Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Поиск генетических маркеров, определяющих предрасположенность к сахарному диабету типа 2

03.01.03 - Молекулярная биология

Потапов Виктор Андреевич

Москва - 2010

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель: доктор биологических наук, Чистяков Дмитрий Александрович, профессор

Научный консультант: доктор биологических наук, Носиков Валерий Вячеславович профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Бирюкова Елена Валерьевна, Московский государственный медико-стоматологический университет

доктор биологических наук, профессор Сломинский Петр Андреевич Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация: Медико-Генетический Научный Центр РАМН

Защита состоится «__» октября 2010 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Автореферат разослан «____» сентября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат химических наук Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. Выборка образцов и методы исследования

Для исследования ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов был использован метод ПЦР с последующим анализом длины рестриктазных фрагментов ДНК в акриламидном или агарозном геле. Основные статистические методы: для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием заболевания нами использовался критерий ч². В исследованиях типа «случай-контроль» относительный риск развития заболевания оценивается с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio, OR).

Для проведения исследования использовали две группы пациентов. В исследования было включено 376 пациентов с установленным диагнозом СД типа 2 («СД2+») на основании клинических и биохимических исследований. Контрольная группа («СД2-») представляла собой случайную выборку из 210 пациентов без признаков заболевания (табл. 1).

Таблица 1.

* ПГТТ - пероральный глюкозо-толерантный тест

У всех пациентов были измерены следующие параметры: базальная концентрация глюкозы и инсулина в крови, концентрация глюкозы и инсулина в крови через 2 часа после ППГТ, а также рассчитаны индексы HOMA-IR (Homeostasis model assessment-insulin resistance) и HOMA-в (homeostasis model assessment of в-cell function), необходимые соответственно для оценки функционирования в-клеток и оценки инсулинорезистентности тканей (Matthews et al, 1985).

Исследуемые группы формировались из числа пациентов Эндокринологического Научного Центра (г. Москва) и Тюменской Государственной Медицинской Академии (г. Тюмень). Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании индивидуального опроса).

2. Описание изучаемых генов и полученные результаты

2.1 Ген белка Kir6.2 (KCNJ11)

Ген KCNJ11 расположен на хромосоме 2q36. Продукт гена - белок Kir6.2 - является одной из двух субъединиц (вторая - рецептор к сульфонилмочевине), которые образуют канал для транспорта ионов калия. Белок Kir6.2 состоит из четырех субъединиц и образует пору для транспорта ионов калия (Aguilar-Bryan et al, 1999). При низком уровне глюкозы в крови и при низкой концентрации АТФ внутри в-клеток, канал транспорта ионов калия открыт, за счет чего создается мембранный потенциал, который препятствует проникновению в клетку ионов кальция, необходимых для секреции гранул, содержащих инсулин (Slinderlands et al, 2007). Мутации в гене KCNJ11 приводят к изменениям в структуре белка Kir6.2 и нарушениям функционирования канала. Канал не закрывается в присутствии АТФ, мембрана остается поляризованной и секреции инсулина не происходит. В ряде работ было показано, что полиморфный маркер rs5219 (Gly23Lys) этого гена ассоциирован с СД типа 2 и с некоторыми нарушениями в работе канала транспорта ионов калия.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов этого маркера в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 2). Легко видеть, что носительство аллеля Lys и генотипа Glu/Lys и Lys/Lys повышало риск развития СД типа 2 (OR = 1,35, 1,07 и 1,53, соответственно). В то же время носительство аллеля Glu и генотипа Glu/Glu уменьшало риск развития заболевания (OR = 0,74 и 0,63, соответственно).

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток также были обнаружены статистически достоверные различия. У носителей генотипов Glu/Lys и Lys/Lys в группе "СД2+" наблюдалась более низкая концентрация инсулина через 2 часа после ППТГ.

Таблица 2. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs5219 гена KCNJ11 в группах «СД2+» и «СД2-».

2.2 Ген рецептора к сульфонилмочевине (ABCC8)

Ген ABCC8 расположен на хромосоме 11р15.1. Кодируемый им рецептор к сульфонилмочевине (SUR1) является компонентом канала транспорта ионов калия, зависимого от АТФ.

Этот канал регулирует секрецию инсулина из в-клеток посредством изменения мембранного потенциала.

Повышение уровня глюкозы в крови приводит к повышению уровня АТФ и к уменьшению проницаемости этого канала, мембранный потенциал снижается, а поступление ионов Са²⁺ в клетку увеличивается, что в свою очередь приводит к увеличению секреции гранул с инсулином (Seino et al, 2003). При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1799859 гена ABCC8 в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 3).

