Розробка складу та технології розчину алергену "Кандидасін" для імунодіагностики кандидозної інфекції
Особливість виконання мікробіологічних досліджень з метою вибору та обґрунтування поживного середовища для культивування гриба C. Albicans. Характеристика розробки раціональної технології розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції.
Рубрика | Медицина |
Вид | автореферат |
Язык | украинский |
Дата добавления | 30.09.2018 |
Размер файла | 214,7 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ
НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
УДК 615.451.16:573.6.086.83:616.594.171.2
15.00.01 - технологія ліків, організація фармацевтичної справи та судова фармація
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук
РОЗРОБКА СКЛАДУ ТА ТЕХНОЛОГІЇ РОЗЧИНУ ЛЕРГЕНУ «КАНДИДАСІН» ДЛЯ ІМУНОДІАГНОСТИКИ КАНДИДОЗНОЇ ІНФЕКЦІЇ
РИБАЛКІН МИКОЛА ВІКТОРОВИЧ
Харків-2011
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я, м. Харків.
Науковий керівник: доктор медичних наук, професор ФІЛІМОНОВА НАТАЛІЯ ІГОРІВНА, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.
Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор ЗАЙЦЕВ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри процесів та апаратів хіміко-фармацевтичних виробництв;
доктор фармацевтичних наук
КРАСНОПОЛЬСЬКИЙ ЮРІЙ МИХАЙЛОВИЧ, Національний технічний університет «Харківський політехнічний інститут», професор кафедри біотехнології і аналітичної хімії.
Захист відбудеться «___» _____________ 2011 р. о ___ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.02 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий «___»_____________ 2011 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради
доктор фармацевтичних наук, професор Д.І. Дмитрієвський
1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За останні роки кількість хворих на кандидамікози різко збільшилася. За даними більшості авторів, ріст захворювання на кандидамікози обумовлений тривалим та нераціональним застосуванням лікарських засобів, які впливають на імунну систему організму, несприятливими екологічними факторами та посиленням патогенності самих дріжджоподібних грибів.
Гриби роду Candida викликають цілу низку інфекційних ушкоджень - від локального ушкодження слизових оболонок та шкіри до небезпечних для життя дисемінованих інфекційних процесів із значним ушкодженням внутрішніх органів та систем. Для лікаря проблема грибкових інфекцій полягає в тому, що вони важко діагностуються, оскільки клінічна симптоматика неспецифічна, важко піддається лікуванню та часто призводить до летального наслідку. Зараз загальновизнано, що імунологічні реакції з алергенами при кандидозних захворюваннях можуть бути використані для діагностики та прогнозування. Однак, незважаючи на гостру необхідність діагностичних алергенів, на сьогодні в Україні не випускається жодного вітчизняного та не зареєстровано жодного імпортного алергену, асортимент яких доволі обмежений та має високу вартість, для діагностики кандидамікозів,. Отже, розробка складу та технології нового алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції актуальна для вітчизняної промисловості.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету («Створення складу та технології одержання біологічно активних речовин та лікарських засобів природного походження (крім рослинних)» № держреєстрації 0103U000477) та проблемної комісії “Фармація” МОЗ і АМН України.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи є розробка науково обґрунтованого складу та технології розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції.
Реалізація поставленої мети вимагала вирішення таких завдань:
Ш провести аналіз літератури з питань імунодіагностики кандидозної інфекції у медичній практиці;
Ш теоретично та експериментально обґрунтувати підхід до розробки розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції;
Ш виконати мікробіологічні дослідження з метою вибору та обґрунтування поживного середовища для культивування гриба C. albicans;
Ш теоретично та експериментально обґрунтувати оптимальну технологію екстрагування алергенних компонентів з біомаси гриба C. albicans;
Ш експериментально обґрунтувати технологію очищення екстракту гриба C. albicans від баластних речовин;
Ш виконати біохімічні дослідження з метою визначення складу одержаного екстракту гриба C. albicans;
Ш провести біологічні дослідження на моделі генералізованого кандидамікозу у мурчаків з метою визначення діагностичної активності алергену;
Ш виконати комплексні фізико-хімічні та біологічні дослідження з метою вибору та обґрунтування оптимального складу розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції;
Ш експериментально обґрунтувати та розробити раціональну технологію розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції;
Ш визначити тип упаковки, умови і термін зберігання розробленого розчину алергену;
Ш визначити специфічну активність та нешкідливість розробленого розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції;
Ш дослідити основні показники якості розробленого розчину алергену, розробити проект методів контролю якості (МКЯ);
Ш розробити проект технологічного промислового регламенту на виробництво розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції та провести його апробацію в умовах промислового виробництва.
Об'єкт дослідження - алерген гриба C. albicans штаму ССМ 335-867, білкові та полісахаридні фракції гриба C. albicans; допоміжні речовини.
Предмет дослідження - розробка науково обґрунтованого складу та технології розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції. Визначення оптимальної концентрації діючих та допоміжних речовин, дослідження фізико-хімічних, біологічних властивостей та розробка методик контролю якості алергену.
Методи дослідження. При вирішенні поставлених у роботі завдань були використані загальноприйняті фізико-хімічні (потенціометричне визначення рН, спектрофотометрія), хроматографічні (паперова хроматографія, гель-хроматографія), математичні (методи математичної статистики згідно з вимогами ДФУ), фармакологічні та біологічні методи (обґрунтування концентрації діючих та допоміжних речовин, вивчення специфічної активності та нешкідливості лікарського засобу), які дозволяють об'єктивно оцінити якісні показники розробленого розчину алергену на підставі експериментально одержаних результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Теоретично та експериментально обґрунтовано підхід до створення розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції. На підставі результатів фізико-хімічних та біологічних досліджень розроблено оригінальний склад та технологію розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції, отриманого з біомаси гриба C. albicans, до складу якого входять білки та полісахариди.
Вперше теоретично та експериментально обґрунтована доцільність комбінування фізико-хімічних методів одержання алергенних компонентів гриба C. albicans - шляхом екстракції 5,0 % розчином натрію гідроксиду з ультразвуком.
Науково та експериментально обґрунтовано оптимальний склад і технологію розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції. Встановлено імунодіагностичну активність та доведено нешкідливість розчину алергену. Визначено оптимальні умови та термін зберігання запропонованого розчину алергену, які забезпечують його стабільність протягом 2 років зберігання.
Запропоновані методики ідентифікації та кількісного визначення діючих речовин розробленого розчину алергену для створення проекту МКЯ. За результатами досліджень одержано 3 патенти України на корисну модель.
Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень створено та запропоновано для практичної медицини та ветеринарії оригінальний розчин алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції на основі біомаси гриба C. albicans. Розроблено проект технологічного регламенту на виробництво розчину алергену під умовною назвою «Кандидасін», а також проект МКЯ, що містить опис методик контролю якості розчину алергену. Технологію виготовлення лікарського засобу апробовано в умовах промислового виробництва ТОВ МНВЦ «Біосан», м. Вінниця (акт апробації від 15.12.2010 р.).
