Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Експериментальне дослідження фармакологічних властивостей екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Хімізація промисловості та сільського господарства призвела до зростання дії різних хімічних чинників на організм людини і тварин. Це обумовлено значним забрудненням навколишнього середовища різними токсикантами. Усі вони, залежно від умов, можуть порушити рівновагу між окиснювальними процесами та захисними системами в організмі та призвести до тяжких захворювань (Губский Ю.И., 1989; Губергриц Н.Б., 2002; Ивашкин В.Т., 2007).

Фармакотерапія гострих та хронічних гепатитів, особливо токсичних (алкогольної, хімічної, медикаментозної, радіаційної етіології), відноситься до актуальних питань сучасної медицини, оскільки значні структурні і функціональні зміни печінкових клітин за даної патології вимагають тривалого лікування та комплексного терапевтичного підходу. Традиційно хворим на гострий та хронічний гепатити призначаються різні за механізмом дії гепатопротектори (Хазанов А.И., 2009; Шаповалова І. О., 2010; O'Shea R.S., 2010; Савченкова Л.В., 2011).

Для лікування патології печінки застосовують вітаміни А, Е і С, групи В, мікроелементи - цинк, селен (Абдурахманов Д.Т., 2009). Гепатопротекторну дію проявляють деякі рослинні препарати з розторопші плямистої (легалон, карсил, лепротек), активною речовиною котрих є силімарин (Громовая В.Ф., 2008; Дроговоз С.М., 2008; Seeff L.B., 2008; Muriel P., 2008; Ивашкин В.Т., 2009). Але терапія патології печінки вітчизняними фітопрепаратами є недостатня та потребує пошуку нових ефективних, малотоксичних рослинних засобів.

Hippophaл rhamnoides L. є розповсюдженим видом, який зростає на території України. В офіційній медицині використовують плоди обліпихи крушиновидної (Fructus hippophaes), що містять олію, цукри, пектини, органічні кислоти, вітаміни А, Д, Е, С, К, В₁, В₂, В₆ (Лушпа В. І. 2004; Покровський Б.М., 2005; Липкан Г.Н. 2008), F, PP, фолієву кислоту, каротиноїди, поліфенольні сполуки (дубильні речовини), лейкоантоціани, флавоноли, катехіни, фенолкарбонові кислоти), клітковину, тритерпеноїди, фосфоліпіди, серотонін, мікро - (цинк, мідь, марганець, кобальт, залізо) і макроелементи (магній, натрій, калій, кальцій) (Косев П.А., 2000; Липкан Г.Н., 2008). Препарати на основі олії з обліпихи активно використовуються у медичній практиці для лікування різноманітних захворювань (Лавренова Г.В., 2007; Попова Т.П., 2008).

На сьогодні ґрунтовно доcліджується хімічний склад насіння, листків, деревини, гілок, коренів, кори коренів та їхні фармакологічні властивості з метою використання цих органів у медицині (Покровський Б.М., 2005; Стажила Є. М., 2010; Коновалова О.Ю., 2010). Відомості про хімічний склад бруньок недостатні. Тому актуальним є дослідження якісного та кількісного складу біологічно активних речовин (БАР) бруньок обліпихи крушиновидної й розробка заходів, спрямованих на використання їх як лікарської сировини, та виготовлення на основі бруньок обліпихи нового високоефективного вітчизняного лікарського засобу з гепатопротекторними властивостями.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом планової наукової теми кафедри фармакогнозії з медичною ботанікою Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського «Фармакогностичне вивчення деяких видів лікарських рослин» (№держ. реєстрації 0105U004109), в якій автор є співвиконавцем.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було експериментальне обґрунтування доцільності створення на основі екстракту чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної лікарського засобу з гепатопротекторною дією.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Провести фітохімічне дослідження чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної.

2. Порівняти якісний та кількісний вміст біологічно активних речовин у водному та спиртовому густих екстрактах з бруньок обліпихи.

3. Провести дослідження гострої та специфічних видів токсичності густого екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної.

4. Провести фармакологічний скринінг екстракту чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної та встановити його умовно терапевтичну дозу в умовах експериментального гострого тетрахлорметанового гепатиту.

5. Визначити гепатопротекторну активність екстракту з бруньок обліпихи в експерименті на тваринах з модельованими гострими токсичними гепатитами (тетрахлорметановий та тетрацикліновий) в порівнянні з силібором.

6. Встановити лікувальну ефективність екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної за умов хронічного токсичного гепатиту.

Об'єкт дослідження - фармакотерапія токсичних уражень печінки різного ґенезу.

Предмет дослідження - фармакологічна активність і механізм гепатопротекторної дії густого екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної.

Методи дослідження: Використовувався комплексний методичний підхід із застосуванням фармакологічних, біохімічних, гістологічних та статистичних методів дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше обґрунтовано можливість використання чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної як джерела отримання БАР для створення високоефективних лікарських препаратів та застосування лікарської сировини в офіційній медицині. Встановлено, що в чоловічих бруньках обліпихи крушиновидної вміст біологічно активних речовин змінюється протягом їх онтогенезу. Виявлено високий вміст вітамінів, макро - та мікроелементів, фенольних сполук, зокрема флавоноїдів (4,24 мг/100 г. абсолютно сухої сировини) у даній сировині.

