Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных сывороточных маркеров фиброза у больных хроническим вирусным гепатитом С (клинико-экспериментальное исследование)

03.00.04 - биохимия

14.00.05 - внутренние болезни

кандидата медицинских наук

Юзько Юлия Валерьевна

Новосибирск - 2007

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Короленко Татьяна Александровна

доктор медицинских наук Волошина Наталья Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

доктор медицинских наук Кривошеев Александр Борисович

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита состоится « » 2007 г. в час на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

(630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2)

Автореферат разослан « » 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Русских Галина Сергеевна

протеаза ингибитор гепатит фиброз

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Наиболее частой причиной развития хронических гепатитов является поражение гепатотропными вирусами, и, прежде всего, вирусами гепатитов В и С. Верифицированы возбудители вирусных гепатитов А, В, С, D, Е. Обсуждается роль вирусов G , TTV и SEN в развитии острого и хронического поражения печени (Ивашкин В. Т., 2002; Подымова С. Д., 1998; Соринсон С. Н., 1998; Шерлок Ш., и соавт., 1999; Van Damme P., 2002; White P. A. et al., 2002; Мамедов М.К., 2005).

В настоящее время в мире насчитывается около 300 млн. больных гепатитом С. В США более 4 миллионов человек инфицированы HCV (Bonkovsky H. et al., 1999; Kim W.R. et al., 2002; Camma C., 2001; Donato F. et al., 2001). По данным НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, в нашей стране отмечается неуклонный рост заболеваемости хроническими вирусными гепатитами (Ивашкин В. Т., 2002; Погромов Л. Ю. и соавт., 2002; Подымова С. Д., 1998; Тучина Л. М. и соавт., 2000).

Тревожная эпидемиологическая обстановка в отношении хронической HCV - инфекции наблюдается в городе Новосибирске. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в НИИ терапии СО РАМН, «распространенность маркеров вируса гепатита В в популяции Новосибирска сходна с таковой в центральной России, в том числе в Москве», а доля HCV - позитивных лиц существенно выше, чем в других регионах (Курилович С. А., Решетников О. В., 2000; Решетников О. В., 2001).

Хронические вирусные гепатиты являются основной причиной развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Блохина Н. П., 1998, 1999; Дьякова И. П., Ильченко Л. Ю., 2003; Ивашкин В. Т., 2002; Лопаткина Т. Н., 1999, 2002; Подымова С. Д., 1998, 2001; Asaba N. et al., 1999; Bonkovsky H. et al., 1999; Camma C. et al., 2001; Donato F. et al., 2001).

Однако многие вопросы, связанные с диагностикой и лечением ХВГ, остаются недостаточно изученными. Часто вирусное поражение печени протекает латентно без каких-либо клинических проявлений или «маскируется» под другие заболевания, но даже латентное течение хронического гепатита может стать причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Ранняя диагностика хронических вирусных гепатитов и правильная лечебная тактика способны предотвратить возможные необратимые последствия, поэтому важной задачей клиницистов является определение степени фиброза у больных ХВГ С на разных стадиях заболевания, что позволило бы прогнозировать течение заболевания, обратимость выявленных изменений и, в конечном счете, определить лечебную тактику для каждого пациента.

В настоящее время «золотым стандартом» определения степени фиброза является пункционная биопсия печени (ПБП), однако возможности пункционной биопсии ограничены наличием противопоказаний, погрешностями в получении материала и в трактовке результатов, а также необходимостью выполнять несколько биопсий в течение жизни одному пациенту, значительной стоимостью процедуры. (Ющук Н.Д. и соавт., 2002). Кроме того, являясь инвазивным методом, ПБП имеет ряд осложнений вплоть до летальных исходов. По данным некоторых авторов количество летальных случаев варьирует от 0 до 3,3 на 1000 ПБП (Poynard T. et al., 2000). Прогноз и управление развитием хронического гепатита в значительной степени зависит от степени и прогрессирования фиброза печени. В связи с этим поиск неинвазивных (сывороточных) маркеров развития фиброза приобретает все большее значение (Takahata T. et al., 2004; Leroy V. et al., 2004).

Cреди cывороточных маркеров фиброза рассматриваются матриксные металлопротеазы -1, -2, -9 и их эндогенные ингибиторы - тканевые ингибиторы металлопротеаз (TIMP-1, TIMP-2), коллаген I, IV и VI типов, гиалуроновая кислота, б₂ -макроглобулин, общий билирубин, TGF-в, PGF, а также лизосомные ферменты сыворотки крови (Forns X., 2003; Leroy V. et al., 2004). Однако наиболее важными их них являются матриксные металлопротеазы и их тканевые ингибиторы (Leroy et al., 2004; Lichtinghagen et al., 2000). Несколько групп исследователей обнаружили тесную корреляцию между металлопротеазами, эндогенными ингибиторами и развитием цирроза печени при токсическом повреждении печени, связанном со злоупотреблением алкоголя, при хроническом воспалении, развивающемся у больных хроническим вирусным гепатитом С (Lichtinghagen et al., 2000; Poynard et al., 2003; Rosenberg et al., 2004). Тем не менее, до настоящего времени четких диагностических критериев, альтернативных инвазивным методам определения и оценки степени фиброза печени, не найдено. Поэтому выбранное направление исследования представляется актуальным и перспективным.

