Изучение роли циркулирующих остеонектин-положительных клеток и эозинофильных гранулоцитов в возникновении рестеноза у пациентов, подвергшихся коронарному стентированию с помощью стентов с лекарственным покрытием

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Изучение роли циркулирующих остеонектин-положительных клеток и эозинофильных гранулоцитов в возникновении рестеноза у пациентов, подвергшихся коронарному стентированию с помощью стентов с лекарственным покрытием

14.01.05 - кардиология

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

кандидата медицинских наук

Имаева Асия Эмверовна

Москва - 2013 год



Работа выполнена в отделе проблем атеросклероза НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова, лаборатории стволовых клеток человека НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук Козлов Сергей Геннадьевич

доктор биологических наук Габбасов Зуфар Ахнафович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Аронов Давид Меерович

руководитель лаборатории кардиологической реабилитации ФГБУ «Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины» МЗ РФ

доктор медицинских наук, Фатхудинов Тимур Хайсамудинович

заведующий лабораторией регенеративной медицины ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова» МЗ РФ

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» МЗ РФ

Защита диссертации состоится « » тября2013г. в 13:30 на заседании диссертационного совета Д 208.073.04 по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ (Москва, 121552, ул. 3-я Черепковская, д.15а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.

Автореферат разослан « » октября 2013года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук Полевая Т.Ю.

остеонектин ишемический имплантация стент



Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Внедрение в клиническую практику стентов с лекарственным покрытием, обладающим антипролиферативным действием, и, как следствие этому, препятствующим развитию неоинтимальной гиперплазии, позволило снизить частоту развития рестеноза, однако, не решить проблему его возникновения. Несмотря на большое число исследований, посвященных проблеме возникновения рестеноза, патогенетические механизмы, касающиеся его развития, остаются плохо изученными.

В строме костного мозга обнаруживают, так называемые, клетки-предшественники. Эти клетки при определенных обстоятельствах способны активизироваться, поступать в кровоток и дифференцироваться в различные типы клеток. За последнее десятилетие появилось немало свидетельств тому, что клетки-предшественники играют определенную роль в восстановлении сосудистой стенки после ее повреждения [He T. и соавт., 2004, Stellos K. и соавт., 2007], а также в возникновении рестеноза [Patel S.D. и соавт., 2010]. Некоторыми исследователями было показано, что подобные клетки-предшественники могут экспрессировать на своей поверхности остеонектин - неколлагеновый гликопротеин костной ткани [Reed M.J. и соавт., 1993]. Имеются данные о возможном участии остеонектин-положительных клеток в клеточной пролиферации и регенерации поврежденных тканей [Reed M.J. и соавт., 1993, Porter P.L. и соавт., 1995]. Однако работы, касающиеся этой проблематике, немногочисленны, а их результаты носят противоречивый характер.

Восстановление сосудистой стенки сопровождается активацией различных клеточных популяций, в том числе клеток крови. В последние годы высказано предположение о том, что одной из возможных причин возникновения рестеноза после имплантации стентов с лекарственным покрытием может являться аллергическая реакция на полимерное покрытие стентов - процесс, в котором эозинофилы играют важную роль [Niccoli G. и соавт., 2010]. Была продемонстрирована массивная инфильтрация клетками воспаления, включая эозинофилы, стенки коронарной артерии в месте развития рестеноза после имплантации стента, покрытого сиролимусом [Hao H. и соавт., 2011]. Показана связь между уровнем эозинофильного катионного белка (ЭКБ) - маркера активации эозинофилов и развитием серьёзных неблагоприятных сердечно-сосудистых событий после имплантации стентов с лекарственным покрытием [Niccoli G. и соавт., 2009]. В то же время, исследования, посвященные данной проблеме, немногочисленны, что определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования. Изучение роли циркулирующих остеонектин-положительных клеток и эозинофильных гранулоцитов в развитии рестеноза после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

Задачи исследования.

1.Исследовать уровень циркулирующих остеонектин-положительных клеток у больных ИБС с рестенозом после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

2.Исследовать уровень эозинофильных гранулоцитов у пациентов с ИБС, у которых возник рестеноз после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом.

3.Исследовать уровень эозинофильного нейротоксина у пациентов, у которых возник рестеноз после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом.

4.Изучить уровень ЭКБ у больных ИБС с рестенозом после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

5.Проанализировать динамику уровня ЭКБ в течение года после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка роли эозинофильных гранулоцитов в возникновении рестеноза у больных ИБС после имплантации стентов с лекарственным покрытием, показано различие в уровне эозинофилов у пациентов с рестенозом и у больных без рестеноза после эндоваскулярного вмешательства. Выявлено повышение уровня ЭКБ - маркера активации эозинофилов у пациентов с рестенозом после имплантации стентов с лекарственным покрытием. Впервые изучена динамика уровня ЭКБ после коронарного стентирования. Показано ее отличие у пациентов, у которых эндоваскулярная реваскуляризация миокарда была осуществлена с помощью стентов с лекарственным покрытием, в сравнении с больными, у которых коронарное стентирование было проведено с помощью стентов без лекарственного покрытия. Выявлено, что повышение уровня ЭКБ происходит через 6-12 месяцев после осуществленного вмешательства.

Практическая значимость. Данные, полученные в процессе исследования, свидетельствуют об участии эозинофильных гранулоцитов в возникновении рестеноза у больных после имплантации стентов с лекарственным покрытием. Выявление связи между развитием рестеноза и повышением уровня ЭКБ позволяет рекомендовать его измерение для прогнозирования возникновения рестеноза.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в научную и практическую работу отдела проблем атеросклероза НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.

Апробация работы. Материалы доложены на заседании межотделенческой конференции НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова и НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 170 отечественных и зарубежных источников. Диссертация содержит 9 таблиц, 25 рисунков.