Вперше запропоновано для корекції уражень печінки густий екстракт на основі чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної. Показано, що найбільш ефективною формою є густий екстракт, виготовлений на 70^о етиловому спирті. Доведена нетоксичність даної субстанції та встановлено, що екстракт відноситься до VІ класу токсичності - нешкідливі речовини. Запропонована умовно терапевтична доза густого екстракту - 100 мг/кг маси тіла тварин. В експерименті на тваринах з модельованим гострим тетрахлорметановим гепатитом та хронічним ураженням печінки тетрахлорметаном та етиловим спиртом доведена ефективність густого екстракту з чоловічих бруньок обліпихи як гепатопротекторного засобу з антиоксидантною та мембранопротекторною дією.

За результатами досліджень отримано патент України на корисну модель №62471 від 25.08.2011.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено оптимальні терміни заготівлі чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної в період найбільшого накопичення БАР. Рекомендовано проводити заготівлю бруньок у грудні місяці. Запропоновано виготовлення густого екстракту на основі бруньок обліпихи Підібрана умовно терапевтична доза екстракту за умов токсичного ураження печінки. Доведена гепатопротекторна активність екстракту з бруньок обліпихи, що дозволяє запропонувати подальше поглиблене вивчення з метою створення на його основі нового лікарського засобу.

Результати дисертаційної роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах: фармації Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова; фармацевтичних дисциплін Ужгородського національного університету; фармакології, хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету; фармакології з клінічною фармакологією Тернопільського державного медичного університету імені І. Я. Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначено мету та завдання дослідження, розроблено методичні підходи до їх реалізації. Автор самостійно провів огляд наукової літератури за темою дисертації, обґрунтував актуальність проблеми, виконав експериментальну частину, статистичний аналіз одержаних цифрових даних та їх узагальнення. Експериментальну частину роботи виконано на базі Центральної науково-дослідної лабораторії Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського» (атестат акредитації - серія КДЛ №001488 від 03.10.2003 р.).

У наукових працях, опублікованих у співавторстві, здобувачу належать збір і систематизація матеріалу, проведення досліджень, статистична обробка й аналіз результатів, підготовка публікацій до друку.

Апробація результатів роботи. Основні результати дисертації оприлюднені на Всеукраїнській науково-практичній конференції «Хімія природних сполук» (Тернопіль, 2005), Міжнародних медичних наукових конгресах студентів та молодих вчених (Тернопіль, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), Всеукраїнській науковій конференції «Проблеми і перспективи наук в умовах глобалізації» (Тернопіль, 2005), науково-практичній конференції «Безпечність ліків і фактори ризику небажаних ефектів фармакотерапії» (Тернопіль, 2010), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології, присвяченої 90-річчю проф. О.О. Столярчука «Клінічна та експериментальна фармакологія метаболічних коректорів, органопротекція, доказова медицина» (Вінниця, 2010).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 наукових праць, з них 6 у наукових журналах, включених ВАК України до переліку фахових видань, 9 у матеріалах конгресів та конференцій, 1 Деклараційний патент на корисну модель.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, списку літературних джерел, додатків. Роботу викладено на 167 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 24 таблицями та 21 рисунком. Список використаних джерел налічує 294 найменування, з них 75 латиницею.

Основний зміст роботи

спиртовий брунька обліпиха гепатопротекторний

Матеріали та методи дослідження. Об'єктами дослідження слугували чоловічі бруньки обліпихи крушиновидної, які заготовляли згідно правил заготівлі (Солодовниченко Н.М., 2001) в листопаді - березні 2006-2008 р.р. з особин, що зростають на території Тернопільської області, а також водні та спиртові екстракти з них.

На першому етапі досліджень проводили фітохімічне вивчення чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної та екстрактів на їх основі. Виявлення вмісту БАР (фенольних сполук, дубильних речовин, флавоноїдів, органічних кислот, вітамінів, каротиноїдів) здійснювали за допомогою реакцій ідентифікації та методів кількісного аналізу (Александрова А.П., 1985; Єрмаков А.И. и соавт., 1987; Фармакопея СССР, 1990; Мусієнко М.М., 2001; Солодовниченко Н.М., 2001).

Об'єктом фармакологічних і токсикологічних досліджень став спиртовий густий екстракт з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної, який виготовлений згідно вимог до екстрактів (Державна Фармакопея України, 2008) на Тернопільській фармацевтичній фабриці «Тернофарм».

Одержаний екстракт бруньок обліпихи - це густий розчин світло-коричневого кольору, трохи кислуватий на смак з малоприємним специфічним запахом. Розчиняється у воді, спирті, майже нерозчинний у неполярних розчинниках.

Фармакологічні дослідження виконані на 239 стандартизованих тваринах (235 щурах, 4 кролях), яких утримували на стандартному раціоні віварію ТДМУ ім. І. Я. Горбачевського.

Всі експерименти проводили у відповідності до «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та наукових цілей» (Страсбург, 1985) та «Правилами використання лабораторних тварин» (2003).

Для скринінгових досліджень використовували густий екстракт чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної на моделі жирової дистрофії печінки, яка виникає при введенні тетрахлорметану. Тетрахлорметан тварини отримували через день протягом семи днів внутрішньошлунково у вигляді 50% олійного розчину в дозі 1,0 мл/кг маси тварини, згідно з методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (Доклинические испытания лекарственных средств. Методические рекомендации, 2002). Екстракт обліпихи вводили щурам внутрішньошлунково в дозах 50, 100, 200 мг/кг маси тіла. Гепатопротекторну активність оцінювали за вмістом ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) (Стальная И.Д., 1977), молекул середньої маси (МСМ) (Николайчик В.В., и соавт., 1989), церулоплазміну (ЦП) (Колб В.Г., 1982) та за активністю аланінамінотрансферази (АлАТ) (Покровский А.А., 1969).