Цель работы:

Изучить изменения активности и концентрации матриксных металлопротеаз, ингибиторов протеаз и лизосомных ферментов при хроническом вирусном гепатите С, циррозе печени в исходе вирусного гепатита С как возможных маркеров развития фиброза.

Задачи исследования:

1. Исследовать сывороточную концентрацию ММП-2, активность ММП-2,7, концентрацию ТИМП-1, ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз, универсального ингибитора протеаз - б₂-макроглобулина у больных ХВГ С в зависимости от активности и стадии заболевания.

2. Оценить активность лизосомных ферментов - хитотриозидазы и в-D-галактозидазы в сыворотке крови пациентов с ХВГ С в зависимости от стадии заболевания.

3. Изучить изменения концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови и ткани печени, сывороточную активность в-D-галактозидазы и активность лизосомных протеаз в печени при развитии фиброза на модели хронического ССl₄-гепатита у мышей;

4. Сопоставить изменения протеаз и ингибиторов протеаз, полученные в эксперименте, с изменениями у больных ХВГ С.

5. Оценить влияние ИФН-б на исследованные ферменты и ингибиторы при остром и хроническом токсическом гепатите у мышей.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение сывороточных маркеров развития фиброза у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени в исходе вирусного гепатита С, в результате которого как наиболее информативные выделены ММП-2 и ТИМП-1; выявлено значительное снижение сывороточной активности лизосомного фермента в-D-галактозидазы на разных стадиях ХВГ С, а также увеличение концентрации ингибитора цистеиновых протеаз - цистатина С.

На основании изучения различных классов протеаз и их ингибиторов (металлопротеаз, цистеиновых и сериновых протеаз) установлено, что наибольшим изменениям подвержена ММП-2, тесно связанная с формированием фиброза.

Для больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С характерны нарушения регуляции ММП, сопровождающиеся повышением активности ММП-2,7 и концентрации ММП-2 и ТИМП-1, связанные с нарушением функционирования компонентов внеклеточного матрикса (синтез коллагена и увеличение внеклеточного матрикса) в печени. Отмечено повышение активности б₁-протеиназного ингибитора и хитотриозидазы, отражающих процесс воспаления и формирование фиброза.

Клинические исследования, проведенные у больных ХВГ С, подтверждаются данными, полученными в эксперименте. Так, при хроническом токсическом гепатите в сыворотке крови мышей обнаружено снижение активности в-D-галактозидазы и повышение содержания ТИМП-1. Аналогичные изменения отмечены в сыворотке крови пациентов с ХВГ С. Выраженная инактивация в-D-галактозидазы обусловлена прямым действием повреждающих факторов (вируса гепатита С у больных и метаболитов CCl₄ у мышей) на клетки печени. Эти изменения свидетельствуют об универсальности механизмов хронического повреждения печени при ХВГ С у больных и в эксперименте. Таким образом, модель хронического токсического гепатита у мышей позволяет изучать механизмы развития хронического повреждения печени и оценивать эффективность препаратов, используемых в лечении вирусных гепатитов у человека.

Практическая значимость

Повышение активности ММП-2,7, соотношения ММП-2:ТИМП-1 и хитотриозидазы, наблюдающиеся в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом С, являются признаками развития фиброза печени и могут быть использованы как неинвазивные маркеры прогрессирования заболевания..

Положения, выносимые на защиту:

1. Среди сывороточных ингибиторов протеаз различных классов (сериновых, цистеиновых, металлопротеаз) для ХВГ С характерно повышение концентрации цистатина С, при отсутствии изменений других ингибиторов (ТИМП-1, б₁ -протеиназного ингибитора и б₂-макроглобулина).

2. Развитие фиброза характеризуется повышенной активностью ММП-2,7, нарушением соотношения ММП-2:ТИМП-1 в сыворотке крови, повышением активности хитотриозидазы - маркера стимуляции макрофагов, которые можно рассматривать в качестве неинвазивных сывороточных показателей развития фиброза.

3. Развитие хронического токсического ССl₄-гепатита у мышей сопровождается повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности цистеиновой протеазы катепсина L в ткани печени и снижением активности в-D-галактозидазы в сыворотке крови. Однократное введение ИФН-б повышает активность цистеиновых - катепсинов B и L и аспартильной протеазы катепсина D, участвующих в деградации компонентов внеклеточного матрикса.

4. Острый токсический ССl₄-гепатит у мышей характеризуется повышением сывороточной активности хитотриозидазы.

Внедрение. Основные результаты настоящей работы используются в лекционном курсе для студентов лечебного факультета ГОУ ВПО НГМУ по пропедевтике внутренних болезней.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» - Новосибирск, 2004; V Сибирском физиологическом съезде - Томск, 2005; Х Российской конференции «Гепатология сегодня» - Москва, 2005; I Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока - Новосибирск, 2005; ХII Российской Гастроэнтерологической Неделе - Москва, 2006; VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием - Красноярск, 2006; VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине - Новосибирск, 2006; Falk Symposium 157 «Chronic Hepatitis: Metabolic, Cholestatic, Viral, and Autoimmune», Freiburg, 2006.