Клиническая характеристика и методы исследования больных

Под наблюдением находилось 170 больных с хроническими формами ИБС, обоего пола, в возрасте от 35 до 75 лет, в том числе 80 пациентов, которым в течение первого года после имплантации стентов с лекарственным покрытием (сиролимус, эверолимус или зотаролимус) была проведена коронароангиография (КАГ); 75 больных, впервые подвергшихся коронарному стентированию, а также 15 пациентов с документированной посредством КАГ ИБС.

В исследование не включали пациентов с нестабильной стенокардией, в первые 2 месяца после перенесенного инфаркта миокарда, с острым нарушением мозгового кровообращения, операцией коронарного шунтирования в анамнезе, ангиопластикой по поводу рестеноза в анамнезе, снижением фракции выброса левого желудочка менее 40%, застойной сердечной недостаточностью, повышением уровня креатинина в крови более 150 мкмоль/л, системными и тяжелыми хроническими заболеваниями, клиническими и лабораторными признаками острого инфекционного заболевания, увеличением количества эозинофилов в крови более 700 клеток в мкл.

Рестенозом считали возникновение стеноза в ранее стентированном сегменте (внутри стента и на 5 мм дистальнее или проксимальнее стента), уменьшающего просвет коронарной артерии более чем на 50% по диаметру.

Исследование состояло из трех последовательно выполненных этапов, результаты каждого из них явились предпосылкой для проведения следующего этапа. На первом этапе была изучена связь между уровнем циркулирующих остеонектин-положительных клеток, а также полиморфноядерных лейкоцитов и развитием рестеноза после имплантации стентов с лекарственным покрытием. В исследование были включены пациенты с ИБС, обоего пола, которым в течение первого года после коронарного стентирования была в плановом порядке проведена КАГ, по результатам которой больные были разделены на 2 группы. В первую группу вошли 20 больных, у которых было отмечено возникновение рестеноза, в группу контроля - 28 пациентов без рестеноза. У пациентов обеих групп было проведено сопоставление уровня в крови циркулирующих остеонектин-положительных клеток и полиморфно-ядерных лейкоцитов.

На втором этапе был изучен уровень ЭКБ, а также эозинофильного нейротоксина у больных с рестенозом после имплантации стентов покрытых лекарственным препаратом. В исследование были включены пациенты с ИБС обоего пола, которым в течение первого года после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов с лекарственным покрытием была в плановом порядке проведена КАГ, на основании результатов которой больные, подвергшиеся ранее коронарному стентированию, были разбиты на 2 группы. В первую группу вошли 13 больных, у которых было отмечено возникновение рестеноза, в группу контроля - 19 пациентов без рестеноза. Вторую группу контроля составили 15 больных с верифицированным посредством КАГ диагнозом ИБС, но не подвергавшихся ранее эндоваскулярной реваскуляризации миокарда. Необходимость создания второй группы контроля обоснована отсутствием данных об уровне ЭКБ в крови пациентов с ИБС, которым коронарное стентирование ранее не проводилось. У пациентов всех групп было проведено измерение уровня в крови ЭКБ, эозинофильного нейротоксина, высокочувствительного С-реактивного белка (вч-СРБ), иммуноглобулина E (Ig E), а также проведено сопоставление уровня этих показателей среди пациентов с рестенозом, без рестеноза и контрольной группы.

Заключительным этапом исследования стала оценка динамики уровня ЭКБ в течение одного года после коронарного стентирования. В исследование было включено 75 пациентов, в том числе 60 больных, которым в плановом порядке были имплантированы 78 стентов, покрытых лекарственным препаратом, и 15 пациентов, которым были установлены 20 стентов без лекарственного покрытия. У всех больных перед стентированием, на первый, третий и седьмой день, а также через 2, 6 и 12 месяцев после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда был определен в крови уровень ЭКБ, Ig E и вч-СРБ. Проведено сопоставление уровня этих показателей среди пациентов, которым были имплантированы стенты с лекарственным покрытием, и у больных, которым были имплантированы стенты без лекарственного покрытия.

Количество остеонектин-положительных лимфоцитоподобных клеток определяли с использованием комбинации трех антител: ON-FITC/CD41-PE/CD45-PC5 [(поликлональных кроличьи антитела к остеонектину человека (ON-FITC, ИМТЕК, Россия); меченые фикоэритрином (PE) моноклональные антитела к CD41 человека (CD41-РЕ, Beсton Dickinson, США); меченые r-фикоэритрин-цианином 5:1 (PC5) моноклональные антитела к CD45 человека (CD45-PC5, Beckman Coulter, США)]. На графике зависимости бокового рассеивания от прямого рассеивания выделяли область (гейт) лимфоцитоподобных клеток (гейт R1, рис. 1 А). Далее среди лимфоцитоподобных клеток выделяли популяцию клеток с положительной флуоресценцией по CD45 PC5 и отсутствием флуоресценции по CD41 PE (гейт R2, рис. 1 Б). Данная процедура позволила нам исключить из анализа агрегаты тромбоцитов и фрагменты клеток. Среди выделенных CD45-положительных клеток на графике зависимости бокового рассеяния света от интенсивности флуоресценции ON-FITC определяли количество остеонектин-положительных клеток (гейт R3, рис. 1 В).



Рис. 1. Гистограммы, демонстрирующие этапы определения остеонектин-положительных клеток в периферической крови пациентов. А - выделение популяции лимфоцитоподобных клеток на диаграмме зависимости бокового рассеивания от прямого рассеивания (гейт R1). Б - анализ клеток гейта R1 для выделения популяции клеток, экспрессирующих CD45 (гейт R2). В - анализ CD45-положительных клеток гейта R2 для выделения остеонектин-положительных клеток (гейт R3).

Клеточный состав и количество клеток популяции лейкоцитов определяли c помощью автоматического гематологического анализатора Cell-Dyn 3500 (Abbott, США) по стандартной методике.

Количество эозинофилов в крови определяли по результатам, полученным на двух различных приборах: на автоматическом гематологическом анализаторе Cell-Dyn 3500 (Abbot Ltd, США) и на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США). Для этого были выполнены следующие действия:

1. С помощью автоматического гематологического анализатора Cell-Dyn 3500В определяли общее количество лейкоцитов в исследуемой пробе крови.