Як модель пошкодження печінки використовували гостру жирову дистрофію печінки. Після останнього введення тетрахлорметану піддослідним тваринам щоденно протягом 7-ми днів внутрішньошлунково вводили 100 мг/кг густого екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної, розведеного водою очищеною 1:10. Референс препаратом було обрано таблетки силібор (виробництва ТОВ «Фармацевтична компанія «Здоров'я», м. Харків), який вводили в дозі 50 мг/кг маси тварин у перерахунку на діючу речовину на 1% крохмальній суспензії.

Евтаназію проводили з використанням тіопенталу натрію на 4-у та 7-у доби від початку застосування екстракту та референс препарату.

Моделлю хронічного комбінованого ураження тварин слугувала інтоксикація тетрахлорметаном у поєднанні з етанолом. Тривалу інтоксикацію викликали введенням тетрахлорметану в дозі 0,2 мл/кг 50% олійного розчину внутрішньошлунково два рази на тиждень протягом чотирьох тижнів із заміною питної води 5% розчином етанолу (Siegers C.P. et al., 1982). Одній групі тварин з профілактичною метою щоденно протягом чотирьох тижнів вводили 100 мг/кг густого екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної, розведеного водою очищеною 1:10 та 2-ій групі - препарат порівняння силібор. Після закінчення введення тетрахлорметану та етанолу ураженим тваринам щоденно протягом 7-ми днів з лікувальною метою вводили 100 мг/кг густого екстракту, розведеного водою очищеною 1:10 та референс препарат - силібор в дозі 50 мг/кг маси тварин у перерахунку на діючу речовину на 1% крохмальній суспензії.

Біохімічним дослідженням піддавали гомогенат печінки, цільну кров та її сироватку та вивчали вміст ТБК-АП, МСМ, ЦП за вище наведеними методами, вміст загального білка, холестерину, активність лужної фосфатази (Гонський Я. І., та ін., 2001), активність АлАТ та каталази (КТ) (Королюк М.А. и соавт., 1988), еритроцитарний індекс інтоксикації (Атаманюк О.Ю., 2008).

Поряд з фармакологічною активністю найважливішою характеристикою нових лікарських засобів є їх нешкідливість, що обумовило необхідність дослідження можливих токсичних властивостей густого екстракту з бруньок обліпихи. Вивчення гострої токсичності густого спиртового екстракту проводили на щурах самцях та самках, яким внутрішньошлунково вводили екстракт з бруньок обліпихи, використовуючи експрес-метод Пастушенко Т.В. та співавт. (1985) та Прозоровського В.Б. (1962). Клас токсичності, до якого належить густий екстракт чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної, визначали за класифікацією Сидорова К.К. (1973).

Дослідження місцевоподразнювальної дії густого екстракту з бруньок обліпихи за методом «кон'юктивальної проби» проводили на кролях шляхом внесення 1-ї краплі розчину препарату в кон'юнктивальний мішок ока кролика. Реакцію слизової оболонки ока оцінювали в динаміці через 15 хвилин, 1 годину і 24 години після введення препарату (Доклинические испытания лекарственных средств. Методические рекомендации, 2002).

Враховуючи інтрагастральне введення густого екстракту бруньок обліпихи, досліджувався вплив його на слизову оболонку шлунка. Для цього екстракт з бруньок обліпихи вводили в дозі 100 мг/кг. Через 3 години всіх тварин знеживлювали, виймали шлунок і візуально, за допомогою лупи, досліджували стан слизової оболонки шлунку. Ульцерогенну дію оцінювали за кількістю виразок на слизовій оболонці шлунку (Андреева А.И., 1978).

Відомо, що ураження організму тварин ксенобіотиками призводить до структурно - функціональних розладів печінки, що характеризується пригніченням її жовчовидільної та знешкоджувальної функцій. Наступним етапом дослідження було вивчення жовчовидільної функції печінки та вплив на неї екстракту з бруньок обліпихи. Моделлю ураження слугувала інтоксикація тетрацикліном в дозі 500 мг/кг маси тварин протягом 5 днів згідно схеми, яка обумовлена в методичних рекомендаціях ДФЦ МОЗ України. Як препарат порівняння використовували алохол (рослинний препарат, який проявляє жовчогінну активність) виробництва ЗАТ НВЦ «Борщагівський ХФЗ» (м. Київ), в дозі 80,0 мг/кг маси тварин у перерахунку на діючу речовину, що є ефективною дозою (ЕD₅₀) (Доклинические испытания лекарственных средств. Методические рекомендации, 2002).

Для вивчення знешкоджувальної функції печінки нами була обрана модель гексеналового сну, яку змоделювали внутрішньоочеревинним введенням 60 мг/кг гексеналу (Доклинические испытания лекарственных средств. Методические рекомендации, 2002). тваринам, ураженим тетрацикліном, та після застосування екстракту з бруньок обліпихи та силібору. Зміни активності монооксигеназної системи реєстрували за тривалістю гексеналового сну у дослідних тварин.

Наступним етапом дослідження було вивчити антиоксидантні, мембранопротекторні та гепатопротекторні властивості екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної за умов гострого та хронічного гепатитів.

Антиоксидантні властивості густого екстракту бруньок обліпихи крушиновидної вивчали за вмістом ТБК-АП, активністю КТ, вмісту ЦП в сироватці крові за вище наведеними методами.

Гепатопротекторну активність екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної вивчали за активністю АлАТ, еритроцитарним індексом інтоксикації (ЕІІ), вмістом МСМ, вмістом загального білка, холестеролу та активності лужної фосфатази за вище наведеними методами, об'ємом жовчі та швидкістю її секреції (Меньшиков В.В. и соавт., 1987).