Фрагменти роботи впроваджені у навчальний процес кафедри фармацевтичної технології і біофармації Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика (акт впровадження від 2.04.2011 р.), кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету «Львівська політехніка» (акт впровадження від 7.04.2011 р.), кафедри технології ліків Запорізького державного медичного університету (акт впровадження від 5.04.2011 р.), кафедри фармації Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 25.12.2010 р.), кафедри промислової фармації Національного фармацевтичного університету (акт впровадження від 3.04.2011 р.), кафедри біотехнології Харківської зооветеринарної академії (акт впровадження від 03.03.2011 р.) та кафедри мікробіології, вірусології та імунології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова (акт впровадження від 15.12.2010р.).
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійною завершеною науковою працею. Особисто здобувачем проведено аналіз і узагальнення літературних даних з досліджуваної проблеми. Проведені експериментальні дослідження з вивчення специфічної активності алергену гриба C. albicans. За допомогою фізико-хімічних та біологічних методів експериментально обґрунтовано і розроблено склад розчину алергену під умовною назвою «Кандидасін» для імунодіагностики кандидозної інфекції. Результати проаналізовані, систематизовані та статистично оброблені. Дисертантом розроблені методи ідентифікації та кількісного визначення вмісту речовин, що входять до складу розчину алергену грибів C. albicans. Усі наукові узагальнення, положення, результати, висновки та рекомендації, викладені у дисертації, отримані автором особисто.
Розроблено проект МКЯ та проект технологічного промислового регламенту на виробництво розчину алергену «Кандидасін» для імунодіагностики кандидозної інфекції. Наукові праці опубліковано у співавторстві з Філімоновою Н.І., Диким І.Л., Дикою О.М., Гаман Д.В, Спиридоновим Д.А., Шевельовою Н.Ю., Дубиніною Н.В та Шакун О.А. Особистий внесок автора наведено за текстом дисертаційної роботи, а також в авторефераті у списку фахових публікацій.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладені й обговорені на: науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2009), 72-ій Міжнародній науково-практичній конференції студентів і молодих учених «Актуальні проблеми теоретичної, клінічної, профілактичної медицини, стоматології та фармації» (Донецьк, 2010), науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2010), Х Міжконтинентальному медичному конгресі молодих вчених (Познань, 2010), VII Національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 2010), IIІ Міжнародному науковому міждисциплінарному конгресі студентів-медиків та молодих вчених (Харків, 2010), ІІ Международной студенческой научной конференции «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2010), ХХVІІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Ліки людині. Сучасні проблеми створення, вивчення та апробації лікарських засобів» (Харків, 2011), XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011), Всеукраїнській науково-практичній конференції «15 Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених» (Тернопіль, 2011), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Сучасні аспекти медицини і фармації» (Запоріжжя, 2011), Х Інтернаціональному конгресі медичної науки (Болгарія, 2011).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 23 наукові праці, у тому числі 6 статей у фахових виданнях, 14 тез доповідей; одержано 3 патенти України на корисну модель № 54687, № 54688 та № 56018.
Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 173 сторінках машинопису, складається зі вступу, чотирьох розділів, загальних висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Список використаної літератури містить 192 джерела, у тому числі 60 іноземних авторів. Робота ілюстрована 30 таблицями та 15 рисунками.
2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі наведено актуальність теми, мету та основні завдання досліджень, відзначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів.
У розділі 1 «Сучасні аспекти створення алергенів для імунодіагностики кандидамікозів» проаналізовані дані літератури з питань класифікації, етіології та патогенезу захворювань на кандидамікоз. Доведено, що сучасна діагностика цієї патології полягає у використанні імунних реакцій. Обґрунтована перспективність використання алергенів. Проаналізовано фармацевтичний ринок алергенів України та встановлено, що в Україні не випускається та не зареєстровано жодного алергену для діагностики кандидозної інфекції. Розглянуто особливості технології алергенів, відмічено основні недоліки та переваги, які виникають при створенні різних лікарських форм. Доведено доцільність створення алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції у формі розчину, на основі біомаси гриба C. albicans.
У розділі 2 «Обґрунтування загальної концепції та методів досліджень» представлено загальну концепцію досліджень, яка враховує особливості підходу до експериментального обґрунтування складу та технології розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції, надані характеристики похідних, діючих та допоміжних речовин, які були використанні для розробки складу алергену у формі розчину: гриб C. albicans штам ССМ 335-867, високомолекулярна фракція алергену гриба C. albicans, фосфатний буферний розчин рН 7,2 ± 0,2 (ДФУ І вид., с. 287), фенол (ДФУ І вид., с. 466).
Обґрунтовано вибір методик для проведення фізичних, біофармацевтичних, мікробіологічних та фармакологічних досліджень, які дозволяють об'єктивно оцінювати якість дослідних зразків та готового лікарського засобу на підставі одержаних та статистично оброблених результатів.
У розділі 3 «Розробка складу та технології розчину алергену для імунодіагностики кандидамікозів» наведено результати теоретичних та експериментальних досліджень з обґрунтування складу та технології виготовлення розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції на основі біомаси гриба C. albicans.
Першим етапом роботи був вибір поживного середовища для культивування біомаси гриба C. albicans. З цією метою були проведені мікробіологічні дослідження з вивчення виходу біомаси гриба при використанні різних поживних середовищ: агар Сабуро, кандида-агар, сусло агар та агар Чапека. На основі мікробіологічних досліджень на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного фармацевтичного університету під керівництвом професора І.Л. Дикого та на базі Державної установи «Інститут мікробіології та імунології ім. Мечнікова» нами було обрано оптимальне поживне середовище для культивування гриба - агар Сабуро.
Наступним етапом досліджень стало визначення оптимального екстрагенту для одержання білка з біомаси гриба C. albicans. Проведенні дослідження з вивчення динаміки накопичення білка в екстрактах при використанні таких екстрагентів: 5,0 % розчин натрію гідроксиду, 5,0% розчин кислоти хлористоводневої та 0,9 % розчин натрію хлориду при температурі 50 ± 2 єС (рис. 1).
Попередньо усі екстракти були доведені до рН 7,2 ± 0,2, проведена їх попередня фільтрація на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,8 мкм та стерилізувальна фільтрація на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,22 мкм.
Рис. 1. Динаміка накопичення білка в екстрактах
За результатами дослідження найбільшу кількість білка було одержано при використанні 5,0 % розчину натрію гідроксиду (табл. 1).
Таблиця 1 Хімічний склад екстрактів, одержаних при використанні різних екстрагентів
Екстракти |
Білки, мг/мл |
Полісахариди, мг/мл |
Нуклеїнові |
Час, години |
|
1 |
0,35 ± 0,02 |
1,17 ± 0,03 |
0,16 ± 0,02 |
24 |
|
2 |
0,30 ± 0,02 |
1,09 ± 0,03 |
0,09 ± 0,02 |
24 |
|
3 |
0,23 ± 0,02 |
1,02 ± 0,03 |
0,07 ± 0,02 |
24 |
Примітка. 1 - екстракція 5,0 % розчином натрію гідроксиду, 2 - екстракція 5,0 % розчином кислоти хлористоводневої, 3 - екстракція 0,9 % розчином натрію хлориду; n=7, P<0,5.