Таблица 3. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1799859 гена ABCC8 в группах «СД2+» и «СД2-»

2.3 Ген транскрипционного фактора 7 (TCF7L2)

Ген TCF7L2 расположен на хромосоме 10q25.3 и кодирует транскрипционный фактор, который является составной частью сигнального пути Wnt.

Данный сигнальный путь задействован в регуляции механизмов роста, развития и функционирования различных клеток, в том числе и в-клеток поджелудочной железы (Jin et al, 2008).

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-» нами были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 4).

Таблица 4. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7903146 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-»

Легко видеть, что носительство аллеля T и генотипа TT повышало риск развития СД типа 2 (OR = 1,51 и 2,47, соответственно). В то же время носительство аллеля С, генотипов СТ и СС уменьшало риск развития заболевания (OR = 0,66, 0,73 и 0,80, соответственно).

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток также были обнаружены статистически достоверные различия. Для носителей генотипов CT и TT в группе "СД2+" и в группе "СД2-", наблюдалось снижение базального уровня инсулина и уровня инсулина через 2 часа после ППТГ, а так же увеличение уровня глюкозы через 2 часа после ППТГ и уменьшение индекса HOMA-в.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs12255372 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-» нами не было найдено статистически значимых различий (табл. 5).

Таблица 5. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs12255372 гена TCF7L2 в группах «СД2+» и «СД2-»

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток были обнаружены статистически достоверные различия. В группах «СД2+» и «СД2-» у носителей генотипов GT и TT по сравнению с носителями генотипа GG наблюдались снижение базального уровня инсулина через 2 часа после ППГТ, повышение уровня глюкозы через 2 часа после ППГТ. Таким образом, полиморфный маркер rs7903146 гена TCF7L2 ассоциирован с СД типа 2 в русской популяции, а полиморфный маркер rs12255372 не показал связи с заболеванием. Однако оба эти полиморфных маркера оказались ассоциированы с изменением метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток как у больных, так и у здоровых людей.

2.4 Ген трансмембранного переносчика цинка типа 8 (SLC30A8)

Ген расположен на хромосоме 8q24.11 и кодирует трансмембранный белок-транспортер ионов цинка типа 8 (ZnT-8). Наибольший уровень экспрессии этого гена наблюдается именно в панкреатических в-клетках. ZnT-8 выполняет функцию канала, через который ионы Zn²⁺ поступают в секреторные везикулы.

Внутри везикул ионы Zn²⁺ образуют комплекс с инсулином, в результате чего инсулин образует гексамерную структуру (Luizzi et al, 2004). Таким образом, каналы транспорта ионов цинка играют важную роль в регуляции созревания, хранения и секреции инсулина в-клетками (Sladek et al, 2007).

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs13266634 гена SLC30A8 в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 6).

Таблица 6. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs13266634 гена SLC30A8 в группах «СД2+» и «СД2-»

Легко видеть, что носительство аллеля С и генотипа СС повышает риск развития СД типа 2 (OR = 1,40). В то же время носительство аллеля Т, генотипов СТ и ТТ уменьшает риск развития заболевания (OR = 0,72, 0,51 и 0,85, соответственно). При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток также были обнаружены статистически достоверные различия. В группе «СД2+» только уровень инсулина через 2 часа после ППТГ у носителей генотипов СТ и ТТ оказался выше чем у носителей генотипа СС. В группе «СД2-» у носителей генотипов СТ и ТТ уровень инсулина после ППГТ и индекс HOMA-в оказался выше, а уровень глюкозы ниже, чем у носителей генотипов СС.

Таким образом, полиморфный маркер rs13266634 гена SLC30A8 ассоциирован с СД типа 2 и со значениями метаболических показателей функции в-клеток в русской популяции.

2.5 Ген белка, ассоциированного с регуляторной субъединицей-1 циклинзависимой киназы типа 5 (CDKAL1)

Ген CDKAL1 расположен на хромосоме 6р22.3. Продукт данного гена имеет значительную гомологию с ингибитором CDK5RAP1 киназы CDK5. Предполагается, что CDKAL1 также играет роль ингибитора активности киназы CDK5, которая играет существенную роль в эффективности секреции гранул инсулина в кровоток (Ubeda et al, 2006; Wei et al, 2005). Для изучения ассоциации гена CDKAL1 с СД типа 2 мы использовали четыре полиморфных маркера, расположенных в интроне 5 этого гена. При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7756992 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 7).