Для підтвердження функціональних змін структури печінки проводили гістологічні дослідження на 4-у та 7-у доби після розвитку тетрхлорметанового гепатиту та корекції екстрактом з бруньок обліпихи крушиновидної та силібором. Зразки органу фіксували в 10%-му розчині формаліну, дегідратували у спиртах зростаючої концентрації та заливали у целоїдин-парафін за загальноприйнятими методиками. Зрізи фарбували гематоксиліном та еозином (Афанасьева Ю.И., 1999). Огляд мікропрепаратів проводили під мікроскопом Mikros 400. Мікрофотографування мікроскопічних зображень виконували цифровим фотоапаратом Nikon Cool Pix 4500.

Результати експериментальних досліджень піддавали статистичному аналізу (Лапач С.Н., 2000), який проводили з використанням критерію Манна-Уітні та обробляли методом варіаційної статистики за допомогою статистичної програми Statistica 6.0. Зміни вважали достовірними при р?0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. Вивчено хімічний склад чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної (аскорбінової кислоти, вітаміну Р, фенольних сполук, макро - та мікроелементів). Встановлено, що максимальний вміст аскорбінової кислоти у бруньках обліпихи становив 123,20 мг/100 г. у грудні місяці. Вміст вітаміну P становив 4,47 мг/100 г. абсолютно сухої сировини у лютому місяці. Максимальний вміст каротиноїдів відмічено у лютому місяці - 17,53 мг/100 г. абсолютно сухої сировини. Показано, що серед фенольних сполук переважають флавоноїди, максимальний вміст у грудні яких становив 4,24 мг/100 г. сировини. Відмічено високий вміст дубильних речовин у грудні місяці (2,10 мг/100 г. абсолютно сухої сировини). Запропоновано створення густих спиртових екстрактів з бруньок обліпихи на основі сировини, заготовленої у грудні місяці, та досліджено їх хімічний склад. В складі спиртового густого екстракту з бруньок обліпихи досліджено вміст фенольних сполук (1377,2 мг/100 г. екстракту), флавоноїдів (104,3 мг/100 г. екстракту), дубильних речовин (23,75 мг/100 г. екстракту) та органічних кислот (23,67 мг/100 г. екстракту).

Необхідною характеристикою нового лікарського засобу є вивчення його нешкідливості, що обумовило наступний етап наших досліджень - вивчення гострої токсичності густого екстракту бруньок обліпихи з визначенням показника ЛД_50. Отримані результати дозволили класифікувати препарат за ступенем токсичності. Встановлено, що густий екстракт обліпихи за класифікацією токсичності речовин Сидорова К.К. належить до VI класу токсичності «відносно нешкідливі речовини» при одноразовому внутрішньошлунковому введенні (ЛД₅₀>15000 мг/кг).

При доклінічному вивченні нових лікарських засобів, призначених для перорального застосування, необхідним є дослідження їх впливу на стан слизової оболонки шлунка. Проведені дослідження підтвердили відсутність ульцерогенної дії густого екстракту з бруньок обліпихи.

Вивчення місцевоподразнювальної дії густого екстракту з бруньок обліпихи показало відсутність набряку та почервоніння кон'юнктиви та склери у кролів, що свідчить про відсутність місцевоподразнювальної дії.

Підбір умовно терапевтичної дози екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної на моделі тетрахлорметанового гепатиту. Застосування 100 мг/кг та 200 мг/кг екстракту з бруньок призводило до зниження вмісту ТБК-АП у сироватці крові уражених тварин на 80% та 83% відповідно та достовірного зниження цих продуктів ліпопероксидації в печінці уражених тварин. При введенні 50 мг/кг екстракту достовірних змін не відмічено (табл. 1).

Таблиця 1. Вплив різних доз екстракту з бруньок обліпихи на біохімічні показники у щурів, уражених тетрахлорметаном, 4-а доба (М±m; n = 6)

Група тварин	Показники
	Сироватка крові	Печінка
	ТБК-АП мкмоль /л	ЦП г/л	МСМ (СМ1) ум. од/л	АлАТ мкмоль/л *год	ТБК-АП мкмоль/ кг	МСМ (СМ1) ум. од/100 г
інтактні	2,81 ±0,06	43,80 ±0,44	0,24 ±0,01	0,23 ±0,02	0,90 ±0,13	2,47 ±0,01
уражені	6,76 ±0,01*	34,06 ±0,93*	0,29 ±0,02*	0,93 ±0,02*	1,91 ±0,02*	3,18 ±0,04*
50 мг/кг екстракту	5,54 ±0,04	36,61 ±0,22**	0,26 ±0,01	0,87 ±0,02	1,82 ±0,03	2,96 ±0,03
100 мг/кг екстракту	3,74 ±0,02**	41,02 ±0,59**	0,25 ±0,01**	0,27 ±0,01**	1,30 ±0,02**	2,56 ±0,02**
200 мг/кг екстракту	3,69 ±0,02**	42,12 ±0,37**	0,24 ±0,01**	0,25 ±0,01**	1,27 ±0,01**	2,52 ±0,01**

Примітка. * (р) достовірні відмінності між інтактними та ураженими тваринами; ** (р₁) достовірні відмінності між ураженими та лікованими тваринами

Застосування гепатотропної отрути викликало зниження вмісту ЦП з 43,8 г/л до 34,06 г./л у сироватці крові, збільшення вмісту МСМ в уражених тварин у порівнянні з інтактними в 1,6 разу в сироватці крові та в 1,3 разу в печінці, підвищення активності АлАТ в сироватці крові щурів в 4 рази (р0,05).