Моносахаридний склад екстрактів визначали за допомогою паперової хроматографії, він був представлений глюкозою, манозою, слідами рибози та двома не ідентифікованими моносахаридами.
Для визначення оптимальної технології інтенсифікації екстракції білка з біомаси гриба C. albicans проведені дослідження з вивчення динаміки накопичення білка в екстрактах з використанням 5,0 % розчину натрію гідроксиду при постійному перемішуванням лопатевою мішалкою зі швидкістю обертання 1000 об/хв при температурі 50 ± 2 єС або з ультразвуковою дезінтеграцією на апараті УЗУУ-21 при частоті 22 кГц, інтенсивності 5 Вт/см2, при тем-пературі 25 ± 2 °С (рис. 2).
Рис. 2. Динаміка накопичення білка в екстрактах
Одержані екстракти обробляли 5,0 % розчином кислоти хлористоводневої, поступово доводячи середовище до значення рН 7,2 ± 0,2, відділяли осад центрифугуванням при швидкості обертання 5000 об/хв протягом 30 хв, проводили попередню фільтрацію на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,8 мкм та стерилізувальну фільтрацію на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,22 мкм. Хімічний склад екстрактів наведено в табл. 2.
Таблиця 2 Хімічний склад екстрактів, одержаних фізико-хімічними методами
Алергенні екстракти |
Білки, мг/мл |
Полісахариди, мг/мл |
Нуклеїнові кислоти, мг/мл |
Час, години |
|
1 |
0,38 ± 0,02 |
1,21 ± 0,03 |
0,21 ± 0,02 |
1,5 |
|
2 |
0,36 ± 0,02 |
1,18 ± 0,03 |
0,17 ± 0,02 |
12 |
Примітка. 1 - екстракція 5,0 % розчином натрію гідроксиду з ультразвуком при 25 ± 2 єС; 2 - екстракція 5,0 % розчином натрію гідроксиду з перемішуванням при 50 ± 2 єС; n=7, P<0,5.
Моносахаридний склад екстрактів був таким же, як і в попередніх дослідженнях. За результатами дослідження найбільшу кількість біополімерів за найменший час було одержано при використанні 5,0 % розчину натрію гідроксиду у поєднанні з ультразвуком.
Для визначення оптимального співвідношення біомаси гриба C. albicans та 5,0 % розчину натрію гідроксиду були проведені дослідження з вивчення динаміка накопичення білка в екстрактах при таких їх співвідношеннях: 1 : 10, 1 : 50 та 1 : 100 (рис. 3).
Рис. 3. Динаміка накопичення білка в екстрактах
Подрібнену суху біомасу гриба C. albicans відважували та обробляли 5,0 % водним розчином натрію гідроксиду при температурі 25 ± 2 єС у поєднанні з ультразвуковою дезінтеграцією при частоті 22 кГц та інтенсивності 5 Вт/см2. Одержанні екстракти обробляли 5,0 % розчином кислоти хлористоводневої, поступово доводячи середовище до значення рН 7,2 ± 0,2. Відділяли осад центрифугуванням при швидкості обертання 5000 об/хв протягом 30 хв та проводили попередню фільтрацію на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,8 мкм і стерилізувальну фільтрацію на мембранних фільтрах з діаметром пор 0,22 мкм. Для приведення умов екстракцій до однакових параметрів так, як саме в такому випадку можливо порівняти результати, екстракти, одержані при співвідношенні біомаси гриба та екстрагента 1 : 10, розводили в десять разів, а екстракти, одержані при співвідношенні - 1 : 50, розводили в два рази, щоб порівняти їх за вмістом білка з екстрактом одержаним при співвідношенні біомаси гриба та екстрагента - 1 : 100. За результатами досліджень обрано співвідношення 1 : 10.
Після екстракції алергенного матеріалу проводили його очищення від баластних речовин, присутність яких в екстрактах небажана (можливі неспецифічні шкірні реакції та уповільнене формування специфічної відповіді). Для очищення використовували широко відомий у біохімії метод гель-фільтраційну хроматографію на колонках із Сефадексом G-100 згідно з ДФУ, який забезпечує глибоке очищення, шляхом розділення екстракту на окремі фракції за розмірами молекул (рис. 4).
Визначення складу одержаних фракцій екстракту гриба C. albicans, мало на меті дати біохімічну характеристику та порівняти біохімічний склад фракцій. У І фракції, об'єм якої становив 30 мл, концентрація білків становила 0,31 ± 0,02 мг/мл, полісахаридів - 3,23 ± 0,21 мг/мл (тобто білка було 9,3 мг, полісахаридів 96,9 мг/мл); у ІІ фракції, об'єм якої становив 50 мл, концентрація білків становила 0,57 ± 0,03 мг/мл, полісахаридів - 0,51 ± 0,03 мг/мл (тобто білка було 28,5 мг, полісахаридів 25,5 мг). Нуклеїнові кислоти були присутні в обох фракціях.
Рис. 4. Криві гель-фракціювання алергена на Сефадексі G-100
Для визначення перспективної фракції для імунодіагностики кандидозної інфекції були проведені скринінгові дослідження одержаних фракцій на моделі гомологічного та гетерологічного генералізованого кандидозу у мурчаків, які характеризуються специфічним імунітетом, що дозволяє досліджувати на цих тваринах такі імунологічні реакції, як шкірні проби при вивченні алерготестів кандидозної інфекції. Кожну фракцію, починаючи з 1 мкг білка в об'ємі 0,1 мл, вводили хворим тваринам внутрішньошкірно у депільовану ділянку шкіри на боці тварини. Результати проб визначали через 15-30 хвилин (реакція гіперчутливості негайного типу) та через 24-48 годин (реакція гіперчутливості уповільненого типу) у мм розмірів еритеми та папули, оцінювали за загальноприйнятою системою: слабо позитивна реакція (+) - почервоніння до 5 мм, позитивна (++) - почервоніння до 10 мм та (+++) - до 20 мм; різкопозитивна (++++) - почервоніння вище 20 мм та папула.
За результатами досліджень при введенні І фракції у концентрації 5 мкг/мл відбувається утворення еритеми та папули через 24-48 годин (реакція гіперчутливості уповільненого типа), тому цю дозу було обрано для подальших досліджень. Специфічні імунодіагностичні властивості І фракції екстракту гриба C. albicans досліджували на тваринах з модельованими гомологічним та гетерологічним генералізованими кандидамікозоми, викликаними грибом C. albicans штам ССМ 335-867 та C. tropicalis. штам ATCC 20336 (табл. 4).