Таблица 7. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7756992 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-»

Легко видеть, что носительство аллеля A и генотипа АА снижает риск развития СД типа 2 (OR = 0,70 и 0,74, соответственно), в то же время у носителей аллеля G и генотипа GG риск развития СД типа 2 увеличен (OR = 1,42 и 2,00). При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток были обнаружены статистически достоверные различия. В группах «СД2+» и «СД2-» обнаружена корреляция между генотипами AG и GG и снижением уровня инсулина через 2 часа после ППГТ, а также снижением индекса HOMA-в. При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs9465871 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 8).

Таблица 8. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs9465871 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-»

Легко видеть, что у носителей аллеля С и генотипа СС понижен риск развития СД типа 2 (OR = 0,69 и 0,57, соответственно), в то время у носителей аллеля Т и генотипов СТ и ТТ риск развития СД типа 2 увеличен (OR = 1,45, 1,38 и 1,51, соответственно). При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток были обнаружены статистически достоверные различия. В группах «СД2+» и «СД2-» обнаружена корреляция между генотипами СТ и ТТ и снижением уровня инсулина через 2 часа после ППГТ. При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs10946398 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-» также были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 9). Легко видеть, что у носителей аллеля А понижен риск развития СД типа 2 (OR = 0,70), в то время у носителей аллеля С риск развития СД типа 2 увеличен (OR = 1,44). При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток были обнаружены статистически достоверные различия. В группах «СД2+» и СД2-» наличие генотипа АС или СС было ассоциировано с более низкой концентрацией инсулина через 2 часа после ППГТ по сравнению с носителями генотипа АА. Также наблюдалось снижение индекса HOMA-в в группе «СД2+» у обладателей генотипов АС или СС.

Таблица 9. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs10946398 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-»

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7754840 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-» достоверных статистических различий обнаружено не было (табл. 10).

Таблица 10. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs7754840 гена CDKAL1 в группах «СД2+» и «СД2-»

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток также не было обнаружено статистически достоверных различий.

2.6 Хромосомная область CDKN2A/CDKN2B

Ингибиторы циклинзависимых киназ входят в семейство белков, участвующих в регуляции клеточного цикла, пролиферации и дифференциации клеток. В различных исследованиях было показано, что нарушения функций ингибиторов циклинзависимых киназ приводят к нескольким видам рака, развитию ишемической болезни сердца и сахарному диабету (Fajas et al, 2010).

Гены CDKN2A и 2В расположены рядом на хромосоме 9р21. Продукты этих генов участвует в контроле пролиферации в-клеток. Гены CDKN2А и 2В кодируют несколько продуктов (Sato et al, 2010) - белки pl6INK4A и p14ARF (белковые продукты альтернативного сплайсинга гена CDKN2A), pl5INK4B (продукт гена CDKN2В -ингибитор клеточного цикла) и ANRIL (некодирующая регуляторная РНК, синтезирующаяся с противоположной цепи ДНК). Один из продуктов гена CDKN2A, pl6INK4A, участвует в контроле пролиферации в-клеток. Было показано, что с возрастом происходит накопление в клетках p16INK4а/в. Это приводит к ингибированию киназы Cdk4 и к нарушению пролиферации в-клеток (Krishnamurthy et al, 2006). Вероятно, CDKN2А вовлечен в развитие сахарного диабета типа 2 вследствие уменьшения количества и регенеративного потенциала в-клеток при старении, что приводит к общему снижению эндокринной функции панкреаса (Teschen et al, 2009).

В исследованиях на мышах было показано, что продукт гена CDKN2В влияет на секрецию инсулина посредством регуляции экспрессии гена E2F1 (Sherr et al, 2001). Транскрипционный фактор E2F1 непосредственно контролирует экспрессию гена KCNJ11. В разных линиях мышей с нарушением функции одного из генов CDKN-E2F1-KCNJ11, наблюдалось ухудшение секреции инсулина (Rane et al, 1999).

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs10811661, расположенного между генами CDKN2A и 2В, в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл. 11). Легко видеть, что у носителей аллеля Т и генотипа Т/Т понижен риск развития СД типа 2 (OR = 0,60 и 0,55, соответственно), в то время как у носителей аллеля С и генотипов ТС и СС риск развития СД типа 2 увеличен (OR = 1,66, 1,20 и 2,14, соответственно).

Таблица 11. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs10811661 гена CDKN2А в группах «СД2+» и «СД2-»

2.7 Ген белка, связывающего мРНК инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2BP2)

Ген расположен на хромосоме 3q27.2. В семейство генов IGFBP входят 6 структурно схожих белков. Часть из них связываются с высоким сродством с инсулиноподобными факторами роста 1 и 2 (IGF-1, 2) (Bach et al, 2002; Firth et al, 2002). В 99% случаев продукт гена IGF2BP2 образует комплекс с мРНК гена IGF2, что резко ускоряет деградацию молекул мРНК гена IGF2 (Rajaram et al, 1997) и что, таким образом, регулирует уровень его трансляции. Предполагается, что ген IGF2 непосредственно влияет на выживание в-клеток (Petrik et al, 1998).