Використання густого спиртового екстракту в дозах 100 мг/кг та 200 мг/кг викликало достовірне зниження активності АлАТ, в сироватці крові тварин. Така ж тенденція спостерігалась щодо вмісту МСМ.

Отже, на моделі гострого ураження печінки тетрахлорметаном після застосування екстракту з бруньок обліпихи відмічено зниження вмісту ТБК-АП, МСМ, активності АлАТ, що дозволило нам виявити умовно терапевтичну дозу - 100 мг/кг маси тіла і саме її ми використовували в подальших дослідженнях з метою вивчення коригуючих властивостей на моделях токсичного ураження печінки.

Дослідження гепатопротекторних властивостей екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної на моделі гострого ураження щурів тетрахлорметаном. Після застосування екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної вміст ТБК-АП у сироватці крові тварин знизився на 125% на 4-у добу і на 93% - на 7-у добу дослідження (рис. 1) відносно уражених тварин (р0,05).

Введення екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної призвело до зниження продуктів ліпопероксидації в печінці уражених тварин в 1,6 разу як на 4-у, так і на 7-у доби експерименту.

Після застосування силібору відмічалось зниження ТБК-АП в сироватці крові та печінці уражених тварин протягом всього періоду дослідження.

Встановлено, що ураження тварин тетрахлорметаном супроводжується глибоким порушенням ферментативної ланки антиоксидантної системи. На 4-у і 7-у доби після введення токсиканту в сироватці крові щурів в 1,7 та 1,9 разу знижується активність каталази, що, можливо, обумовлено пригніченням білоксинтезуючої функції печінки.

Рис. 1. Вміст ТБК-АП у сироватці крові та печінці тварин, уражених тетрахлорметаном, після застосування екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної та силібору, %

Після використання екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної в сироватці крові щурів, уражених тетрахлорметаном, достовірно підвищується активність КТ в обидва досліджувані терміни (на 4-у добу в 1,3, на 7-у в 1,6 разу). Введення силібору викликало достовірне підвищення досліджуваного показника в сироватці крові протягом всього експерименту.

Відмічено зниження вмісту церулоплазміну в сироватці крові уражених тварин на 4-у добу на 33%, на 7 - у - на 16% від рівня інтактних щурів. Після застосування екстракту спостерігалось підвищення вмісту ферменту в лікованих тварин відносно уражених на 13% на 4-у та на 10% на 7-у доби дослідження. Дані зміни були відмічені як вірогідні при застосуванні екстракту з бруньок обліпихи та силібору.

Проведені дослідження свідчать, що екстракт з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної проявляє антиоксидантну дію, знижуючи високий вміст продуктів ліпопероксидації в уражених тварин уже на початкових стадіях цього процесу, а також, призводить до нормалізації активності антиоксидантних ферментів.

Визначення активності АлАТ (рис. 2) у сироватці крові тварин за умов тетрахлорметанового гепатиту та після корекції порушень екстрактом з бруньок обліпихи крушиновидної показали суттєве зростання активності АлАТ у сироватці крові (р₁<0,05) на 4-у та 7-у доби після отруєння (в 1,7 та 1,6 разу відповідно).

Після застосування екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної активність АлАТ у сироватці крові уражених тварин знизилася на 46% на 4-у добу експерименту та на 57% на 7-у добу, достовірні зміни відмічено в обидві доби дослідження (р<0,05).

Введення силібору призвело до зниження активності АлАТ в сироватці крові, проте екстракт з бруньок обліпихи виявився більш ефективним.



Рис. 2. Порівняльний вплив екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної та силібору на активність АлАТ у сироватці крові щурів, уражених тетрахлорметаном, %.

Маркером ступеня ушкодження мембран еритроцитів є ЕІІ. На 4 - добу від остатнього введення токсиканту відмічалось достовірне збільшення ЕІІ, тобто підвищилась проникність еритроцитарної мембрани. У цей період під впливом введеного в організм екстракту, ЕІІ знизився на 10%, на 7-у добу - на 7% від рівня уражених тварин. Після застосування силібору проникність еритроцитарних мембран теж зменшувалась.

Активація вільнорадикальних процесів призводить до поглиблення ендогенної інтоксикації організму, маркерами якої є МСМ. Встановлено, що на четверту добу дослідження в сироватці крові уражених щурів зростав вміст фракцій СМ₁ (переважають ланцюгові амінокислоти) та СМ₂ (переважають ароматичні амінокислоти) і становив 130% та 137% відповідно. На 7-му добу дослідження їх вміст у сироватці крові зростав ще більше (для СМ₁ в 1,85 разу, для СМ₂ в 1,55 разу) в порівнянні зі здоровими тваринами.

Результати вивчення вмісту МСМ після введення ураженим тваринам екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної показали, що на 4-у добу дослідження достовірних змін за даними показниками відмічено не було. Достовірні зміни щодо зниження вмісту фракцій СМ₁ та СМ₂ у сироватці крові лікованих тварин відносно уражених спостерігали на 7-у добу дослідження (на 46% та 15% відповідно).

Після застосування препарату порівняння силібору відмічено зниження вмісту МСМ у сироватці крові. Екстракт з бруньок обліпихи проявив більш ефективний вплив на даний показник в порівнянні з силібором.

Дослідження загального білка показало, що введення тетрахлорметану в організм тварин призводить до зростання вмісту даного показника у сироватці крові на 7-у добу після отруєння (табл. 2). Застосування густого екстракту з бруньок обліпихи та силібору призвело до зниження білка, проте достовірних змін відмічено не було.