Таблиця 4 Постановка шкірних проб з розчином алергену
Тварини |
Діаметр еритеми та папули через 24-48 години після введення І фракції |
||||
C. albicans |
C. tropicalis |
||||
Здорові (Контроль) |
Хворі (Дослід) |
Здорові (Контроль) |
Хворі (Дослід) |
||
1 |
3,1 |
20,2; 11,4 п |
3,3 |
10,2 |
|
2 |
3,2 |
19,1; 7,5 п |
3,1 |
17,1 |
|
3 |
2,4 |
20,2; 8,6 п |
2,6 |
15,2 |
|
4 |
4,3 |
22,3; 11,2 п |
2,3 |
9,3 |
|
5 |
3,7 |
18,5; 6,1 п |
2,7 |
18,5; 6,1 п |
|
6 |
3,2 |
20,2; 10 п |
4,2 |
4,2 |
|
7 |
2,5 |
20,8; 9,4 п |
2,3 |
6,8 |
|
8 |
4,2 |
19,6; 8,2 п |
3,1 |
19,4; 7,3 п |
|
9 |
3,6 |
21,4; 9,3 п |
2,5 |
12,4 |
|
10 |
3,1 |
19,1; 7,3 п |
4,2 |
9,1 |
Примітка. п - папула.
Згідно з одержаними даними І фракція екстракту гриба C. albicans виявляє 100 % хворих тварин на гомологічний кандидамікоз, викликаний грибом C. albicans та 20 % хворих тварин (наявність папули) на гетерологічний кандидамікоз. Встановлено амінокислотний склад І фракції.
На стадії розробки складу розчину алергену гриба C. albicans необхідно було обґрунтувати розчинник. Для дослідження, згідно з рекомендаціями ДФУ, було обрано такі розчинники: 50,0 % розчин гліцерину з рН 7,2 ± 0,2, фосфатний буферний розчин з рН 7,2 ± 0,2 та ізотонічний 0,9 % розчин натрію хлориду з рН 7,2 ± 0,2. При шкірному тестуванні усі розчинники зберігали активність алергену. Враховуючи, що фосфатний буферний розчин зберігає постійне значення рН, його було обрано для подальших досліджень.
Досліджено вплив на активність алергену таких консервантів: метилпарагідроксибензоат (ніпагін), пропілпарагідроксибензоат (ніпазол), фенол, кислота сорбінова, кислота бензойна, спирт бензиловий. При виборі консерванта враховували вимоги, які ставляться до цієї групи речовин: активність відносно широкого спектра мікроорганізмів, повільне формування резистентних варіантів мікроорганізмів, прояв антимікробних властивостей у широкому діапазоні рН, відсутність специфічного запаху, кольору та смаку, сумісність з основними компонентами лікарської форми, безпечність.
За результатами досліджень встановлено, що кислота сорбінова, спирт бензиловий та кислота бензойна знижують активність алергену гриба C. albicans, а ніпазол, ніпагін та фенол не впливають на активність алергену. За даними літератури, серед цих консервантів ніпагін наймеш ефективний проти пліснявих грибів, грамнегативних мікроорганізмів; рекомендується використовувати його разом з ніпазолом. Необхідно зазначити, що кількість фенолу в одній діагностичній дозі об'ємом 0,1 мл надзвичайно мала 0,00025 мл, крім того, він добре себе зарекомендував як консервант для алергенів. Отже, для подальших досліджень було обрано фенол і ніпазол.
Обґрунтування концентрації обраних консервантів здійснювали згідно з методикою ДФУ (5.1.3. Ефективність антимікробних консервантів). Дослідні зразки інокулювали тест-мікроорганізмами S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans, A. niger та проводили дослідження з вивчення кількості життєздатних мікроорганізмів протягом 28 діб.
Нами було проведене дослідження ефективності антимікробної консервувальної дії консервантів ніпазолу у концентрації 0,2 % та фенолу у концентраціях 0,2 %, 0,25 % у розчинах алергену гриба C. albicans. У результаті досліджень встановлено, що за ефективністю консервувальної дії критерію А ДФУ відповідав консервант фенол у концентрації 0,25 %.
На підставі проведених досліджень був запропонований такий склад розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції на основі гриба C. albicans під умовною назвою «Кандидасін» на 1 мл:
Білки та полісахариди клітини гриба C. albicans (концентрація білка в екстракті 5 мкг/мл) - 0,0005 г
Фенол (0,25 %) - 0,0025 мл
Фосфатний буфер (з рН 7,2 ± 0,2) - до 1 мл
Технологія приготування розчину алергену гриба C. albicans передбачає використання підвищених температур. Тому для обґрунтування критичної температури проведення технологічного процесу було вивчено вплив цього чинника на специфічну активність алергену. За результатами досліджень встановлено, що при температурі вище 55 єС та часі експозиції 120 хв, алерген зменшує свою активність на порядок. Враховуюче це, висушування біомаси гриба C. albicans проводили при температурі 50 ± 2 єС.
Одним з важливих технологічних та біофармацевтичних аспектів виробництва розчину алергену є величина рН, яка значною мірою впливає на активність алергену. Результати досліджень свідчать про те, що алерген гриба C. albicans виявляє стабільність у діапазоні рН від 4,0 до 10,0.
На рис. 5 зображена технологічна схема виробництва розчину алергену під умовною назвою «Кандидасін».
У розділі 4 «Фізико-хімічні та біологічні методи дослідження розчину алергену під умовною назвою «Кандидасін» наведені результати розробки методик аналізу розчину алергену, а також дослідження його фізико-хімічних та біологічних властивостей. Якість розчину оцінювали за всіма показниками, які визначені ДФУ, що до розчину алергенів: опис, якісне та кількісне визначення речовин у складі розчину алергену, стерильність, герметичність контейнера, об'єм контейнера та активність алергену.
Якісне визначення білкового алергенного матеріалу проводили одночасно з кількісним згідно з вимогами ДФУ. Якісне і кількісне визначення фенолу проводили згідно з вимогами ДФУ.
Рис. 5. Технологічна схема виробництва розчину алергену «Кандидасін»
Розроблений розчин алергену під умовною назвою «Кандидасін» є стерильним продуктом, тому необхідно було визначити термін придатності після першого розкриття первинної упаковки. Термін придатності визначали шляхом розкриття упаковки і наступного визначення стерильності. Стерильність визначали через кожну годину після першого розкриття первинної упаковки. Розчин залишався стерильним протягом 7 годин.
Для дослідження були виготовленні й закладенні на зберігання 2 зразки розчину алергену «Кандидасін» різних серій у скляних флаконах з прозорого та непрозорого нейтрального скла 1 класу.
Якість розчину в процесі зберігання оцінювали за всіма показниками, які визначаються ДФУ, щодо алергенів: опис, якісне та кількісне визначення речовин у складі розчину алергену, стерильність, герметичність контейнера, об'єм контейнера та активність алергену. Розчин зберігали при 2-х температурних режимах: в умовах холодильника від 2 єС до 8 єС та при кімнатній температурі від 15 єС до 25 єС.
При вивченні стабільності розчину алергену встановлено, що він є стабільним протягом 2 років зберігання в скляному флаконі без доступу світла при температурі зберігання від 2 єС до 8 єС.
Специфічну активність розчину алергену «Кандидасін» визначали на мурчаках. Розчин алергену «Кандидасін» в об'ємі 0,1 мл з концентрацією 5 мкг/мл білка вводили внутрішньошкірно здоровим мурчакам у депільовану ділянку шкіри на боці тварини та визначали результати. Інших тварин внутрішньочеревинно заражали інфектом гриба C. albicans. Після розвитку генералізованого кандидамікозу, на 20 день після зараження, тваринам вводили розчин алергену «Кандидасін» в об'ємі 0,1 мл з концентрацією 5 мкг/мл білка внутрішньошкірно у депільовану ділянку шкіри на боці тварини та визначали результати.