Публикации: по материалам диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе 5 статей, 4 публикации в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации

Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, обсуждение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована 37 рисунками и 15 таблицами. Список цитируемой литературы включает 46 отечественных и 125 зарубежных источников.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика больных. Исследование проведено у 106 больных хроническим вирусным гепатитом С (67 мужчин, средний возраст 36,78 ± 11,62 лет и 39 женщин, 43,26 ± 15,81 лет) и у 27 больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С (13 мужчин, средний возраст 49,69 ± 10,48 лет и 14 женщин 60,50 ± 11,90 лет). Все пациенты обратились за медицинской помощью в МУЗ МКБ № 7 г. Новосибирска по поводу астенического синдрома и/или болей билиарного характера. Ранее заболеваний печени у них диагностировано не было. Диагноз ХВГ С подтвержден на основании определения маркеров методами ИФА и ПЦР-диагностики с определением РНК вируса гепатита С полуколичественным методом с генотипированием. У части больных (25,5%) диагноз подтвержден морфологическим методом при пункционной биопсии печени.

Диагноз цирроза печени в исходе вирусного гепатита С верифицирован с использованием полного клинического обследования больных, лабораторной диагностики и инструментальных методов обследования (фиброгастродуоденоскопия, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и т.д.). У всех пациентов определен прогностический класс А по Чайльд-Пью.

Контрольную группу составили 20 практически здоровых постоянных доноров (11 мужчин 33,45 ± 6,76 лет и 9 женщин 36,78 ± 7,84 лет). У всех пациентов получено письменное информированное согласие для проведения исследования.

Экспериментальные модели. В работе использованы самцы мышей линии СВА, массой 20-25 г (виварий Института фармакологии СО РАМН, г. Томск). В ходе работы проведены 2 серии экспериментов: воспроизведение моделей острого и хронического CCl₄-гепатитов. Для воспроизведения модели острого токсического гепатита мышам однократно перорально вводили масляный раствор CCl₄ в дозе 50 мг/кг массы тела. Животных декапитировали через 24, 48, 72 ч после затравки CCl₄. Для изучения возможного защитного действия б-интерферона животным за 24 ч до затравки CCl₄ внутрибрюшинно однократно вводили раствор б-интерферона (ДГУ ПП «Вектор-фарм», Новосибирск) в дозе 10000 МЕ. Модель хронического токсического гепатита воспроизводили посредством перорального введения CCl₄. При воспроизведении данной модели масляный раствор CCl₄ в дозе 50 мг/кг массы тела животного вводили 2 раза в неделю в течение 4-х недель. б-интерферон вводили внутрибрюшинно в той же дозе, что и при воспроизведении острого токсического гепатита однократно за 24 ч до последней затравки CCl₄. Животных декапитировали через 24 ч после последнего введения CCl₄.

Морфологическое исследование печени мышей выполнено совместно с к.м.н. Фаламеевой О.В. и д.м.н. Филимоновым П.Н.

Методы определения активности и/или содержания ферментов и ингибиторов протеаз. Активность в-D-галактозидазы в сыворотке крови определяли по методу Barrett, 1972 г. в модификации Sewell et al., 1988г. с использованием флуоресцентного субстрата 4-метилумбеллиферил-в-D-галактопиранозида (Melford Laboratories ltd., England); активность хитотриозидазы определяли по методу, предложенному Guo et al. (1995). В качестве субстрата использовали 4-метилумбеллиферил- в-D-N,N^',N^"-триацетилхитотриозид (C₃₄H₄₇N₃O₁₈); активность матриксных металлопротеаз-2,7 (ММП-2,7) определяли по методу Nagase et al. (1994) с использованием субстрата МСА-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH₂ (ICN Biomedicals Inc, USA); активность катепсина В в гомогенате печени мышей определяли с помощью флуоресцентного субстрата Na-CBZ(carbobenzoxy) -Arg-Arg-7-amido-4methylcoumarin hydrochloride («Вектор», Новосибирск) по методу Barrett, Kirschke, 1981; для определения активности катепсина L использовали субстрат Na-CBZ(carbobenzoxy) -Phe-Arg-7-amido-4methylcoumarin hydrochloride («Вектор», Новосибирск) с добавлением в инкубационную смесь селективного ингибитора катепсина В СА-074 (Kirschke Н., Wiederanders B., 1984); Активность катепсина D в гомогенате печени мышей определяли спектрофотометрическим методом Видерандерса и Ольке (Wiederanders B., Oelke B., 1986). В качестве субстрата использовали 2% раствор азоказеина, приготовленный на 6,0 М растворе мочевины, рН=5.0; содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry O., 1951); активность б₁ - протеиназного ингибитора и б₂ -макроглобулина в сыворотке крови определяли по методу Яровой и соавт., 1982 с использованием субстрата бензоил-аргинин-этиловый эфир гидрохлорид (БАЭЭ); концентрацию ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови определяли с помощью готовых коммерческих наборов ИФА для человека (Ray Biotech, Human MMP-2 ELISA Kit, Human TIMP-1 ELISA Kit, USA) и мышей (Ray Biotech, Mouse TIMP-1 ELISA Kit, USA) (Clark et al., 1991; Plumpton et al., 1995); концентрацию цистатина С в сыворотке крови определяли с помощью готовых коммерческих наборов ИФА для человека (BioVendor, Czech Republic).