У сироватці крові досліджуваних тварин на 4-у та 7-у доби після змодельованої патології відмічено зростання активності лужної фосфатази в 1,3 разу в порівнянні зі здоровими тваринами. Застосування густого екстракту та референс препарату призвело до зниження даного показника.

Таблиця 2. Вміст загального білка (г/л), холестеролу (ммоль/л) та активність лужної фосфатази (ммоль/л·год) у сироватці крові щурів, уражених ССІ₄, та після введення екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної та силібору (М±m; n=6)

Група тварин	Показники
	Загальний білок	Лужна фосфатаза	Холестерол
	4-та доба	7-ма доба	4-та доба	7-ма доба	4-та доба	7-ма доба
інтактні	67,80±4,50	25,70±1,70	1,35±0,07
уражені	72,00± 5,10	73,60± 4,70	33,20± 1,80*	34,50± 1,90*	1,98± 0,08*	2,15± 0,09*
ліковані екстрактом з обліпихи, 100 мг/кг	70,50± 4,30	71,20± 3,90	30,50± 1,50	30,80± 1,70	1,65± 0,09**	1,60± 0,08**
ліковані силібором 50 мг/кг	69,70± 3,80	68,40± 4,10	30,20± 1,30	29,60± 1,40	1,52± 0,08**	1,42± 0,07**

Примітка. * (р) достовірні відмінності між інтактними та ураженими тваринами; ** (р₁) достовірні відмінності між ураженими та лікованими тваринами.

Гостре ураження печінки, викликане тетрахлорметаном, супроводжувалось підвищенням вмісту холестеролу в сироватці крові як на 4-у, так 7-у доби спостереження. Після використання густого екстракту з бруньок обліпихи відмічено зниження даного показника у ці терміни на 20% та 35% відповідно. Застосування силібору призвело до зниження підвищеного вмісту холестеролу на 30% та 40% у відповідні сроки.

Проведені гістологічні дослідження печінки за експериментального токсичного гепатиту в умовах використання екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної показали позитивний вплив препарату на структурні компоненти органу. Це проявилось менш вираженими змінами судинного русла, кращою збереженістю печінково-балкової організації органу та зменшенням ступеня деструкції гепатоцитів. Позитивний вплив препарату на структуру органу більш виражено проявився на 7-у добу експерименту. Дані дослідження є підтвердженням гепатопротекторної активності густого екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної.

Таким чином, на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту встановлено, що екстракт чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної проявив гепатопротекторну активність та краще силібору позитивно вплинув на функціональний стан печінки.

Іншою моделлю токсичного гострого гепатиту було обрано тетрацикліновий гепатит.

Вивчення жовчогінної дії екстракту бруньок обліпихи на моделі тетрациклінового гепатиту показало, що введення густого екстракту з бруньок обліпихи дослідним тваринам сприяло покращенню процесів жовчоутворення та жовчовиділення. Це свідчить про підвищення, знижених після ураження функціональних показників печінки, до рівня інтактних тварин (табл. 3). Алохол проявив більш ефективний вплив на процеси жовчовиділення у щурів.

Таблиця 3. Дослідження жовчогінної активності екстракту обліпихи на моделі гострого ураження печінки тетрацикліном (М±m; n = 6)

Показники	Інтактні	Уражені	Ліковані екстрактом з обліпихи 100 мг/кг	Ліковані алохолом 80,0 мг/кг
Об'єм жовчі, мл/100 г.	0,80 0,07	0,52 0,04*	0,74 0,05**	0,82 0,07**
Швидкість секреції жовчі, мг/хв100	4,12 0,42	2,72 0,20*	3,750,31**	4,15 0,35**

Примітка. * (р) достовірні відмінності між інтактними та ураженими тваринами; ** (р₁) достовірні відмінності між ураженими та лікованими тваринами

Для вивчення знешкоджувальної функції печінки досліджено тривалість гексеналового сну, який характеризує стан системи мікросомального окиснення. Проведені дослідження показали, що застосування екстракту з бруньок обліпихи сприяє відновленню активності монооксигеназ мікросомального ланцюга та сприяє підвищенню функціональної спроможності печінки, про що свідчить зменшення тривалості гексеналового сну (на 9,3 хв.). Силібор виявився менш ефективним у даному випадку.

Вивчення гепатопротекторних властивостей густого екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної за умов хронічного гепатиту. Показано, що ураження тварин тетрахлорметаном та етиловим спиртом призводить до суттєвого зростання вмісту ТБК-АП на 37-у добу спостереження.

Під впливом екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної вміст ТБК-АП у сироватці крові знизився в 1,3 разу на 30-у добу дослідження та в 1,7 разу - на 37-у добу дослідження відносно уражених (р0,05) тварин.

Застосування екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної призвело до зниження продуктів ліпопероксидації в печінці уражених тварин на 49% на 30-у та на 120% на 37-у доби дослідження. Достовірні зміни даного показника відмічені протягом всіх термінів спостереження (р<0,05). Застосування силібору позитивно вплинуло на даний показник.

Ураження тварин тетрахлорметаном та етиловим спиртом супроводжується глибокими порушеннями у ферментативній ланці антиоксидантної системи. На 30-у та 37-доби після введення токсинів достовірно знижувалася активність каталази в сироватці крові щурів у порівнянні зі здоровими тваринами. У печінці уражених тварин відмічено зниження активності даного ферменту.

Застосування екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної достовірно вплинуло активність КТ у сироватці крові щурів. У печінці уражених тварин відмічено тенденцію до підвищення активності даного ферменту. Введення в уражений організм силібору виявилось ефективним для даного показника, проте при використанні екстракту з бруньок обліпихи зміни були більш вираженими.