2. В той же пробе крови с помощью проточного цитофлуориметра FACS Calibur по параметрам светорассеяния клеток определяли процентное содержание CD45+ гранулоцитов с высоким уровнем автофлуоресценции (автофлуоресценция+/CD45+).

3. По данным этих двух измерений вычисляли концентрацию эозинофильных гранулоцитов крови в 1 мкл.

Уровень ЭКБ определяли:

1. Иммуноферментным методом на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 (DPC-Siemens, США) - с использованием набора «Immulite-1000 ECP» (Siemens Healthcare, Великобритания);

2. С помощью измерения коэффициента поглощения на медицинском анализаторе Униплан (ПИКОН, Россия) - в соответствии с рекомендациями к набору «ECP ELISA Kit» (MBS, США).

Определение уровня эозинофильного нейротоксина в плазме крови проводили с помощью измерения коэффициента поглощения на медицинском анализаторе Униплан (ПИКОН, Россия) в соответствии с рекомендациями к набору «EDN ELISA Kit» (MBL, Япония).

Определение уровня С-реактивного белка проводили на автоматическом лазерном нефелометре BN-proSpec (Dade-Behring, Германия) высокочувствительным нефелометрическим методом, уровня Ig Е - на автоматическом хемилюминесцентном анализаторе Immulite-1000 (DPC-Siemens, США) иммуноферментным методом.

Статистический анализ проведен с помощью программного пакета «STATISTICA 6».

Результаты исследования и их обсуждение

Уровень циркулирующих остеонектин-положительных клеток и полиморфно-ядерных лейкоцитов у больных с рестенозом после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом.

Клиническая характеристика больных, вошедших в исследование, представлена в таблице 1. Пациенты, у которых возник рестеноз после имплантации стентов с лекарственным покрытием, и больные, у которых рестеноза не было выявлено, не отличались по возрасту, соотношению мужчин и женщин, курящих и некурящих, а также наличию гиперлипидемии и сахарного диабета (СД). Количество больных со стенокардией II-IV функционального класса было сопоставимым в обеих группах. Равное количество пациентов имели постинфарктный кардиосклероз и артериальную гипертонию. У больных обеих групп одинаково часто встречалось поражение одной, двух и трех магистральных коронарных артерий.

У больных обеих групп одинаково часто осуществлялось стентирование передней нисходящей, огибающей и правой коронарной артерии (таблица 2). Одинаково часто осуществлялось стентирование бифуркационных стенозов, окклюзий, протяженных стенозов, артерий малого диаметра. Пациенты обеих групп не отличались по должному диаметру артерий в месте установки стента.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных, у которых после имплантации стентов с лекарственным покрытием был исследован уровень циркулирующих остеонектин-положительных клеток и полиморфно-ядерных лейкоцитов

Показатель	Пациенты с рестенозом (n=20)	Пациенты без рестеноза (n=28)	p
Возраст, лет	58 (49-63)	60 (54-67)	1,00
Мужчины/женщины	17 (85%)/3 (15%)	23 (82%)/5 (18%)	1,00
Стенокардия II ФК	6 (30%)	8 (29%)	1,00
Стенокардия III ФК	10 (50%)	13 (46%)	1,00
Стенокардия IV ФК	2 (10%)	3 (11%)	1,00
Инфаркт миокарда в анамнезе	11 (55%)	13 (46%)	0,77
Артериальная гипертония	14 (70%)	23 (82%)	0,49
Курение	10 (50%)	12 (43%)	0,77
Сахарный диабет	2 (10%)	9 (32%)	0,09
Гиперлипидемия	20 (100%)	28 (100%)	1,00
Общий ХС (ммоль/л)	4,54 (4,17; 5,27)	4,41 (4,22; 5,45)	0,87
ХС ЛНП (ммоль/л)	3,16 (2,43; 4,16)	3,07 (2,38; 3,91)	0,23
Поражение 1 МКА	5 (25%)	8 (29%)	1,00
Поражение 2 МКА	8 (40%)	11 (39%)	1,00
Поражение 3 МКА	7 (35%)	9 (32%)	1,00

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов (% от общего числа). Биохимические показатели крови представлены в виде медианы (25; 75 процентиль).

Таблица 2. Ангиографическая характеристика больных, у которых был исследован уровень циркулирующих остеонектин-положительных клеток и полиморфно-ядерных лейкоцитов после имплантации стентов с лекарственным покрытием

Показатель	Пациенты с рестенозом (n=20)	Пациенты без рестеноза (n=28)	p
ПНА	7 (35%)	11 (39%)	1,00
ОА	7 (35%)	9 (32%)	1,00
ПКА	14 (70%)	16 (57%)	0,55
Бифуркационный стеноз	6 (30%)	8 (29%)	1,00
Окклюзия	1 (5%)	2 (7%)	1,00
Протяженность стеноза >20 мм	3 (15%)	4 (14%)	1,00
Диаметр артерии ?2,75 мм	6 (30%)	9 (32%)	1,00
Должный диаметр артерии, мм	2,76 (2,56; 2,79)	2,78 (2,55; 2,89)	0,79

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов (% от общего числа). Должный диаметр артерии представлен в виде медианы (25; 75 процентиль).

Медиана (25; 75 процентиль) уровня остеонектин-положительных клеток в крови больных ИБС, у которых после имплантации стентов с лекарственным покрытием возник рестеноз, составила 1,9 (1,1; 2,5) клеток в мкл, что достоверно не отличалось от медианы уровня остеонектин-положительных клеток в крови пациентов без рестеноза, которая равнялась 1,8 (1,2; 2,7) клеток в мкл (р=0,76). (Рис. 2).

Рис. 2. Уровень остеонектин-положительных клеток в крови больных ИБС после имплантации стентов с лекарственным покрытием. Примечание. 1 - пациенты без рестеноза (n=28); 2 - пациенты с рестенозом (n=20). Mann-Whitney U-test, p = 0,76.