При внутрішньошкірному введені здоровим тваринам алергену гриба C. albicans результати були негативні - незначне подразнення шкіри з розміром еритеми 3,3 ± 0,3 мм; у хворих тварин результати були позитивні - розміри еритеми та папули в середньому становили 20,1 ± 0,3 мм та відповідно 8,2 ± 2,1 мм (табл. 5).
Профіль антигену розчину алергену «Кандидасін» визначали на мурчаках згідно вимог ДФУ: за якісним показником - поява еритеми та папули та кількісним - розміри еритеми 20,1 ± 0,3 мм та папули 8,2 ± 2,1 мм відповідно до попередньо одержаних результатів.
Дослідження імунодіагностичної активності проводили на базі Державної Установи «Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова» під керівництвом доктора фармацевтичних наук, старшого наукового співробітника А.В. Мартинова.
Таблиця 5 Шкірні проби з алергеном «Кандидасін»
Тварини |
Діаметр еритеми та папули через 24-48 годин після введення |
||
до зараження |
після зараження |
||
1 |
Еритема - 3,1 |
Еритема - 20,2; папула - 11,4 |
|
2 |
Еритема - 3,2 |
Еритема - 19,1; папула - 7,5 |
|
3 |
Еритема - 2,4 |
Еритема - 20,2; папула - 8,6 |
|
4 |
Еритема - 4,3 |
Еритема - 22,3; папула - 11,2 |
|
5 |
Еритема - 3,7 |
Еритема - 18,5; папула - 6,1 |
|
6 |
Еритема - 3,2 |
Еритема - 20,2; папула - 10 |
|
7 |
Еритема - 2,5 |
Еритема - 20,8; папула - 9,4 |
|
8 |
Еритема - 4,2 |
Еритема - 19,6; папула - 8,2 |
|
9 |
Еритема - 3,6 |
Еритема - 21,4; папула - 9,3 |
|
10 |
Еритема - 3,1 |
Еритема -19,1; папула - 7,3 |
|
x ± t Sx |
Еритема - 3,3 ± 0,3 |
Еритема - 20,1 ± 0,3, папула - 8,2 ± 2,1 |
Аномальну токсичність розчину алергену «Кандидасін» вивчали на двох видах тварин: мишах та мурчаках. 0,1 мл розчину алергену «Кандидасін» з концентрацією 5 мкг/мл білка вводили внутрішньочеревинвно п'яти білим мишам та двом мурчакам. Спостереження за тваринами проводили протягом 7 діб. У результаті дослідження встановлено, що розроблений препарат «Кандидасін» нетоксичний. культивування алерген кандидозний інфекція
Аналіз результатів проводили методами, зазначеними у ДФУ ст. 5.3 «Статистичний аналіз результатів біологічних випробувань і кількісних визначень».
ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ
1. На підставі мікробіологічних, фізико-хімічних та біологічних досліджень з використанням системного підходу розроблено науково обґрунтований оригінальний склад та раціональну технологію розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції.
2. Мікробіологічними дослідженнями встановлено, що агар Сабуро є найбільш оптимальним поживним середовищем для культивування при температурі 23 ± 2 єС гриба C. albicans, на основі якого розроблено розчин алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції.
3. Експериментально обґрунтована оптимальна технологія екстрагування білка та полісахаридів з біомаси гриба C. albicans шляхом поєднання фізико-хімічних методів: екстракцією 5,0 % розчином натрію гідроксиду з ультразвуком. Визначено оптимальне співвідношення біосировини та екстрагенту (1 : 10), а також час експозиції дії ультразвуку 15 хв при температурі 25 ± 2 єС.
4. За результатами проведених біохімічних досліджень встановлено склад одержаного екстракту гриба C. albicans, який містить білки, полісахариди та нуклеїнові кислоти. Визначено моносахаридний склад полісахаридів, до якого входять маноза, глюкоза та сліди рибози.
5. Враховуючи, що низькомолекулярні речовини здатні впливати на результати імунодіагностики кандидозної інфекції, фізико-хімічними та біологічними дослідженнями обґрунтовано технологію очищення екстракту гриба С. albicans від баластних низькомолекулярних речовин методом гель-хроматографії на Сефадексі G-100;
6. За результатами біологічних досліджень на моделі генералізованого кандидамікозу у мурчаків обрано високомолекулярну фракцію, яка при внутрішньошкірному введенні в об'ємі 0,1 мл з концентрацією білка 5 мкг/мл через 24-48 годин викликає утворення еритеми 18-22 мм та папули 5-10 мм, тобто спричиняє реакцію гіперчутливості уповільненого типу. Встановлено амінокислотний склад фракції з домінуванням гліцину, дещо в меншій кількості виявлено гістидин та лізин, які мають лужну природу.
7. Для створення розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції біологічними дослідженями на моделі генералізованого кандидамікозу у мурчаків експериментально обґрунтовано розчинник - фосфатний буферний розчин з рН 7,2 ± 0,2, який не впливає на активність алергену та забезпечує протягом тривалого часу постійне значення рН.
8. На підставі фармакопейного тесту «Ефективність антимікробних консервантів» встановлено оптимальну концентрацію консерванту фенолу - 0,25 %, присутність якого забезпечує мікробіологічну чистоту, зокрема й після розкриття первинної упаковки.
9. У результаті проведених комплексних досліджень розроблено раціональну технологію розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції, важливим параметром якої є поєднання фізико-хімічних методів екстракції білка та полісахаридів, очищення від баластних низькомолекулярних речовин, а також температурні режими та значення рН. Встановлено, що температура під час висушування біомаси гриба С. albicans повинна дорівнювати 50 ± 2 єС при експозиції 120 хв. рН розчину алергену може знаходитися в межах від 4,0 до 10,0.
10. Експериментально встановлено тип упаковки, умови та термін зберігання розробленого розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції: розчин алергену є стабільним протягом 2 років зберігання при температурі 2-8 єС у флаконах з непрозорого нейтрального скла першого класу.
11. Опрацьовані методи ідентифікації та кількісного визначення вмісту діючих речовин у розчині алергену «Кандидасін». Досліджені основні показники якості розробленого розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції, розроблено проект методів контролю якості (МКЯ).
12. Проведені біологічні та фізико-хімічні дослідження розробленого складу розчину алергену під умовною назвою «Кандидасін» дають змогу запропонувати його як ефективний та нешкідливий алерген для імунодіагностики кандидозної інфекції.
13. Розроблено проект технологічного промислового регламенту на виробництво розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції та проведено його апробацію в умовах промислового виробництва ТОВ МНВЦ «Біосан» (акт апробації від 15.12.2010 р).
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Наукові статті у фахових виданнях
1. Біотехнологічне обґрунтування актуальності розробки нового імунодіагностичного препарату на основі біомаси гриба Candida albicans / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова, Н. Ю. Шевельова, Д. В. Гаман // Український біофармацевтичний журнал. - 2010. - Т. 11, № 6. - С. 75-82. (Особистий внесок - аналіз літературних джерел, планування та проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, оформлення статті).