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка проведена с применением пакета программ SPSS 9.0 и включала создание базы данных, автоматизированную проверку качества подготовки информации и статистический анализ (Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2000; Флетчер Р. И соавт., 1998; Власов В.В., 2001). Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (m), достоверность оценивалась по t-критерию Стьюдента. Рассчитывались доверительные интервалы, позволяющие оценить, в каких пределах может находиться истинное значение параметра. В ряде случаев, ввиду наличия выборок из переменных, не подчиняющихся нормальному распределению, использовались непараметрические методы статистической обработки (U критерий Манна-Уитни). Для определения связи между изучаемыми признаками использовались коэффициенты корреляции Пирсона и Спирмана.

Результаты и обсуждение

Результаты клинических исследований. При обследовании больных ХВГ С обнаружено повышение содержания ММП-2 (U=109,5; р=0,001) и тенденция к повышению содержания ТИМП-1 в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами (рис.1;табл.1). Выявлена прямая корреляционная зависимость концентрации ММП-2 и ТИМП-1 (r=0,345). Эти изменения свидетельствуют о том, что в результате персистенции повреждающего фактора (вируса гепатита С) регенерация паренхимы печени замедляется и гепатоциты замещаются избыточным количеством белков внеклеточного матрикса, включая фибриллярный коллаген. Накопление внеклеточного матрикса является результатом, как повышения синтеза, так и снижения деградации его элементов - ММП, фибронектина, ундулина, коллагенов I, III и IV типов и протеогликанов. Снижение скорости выведения внеклеточного матрикса и ММП является следствием перевысвобождения их специфических ингибиторов - ТИМП.

Рисунок 1. Концентрация ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных ХВГ С

Примечание: * - р<0,05

В сыворотке крови больных ХВГ С не отмечено изменений активности ингибитора сериновых протеаз - б₁-протеиназного ингибитора и универсального ингибитора протеаз всех четырех классов - б₂-макроглобулина, тем не менее, отмечена обратная корреляционная зависимость активности МГ с концентрацией ТИМП-1 (r=-0,717). Таким образом, увеличение концентрации ММП-2 может быть связано с усилением расхода не только эндогенного ингибитора ТИМП-1, но и универсального ингибитора протеаз - МГ, так как известно, что он, наряду со специфическими ингибиторами ММП - ТИМП, является неспецифическим ингибитором ММП.

Показано, что в сыворотке крови больных ХВГ С повышается содержание ингибитора цистеиновых протеаз - цистатина С. Это, вероятно, обусловлено тем, что в протеолитический каскад деградации компонентов внеклеточного матрикса вовлечены протеазы различных классов, в том числе и цистеиновые (катепсины В и L).

Отмечено снижение активности лизосомного фермента в-D-галактозидазы в сыворотке крови больных ХВГ С (табл.2), не зависящее от активности гепатита. Полученные результаты свидетельствуют о прямом цитопатическом воздействии на клетки печени, так как нейраминидаза, входящая в состав вируса, после эндоцитоза вируса клетками печени может разрушает комплекс галактозидаза-нейраминидаза-катепсин А (так называемый стабилизирующий белок).

Изменений активности хитотриозидазы и активности ММП-2,7 в сыворотке крови больных ХВГ С не отмечено (табл.2).

Таблица 1. Характеристика ММП -2 и ингибиторов протеаз в сыворотке крови больных ХВГ С

Ферменты/ ингибиторы	Доноры	ХВГ С
	N	M	m	N	M	m
ММП-2, пкг/мл	15	453,0	184,0	36	1308,47**	318,59
ТИМП-1, пкг/мл	13	380,38	94,64	34	446,18	142,06
Цистатин С, нг/мл	10	1242,0	290,2	10	2969,0*	1136,77
б1 -ПИ, ИЕ/мл	10	21,16	1,9	10	22,8	2,72
б2 -МГ,ИЕ/мл	9	2,82	0,41	9	2,22	0,3

Примечание: ^* - р<0,05; ^**- р<0,001

Таблица 2. Активность лизосомных ферментов и ММП-2,7 в сыворотке крови больных ХВГ С

Ферменты	Доноры	ХВГ С
	N	M	m	N	M	m
в-галактозидаза, мкмоль МУФ/л в мин	10	0,72	0,04	100	0,12**	0,01
Хитотриозидаза, мкмоль МУФ/л в мин	15	3,85	0,35	42	3,62	0,43
ММП-2,7, мкмоль МКА/л в час	6	258,13	15,9	11	236,1	29,75

Примечание: **- р<0,001

В сыворотке крови пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С обнаружено повышение активности ММП-2,7 по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза печени (р=0,01; 95% CI 381,6-62,4). При сопоставлении активности фермента с донорами также отмечены достоверные изменения (р=0,001; 95% CI 126,97-273,48) (таблица 3).