При проведении методом проточной цитофлуориметрии детального анализа состава клеточных субпопуляций лимфоцитоподобных клеток (CD45-положительные лейкоциты) крови больных ИБС в некоторых экспериментах были выявлены клетки, обладающие интенсивной автофлуоресценцией по каналу FL-1. В крови пациентов с рестенозом было обнаружено большее, чем в крови больных без рестеноза, количество клеток с интенсивной автофруоресценцией (рис. 3). Анализ данных литературы показал, что подобная автофлуоресценция характерна для эозинофильных гранулоцитов и связана с интенсивным свечением специфических цитоплазматических гранул эозинофилов, даже в том случае, когда клетки не окрашены флуоресцентными зондами [Weil G.J., Chused T.M. 1981, Thurau A.M., et. al. 1996]. Предположение о том, что обнаруженная нами популяция клеток с интенсивной автофлуоресценцией является эозинофильными гранулоцитами, было подтверждено специалистами из ФГБУ «Гематологический Научный Центр МЗ РФ». После проведения дополнительных исследований, в том числе, выделении подобных клеток на оснащенном клеточным сортером проточном цитофлуориметре, фиксации их на стекле и окрашивании по Романовскому-Гимзе, было дано заключение, что полученная суспензия клеток на 99% состоит из эозинофильных гранулоцитов.

Рис. 3. Гистограммы зависимости интенсивности флуоресценции лейкоцитов, меченных антителами к CD45, по каналу FL-3 (СD45-PC5) от интенсивности автофлуоресценции лейкоцитов по каналу FL-1. А - лейкоциты, полученные из крови пациентов, у которых развился рестеноз. Б - лейкоциты, полученные из крови пациентов без рестеноза. Гейты R1 и R2 содержат CD45- положительные клетки с интенсивной автофлуоресценцией.

Полученные данные послужили поводом для более детального анализа лейкоцитарной формулы пациентов, у которых после имплантации стентов с лекарственным покрытием развился рестеноз. Уровень лейкоцитов в крови больных был проанализирован с помощью гематологического анализатора Cell-DYN 3500. Пациенты обеих групп не отличались по общему количеству лейкоцитов, а также по уровню нейтрофильных и базофильных гранулоцитов. Однако количество эозинофильных гранулоцитов в крови пациентов, у которых развился рестеноз, было достоверно больше (р=0,03), чем в крови больных без рестеноза (таблица 3).



Таблица 3. Уровень лейкоцитов в крови больных ИБС, которым в течение предшествующего года были имплантированы стенты с лекарственным покрытием

Показатель	Пациенты с рестенозом (n=20)	Пациенты без рестеноза (n=28)	p
Лейкоциты, тыс. кл./мкл	7.42 (6,58; 8,66)	7.53 (6,60; 8,51)	0,85
Нейтрофильные гранулоциты, тыс. кл./мкл	3.97 (3,04; 4,31)	4.38 (3,68; 4,89)	0,31
Базофильные гранулоциты, кл./мкл	80 (57; 124)	75 (60; 84)	0,42
Эозинофильные гранулоциты кл./мкл	244 (205, 270)	160 (107; 206)	0,03

Примечание. Данные представлены в виде медианы (25; 75 процентиль). Mann-Whitney U-test.

Обнаруженное с помощью гематологического анализатора различие в уровне эозинофильных гранулоцитов в крови больных с рестенозом и без рестеноза побудило провести более детальный анализ состава различных субпопуляций ядросодержащих клеток крови (CD45-положительных лейкоцитов) методом проточной цитофлуориметрии. Было выявлено, что количество эозинофильных гранулоцитов с высоким уровнем автофлуоресценции в крови пациентов, у которых после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом, развился рестеноз, значительно выше, чем в крови пациентов без рестеноза (рис. 4). Медиана (25; 75 процентиль) уровня эозинофилов в крови пациентов с рестенозом составила 272 (234; 292) клеток в мкл, в то время, как в крови больных без рестеноза - 134 (85; 156) клеток в мкл (p=0,002).



Рис. 4. Уровень эозинофильных гранулоцитов в крови больных после имплантации стентов с лекарственным покрытием. Примечание. 1 - пациенты без рестеноза (n=28); 2 - пациенты с рестенозом (n=20). Mann-Whitney U-test, p<0,001.

По уровню эозинофилов в периферической крови пациенты, подвергшиеся коронарному стентированию с помощью стентов с лекарственным покрытием, были разделены на 2 группы. В первую группу вошли 24 больных с уровнем эозинофилов в крови ниже (<174 клеток в мкл) медианы распределения, во вторую группу - 24 пациентов с уровнем эозинофилов в крови выше (>174 клеток в мкл) медианы распределения (рис. 5). У больных обеих групп не было выявлено достоверных отличий в возрасте, соотношении мужчин и женщин, курящих и некурящих, наличии постинфарктного кардиосклероза, гиперлипидемии, артериальной гипертонии, сахарного диабета. Пациенты обеих групп не отличались по ангиографической характеристике. Среди больных с уровнем эозинофилов крови ниже медианы распределения рестеноз возник у 1 (4%) пациента, что было достоверно меньше (p<0,001), чем во второй группе, где рестеноз был выявлен у 19 (76%) пациентов.

Участие эозинофилов в возникновении рестеноза было продемонстрировано так же другими исследователями. В том числе, в работе Hao H. и соавт. (2011 г.) была обнаружена массивная инфильтрация клетками воспаления, включая эозинофилы, стенки коронарной артерии в месте развития рестеноза после имплантации стента, покрытого сиролимусом.

Рис. 5. Развитие рестеноза в зависимости от уровня эозинофилов в крови. 1 - пациенты с уровнем эозинофилов менее 174 клеток в мкл; 2 - пациенты с уровнем эозинофилов более 174 клеток в мкл. Mann-Whitney U-test, p<0,001.