2. Дослідження амінокислотного складу екстракту грибів Candida albicans / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова, О. М. Дика, Н. В. Дубиніна // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. - 2010. - Т. 5, № 4. - С. 32-37. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень та узагальненні результатів, оформлення статті).
3. Рибалкін М. В. Визначення специфічної активності та аномальної токсичності розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції / М. В. Рибалкін // Запорожский медицинский журнал. - 2011. - Т. 13, № 4. - С. 132-134. (Особистий внесок - планування та проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, оформлення статті).
4. Розробка складу розчину алергену на основі гриба Candida albicans для виявлення кандидозної інфекції / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова, Д. А. Спиридонов, Н. В. Дубиніна // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. - 2011. - Т. 6, № 1. - С. 109-113. (Особистий внесок - підготовка зразків, планування та проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, оформлення статті).
5. Філімонова Н. І. Дослідження алергенних біополімерів, одержаних шляхом поєднання ультразвукової та хімічної обробки біомаси грибів роду Candida albicans / Н. І. Філімонова, І. Л. Дикий, М. В. Рибалкін // Запорожский медицинский журнал. - 2010. - Т. 12, № 3. - С. 123-125. (Особистий внесок - планування та проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, оформлення статті).
6. Фракційне розділення та імунодіагностичні скринінгові дослідження алергенів грибів Candida / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова, О. М. Дика, О. А. Шакун // Український біофармацевтичний журнал. - 2010. - Т. 9, № 4. - 68-72. (Особистий внесок - підготовка зразків, планування та проведення експериментальних досліджень, статистична обробка результатів, оформлення статті).
7. Пат. 54687 UA, МПК (2009) А61К 36/06; А61К 41/00; А61Р 43/00. Спосіб одержання імунологічного препарату для алергодіагностики кандидозної інфекції / Філімонова Н. І., Рибалкін М. В., Дика О. М., Сілаєв А. О., Бойко М. М.; Національний фармацевтичний університет. - № 2010 03969; заявл. 06.04.2010; опубл. 25.11.2010, Бюл. № 22. - 4 с. (Особистий внесок - патентний пошук, розробка технології одержання алергену кандидозної інфекції, підготовка формули винаходу та опису до патенту, оформлення патенту).
8. Пат. 54688 UA, МПК (2009) А61К 36/06; А61К 41/00; А61Р 43/00. Імунологічний препарат для алергодіагностики кандидозної інфекції / Філімонова Н. І., Рибалкін М. В., Дика О. М., Шевельова Н. Ю., Гаман Д. В.; Національний фармацевтичний університет. - № 2010 03970; заявл. 06.04.2010; опубл. 25.11.2010, Бюл. № 22. - 4 с. (Особистий внесок - патентний пошук, розробка складу та технології алергену кандидозної інфекції, підготовка формули винаходу та опису до патенту, оформлення патенту).
9. Пат. 56018 UA, МПК (2011.01) А61К 36/06; А61К 41/00. Спосіб одержання алергодіагностичного препарату кандидозної інфекції / Філімонова Н. І., Рибалкін М. В., Дика О. М., Гейдеріх О. Г., Бойко М. М.; Національний фармацевтичний університет. - № 2010 03964; заявл. 06.04.2010; опубл. 27.12.2010, Бюл. № 24. - 4 с. (Особистий внесок - патентний пошук, обробка первинної інформації, систематизація та інтерпретація отриманих результатів, розробка технології одержання розчину алергену, підготовка формули винаходу та опису до патенту, оформлення патенту).
10. Рыбалкин Н. В. Разработка технологии очистки иммунологического препарата на основе грибов рода Candida albicans для аллергодиагностики кандидозной инфекции / Н. В. Рыбалкин, В. Г. Светяш, Н. И. Филимонова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : материалы ІІІ Всерос. науч. конф. с междунар. участием, посвященной 75-летию Курского государственного медицинского университета. - Курск : ГОУ ВПО КГМУ Роздрава, 2010. - С. 137-140. (Особистий внесок - аналіз літературних джерел, планування та проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, оформлення статті).
11. Рибалкін М. В. Перспективні напрямки в удосконаленні антифунгальної терапії та алергодіагностики кандидозів / М. В. Рибалкін // Актуальні питання створення нових лікарських засобів : матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. студентів та молодих вчених, м. Харків, 23-24 квіт. 2009 р. - Х. : Вид-во НФаУ, 2009. - С. 179.
12. Рибалкін М. В. Актуальність розробки алергодіагностикуму вісцеральних кандидозів та кандидозів печінки / М. В. Рибалкін // Хвороби печінки в клінічній практиці : матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю, м. Харків, 26-27 берез. 2009 р. - Х. : ФО-П Азамєва В.П., 2009. - С. 145.
13. Рибалкін М. В. Біотехнологічні аспекти розробки алергодіагностикуму кандидозної інфекції / М. В. Рибалкін // Біологія: від молекули до біосфери : матеріали ІV Міжнар. конф. молодих науковців, м. Харків, 17-21 листоп. 2009 р. - Х. : ППВ Новое слово, 2009. - C. 30.
14. Рибалкін М. В. Експериментальне моделювання генералізованого кандидозу у гвінейських свинок та його патологоанатомічна діагностика / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова // Актуальні проблеми клінічної, експериментальної, профілактичної медицини, стоматології та фармації : програма та матеріали 72-ї Міжнар. наук.-практ. конф. молодих вчених, м. Донецьк, 14-16 квіт. 2010 р. - Д. : Каштан, 2010. - C. 29.
15. Rybalkin M. V. Protein and polysaccharidic determinants of fungus Candida albicans allergen / M. V. Rybalkin, D. V. Gaman, N. I. Filimonova // 3-rd International Scientific Interdisciplinary Congress for medical students and young doctors. National Medical University, с. Kharkiv, 14-16 apr. 2010 у. - K. : KNMU, 2010. - P. 36.
16. Рибалкін М. В. Технологічні методи одержання алергенних ізолятів клітин гриба Candida albicans / М. В. Рибалкін, Д. В. Гаман, Н. І. Філімонова // Актуальні питання створення нових лікарських засобів : матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. студ. та молодих вчених, м. Харків 21-22 квіт. 2010 р. - Х. : Вид-во НФаУ, 2010. - С. 208.
17. Rуbalkin M. V. Allergens of Candida / M. V. Ribalkin, D. V. Gaman // X Intercontenental congres of yong medical scientists, с. Poznan 17-21 may 2010 у. - Poznan : PUMS, 2010. - P. 122.
18. Рибалкін М. В. Дослідження активності алергенів грибів Candida з різними стабілізаторами та консервантами при різних умовах зберігання / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова // Фармація України. Погляд у майбутнє : матеріали VІІ Нац. з'їзду фармацевтів України (Харків, 15-17 верес. 2010 р.) у 2 т. - Х. : Вид-во НФаУ, 2010. - T. 1. - С. 396.
19. Рыбалкин Н. В Исследование диагностических свойств иммунологического препарата на основе аллергенов Candida albicans при выявлении кандидозной инфекции / Н. В. Рыбалкин // Клинические и теоретические аспекты современной медецины : материалы ІІ Междунар. студен. науч. конф с участием молодых ученых, г. Москва, 22-23 апр. 2010 г. - М. : РУДН, 2010. - С. 225.