Рисунок 2. Активность ММП-2,7 в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С

Примечание: * - р<0,05

Тем не менее, изменений концентрации ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с пациентами с ХВГ С не отмечено, наблюдалась лишь тенденция к повышению, р>0,05 (табл.3). Несмотря на это, при подсчете соотношения ММП-2:ТИМП-1 показано, что у здоровых доноров это соотношение составляет приблизительно 1:1, у больных ХВГ С - 3:1, а у пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С - 4:1, что, вероятно, связано с избыточным накоплением компонентов внеклеточного матрикса. Обнаружены прямые корреляционные взаимосвязи между концентрациями ММП-2, ТИМП-1 и активностью АЛТ (r=0,610; р=0,007), а также прямая корреляционная зависимость ММП-2 и ТИМП-1 между собой (корреляционный коэффициент Пирсона r=0,665; р=0,007). Эти данные указывают на то, что формирование фиброза у данной группы пациентов тесно связано с воспалительным процессом в печени. Поврежденные гепатоциты через активацию провоспалительных цитокинов активируют клетки Купфера и звездчатые клетки (основные продуценты внеклеточного матрикса). Под воздействием трансформирующего фактора роста-в1 (TGF- в1) происходит дифференцировка звездчатых клеток печени в миофибробласто-подобные клетки, которые приобретают сократительные, провоспалительные и фиброгенные свойства. Таким образом, наблюдается ситуация, когда клетки воспаления и клетки, ответственные за фиброгенез, активируют друг друга.

Таблица 3. Характеристика ММП-2 и ингибиторов протеаз в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С

Ингибиторы	Доноры	ХГВ С	Цирроз печени
	N	M ± m	N	M ± m	N	M ± m
ММП-2, пкг/мл	15	453,0±184,0	36	1308,5±318,6*		2224,4±578,1*
ТИМП-1, пкг/мл	13	380,4±94,6	34	446,18 ± 142,1	16	578,1±276,5
Цистатин С, нг/мл	10	1242,0 ± 290,2	10	2969,0 ±1136,8*	10	3088,0±476,3*
б1 -ПИ, ИЕ/мл	10	21,16 ± 1,9	10	22,8 ± 2,72	9	27,60 ±1,3*
б2 -МГ,ИЕ/мл	9	2,82 ± 0,41	9	2,22 ± 0,3	8	2,40 ± 0,2

Примечание: ^* - р<0,05 - по сравнению с донорами

На активацию макрофагов указывает и повышение активности хитотриозидазы в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С как по сравнению с донорами, так и по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза печени (таблица 4). Тем не менее, выявлена обратная корреляционная зависимость активности хитотриозидазы и активности АЛТ (корреляционный коэффициент Спирмана r=-0,525; р=0,021), а также обратная корреляционная зависимость между активностью хитотриозидазы и концентрацией ММП-2 (корреляционный коэффициент Спирмана r=-0,531; р=0,034). Полученные результаты свидетельствуют о том, что, повышение концентрации ММП-2 и активности АЛТ в сыворотке крови сопровождалось умеренным снижением активности хитотриозидазы, несмотря на повышение активности фермента в общей группе пациентов.

В сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С отмечено снижение активности в-D-галактозидазы по сравнению с донорами (р=0,0001; 95% CI 0,66-0,52) и повышение по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза печени (р=0,002; 95% CI 0,04-0,20) (таблица 4).

Таблица 4. Активность лизосомных ферментов и ММП-2,7 в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С

Ферменты	Доноры	ХВГ С	Цирроз печени
	N	M ± m	N	M ± m	N	M ± m
в-галактозидаза, мкмоль МУФ/л в мин	10	0,72 ± 0,04	100	0,12 ± 0,01**	18	0,24 ± 0,07^*
Хитотриозидаза, мкмоль МУФ/л в мин	15	3,85 ± 0,35	42	3,62 ± 0,43	19	5,81 ± 1,24^
ММП-2,7,мкмоль МКА/л в час	6	258,13 ± 15,9	11	236,1 ± 29,75	3	458,35 ±15,4^*

Примечание: **- р<0,001 по сравнению с донорами;

^ - р<0,05 по сравнению с ХГВС

В сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению со здоровыми донорами выявлено повышение ингибиторной активности б₁-ПИ (р=0,02; 95% CI 1,43-11,46) (таблица 3). Изменений активности ингибитора по сравнению с пациентами с ХВГ С без признаков цирроза не найдено (р>0,05).

Отмечено повышение концентрации цистатина С в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с донорами, соответственно 3088,0 ± 476,25 нг/мл и 1242,0 ± 290,2 нг/мл (р=0,005; 95% CI 656,41 - 3035,59). Изменений концентрации данного ингибитора по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза не обнаружено (р>0,05).

Несмотря на то, что изменений содержания цистатина С в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С не выявлено, отмечена прямая корреляционная зависимость концентрации цистатина С и активности б₁ - протеиназного ингибитора (коэффициент корреляции Пирсона r=0,731; р=0,025). Обнаруженная взаимосвязь между ингибиторами цистеиновых и сериновых протеаз отражает их участие в протеолитическом каскаде при деградации компонентов внеклеточного матрикса, так как известно, что одной из биологических функций катепсина В и эластазы (сериновая протеаза) является расщепление белков соединительной ткани (фибронектин, ламинин и др.) (Yan and Sloane, 2003).

Результаты экспериментальных исследований.

С целью изучения влияния ИФН-б на изменения протеаз и ингибиторов не только в сыворотке крови, но и в ткани печени при развитии фиброза, проведена серия экспериментов по воспроизведению модели хронического токсического гепатита у мышей. В качестве токсического агента был выбран четыреххлористый углерод как наиболее изученный и удобный в использовании. Для изучения влияния интерферонотерапии на исследуемые показатели у больных хроническим вирусным гепатитом С, животным с ССl₄-гепатитом однократно вводили ИФН-б в дозе 10000 МЕ за 24 ч до последней затравки ССl₄.

