Розробка та валідація методик контролю якості вітамінно-мінерального препарату

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Міністерство охорони здоровя україни

Національній фармацевтичний універстиет

УДК 15.07:54.062.543.422

Автореферта

Дисертацї на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

Розробка та валідація методик контролю якості вітамінно-мінерального препарату

Левшова О.Л.

Харків

Дисертація є рукопис

Робота виконана на кафедрі управління якістю Національного фармацевтичного університету

Науковий керівник: доктор хімічних наук, професор КОВАЛЕНКО СЕРГІЙ МИКОЛАЙОВИЧ

Національний фармацевтичний університет, м. Харків завідувач кафедри управління якістю

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор, ГРИЗОДУБ ОЛЕКСАНДР ІВАНОВИЧ,

Державне підприємство «Український науково - фармакопейний центр якості лікарських засобів», завідувач відділу Державної Фармакопеї України кандидат фармацевтичних наук НАЗАРОВА ОЛЕНА СЕРГІЇВНА Державне підприємство «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції», м. Харків завідувач лабораторії аналізу, якості та стандартизації лікарських препаратів

Захист відбудеться « 6 » жовтня 2011р. о 1200 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету за адресою: 61168 м. Харків, вул. Блюхера, 4

Автореферат розісланий « 5 » вересня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор В.А.Георгіянц

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Кількість лікарських засобів, мультивітамінних препаратів, біологічно активних та харчових добавок (БАД), з кожним роком збільшується. Визначити склад багатокомпонентної суміші при широкому діапазоні концентрацій аналізованих речовин і особливо виявити присутність домішок, користуючись яким-небудь одним методом зазвичай досить важко. Зростаючі вимоги до безпеки, ефективності та якості лікарських препаратів, БАДів обумовлюють необхідність розробляти нові і удосконалювати існуючі методи їх аналізу.

Слід відзначити, що, незважаючи на дуже широке застосування мультивітамінних препаратів і БАДів, а також наявність загальних методів їх аналізу в Фармакопеї США, питання розробки, верифікації і валідації методик контролю якості конкретних мультивітамінних препаратів і БАДів практично не вивчалися в вітчизняній літературі. Це пов'язано, передусім, зі значною складністю цих об'єктів - вони містять велику кількість мікроелементів, водо- і жиророзчинних вітамінів у низьких концентраціях, які є дуже чутливими до хімічних і фізичних чинників і умов зберігання. Це обумовлює необхідність застосування для контролю їх якості комплексу сучасних методів аналізу, зокрема поєднання високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) і атомно-абсорбційної спектрометрії (ААС).

Тому розробка та валідація селективних методик одночасного кількісного визначення мікроелементів, водо- і жиророзчинних вітамінів, є актуальним завданням.

Зв'язок з науковими програмами,планами, темами. Робота виконана за планом науково-дослідних робіт кафедри управління якістю Національного фармацевтичного університету і відповідає темі НДР по НФаУ «Розробка та валідація методів контролю якості лікарських засобів аптечного та промислового виробництва» (номер державної реєстрації 0108U010944). Тема дисертаційної роботи затверджена на засіданні Вченої ради НФаУ (протокол № 5 від 28.12.2009 р.) та на засіданні ПК «Фармація» (протокол № 61 від 12.12.2009 р.).

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження є розробка та валідація методик аналітичного контролю вітамінно-мінеральних препаратів на вміст мікроелементів (МЕ), водо- та жиророзчинних вітамінів.

Для виконання поставленої мети необхідне рішення наступних завдань:

- провести аналіз стану валідації і верифікації аналітичних методик контролю якості ліків методом ААС, включаючи міжнародні програми і зарубіжні фармакопеї;

- розробити методики встановлення достовірності та кількісного визначення мікроелементів методом ААС;

- провести дослідження та запропонувати підходи валідації ААС методик кількісного визначення методом калібрувального графіку;

- запропонувати стандартизовану схему процесу валідації методом ААС;

- сформулювати єдині критерії прийнятності валідаційних характеристик;

- оптимізувати процес валідації методик ААС лікарських засобів та розробити документацію з валідації аналітичних методик кількісного визначення мікроелементів;

- провести дослідження та запропонувати алгоритм методики кількісного визначення водо- та жиророзчинних вітамінів методом ВЕРХ.