Выявленное на первом этапе исследования различие в уровне эозинофилов в крови пациентов, у которых возник рестеноз после имплантации стентов с лекарственным покрытием, и у больных, у которых рестеноза не было выявлено, поставило вопрос о том, что находятся ли эозинофилы у пациентов с рестенозом в активном состоянии или нет? Гранулы эозинофилов содержат уникальные основные протеины, к которым относятся большой основной белок, эозинофильная пероксидаза, ЭКБ и эозинофильный нейротоксин. По наличию на поверхности эозинофильных гранулоцитов уникальных катионных белков или по их уровню в крови можно количественно определять активацию эозинофилов. На втором этапе исследования была изучена связь между уровнем секретируемого эозинофилами катионного белка, а также эозинофильного нейротоксина, и развитием рестеноза после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

Уровень ЭКБ и эозинофильного нейротоксина у больных с рестенозом после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

Клиническая характеристика больных, вошедших в исследование, представлена в таблице 4. Пациенты всех трех групп не отличались между собой по возрасту, соотношению мужчин и женщин, курящих и некурящих. Количество больных со стенокардией II-IV функционального класса было сопоставимым во всех группах. Равное количество пациентов имели постинфарктный кардиосклероз, артериальную гипертонию, гиперлипидемию и СД. У всех больных на момент включения в исследование были достигнуты целевые значения артериального давления. Одинаково часто встречалось поражение одной, двух и трех магистральных коронарных артерий. У всех больных СД 2 типа компенсация углеводного обмена осуществлялась с помощью диеты и гипогликемических препаратов для приема внутрь и на момент проведения операции все пациенты имели компенсированный углеводный обмен. Ангиографическая характеристика пациентов обеих групп представлена в таблице 5.

Таблица 4. Клиническая характеристика больных, у которых был исследован уровень ЭКБ и эозинофильного нейротоксина после имплантации стентов с лекарственным покрытием

Показатель	Пациенты с рестенозом (n=13)	Пациенты без рестеноза (n=19)	Пациенты с ИБС (n=15)	р
Возраст, лет	60 (40-73)	59 (48-75)	54 (47-63)	0,52
Мужчины/женщины	11 (85%)/ 2(15%)	18 (95%)/ 1(5%)	13 (87%)/ 2(13%)	0,61
Стенокардия II ФК	7 (54%)	8 (42%)	8 (53%)	0,74
Стенокардия III ФК	4 (30%)	8 (42%)	3 (20%)	0,61
Стенокардия IV ФК	1 (7%)	1 (5%)	0 (0%)	0,58
Инфаркт миокарда в анамнезе	9 (69%)	10 (52%)	8 (53%)	0,60
Артериальная гипертония	10 (76%)	14 (74%)	11 (73%)	0,82
Гиперлипидемия	9 (69%)	13 (68%)	9 (60%)	0,99
Общий ХС, ммоль/л	4,34 (4,17; 5,27)	4,27 (4,11; 5,43)	4,51(4,02; 5,67)	0,17
ХС ЛНП, ммоль/л	3,06 (2,43; 4,2)	3,24 (2,23; 4,05)	3,13(2,18; 3,81)	0,34
Курение	5 (38%)	8 (42%)	5 (33%)	0,87
Сахарный диабет	3 (23%)	4 (21%)	2 (13%)	0,78
Поражение 1 МКА	6 (46%)	8 (42%)	8 (53%)	0,81
Поражение 2 МКА	5 (39%)	7 (37%)	5 (34%)	0,96
Поражение 3 МКА	2 (15%)	4 (21%)	2 (13%)	0,82

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов (% от общего числа). Биохимические показатели крови представлены в виде медианы (25; 75 процентиль).

Таблица 5. Ангиографическая характеристика больных, у которых был исследован уровень ЭКБ и эозинофильного нейротоксина после имплантации стентов с лекарственным покрытием

Показатель	Пациенты с рестенозом (n=13)	Пациенты без рестеноза (n=19)	P
Стентирование ПНА	7 (54%)	9 (47%)	1,00
Стентирование ОА	5 (38%)	6 (32%)	0,72
Стентирование ПКА	8 (62%)	10 (53%)	0,73
Бифуркационный стеноз	1 (8%)	2 (11%)	1,00
Окклюзия	1 (8%)	1 (5%)	1,00
Протяженность стеноза >20 мм	4 (31%)	6 (32%)	1,00
Должный диаметр артерии ?2,75 мм	3 (23%)	3 (16%)	0,67
Должный диаметр артерии, мм	2,79 (2,49; 2,92)	2,82 (2,48; 2,99)	0,74

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов. Должный диаметр артерии, минимальный диаметр артерии, % стеноза представлены в виде медианы (25; 75 процентиль).

Больным обеих групп одинаково часто проводили стентирование передней нисходящей, огибающей и правой коронарной артерии, протяженных (>20 мм) стенозов, артерий малого (<2,75 мм) диаметра, окклюзий, а также бифуркационных стенозов. Пациенты обеих групп не отличались по должному диаметру артерий в месте установки стента.

Медиана (25; 75 процентиль) уровня ЭКБ в плазме крови пациентов, у которых возник рестеноз, была статистически значимо выше (p=0,017), чем у больных без рестеноза и у пациентов контрольной группы (таблица 6, рис. 6). В то же время, медиана уровня (25; 75 процентиль) ЭКБ у пациентов без рестеноза достоверно не отличалась (p=0,336) от аналогичного показателя у пациентов контрольной группы. Достоверных отличий в уровне эозинофильного нейротоксина, вч-СРБ и Ig E в крови пациентов всех трех групп не было обнаружено.

