического и иммуногистохимического исследования биоптатов миокарда. Морфологическое изучение биоптатов позволяет, прежде всего, дифференцировать миокардит тяжелого течения и ДКМП (дилатационная кардиомиопатия).

Литература

1. Руководство иммуногистохимические методы Edited by - George L. Kumar, Lars Rudbeck. Русское издание под редакцией Г.А. Франка и П.Г. Малькова. Москва, 2011

2. Практическая иммуногистоцитохимия (методические рекомендации) В.Н. Эллиниди, Н.В. Аникеева, Н.А. Максимова. Санкт-Петербург 2002 год.

3. Библиотека патологоанатома. Научно- практический журнал. Л.Б. Митрофанова, В.Е. Карев. Миокардиты. Стандарты морфологической диагностики при аутопсии и эндомиокардиальной биопсии. Санкт- Петербург 2010 год.

4. С.В. Петров, Н.Т. Райхлин. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань «Титул» 2004 год.

5. B. Maisch, B. Bultman, S. Factor, et al., Конференции консенсуса Всемирной федерации сердца, определение воспалительной кардиомиопатии (миокардит): доклад двух экспертных комитетов по гистологии и вирусной кардиомиопатией, Heart beat 4 (1999) 3-4.

6. C. Basso, F. Calabrese, A. Angelini, E. Carturan, G. Thiene, Классификация и гистологические, Иммуногистохимическая и молекулярная диагностика воспалительного заболевания миокарда, сердечной недостаточности Rev. 18 (2013) 673-681.

Приложение

Рисунок 2. Диагноз миокардит. CD 45 (общий лейкоцитарный антиген), Ядра докрашивали гематоксилином

Рисунок 3. Диагноз миокардит. CD68 (маркер макрофагов)

Размещено на Allbest.ru

...