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs4402960 гена IGF2BP2 в группах «СД2+» и «СД2-» достоверных статистических различий обнаружено не было (табл. 12). При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток также не было обнаружено статистически достоверные различий.

Таблица 12. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs4402960 гена IGF1B2 в группах «СД2+» и «СД2-»

2.8 Хромосомная область HHEX-IDE

Одним из итогов нескольких масштабных геномных поисков стало обнаружение хромосомной области 10q24, включающей гены HHEX и IDE, ассоциированной с развитием СД типа 2. Ген HHEX кодирует транскрипционный фактор, экспрессия которого наблюдается на эмбриональной стадии в вентролатеральной части передней кишки, из которой в дальнейшем образуются поджелудочная железа и печень (Bort al, 2004). При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1111875 расположенного в области HHEX-IDE в группах «СД2+» и «СД2-» достоверных статистических различий обнаружено не было (табл. 13). При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток также не было обнаружено статистически достоверных различий.

Таблица 13. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs1111875 области HHEX-IDE в группах «СД2+» и «СД2-»

2.9 Ген белка адипонектина (ADIPOQ)

Белок адипонектин - продукт гена ADIPOQ, который расположен на хромосоме 3q27. Адипонектин вырабатывается клетками белой жировой ткани и относится к семейству коллектинов. Частично гомологичен с коллагеном VIII и Х и комплементом С1q (Hotta et al, 2000). Имеются данные, что повышение концентрации эндогенного (Spranger et al, 2003), а также введение экзогенного рекомбинантного адипонектина, увеличивает чувствительность клеток к инсулину, а пониженная концентрация адипонектина является одной из причин развития инсулинорезистентности (Gu et al, 2004).

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ в группах «СД2+» и «СД2-» достоверных статистических различий обнаружено не было (табл. 14).

Таблица 14. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2241766 гена ADIPOQ в группах «СД2+» и «СД2-»

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток были обнаружены статистически достоверные различия. В группах «СД2+» и «СД2-» уровень глюкозы через 2 часа после ППТГ оказался выше у носителей генотипов GG и TG. В группе «СД2+» генотипы GG и TG коррелируют с повышенным уровнем инсулина.

2.10 Гены рецепторов к адипонектину типа 1 и 2 (ADIPOR1 и 2)

Существуют два вида рецепторов к адипонектину. Рецепторы типа 1 преимущественно располагаются в скелетной мускулатуре, а типа 2 экспрессируются преимущественно в печени. Ген ADIPOR1 расположен на хромосоме 1q32, а ген ADIPOR2 на хромосоме 12р13.33 (Yamauchi et al, 2003). При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2275738 гена ADIPOR1 в группах «СД2+» и «СД2-» достоверных статистических различий обнаружено не было (табл.15).

Таблица 15. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs2275738 гена ADIPOR1 в группах «СД2+» и «СД2-»

В группе «СД2+» наблюдался пониженный уровень базального инсулина, инсулина через 2 часа после ППТГ и увеличение индекса HOMA-IR у носителей генотипов AG и GG по сравнению с АА. В группе «СД2-» у носителей генотипов СТ и ТТ был повышен уровень концентрации глюкозы через 2 часа после ППТГ.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11061971 гена ADIPOR2 в группах «СД2+» и «СД2-» были обнаружены статистически достоверные различия (табл.16). Легко видеть, что носительство аллеля А ассоциировано со снижением риска развития СД типа 2 (OR = 0,76), в то время как у носителей аллеля Т риск развития СД типа 2 был существенно выше (OR = 1,31).

Таблица 16. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs11061971 гена ADIPOR2 в группах «СД2+» и «СД2-»

При анализе ассоциации данного полиморфного маркера со значениями метаболических показателей глюкозотолерантности и функции в-клеток были обнаружены статистически достоверные различия.

В группах «СД2+» и «СД2-» наблюдается повышение базального уровня инсулина для генотипов АТ и ТТ по сравнению с генотипом АА. В группе «СД2+» индекс HOMA-IR у носителей генотипов АТ и ТТ оказался также повышенным.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов другого полиморфного маркера (rs16928751) гена ADIPOR2 в группах «СД2+» и «СД2-» достоверных статистических различий обнаружено не было (табл. 17).

Таблица 17. Сравнительный анализ рас...