Відмічено зниження вмісту ЦП у сироватці крові уражених тварин на 30-у та 37-у доби порівняно з інтактними щурами. Під впливом екстракту з бруньок обліпихи істотно підвищувався цей показник (на 11% на 30-у та на 16% на 37-у доби дослідження). Використання силібору позитивно вплинуло на вміст ЦП.

Таким чином, на підставі отриманих даних, можна стверджувати, що екстракт з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної проявляє антиоксидантні властивості за умов ураження печінки тетрахлорметаном та етанолом.

Ураження тварин тетрахлорметаном та етанолом призводить до зростання активності АлАТ в сироватці крові на 30-у та 37-у доби дослідження в 1,4 та в 1,7 разу відповідно.

Застосування екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної призвело до зниження активності АлАТ у сироватці крові на 27% на 30-у добу дослідження та на 60% на 37-у (р<0,05). Використання екстракту з обліпихи крушиновидної проявило більш виражений вплив на даний показник, ніж силібор.

Нами показано, що після ураження у тварин збільшувався ЕІІ. До кінця експерименту він значно перевищував такий показник у здорових щурів.

Екстракт з бруньок обліпихи викликав достовірні зміни проникності мембран еритроцитів в сторону нормалізації на 30-у та 37-у доби експерименту. Після лікування силібором були відмічені достовірні зміни в обидва досліджувані терміни.

На 30-у добу дослідження в сироватці крові уражених щурів зростав вміст СМ₁ та СМ₂ і становив 217% та 225% відповідно від рівня інтактних тварин. На 37-му добу дослідження вміст даних продуктів у сироватці крові зростав ще більше (СМ₁ у 2,83, СМ₂ у 2,25 разу) у порівнянні з інтактними тваринами. Відмічено достовірне підвищення фракцій СМ₁ та СМ₂ у печінці дослідних щурів протягом всього експерименту.

Після введення ураженим тваринам екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної спостерігались вірогідні зміни щодо зниження вмісту фракцій СМ₁ та СМ₂ як в сироватці крові, так і в печінці лікованих тварин. При вивченні цього показника ефективнішим виявилось застосування густого екстракту з обліпихи.

Зниження активності АлАТ та зменшення проникності еритроцитарної мембрани засвідчують гепатопротекторну активність густого екстракту з бруньок обліпихи за умов хронічного ураження печінки.

Таким чином, екстракт чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної за умов хронічного токсичного гепатиту проявив антиоксиданту, мембранопротекторну та антитоксичну дію.

Отримані дані з вивчення фармакологічної активності екстракту з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної дають можливість рекомендувати його для подальшого вивчення з метою введення в офіційну медицину як гепатопротекторного засобу.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуальної наукової задачі щодо створення із чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної густого спиртового екстракту та експериментально обґрунтовано доцільність та ефективність його застосування як гепатопротекторного засобу з антиоксидантною та мембранопротекторною дією при токсичних ураженнях печінки.

1. Фітохімічними дослідженнями встановлено, що до складу чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної входять вітаміни, дубильні речовини (2,10 мг/100 г. абсолютно сухої сировини), флавоноїди (4,24 мг/100 г. абсолютно сухої сировини), органічні кислоти (4,76 мг/100 г. абсолютно сухої сировини), макро - та мікроелементи.

2. Встановлено, що до складу густого спиртового та водного екстракту з чоловічих бруньок обліпихи входять: фенольні сполуки (дубильні речовини, флавоноїди), органічні кислоти. Кількісний вміст визначених біологічно активних речовин переважає у спиртовому густому екстракті: флавоноїдів (104,3 мг/100 г. екстракту), дубильних речовин (23,75 мг/100 г. екстракту) та органічних кислот (23,67 мг/100 г. екстракту).

3. Показано, що густий екстракт з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної за класифікацією Сидорова К.К. належить до VI класу токсичності «відносно нешкідливі речовини» (ЛД₅₀>15000 мг/кг) та не проявляє ульцерогенної та місцевоподразнювальної дії.

4. У процесі фармакологічного скринінгу екстракту чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної встановлена його умовно терапевтична доза - 100 мг/кг маси тіла тварин.

5. Доведена виражена гепатопротекторна активність густого екстракту чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту, що проявляється зниженням вмісту ТБК-активних продуктів у сироватці крові в середньому на 90%, зниженням активності АлАТ в середньому на 50%, підвищенням вмісту церулоплазміну, зниженням вмісту холестеролу у сироватці крові на 30% відносно уражених тварин. Отримані результати підтверджені гістологічними дослідженнями. Екстракт бруньок обліпихи краще силібору позитивно відновлював функціональний стан печінки. За умов тетрациклінового гепатиту екстракт обліпихи покращував процеси жовчоутворення та сприяв відновленню активності монооксигеназного мікросомального ланцюга, підвищуючи функціональну спроможність печінки у знешкодженні токсичних сполук.

6. Встановлено лікувальну ефективність екстракту чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної за умов хронічного ураження печінки. Це підтверджується зниженням вмісту ТБК-активних продуктів у сироватці крові в середньому у 1,5 раза в порівнянні з ураженими тваринами, достовірним підвищенням активності каталази, зростанню вмісту церулоплазміну в середньому на 14%, нормалізацією активності аланінамінотрасферази та вмісту молекул середньої маси. Ефективність екстракту бруньок обліпихи перевищувала за більшістю показників дію силібору.