При исследовании срезов печени мышей с CCl₄-гепатитом в световом микроскопе показано преобладание проявлений хронического токсического гепатита: воспалительная полиморфноклеточная инфильтрация (лимфоциты, моноциты, макрофаги и нейтрофилы) преимущественно в перицентральных отделах долек; лобулярные очаговые некрозы гепатоцитов с нарушением в этих зонах балочного строения и формированием фагоцитарных макрофагальных гранулем; большинство гепатоцитов в состоянии умеренно выраженной или тяжелой дистрофии; большинство центролобулярных воспалительных инфильтратов распространяется узкими тяжами в соседнюю дольковую паренхиму по типу мостовидных некрозов с формированием молодых незрелых соединительнотканных септ. Дольковое строение печени в целом сохранено, и септальный фиброз соответствует II стадии. Имеются также признаки центро-перицентрального и очагового лобулярного перисинусоидального фиброза, в основном вблизи от воспалительных инфильтратов.

Введение мышам с ССI₄-гепатитом ИФН-б сопровождалось аналогичными изменениями в печени, однако воспалительный компонент поражения был менее выражен по сравнению группой животных с ССI₄-гепатитом, что позволяет говорить о слабом защитном действии ИФН-б.

Развитие ССl₄-гепатита сопровождалось снижением активности в сыворотке крови лизосомного фермента в-D-галактозидазы по сравнению с интактными животными (р=0,024; 95% CI 0,23-2,90). Однократное введение ИФН-б мышам с ССl₄-гепатитом не сопровождалось изменением активности фермента (табл. 5)

Аналогичные изменения сывороточной активности в-D-галактозидазы отмечены и у больных ХВГ С. Для в-D-галактозидазы не обнаружено эндогенных белковых ингибиторов, фермент может подвергаться действию перекисей липидов и свободных радикалов, возникающих при метаболизме четыреххлористого углерода. Можно полагать, что резкое снижение активности в-D-галактозидазы сыворотки крови является следствием прямого действия повреждающих факторов (вируса гепатита С у больных и метаболитов CCl₄ у мышей) на клетки печени. Возможно, выраженная инактивация в-D-галактозидазы свидетельствует об универсальности механизмов хронического повреждения печени при ХВГ С у больных и в эксперименте.

В сыворотке крови мышей с хроническим CCl₄-гепатитом обнаружено повышение содержания ТИМП-1 по сравнению с интактными животными, р=0,020; 95% CI - 518,91-48,65 (рис. 3, табл. 5); в тоже время, введение ИФН-б не сопровождалось изменением концентрации ТИМП-1 (р>0,05). Показано, что в гомогенате печени мышей концентрация ТИМП-1 повышена по сравнению с интактными животными (р=0,044; 95% CI -35,21-0,62 (табл. 6), а однократное введение ИФН-б снижало содержание ТИМП-1 даже ниже контрольных значений (р=0,0001; 95% CI 13,21-31,53) (табл. 6). Эти данные представляют определенный интерес и свидетельствуют о том, что даже однократное воздействие высокой дозы ИФН-б (10000 МЕ) проявляет защитный эффект при хроническом токсическом гепатите. Можно полагать, что ИФН-б оказывает благоприятное влияние на развитие фиброза печени у мышей, как и интерферонотерапия у пациентов с ХВГ С.



Рисунок 3. Содержание ТИМП-1 в сыворотке крови и гомогенате печени мышей с хроническим токсическим гепатитом и однократным введением ИФН-б.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с интактными; ^ - p<0,05 по сравнению с CCl₄

Таблица 5. Активность АЛТ, Я-D-галактозидазы и ТИМП-1 в сыворотке крови мышей с хроническим токсическим гепатитом и однократным введением ИФН-б.

	Интактные	ССl4	ССl4 + ИФН-б
	M ± m	M ± m	M ±m
Я-D-галактозидаза, мкмоль МУФ/ л мин	3,68 ± 0,57 n=9	2,12 ± 0,32* n=10	2,93 ±0,35 n=10
ТИМП-1, пкг/мл	425,56 ± 45,65 n=9	709,33 ± 82,83 n=15	607,33 ±86,56 n=15

Примечание: * - p<0,05; ** - р<0,001.

В регуляции синтеза и деградации компонентов внеклеточного матрикса принимают участие протеазы различных классов, в том числе цистеиновые (катепсины В и L) и аспартильные (катепсин D). Учитывая тот факт, что в сыворотке крови представлены, в основном, ингибиторы, большой интерес представляет исследование активности этих лизосомных ферментов в ткани печени.

Так, в гомогенате печени мышей с CCl₄-гепатитом показано снижение активности катепсина L по сравнению с интактными животными (р=0,0001; 95% CI 0,20-0,36), а также повышение активности катепсина D (р=0,0001; 95% CI -0,46-0,26) (табл. 6). Изменений активности катепсина В не обнаружено. Тем не менее, у данной группы животных отмечена прямая корреляционная зависимость между изменениями активности катепсинов В и D (r=0,723; р=0,028). Однократное введение ИФН-б мышам с CCl₄-гепатитом сопровождалось повышением активности катепсинов В, L и D (табл. 6).