Об'єкт дослідження: розробка та валідація методик аналізу препаратів, що містять мікроелементи, водо- та жиророзчинні вітаміни.

Предмет дослідження: критерії прийнятності валідаційних характеристик, методики аналізу мікроелементів, вітамінів, процес валідації аналітичних методик.

Методи дослідження: фізичні та фізико-хімічні методи аналізу (ААС, ВЕРХ); хімічні методи аналізу (хімічні реакції деструкції, розкладання), процедури валідації аналітичних методик відповідно до вимог USP, ДФУ. Обробку експериментальних даних здійснювали методами математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше сформульовані критерії прийнятності із застосуванням принципу незначущості для валідаційних характеристик аналітичних методик кількісного визначення лікарських засобів методом ААС.

Вперше стандартизовано процедуру валідації аналітичних методик кількісного визначення лікарських засобів методом ААС із застосуванням калібрувального графіку. Процедура придатна для одночасної валідації методик кількісного визначення вмісту та тесту на розчинення відповідно до найширшого діапазону застосування та найбільш критичних вимог до максимально припустимої невизначеності методики аналізу у відповідності зі сформульованими критеріями прийнятності.

Розроблено схему проведення валідації методик ААС лікарських засобів для одночасного оцінювання валідаційних характеристик специфічності, лінійності, точності та прецизійності. Запропоновано застосування нормалізованих координат, що дозволяє оцінювати єдині критерії. Розроблена методика визначення кількісного вмісту мікроелементів і проведення тесту «розчинення» методом атомно-абсорбційної спектрометрії із застосуванням калібрувального графіку. За результатами дослідження оформлені заявки: № u 2011 07070 на видачу патенту на корисну модель та № а 2011 07078 на видачу патенту на винахід «Спосіб кількісного визначення заліза (ІІ) у фармацевтичній композиції».

Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених досліджень розроблена схема проведення кількісного визначення водорозчинних вітамінів і жиророзчинних вітамінів для вітамінно-мінеральних препаратів. Селективні методики дозволяють проводити визначення 6 водо- та 2 жиророзчинних вітамінів в складній матриці препарату.

Розроблені селективні і відтворні методики якісного і кількісного аналізу мікроелементів методом ААС із застосуванням калібрувального графіку.

Проведені дослідження дозволили валідувати аналітичні методики кількісного визначення мікроелементів, розробити та затвердити документацію з валідації (план, протокол, звіт). Практичне значення підтверджуються актами впровадження з відділу аналітичної хімії функціональних матеріалів та об'єктів навколишнього середовища ім. А.Б.Бланка ДНУ «НТК «Інститут Монокристалів» НАН України, м. Харків(2011р.), з лабораторії фармакопейного аналізу ДП «Український науково-експертний фармакопейний центр якості лікарських засобів», м. Харків (2011р.), з фармацевтичної аналітичної лабораторії «Лабоваль», м. Монреаль (2009 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено аналіз асортименту полівітамінних препаратів на фармацевтичному ринку України; проведено пошук та аналіз даних наукової літератури вітчизняних та іноземних джерел із проблем проведення процедури валідації аналітичних методик ідентифікації та кількісного визначення; здійснено вибір аналітичних методик для визначення мікроелементів та вітамінів у вітамінно-мінеральних препаратах. Практично апробована експериментальна схема валідації та розраховано критерії придатності методик кількісного визначення та розчинення мікроелементів таблеток вітамінно-мінерального комплексу «Жестікер» методом атомно-абсорбційної спектроскопії; проведено статичну обробку отриманих даних; написано розділи дисертації, сформульовані висновки; оформлені заявки на корисну модель на винахід щодо визначення заліза у фармацевтичних композиціях.