7. Проведене дослідження експериментально обґрунтовує доцільність подальшого доклінічного та клінічного вивчення нового вітчизняного, високоефективного та малотоксичного засобу з густого екстракту обліпихи з метою впровадження його в медичну практику як гепатопротекторного препарату.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Фіра Л.С. Вивчення хімічного складу бруньок обліпихи крушиновидної / Л.С. Фіра, В.П. Пида // Медична хімія. - 2005. - Т. 7, №4. - С. 80-83. (Дисертантом проведено дослідження, статистично опрацьовані результати, сформульовані висновки).

2. Пида В.П. Дослідження вмісту біологічно активних речовин у чоловічих бруньках Hippophae rhamnoides L. / В.П. Пида, Л.С. Фіра // Запорожский медицинский журнал. - 2007. - №3. - С. 69-71. (Дисертантом проведено дослідження, статистично опрацьовані результати, сформульовані висновки).

3. Пида В.П. Дослідження мінімально діючої дози екстракту бруньок обліпихи крушиновидної на моделі тетрахлорметанового гепатиту / В.П. Пида, Л.С. Фіра // Фармацевтичний часопис. - 2009. - №2 (10). - С 32-35. (Дисертантом проведено дослідження, статистично опрацьовані результати, сформульовані висновки).

4. Пида В.П. Вивчення антиоксидантних та гепатопротекторних властивостей екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної на моделі гострого тетрахлорметанового гепатиту / В.П. Пида, Л.С. Фіра // Здобутки клінічної і експериментальної медицини. - 2010. - №2 (13). - С. 84-86. (Дисертантом проведено дослідження, статистично опрацьовані результати, сформульовані висновки).

5. Пида В.П. Застосування густого екстракту з обліпихи крушиновидної в умовах хронічного комбінованого гепатиту в щурів / В.П. Пида // Медична хімія. - 2011. - Т. 13, №1. - С. 78-81.

6. Пида В.П. Експериментальне вивчення антиоксидантної та імуномодуляторної активності густого екстракту бруньок обліпихи крушиновидної / В.П. Пида // Український біофармацевтичний журнал. - 2011. - Т. 12, №1. - С. 36-40.

7. Пат. 62471 U. Україна, МПК А61К36/72, А61Р1/16. Спосіб корекції токсичних уражень печінки / / В.П. Пида, Л.С. Фіра, П.Г. Лихацький, Е.М. Вашкеба, І.І. Медвідь. - №201102439; Заявлено 01.03.2011; Опубл. 25.08.2011, Бюл. №16. (Дисертантом самостійно сформульовано ідею та виконано дослідження щодо одержання екстракту та проведено фармакологічний експеримент, сформульовані висновки).

8. Пида Віктор. Накопичення флавоноїдів у бруньках Hippophae rhamnoides L. / Віктор Пида // ІХ Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених: матеріали конгр., 21-21 квітня 2005 р - Тернопіль, 2005. - С. 224.

9. Пида Віктор. Дослідження хімічного складу чоловічих бруньок Hippophae rhamnoides L. / Віктор Пида // Х Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених: матеріали конгр., 11-13 травня 2006 р - Тернопіль, 2006. - С. 232.

10. Пида Віктор. Елеменний склад чоловічих бруньок Hippophae rhamnoides L. / Віктор Пида // ХІ Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених: матеріали конгр., 10 - 12 травня 2007 р. - Тернопіль, 2007. - С. 270.

11. Пида Віктор. Вивчення антиоксидантних та гепатопротекторних властивостей бруньок обліпихи крушиновидної в експерименті на тваринах / Віктор Пида // ХІІ Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених: матеріали конгр., 31 березня - 2 квітня 2008 р. - Тернопіль, 2008. - С. 222.

12. Пида Віктор. Вплив різних видів екстрагентів на вилучення діючих речовин з чоловічих бруньок обліпихи крушиновидної / Віктор Пида // ХІІІ Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених: матеріали конгр., 27-29 квітня 2009 р. - Тернопіль, 2009. - С. 223.

13. Пида В.П. Застосування густого екстракту з бруньок обліпихи для корекції порушень в умовах тетрахлорметанового гепатиту / В.П. Пида, Л.С. Фіра // Безпечність ліків і фактори ризику небажаних ефектів фармакотерапії: науково-практ. конф., 21-22 жовтня 2010 р.: матер. конф. - Тернопіль, 2010. - С. 45-46. (Дисертантом проведено дослідження, статистично опрацьовані результати, сформульовані висновки).

14. Пида В.П. Дослідження стану імунної системи щурів на моделі хронічного гепатиту та корекція виявлених порушень густим екстрактом з бруньок обліпихи крушиновидної / В.П. Пида, Л.С. Фіра // Матеріали VІ Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології, присвяченої 90-річчю професора О.О. Столярчука, 10-11 листопада 2010 року. - Вінниця, 2010. - С. 324-325. (Дисертантом проведено дослідження, статистично опрацьовані результати, сформульовані висновки).

15. Пида В.П. Дослідження мембранопротекторних властивостей екстракту з бруньок обліпихи крушиновидної за умов комбінованого ураження печінки / В.П. Пида // Матеріали науково-практичної конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів, 21-22 квітня 2011 року. - Суми, 2011. - С. 69.

16. Пида Віктор. Вивчення структури печінки в умовах тетрахлорметанового гепатиту після корекції екстрактом з бруньок обліпихи / Віктор Пида // ХV Міжнародний медичний конгрес студентів та молодих вчених: матеріали конгр., 27-29 квітня 2011 р. - Тернопіль, 2011. - С. 359.

Размещено на Allbest.ru

...