Таблица 6. Уровень ЭКБ и эозинофильного нейротоксина в крови больных ИБС, подвергшихся эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов с лекарственным покрытием

Показатель	Пациенты с рестенозом (n=13)	Пациенты без рестеноза (n=19)	Пациенты без стентирования (n=15)	Р
Эозинофильный катионный белок, нг/мл	17,7 (11,2; 24)	9 (6,4; 12,9)	8,5 (6,6; 10,9)	0,02
Эозинофильный нейротоксин, нг/мл	9 (8,5; 17,6)	9,3 (6; 22)	8,8 (6,2; 19,2)	0,76
Ig E, кЕ/л	58,8 (42,1; 164)	52,9 (12,8; 76,1)	56,3 (34,2; 98,2)	0,62
вч-СРБ, мг/л	2,38 (0,3; 4,08)	1,63 (0,61; 2,47)	2,31 (0,42; 2,94)	0,12

Примечание. Данные представлены в виде медианы (25; 75 процентиль), Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks.

По уровню ЭКБ в плазме крови пациенты, подвергшиеся коронарному стентированию, были разделены на 2 группы. В первую группу вошли 16 больных с уровнем ЭКБ ниже медианы распределения (<11 нг/мл), во вторую группу - 16 пациентов с уровнем ЭКБ выше медианы распределения (>11 нг/мл). У больных обеих групп не было выявлено достоверных отличий в возрасте, соотношении мужчин и женщин, курящих и некурящих, наличии постинфарктного кардиосклероза, гиперлипидемии, артериальной гипертонии, СД. Пациенты обеих групп не отличались по ангиографической характеристике.

Рис. 6. Уровень ЭКБ в крови пациентов с ИБС, 1 - которым стентирование не проводилось (n=15), 2 - больных без рестеноза (n=19) и 3 - пациентов, у которых возник рестеноз после имплантации стентов с лекарственным покрытием (n=13). Kruskal-Wallis ANOVA by Ranks, p <0,05.

Среди больных с уровнем ЭКБ в крови ниже медианы распределения рестеноз был обнаружен у 3 (19%) пациентов, что было достоверно ниже, чем у больных с уровнем ЭКБ выше медианы распределения, среди которых рестеноз был выявлен у 10 (63%) пациентов (рис. 7).



Рис. 7. Возникновение рестеноза у пациентов с ИБС в зависимости от уровня ЭКБ в плазме крови. 1 - больные с уровнем ЭКБ <11 нг/мл; 2 - пациенты с уровнем ЭКБ >11 нг/мл. Mann-Whitney U-test, p=0,019.

По результатам однофакторного логистического регрессионного анализа, было выявлено, что единственным показателем, продемонстрировавшим ассоциацию с развитием рестеноза, был ЭКБ (ОШ=7,29, 95% ДИ 1,39-4,71, р=0,01). После коррекции на такие факторы риска, как наличие СД, уровень вч-СРБ, протяженность стеноза более 20 мм и диаметр артерии менее 2,75 мм достоверность сохранялась (ОШ корр.=3,87, 95% ДИ 1,08-2,97, р=0,03).

Следует отметить, что подъем уровня ЭКБ не был связан ни с интенсивностью воспалительного процесса, который определялся по уровню вч-СРБ, ни с развитием Ig E-зависимой аллергической реакции.

Связь между уровнем эозинофильного катионного белка и развитием серьёзных неблагоприятных сердечно-сосудистых событий (повторная реваскуляризация миокарда, инфаркт миокарда или смерть от ИБС) после имплантации стентов с лекарственным покрытием была продемонстрирована в исследовании Niccoli G. и соавт. (2009).

Выявление связи между возникновением рестеноза и уровнем ЭКБ у пациентов после имплантации стентов с лекарственным покрытием явилось предпосылкой к проведению исследования по оценке динамики ЭКБ после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда.

Динамика уровня ЭКБ после имплантации стентов с лекарственным покрытием.

Клиническая характеристика пациентов, вошедших в исследование, представлена в таблице 7. Пациенты обеих групп не отличались по возрасту, соотношению мужчин и женщин, курящих и некурящих. Количество больных со стенокардией II-IV ФК было сопоставимым в обеих группах. Равное количество больных имели постинфарктный кардиосклероз, артериальную гипертонию, гиперлипидемию и СД. У всех больных на момент включения в исследование были достигнуты целевые значения артериального давления. У больных обеих групп одинаково часто встречалось поражение одной, двух и трех магистральных коронарных артерий. У всех больных СД 2 типа компенсация углеводного обмена осуществлялась с помощью диеты и гипогликемических препаратов для приема внутрь и на момент проведения операции все пациенты имели компенсированный углеводный обмен.

Ангиографическая характеристика представлена в таблице 8. У больных обеих групп одинаково часто осуществлялось стентирование передней нисходящей, огибающей и правой коронарной артерии. Одинаково часто осуществлялось стентирование окклюзий и артерий малого диаметра. Пациенты обеих групп не отличались по должному диаметру артерий в месте установки стента. У больных, которым были имплантированы стенты с лекарственным покрытием, чаще проводили стентирование протяженных и бифуркационных стенозов.



Таблица 7. Клиническая характеристика больных, у которых была исследована динамика уровня ЭКБ после имплантации стентов.

Показатель	С лекарственным покрытием (n=60)	Без лекарственного покрытия (n=15)	P
Возраст, лет	56 (42-71)	62 (59-68)	0,97
Мужчины/женщины	42 (70%)/18(30%)	10 (67%)/5(33%)	0,77
Стенокардия II ФК	24 (40%)	7 (47%)	0,77
Стенокардия III ФК	24 (40%)	5 (33%)	0,77
Стенокардия IV ФК	3 (5%)	0 (0%)	0,89
Инфаркт миокарда в анамнезе	13 (22%)	5 (33%)	0,34
Артериальная гипертония	38 (62%)	11 (73%)	0,56
Гиперлипидемия	40 (67%)	13 (87%)	0,21
Общий ХС, ммоль/л	4,36 (4,07; 5,17)	4,71 (4,12; 5,5)	0,71
ХС ЛНП, ммоль/л	3,16 (2,43; 4,2)	3,03 (2,38; 3,81)	0,56
Курение	21 (35%)	2 (13%)	0,13
Сахарный диабет	10 (17%)	0 (0%)	0,20
Поражение 1 МКА	26 (43%)	9 (60%)	0,27
Поражение 2 МКА	28 (47%)	6 (40%)	0,77
Поражение 3 МКА	6 (10%)	0 (0%)	0,34

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов (% от общего числа). Биохимические показатели крови представлены в виде медианы (25; 75 процентиль).