Апробація роботи. Основні положення роботи представлені і обговорені на: Міжнар. наук. конф. студентів та молодих вчених, присвячена 200-річчю з дня народження М.Ш.Пирогова «Молодь - медицині майбутнього» (Одеса, 2010); VI Регіон. наук.-практ. конф. молодих вчених та студентів «Фармацевтична наука: історичні аспекти формування та шляхи вдосконалення» (Луганськ, 2010); VII Нац. з'їзду фармацевтів України «Фармація України. Погляд у майбутнє» (Харків, 2010); XIII Конгресі Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (СФУЛТ) (World Federation of Ukrainian Medical Associations) (Львів-Київ-Чикаго, 2010); V науч.-практ. конф «Управление качеством в фармации» (Харків, 2011).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, із них 5 статей (у наукових фахових виданнях), 5 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладено на 153 сторінках друкованого тексту (обсяг основного тексту 140 сторінок) і складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), об'єктів і методів дослідження (розділ 2), експериментальної частини власних досліджень (розділи 3-6), загальних висновків, списку використаних джерел і додатків. Робота містить 39 таблиць, 17 рисунків. Список використаної літератури містить 166 найменування, у тому числу 72 - зарубіжних авторів.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі викладено актуальність теми, мету та основні задачі досліджень, наукову новизну і практичне значення отриманих результатів.

У першому розділі наведено аналіз літературних даних щодо питань валідації та верифікації аналітичних методів контролю якості ліків. Аналіз літератури показав, що не зустрічається систематизованої процедури та науково обґрунтованих критеріїв придатності валідаційних характеристик, що пов'язані з вимогами до невизначеності результату аналізу фармацевтичних випробувань. Визначено, що у керівних документах надаються тільки загальні вимоги щодо оцінки невизначеності результатів аналізу, які не стосуються специфіки фармацевтичного аналізу.

Таким чином, необхідно розробити науково обґрунтовані стандартні процедури проведення валідації та критерії прийнятності для основних фармацевтичних кількісних випробувань.

У другому розділі дана характеристика об'єктів аналізу, приведені відомості про обладнання, реактиви та методи дослідження, що використані в даній роботі.

У третьому розділі запропоновані методики визначення мікроелементів методом ААС із використанням калібрувального графіку. На основі проведених досліджень була розроблена методика кількісного визначення заліза та запропонована методика одночасного визначення кальцію та цинку методом ААС. Для кількісної оцінки вмісту мікроелементів застосовували калібрувальні графіки, що відображають якісний і кількісний склад розчинів стандартних речовин. Для детектування і вимірювання вмісту мікроелементів були визначені умови вимірювання мікроелементів, що наведені в таблиці 1.

Таблиця 1 Умови вимірювання мікроелементів

МЕ	Довжина хвилі, нм	Ширина щілини, нм	Тип полум'я
Fe	248.3	0,2	повітря/ацетилен
Zn	213.9	1,0	повітря/ацетилен
Са	422.7	0,5	N2О/ацетилен

Пробопідготовка для визначення заліза. Досліджуваний зразок піддавали сухому озоленню, при якому відбуваються повне окислення і видалення органічної основи проби. Зразок перед озоленням висушували на плитці з поступовим нагрівом від 60єС до 100єС. Використовували лабораторний посуд з фарфору. Озолення досліджуваної речовини проводили в муфельній печі при температурі 550єС, яка була встановлена емпіричним шляхом та дозволяє досягти необхідного ступеню озолення супровідних компонентів препарату. Для уникнення втрат визначуваного елементу необхідно строго контролювати максимальну температуру озолення. Озолення зразків дозволяє сконцентрувати незначний вміст заліза в препараті.