Рисунок 4. Активность катепсинов B, L и D в ткани печени мышей СВА

Таблица 6. Активность лизосомных ферментов и концентрация ТИМП-1 в печени мышей с хроническим токсическим гепатитом и однократным введением ИФН-б.

	Интактные	ССl4	ССl4 + ИФН-б
	M ± m	M ± m	M ±m
Катепсин В, мкмоль МКА/мин на мг белка	0,20 ± 0,03 n=10	0,14 ± 0,02 n=9	0,32 ± 0,05^ n=10
Катепсин L, мкмоль МКА/мин на мг белка	0,43 ± 0,03 n=10	0,15 ± 0,01* n=9	0,50 ± 0,06*^ n=10
Катепсин D, Е366х102/ мин в расчете на мг белка	0,23 ± 0,02 n=10	0,59 ± 0,02** n=9	0,71 ± 0,1* n=9
ТИМП-1, пкг/мл	6,84 ± 0,67 n=5	24,76 ± 8,28* n=4	2,38 ±0,95* n=15

Примечание:* - р<0,05 -по сравнению с интактными; ^ - p<0,05 - по сравнению с CCl₄

ИФН-б обладает не только противовирусным, но и иммуномодулирующим эффектом. Интерфероны повышают клеточный иммунный ответ, стимулируя активность цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров и продукцию цитокинов Т-клетками и макрофагами. Повышение активности лизосомных ферментов - катепсинов В, L и D в ткани печени мышей с CCl₄-гепатитом под воздействием ИФН-б свидетельствует об иммуноопосредованном запуске протеолитического каскада, направленного, главным образом, на деградацию компонентов внеклеточного матрикса и разрешение фиброза. Эти же механизмы, вероятно, обеспечивают терапевтический эффект ИФН-б при лечении вирусных гепатитов у человека.

Выводы

1. Повышение активности ММП-2,7 в сыворотке крови пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза, не зависящее от активности АЛТ сыворотки крови, является показателем деградации компонентов внеклеточного матрикса, что позволяет включить его в ряд сывороточных маркеров фиброза печени.

2. Повышение активности хитотриозидазы в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С отражает стимуляцию макрофагов и развитие воспаления; снижение активности в-D-галактозидазы при ХВГ С связано с прямым цитопатическим действием вируса.

3. Модель хронического ССl4-гепатита у мышей характеризуется развитием фиброза, повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности катепсина L и повышением активности катепсина D в ткани печени, что свидетельствует о нарушении регуляции в системе протеазы-ингибиторы протеаз.

4. Однократное введение высокой дозы ИФН-б мышам с хроническим ССl₄-гепатитом повышает содержание ТИМП-1; повышенная активность катепсина В и катепсина D отражает стимуляцию макрофагов печени.

5. Наиболее информативными сывороточными маркерами раннего выявления фиброза печени у пациентов с ХВГ С являются суммарная активность ММП и соотношение концентрации ММП-2:ТИМП-1.

Список опубликованных работ

1. Гурова (Юзько) Ю.В., Гончарова И.А., Алексеенко Т.В. Влияние стимуляторов макрофагов и реаферона на повреждение печени мышей и секрецию ферментов лизосом // Тез. докл. V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины».- Новосибирск, 2004г.- С. 9.

2. Короленко Т.А., Юзько Ю.В., Савченко Н.Г., Алексеенко Т.В., Сорочинская Н.В., Жанаева С.Я., Потеряева О.Н., Волошина Н.Б., Гончарова И.А., Гончарова Н.В., Нагорный В.В. Нарушения функциональных проб печени и лизосомных ферментов сыворотки крови у больных хроническими вирусными гепатитами // TERRA MEDICA nova. - 2004. - №1. - С.16-18.

3. Юзько Ю.В., Волошина Н.Б., Алексеенко Т.В., Савченко Н.Г., Короленко Т.А. Лизосомные ферменты сыворотки крови у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени // Бюллетень Сибирского отделения Академии Медицинских Наук. - 2005. - №4 (118). - С. 85-89.

4. Юзько Ю.В., Савченко Н.Г., Алексеенко Т.В., Жанаева С.Я., Короленко Т.А. Активность хитотриозидазы сыворотки крови как показатель стимуляции макрофагов // Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда. - Томск. - 2005. - С. 102.

5. Савченко Н.Г., Юзько Ю.В., Алексеенко Т.В., Сорочинская Н.В., Короленко Т.А. Лизосомные ферменты в желчи мышей - интактных и при развитии внутрипеченочного холестаза // Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда. - Томск. - 2005. - С. 62.

6. Венедиктова А.А., Фаламеева О.В., Юзько Ю.В. Активность аспартильной протеазы катепсина D в печени у крыс при старении // Тез. докл. V Сибирского физиологического съезда. - Томск. - 2005. - С. 111.

7. Волошина Н.Б., Осипенко М.Ф., Пальцев А.И., Юзько Ю.В., Савченко Н.Г. Влияние этиотропной терапии на состояние билиарного тракта при ХВГ // Материалы Х Российской конференции «Гепатология сегодня». - Москва, 28-30 марта 2005. - С. 77.