20. Рибалкін М. В. Визначення амінокислотного складу екстракту гриба Candida albicans / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова, Д. В. Гаман // Медицина третього тисячоліття : збірник тез міжвуз. конф. молодих вчених та студентів, м. Харків, 18-19 січ. 2011 р. - Х. : ХНУРЕ, 2011. - С. 21.
21. Рибалкін М. В. Імунологічні дослідження фракцій алергенів Сandida при виявленні кандидамікозів / М. В. Рибалкін, Н. І. Філімонова // Ліки людині. Сучасні проблеми створення, вивчення та апробації лікарських засобів : матеріали XXVIII Всеукр. наук.-практ. конф. з міжнар. участю, м. Харків, 3 лют. 2011 р. - Х. : Вид-во НФаУ, 2011. - С. 113-114.
22. Гаман Д. В. Разработка технологии очищения аллергенного экстракта Candida albicans / Д. В. Гаман, Н. В. Рыбалкин, Н. И. Филимонова // Человек и лекарство : материалы XVIII Рос. нац. Конгр., г. Москва, 12-15 апр. - М. : ОАО Щербинская типография, 2011. - С. 501-502.
23. Рибалкін М. В. Дослідження впливу допоміжних речовин на активність алергену гриба Candida albicans для імунодіагностики кандидамікозів / М. В. Рибалкін : матеріали ХV Міжнар. медичного конгр. студентів та молодих вчених, м. Тернопіль, 27-29 квіт. 2011 р. - Тернопіль : Укрмедкнига, 2011. - С. 365.
АНОТАЦІЯ
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.01 - технологія ліків, організація фармацевтичної справи та судова фармація. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2011.
На підставі фізико-хімічних та біохімічних досліджень запропоновано метод одержання алергену з біомаси гриба C. albicans шляхом поєднання дії екстрагенту 5,0 % натрію гідроксиду та ультразвуку. На підставі фізико-хімічних та біологічних досліджень запропоновано склад розчину алергену під умовною назвою «Кандидасін», який містить білки та полісахариди, фосфатний буферний розчин рН 7,2 ± 0,2 та консервант фенол у концентрації 0,25 %.
Розроблені методи стандартизації розчину алергену для імунодіагностики кандидозної інфекції та проведені комплексні дослідження.
Доведена висока імунодіагностична активність та стабільність розчину алергену у процесі зберігання.
Ключові слова: «Кандидасін», алерген, розчин, кандидозна інфекція.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.01 - технология лекарств, организация фармацевтического дела и судебная фармация. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2011.
В диссертации приведено теоретическое и экспериментальное обоснование состава и технологии изготовления нового диагностического аллергена в форме раствора для иммунодиагностики кандидозной инфекции, который содержит белки и полисахариды клеток гриба C. albicans.
Раствор аллергена выявляет скрытые формы кандидоза, которые сложно установить при использовании других методов лабораторной диагностики, является эффективным диагностическим средством природного происхождения, не обладает побочными эффектами.
При изучении питательных сред, которые используются для культивирования биомассы гриба C. albicans было установлено, что оптимальной питательной средой является агар Сабуро. Гриб культивировали в матрасе при температуре 23 ± 2 єС на протяжении 12 дней. Каждые 6 дней биомассу гриба проверяли на микробиологическую чистоту визуально и методом микроскопирования. Полученную биомассу гриба смывали 0,9 % раствором натрия хлорида, центрифугировали в течении 30 мин при скорости вращения 5000 об/мин. Осадок высушивали в термостате при температуре 50 ± 2 єС в течение 120 минут, остаточная влажность биомассы составляла 5-7 %. Сухую биомассу гриба измельчали в ступке и подвергали экстракции.
При изучении различных экстрагентов (5,0 % раствора натрия гидроксида, 5,0 % раствора кислоты хлористоводородной и 0,9 % натрия хлорида) для обеспечения эффективной экстракции белка из клеток гриба C. albicans установлено, что 5,0 % раствор натрия гидроксида обеспечивает максимальную экстракцию биополимеров. Чтобы ускорить и увеличить выход биополимеров при их экстрагировании из биомассы гриба, было исследовано влияние ультразвука при температуре 25 ± 2 єС или постоянного перемешивания при температуре 50 ± 2 єС при использовании лопостной мешалки со скоростью вращения 1000 об/мин. Результаты исследований показали значительные преимущества использования ультразвука в сочетании с экстрагентом - 5,0 % раствор натрия гидроксида при температуре 25 ± 2 єС. При изучении различных соотношений биомассы гриба и экстрагента при различных экспозициях ультразвука установлено оптимальное соотношение 1:10 и время экспозиции ультразвука 15 мин при температуре 25 ± 2 єС.
Полученный экстракт подвергали предварительной фильтрации на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,8 мкм и стерилизующей фильтрации на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильный экстракт очищали методом гель-хроматографии на колонках с Сефадексом G-100, в результате чего было получено две фракции: высокомолекулярная и низкомолекулярная. Каждую фракцию исследовали на иммунодиагностическую активность методом кожных проб на модели гомогенного и гетерогенного генерализованного кандидоза у морских свинок. Фракции вводили внутрикожно в объеме 0,1 мл в депилированный участок кожи на боку животного с различной концентрацией белка, результаты реакции определяли по размеру эритемы и папулы через 10-15 мин и через 24-48 часов. Высокомолекулярная фракция проявляла высокую иммунодиагностическую активность с концентрацией белка 5 мкг/мл: через 24-48 часов после введения аллергена размер эритемы был 18-22 мм, а размер папулы 8-10 мм. Реакция была идентифицирована как реакция гиперчувствительности замедленного типа
На следующем этапе исследований был разработан состав раствора аллергена для иммунодиагностики кандидозной инфекции. В качестве растворителя был использован фосфатный буферный раствор с рН 7,2 ± 0,2, который способен сохранять постоянное значение рН и не влияет на активность аллергена. Для обеспечения стерильности разрабатываемой лекарственной формы в результате исследований из широкого ряда консервантов (нипагин, нипазол, фенол, кислота сорбиновая, кислота бензойная, спирт бензиловый ) был выбран фенол в количестве 0,25 %, концентрация которого была определена согласно методике ГФУ и не влияет на активность аллергена. С целью разработки оптимальной технологии раствора аллергена для иммунодиагностики кандидозной инфекции исследовано влияние температуры и рН на активность аллергена. Результаты исследований свидетельствуют о стабильности аллергена гриба C. albicans в диапазоне рН от 4,0 до 10,0 и при температуре 55 ± 2 єС в течении 120 мин.
Разработаны методики идентификации и количественного определения действующих веществ в растворе аллергена. Белок и фенол предложено определять согласно методике ГФУ. Установлено, что препарат является стабильным в течение 2 лет хранения при температуре от 2 єС до 8 єС во флаконе из непрозрачного нейтрального стекла первого класса.