Зольні залишки досліджувального зразка розчиняли при нагріванні у розчині концентрованої HCl та дистильованої води (1:1), з подальшим розбавленням до 0,1N соляної кислоти у розчині. Сполуки заліза (II) найбільш стабільні у 0,1 Н кислому середовищі. Отримували розчин жовто-зеленого кольору, який підтверджує утворення акваіонів заліза (II). Реакція окиснення Fe (II) до Fe (III) киснем повітря відбувається інтенсивно в лужному та нейтральному середовищі. Сполуки заліза (III) не утворюються за високої концентрації хлористоводневої кислоти, яка використовується для розчинення зразку, та володіє відновлюваними властивостями.

Побудова калібрувального графіка. Для побудови калібрувального графіка використовують 1000 ррм стандартний розчин. До 10,0 мл стандартного розчину заліза для атомної абсорбції додають до 100 мл 0,1N HCl до 100 мл (розчин А), з отриманого розчину проводять наступні розбавлення: беруть 2, 3, 4, 5 і 6 мл і розбавляють в мірних колбах місткістю 100 мл 0,1N HCl. Розчини аналізують з отриманням не менше 5 вимірювань для кожного в діапазоні 50-150% від номінальної концентрації. Концентрації заліза для калібрувального графіка: 50.0, 75.0, 100.0, 125.0 і 150.0% від номінального вмісту заліза в препараті, що відповідає Cst,i = 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 і 6.0 ppm в кінцевому розчині (табл.2) і вимірюють атомну абсорбцію заліза в полум'ї повітря/ацетилен при довжині хвилі 248.3 нм.

Побудову калібрувального графіка проводять в нормалізованих координатах. Масу заліза в грамах знаходять по калібрувальному графіку.

Вимірювання проводять на спектрометрі атомної абсорбції Varian 220 FS Double Beam AA (USA), забезпеченому лампою з порожнистим катодом специфічною для відповідного елементу. Згідно інструкції з експлуатації приладу: очищають і коректують положення пальника (висота, глибина); регулюють положення лампи; оптимізують сигнал; регулюють потік рідини 4-6 мл/ хв.

Для стандартизації методу визначення заліза був отриманий і досліджений атомний спектр поглинання при довжині хвилі 248.3 нм в повітряно-ацетиленовому полум'ї, залежність атомної абсорбції від концентрації досліджуваного розчину визначають по калібрувальному графіку.

Розрахунки кількісного вмісту заліза проводять за формулою:

=

де: Мзраз - маса зразка, г; Мср - маса стандарту, г/таб; C - концентрація, мг.

Вміст заліза у препараті повинен бути в інтервалі від 25.2 до 32.2 мг.

Пробопідготовка для визначення Ca, Zn. Нами була розроблена методика визначення кальцію і цинку у вітамінно-мінеральному комплексі методом ААС. Перешкоди при визначенні атомної абсорбції кальцію головним чином пов'язані з підвищенням іонізації і з світлом в аналізованому розчині з'єднань, що важко підлягають атомізації у полум'ї. Кислоти зміщують рівновагу дисоціації солей в полум'ї, зменшують швидкість випаровування дрібних крапель аерозолю, дають фон, що впливає на аналітичну лінію. Але в ААС всі ці впливи позначаються дуже незначно у зв'язку з наявністю в полум'ї великої кількості не збуджених атомів кальцію. Кислоти зменшують кількість ОН-радікалів в полум'ї, а отже, і концентрацію молекул СаОН.

Виходячи з того, що додаткове кишково-розчинне покриття у вітамінно-мінеральному препараті дозволяє вивільнювати інгредієнти у шлунково-кишковому тракті, доцільним є використання хлористоводневої кислоти для розчинення карбонату кальцію, а також збільшення часу для проведення реакції. Оксид цинку переходить у розчинну форму при реакції з хлористоводневою кислотою з утворенням ZnCl2. Тому, при аналізі Ca та Zn використовували кислотну екстракцію визначуваних елементів. До подрібнених зразків додавали хлористоводневу кислоту та залишали не менш ніж на 8 годин для отримання повноти перебігу реакції.