Таблица 8. Ангиографическая характеристика больных, у которых была исследована динамика уровня ЭКБ после имплантации стентов

Показатель	С лекарственным покрытием (n=60)	Без лекарственного покрытия (n=15)	P
Стентирование ПНА	24 (40%)	7 (47%)	0,77
Стентирование ОА	15 (25%)	2 (13%)	0,50
Стентирование ПКА	27 (45%)	6 (40%)	0,78
Бифуркационный стеноз	12 (20%)	0 (0%)	0,03
Окклюзии	6 (10%)	0 (0%)	0,33
Протяженность стеноза >20 мм	13 (22%)	0 (0%)	0,03
Диаметр артерии ?2,75 мм	6 (10%)	0 (0%)	0,34
Должный диаметр артерии, мм	2,80 (2,71; 2,88)	2,83 (2,77; 2,92)	0,65

Примечание. Данные представлены в виде абсолютного числа пациентов. Должный диаметр артерии представлен в виде медианы (25; 75 процентиль).

Медиана (25; 75 процентиль) уровня ЭКБ перед имплантацией стентов с лекарственным покрытием составила 7,8 (6,4; 8,7) нг/мл (рис. 8). Медиана (25; 75 процентиль) уровня ЭКБ на первый, третий, седьмой день, а также через 2 месяца после стентирования достоверно не отличалась и равнялась 7,9 (6,2; 8,9), 7,6 (5,6; 8,4), 7,5 (5,6; 8,3) и 7,3 (6,55; 8,6) нг/мл, соответственно. Медиана (25; 75 процентиль) уровня ЭКБ через 6 месяцев после имплантации стентов с лекарственным покрытием была достоверно выше (р=0,04) исходного значения и составила 8,6 (7,3; 9,7) нг/мл. В последующем отмечено еще большее увеличение уровня ЭКБ. Медиана (25; 75 процентиль) его уровня через 12 месяцев после коронарного стентирования составила 12,5 (10,1; 14,6) нг/мл, что было достоверно выше уровня ЭКБ через 6 месяцев после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда (p=0,001).

Медиана (25; 75 процентиль) уровня ЭКБ перед имплантацией стентов без лекарственного покрытия составила 7,2 (6,5; 9,5) нг/мл и достоверно не отличалась от медианы исходного уровня ЭКБ пациентов, которым были имплантированы стенты с лекарственным покрытием. Достоверной динамики уровня ЭКБ в крови после имплантации стентов без лекарственного покрытия обнаружено не было в течение всего периода наблюдения. Больные после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов с лекарственным покрытием имели в сравнении с пациентами, которым были имплантированы стенты без лекарственного покрытия, более высокий уровень ЭКБ через 6 (р=0,01) и 12 (р=0,001) месяцев наблюдения.



Рис. 8. Динамика уровня ЭКБ в крови больных в течение первого года после стентирования. 1 - уровень ЭКБ после имплантации стентов покрытых лекарственным препаратом, 2 - уровень ЭКБ после имплантации стентов без лекарственного покрытия. Mann-Whitney U-test.

Повышение уровня ЭКБ после имплантации стентов с лекарственным покрытием не было связано с интенсивностью локального воспалительного ответа, который определялся по уровню вч-СРБ в крови. Медиана (25; 75 процентиль) его уровня на первый день после имплантации стентов с лекарственным покрытием составила 4,2 (3,09; 5,73) мг/л и была достоверно выше (p=0,001) его исходного значения, который был равен 1,33 (0,98, 2,55) мг/л (рис. 9). На третий день после стентирования уровень вч-СРБ вернулся к исходному. В последующем достоверной динамики его уровня не было выявлено. Пациенты, которым были имплантированы стенты без лекарственного покрытия, имели идентичный с больными, которым эндоваскулярная реваскуляризация миокарда была осуществлена с помощью стентов с лекарственным покрытием, исходный уровень вч-СРБ. Медиана (25; 75 процентиль) его уровня на первый день после имплантации стентов с лекарственным покрытием составила 4,82 (3,38; 6,35) мг/л и была достоверно выше (p=0,001) его исходного значения, который был равен 1,06 мг/л (0,59; 2,23) мг/л. На третий и на седьмой день после стентирования отмечено прогрессивное снижение уровня вч-СРБ, который составил, соответственно, 2,61 (2,35; 3,46) и 2,27 (1,12; 2,87) мг/л. В последующем уровень вч-СРБ вернулся к исходным значениям и его достоверной динамики не было выявлено.

Рис. 9. Динамика уровня вч-СРБ в крови больных ИБС в течение первого года после стентирования. 1 - уровень вч-СРБ после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом. 2 - уровень вч-СРБ после имплантации стентов без лекарственного покрытия. Mann-Whitney U-test.

Различий в исходном уровне Ig E и его достоверной динамики в крови больных, как после имплантации стентов с лекарственным покрытием, так и после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов без лекарственного покрытия, обнаружено не было в течение всего периода наблюдения (рис.10).



Рис. 10. Динамика уровня Ig E в крови больных ИБС в течение первого года после стентирования. 1 - уровень Ig E после имплантации стентов, покрытых лекарственным препаратом. 2 - уровень Ig E после имплантации стентов без лекарственного покрытия. Mann-Whitney U-test.

Полученные нами результаты могут свидетельствовать об активации эозинофилов по типу развития реакции гиперчувствительности в отдаленном периоде после имплантации стентов с лекарственным покрытием, тогда, как в случае с имплантацией стентов без лекарственного покрытия, активации эозинофилов не наблюдалось. Подобная реакция, вероятно, связана с отсутствием в просвете стентированной артерии противовоспалительного препарата и наличием нерастворимого биополимерного покрытия в составе стента.