Биологическими исследованиями in vivo установлено, что раствор аллергена «Кандидасин» обладает выраженной иммунодиагностической активностью на модели генерализованного кандидамикоза у морских свинок. Исследована аномальная токсичность раствора аллергена «Кандидасин» и установлено, что аллерген нетоксичен.
Ключевые слова: «Кандидасин», аллерген, раствор, кандидозная инфекция.
Dissertation for candidates of pharmacy degree in speciality 15.00.01 - Technology of drugs, organization of pharmaceutical business and forensic pharmacy. - National University of Pharmacy, Kharkiv, 2011.
On the basis of physical-chemical and biochemical researches the method of allergen obtaining from the Candida albicans fungus biomass with by means of extractant 5% sodium hydroxide combining and ultrasound has been proposed. The allergen solution composition under codename «Сandidasin», containing lipids and polysaccharides, phosphate-buffered solution, pH 7,2+0,2 and 0,25 % phenol concentration preservative has been proposed on the base of physical-chemical and biochemical researches.
...Подобные документы
Обґрунтування вибору біологічного агента та середовища для його культивування. Обґрунтування способу культивування і типу ферментера для отримання правцевого токсину. Процес біосинтезу правцевого анатоксину. Контроль виробництва правцевого токсину.
курсовая работа [476,6 K], добавлен 24.06.2015Сумісність лікарської речовини й антимікробного консерванту, обґрунтування складу, показників якості, матеріалу первинного пакування і технології одержання очних крапель на основі кромоглікату натрію, їх стабільність в процесі виробництва і зберігання.
автореферат [38,8 K], добавлен 10.04.2009Гострі респіраторні вірусні інфекції як велика група клінічно та морфологічно подібних гострих запальних захворювань, що викликаються пневмотропними вірусами. Грип, парагрип, аденовірусна і респіраторно-синцитіальна інфекції як найбільш значущі.
курсовая работа [35,6 K], добавлен 10.06.2010Небезпека загальної хірургічної інфекції (сепсису) для життя людини. Розвиток сепсису в разі запізнілої діагностики та неефективного лікування місцевих форм гнійної інфекції. Ознаки сепсису, критерії його класифікації. Характеристика збудників інфекції.
реферат [54,2 K], добавлен 04.02.2012Проблеми розвитку ВІЛ-інфекції. Створення посібника для поширення інформації щодо лікування та профілактики синдрому набутого імунодефіциту. Контроль за безпекою щодо зараження СНІДом медичних працівників під час виконання ними професійних обов'язків.
отчет по практике [29,9 K], добавлен 14.12.2010Мікоплазмові інфекції – провідне місце серед інфекцій, що передаються статевим шляхом. Ефективність лікування урогенітального мікоплазмозу у жінок за рахунок раціональної системи діагностики, лікування і контролю ерадикації мікоплазмової інфекції.
автореферат [44,4 K], добавлен 06.04.2009Розробка науково обгрунтованого складу, технології та методик контролю якості вагінальних супозиторіїв з Протефлазідом. Вивчення провідної можливості використання культури клітин крові для дослідження імунної активності розчинних лікарських засобів.
автореферат [105,9 K], добавлен 04.04.2009Харчові інфекції та їх виникнення. Дизентерія, черевний тиф та паратифів А, В, С, холера, зоонозі, бруцельоз, сібірка (сибірська виразка), туляремія, ящур - афтозна лихоманка. Характеристика хвороб, їх розповсюдження, попередження та профілактика.
реферат [17,2 K], добавлен 21.11.2008Клінічні аспекти використання маніту в інтенсивній терапії. Переваги ін'єкційного шляху введення ліків. Характеристика сировини, матеріалів та готового препарату. Стадії технологічного процесу виробництва розчину маніту, вибір та розрахунок обладнання.
дипломная работа [465,1 K], добавлен 19.12.2011Аналіз процесу отримання бензилпеніциліну шляхом мікробіологічного синтезу. Опис основних стадій технології виробництва антибіотиків. Характеристика об’єкту біосинтезу. Підготовка посівного матеріалу. Стерилізація поживного середовища. Процес ферментації.
курсовая работа [1,1 M], добавлен 17.05.2011Стан імунної системи у жінок, які страждають дисменореєю при поєднаних формах урогенітальної інфекції, гормональна насиченість пацієнток. Методи комплексного лікування дисменореї, розробка практичних рекомендацій щодо тактики ведення хворих жінок.
автореферат [38,0 K], добавлен 06.04.2009Особливості клінічних проявів гострого та хронічного гепатиту В залежно від генотипу та геноваріанта НВV. Методика прогнозування перебігу та можливих наслідків НВV-інфекції з врахуванням типу імунологічного реагування організму та генотипу вірусу.
автореферат [253,3 K], добавлен 09.03.2009Роль лабораторної діагностики в системі протиепідемічних заходів та профілактики вірусних захворювань. Діяльність лабораторії діагностики інфекції вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ) та опортуністичних хвороб. Процес первинної активації репродукції ВІЛ.
отчет по практике [926,6 K], добавлен 16.12.2013Аналіз поняття внутрішньолікарняних інфекцій, пов'язаних з перебуванням, лікуванням, обстеженням і зверненням за медичною допомогою в лікувально-профілактичний заклад. Обов’язки та організація роботи медичної сестри з ЛФК. Заходи профілактики інфекції.
реферат [28,9 K], добавлен 25.08.2013Виникнення генітальної герпетичної інфекції, симптоми та причини захворювання. Аналіз фармакологічної дії сучасного арсеналу лікарських препаратів протигерпетичної спрямованості. Підвищення рівня діагностики та ефективності лікування і профілактики.
автореферат [38,1 K], добавлен 12.03.2009Антиретровірусна терапія як основа лікування ВІЛ-інфекції. Перші випадки ВІЛ-інфекції серед громадян України. Стадії розвитку синдрому набутого імунодефіциту людини (СНІД). Діагностика хвороби, основні методи лікування. Перспективи в лікуванні СНІДу.
курсовая работа [1,4 M], добавлен 07.04.2014Епідеміологія, поширеність, особливості клінічного перебігу та комплексне лікування дітей з гнійною хірургічною інфекцією кісток і суглобів шляхом удосконалення методів хірургічної санації патологічного вогнища інфекції. Загальні результати лікування.
автореферат [57,2 K], добавлен 19.03.2009Результати експериментальних досліджень із розробки технології виготовлення на основі модифікованого штаму ВК-1М вірусу діареї вакцини живої культуральної проти вірусної діареї та вивчення її імуногенної ефективності в лабораторних і виробничих умовах.
автореферат [317,9 K], добавлен 11.04.2009Загальні відомості про захворювання. Сутність фізичної реабілітації. Обов'язкові складові будь-якого короткочасного курсу хіміотерапії. Особливість туберкульозної інфекції. Засоби профілактики гастриту. Лікувальна фізкультура при деяких формах хвороби.
курсовая работа [84,1 K], добавлен 31.01.2014Інфекції сечової системи. Результати досліджень імунопатогенезу урогенітальних інфекцій за останнє десятиріччя. Помилки діагностики та лікування. Рівень резистентності виявлених збудників до антибактеріальних препаратів. Нозологічна характеристика хворих.
автореферат [142,7 K], добавлен 12.03.2009