8. Юзько Ю.В., Короленко Т.А., Савченко Н.Г., Алексеенко Т.В., Сорочинская Н.В., Волошина Н.Б., Гончарова Н.В. // Тез. докл. I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 6-8 декабря 2005г. - С. 823.

9. Савченко Н.Г., Юзько Ю.В., Алексеенко Т.В., Сорочинская Н.В., Волошина Н.Б., Короленко Т.А. Лизосомные ферменты в желчи при развитии внутрипеченочного холестаза // Тез. докл. I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 6-8 декабря 2005г. - С. 628.

10. Юзько Ю.В., Волошина Н.Б., Короленко Т.А. Прогностическая роль матриксных металлопротеаз, тканевого ингибитора ТИМП-1 и хитотриозидазы в развитии фиброза и цирроза печени. // Материалы ХII Российской Гастроэнтерологической Недели. - Москва, 16-18 октября 2006. - С. 90.

11. Юзько Ю.В., Филатова Т.Г., Алексеенко Т.В., Жанаева С.Я., Волошина Н.Б., Короленко Т.А. Роль изменений металлопротеаз и ингибиторов в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом // Материалы VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения». - Красноярск, 4-5 мая 2006. - С. 287-293.

12. Волошина Н.Б., Юзько Ю.В., Короленко Т.А., Савченко Н.Г. Активность хитотриозидазы у больных хроническим гепатитом С и циррозом печени // Материалы VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения». - Красноярск, 4-5 мая 2006. - С.345.

13. Юзько Ю.В., Волошина Н.Б., Короленко Т.А. Влияние хронической HCV-инфекции на активность в-галактозидазы лизосом, хитотриозидазы и матриксных металлопротеаз-2,7 сыворотки крови // Тез. докл. VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине.- Новосибирск, 12-16 июня 2006г.- С. 63.

14. Савченко Н.Г., Юзько Ю.В., Короленко Т.А. Активность лизосомальных ферментов в желчи при развитии внутрипеченочного холестаза // Тез. докл. VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине.- Новосибирск, 12-16 июня 2006г. - С. 48.

15. Короленко Т.А., Филатова Т.Г., Юзько Ю.В., Савченко Н.Г., Волошина Н.Б. Концентрация ТИМП-1 сыворотки крови больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени // Материалы 13 международного конгресса по приполярной медицине.- Новосибирск, 12-16 июня 2006г. - С. 143.

16. Пальцев А.И., Волошина Н.Б., Еремина А.А., Шишаева Л.П., Курганова И.В., Юзько Ю.В., Савченко Н.Г., Борисов В.И., Мигуськина Е.И. Проблема боли в историческом аспекте. Боль при гепатобилиарной патологии. Значение мебеверина гидрохлорида в комплексной патологии // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2006. - №2. - С. 83-95.

17. Короленко Т.А., Филатова Т.Г., Савченко Н.Г., Юзько Ю.В., Гончарова И.А., Алексеенко Т.В. Нарушения концентрации тканевого ингибитора металлопротеаз первого типа в сыворотке крови и в печени мышей с CCl₄ - гепатитом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - №3 (143). - С.280-283.

18. T.A. Korolenko, N.G. Savchenko, T.V. Alexeenko, Ju.V. Yuz?ko, S.Ya. Zhanaeva, N. Sorochinskaya, С.P. Korolenko and V.I. Kaledin Chitotriosidase activity in serum and bile during lysosomal storage of lipids in liver cells // 15^th European Study Group on Lysosomal Disease Workshop. - Oslo, Norway. - September 15-18, 2005. - P. 86.

19. Yuz?ko Y.V., Korolenko T.A., Voloshina N.B. Biochemical characteristic of liver damage in patients with chronic HCV infection and liver cirrhosis // Falk Symposium 157. Chronic Hepatitis: Metabolic, Cholestatic, Viral and Autoimmune. -Freiburg. - October 10-11, 2006. - P. 222.

20. Voloshina N.B., Yuz?ko Y.V., Savchenko N.G. Cholestasis syndrome of CVH patients // Falk Symposium 157. Chronic Hepatitis: Metabolic, Cholestatic, Viral and Autoimmune. - Freiburg. - October 10-11, 2006. - P. 215.

21. Savchenko N.G., Yuz?ko Y.V., Alexeenko T.V., Sorochinskaya N.V., Korolenko T.A. Bile lysosomal enzymes activity in intrahepatic cholestasis development // Falk Symposium 157. Chronic Hepatitis: Metabolic, Cholestatic, Viral and Autoimmune. - Freiburg. - October 10-11, 2006. - P. 174.

Список сокращений

АЛТ - аланиновая аминотрансфераза

ИФН-б - интерферон-б

МГ - б₂-макроглобулин

МКА - метилкумариламид

ММП-2 - матриксная металлопротеаза второго типа

МУФ - метилумбеллиферил

ПБП - пункционная биопсия печени

ТИМП-1 - тканевой ингибитор металлопротеаз первого типа

ХВГ С - хронический вирусный гепатит С

HCV - вирус гепатита С

IL-1 - интерлейкин 1

PGF - фактор роста тромбоцитов

TGF-б - фактор роста опухоли б

TGF-в - фактор роста опухоли в

б₁-ПИ - б₁-протеиназный ингибитор

Соискатель Юзько Ю.В.

Размещено на Allbest.ru

...