Выводы

1. Больные ИБС с рестенозом и пациенты без рестеноза после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов с лекарственным покрытием имеют идентичный уровень циркулирующих остеонектин-положительных (CD45+/остеонектин+) клеток.

2. Количество эозинофильных гранулоцитов в крови пациентов, у которых отмечено возникновение рестеноза после имплантации стентов с лекарственным покрытием, достоверно выше уровня эозинофилов в крови больных, не имеющих рестеноза, что может свидетельствовать об участии этой популяции клеток в его возникновении.

3. Возникновение рестеноза после коронарного стентирования с помощью стентов с лекарственным покрытием не сопровождается повышением в крови уровня эозинофильного нейротоксина.

4. У пациентов, подвергшихся коронарному стентированию с помощью стентов с лекарственным покрытием и имеющих в крови более высокий (выше медианы распределения) уровень эозинофильного катионного белка, отмечено более частое возникновение рестеноза в сравнении с пациентами с более низким (ниже медианы распределения) уровнем этого белка.

5. Эндоваскулярная реваскуляризация миокарда с помощью стентов с лекарственным покрытием вызывает, в отличие от имплантации стентов без лекарственного покрытия, повышение уровня эозинофильного катионного белка, которое обнаруживают через 6-12 месяцев после коронарного стентирования.

Практические рекомендации

Эозинофильный катионный белок, входящий в состав эозинофильных гранулоцитов и являющийся показателем их активации, может быть использован в качестве маркера развития рестеноза после эндоваскулярной реваскуляризации миокарда с помощью стентов с лекарственным покрытием.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Gabbasov Z.A., Kozlov S.G., Imaeva A.E., Saburova O.S., Zykov K.A., Masenko V.P., Smirnov V.N.. In-stent restenosis after revascularization of myocardium with drug-eluting stents is accompanied by elevated level of blood plasma eosinophil cationic protein. Canadian journal of physiology and pharmacology. 2011, 89(6):413-418. [PMID:21751895, ISSN 0008-4212]

2. Габбасов З.А., Козлов С.Г, Сабурова О.С., Имаева А.Е., Босых Е.Г., Лякишев А.А., Зыков К.А., Масенко В.П. Эозинофильный катионный белок и развитие рестеноза стентов с лекарственным покрытием. Кардиология 2011;51(6):49-54. [PMID: 21878071]

3. Габбасов З.А., Козлов С.Г., Сабурова О.С., Имаева А.Э., Васильева О. А., Домогатский С. П. Участие стромальных клеток-предшественников и полиморфно-ядерных лейкоцитов в развитии рестеноза после имплантации стентов с лекарственным покрытием. Клиническая Физиология Кровообращения. 2010; 3:70-75.

4. Имаева А.Э., Габбасов З.А., Козлов С.Г., Сабурова О.С., Кухарчук В.В., Зыков К.А., Масенко В.П., Казначеева Е.И. Динамика уровня эозинофильного катионного белка в сыворотке крови при внутрикоронарной имплантации стентов с лекарственным покрытием. Кардиологический Вестник. 2012, Том VII (XIX), 2: 21-24.

5. Gabbasov Z.A., Kozlov S.G., Saburova O.S., Imaeva A.E., Vasilieva O.A., Domogatsky S. P., Kucharchuk V.V. MS139 In-stent restenosis is accompanied by elevation of circulating eosinophils. Proceedings of the 78^th European Atherosclerosis Society Congress, Hamburg, Germany, June 20-23, 2010. Atherosclerosis Supplements 11, 2 (2010) p. 137

6. Имаева А.Э., Габбасов З.А., Козлов С.Г. Сабурова О.А., Босых Е.Г., Зыков К.А., Масенко В.П. Уровень эозинофильного катионного белка и развитие рестеноза после имплантации стентов, покрытых сиролимусом. Российский Национальный Конгресс Кардиологов, 11-13 октября 2011г., Москва. Материалы конгресса. Приложение к журналу «Кардиоваскулярная терапия и профилактика», 2011, 10 (6): 305-307

7. Gabbasov Z.A., Kozlov S.G., Imaeva A.E., Saburova O.S., Prokofieva L. V., Masenko V.P., Smirnov V.N. Coronary in-stent restenosis after sirolimus-eluting stent implantation is accompanied by elevated plasma level of eosinophil cationic protein. Proceedings of the 9^th International Congress on Coronary Artery Disease, Venice, Italy, October 23-26, 2011. Coronary Artery Disease: Update, p. 427-432.

8. Imaeva A.E., Gabbasov Z.A., Kozlov S.G., Saburova O.S., Zykov K.A., Masenko V.P., Smirnov V.N. Effect of drug-eluting stent implantation on serum level of eosinophil cationic protein. Proceedings of the 80^th European Atherosclerosis Society Congress, Milan, Italy, May 25-28, 2012.

9. Имаева А.Э., Габбасов З.А., Козлов С.Г., Сабурова О.С., Масенко В.П., Казначеева Е.И., Кухарчук В.В. Уровень эозинофильного катионного белка после коронарного стентирования с помощью стентов с лекарственным покрытием. Московский международный форум кардиологов, 26-28 марта 2013 г., Москва. Специальный выпуск журнала «Кардиоваскулярная терапия и профилактика», 2013; 12 (3): 186-187

10. Патент на изобретение «Способ диагностики развития стенозирования стентов, покрытых лекарственным веществом» Габбассов З.А., Козлов С.Г., Имаева А.Э., Сабурова О.С. Смирнов В.Н. RU № 2466403.



Список сокращений

вч-СРБ ИБС МКА КАГ ФК ХС ЛНП ПНА ОА ПКА	- - - - - - - - - -	высокочувствительный С-реактивный белок ишемическая болезнь сердца магистральная коронарная артерия коронароангиография функциональный класс холестерин липопротеиды низкой плотности передняя нисходящая артерия огибающая артерия правая коронарная артерия
ЭКБ	-	эозинофильный катионный белок
CD	-	маркер поверхности лейкоцитов
Ig E	-	иммуноглобулин Е

Размещено на Allbest.ru

...