Безпосередньо перед вимірюванням до розчинів зразка та стандартів кальцію додавали розчин хлориду лантану та використовували полум'я з суміші N2O/ ацетилен, який дозволяє знехтувати інтерференцію заліза під час вимірювання.

Визначення Ca та Zn проводили з використанням калібрувального графіку аналогічно визначенню заліза.

У четвертому розділі обґрунтований і розроблений план та операційна процедура процесу валідації аналітичної методики кількісного визначення заліза методом ААС.Валідації підлягали наступні валідаційні характеристики: лінійність, прецизійність, специфічність, діапазон застосування, внутрішньолабораторна прецизійність, робасність.

Нами були розроблені статистичні критерії процесу валідації методики кількісного вмісту заліза у вітамінно-мінеральних препаратах.

Вміст заліза в препараті складає 25.2-32.2 мг, що відповідає (28 ± 3.5 мг) або 87.8% - 112.2% (100 ± 12.2)% від номінального вмісту.

Повна невизначеність (ДАs): max ДАs = 0.32 · 12.2 = 3.90% (2)

Критерій статистичної незначущості (системна невизначеність):

max д = 0.32 · max ДАs = 0.32 · 3.90 = 1.25%

Нами було проведене визначення концентрації за допомогою калібрувального графіку, який будували по 5 точкам в інтервалі 50-150% від номінального вмісту заліза. Концентрації заліза для калібрувального графіку становлять 50.0%, 75.0%, 100.0%,125.0% та 150.0% від номінального вмісту, що відповідає Сst,i = 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 та 6.0 мг/мл в робочому розчині. Виходячи з характеристик прибору, ці концентрації відповідають значенням абсорбції 0.1-0.4. Цей діапазон концентрацій відповідає стандартному відхиленню калібрувальних концентрацій SDCo = 39.53% або 1.58 ppm.

Критерії оцінки лінійності калібрувальної прямої і результатів аналізу модельних сумішей

Повна невизначеність результатів аналізу (зокрема, модельних сумішей) (?As) визначається декількома чинниками, серед яких головними є:

Невизначеність, пов'язана з калібрувальною прямою (?кал), викликана невизначеністю параметрів а і b калібрувальної прямої. Характеристикою цієї невизначеності є залишкове стандартне відхилення SDзалиш, якому відповідає довірчий інтервал. ?кал = t (0.95, v = 5 - 2 = 3) * SD залиш= 2.35 * SD залиш (4)

Невизначеність, пов'язана з самим випробовуваним розчином (?зраз),

невизначеністю оптичної щільності Ai і пробопідготовки. Значення ?зраз може бути знайдене в процесі валідації при аналізі модельних сумішей і розрахункам їх концентрацій по калібрувальному графіку.

Тому повну невизначеність визначення концентрації, з урахуванням співвідношення (2), можна записати у вигляді:

?As = ? max ?As = 3.90

При проведенні аналізу тільки одного зразка (відповідно до методики) і розрахунку його концентрації по калібрувальному графіку ми можемо оцінити тільки невизначеність калібрування ?кал, фактична ж величина ?зраз нам невідома. Вона може бути оцінена з результатів аналізу модельних сумішей в процесі проведення валідації. Таким чином, нам необхідно пред'явити критерії прийнятності до обох величин - ?кал і ?зраз.

Із співвідношення (5) видно, що є критерій тільки для сумарної величини ?As, тому необхідні початкові припущення (які повинні бути підтверджені експериментально) для однієї з величин - ?кал і ?зраз. Доцільно ці допущення пред'явити до ?кал, оскільки ця величина завжди буде знаходитися при побудові калібрувального графіку, і допущення завжди повинно перевірятися (тобто, фактично, бути тестом на придатність системи).

Нами для визначення критеріїв для величини ?кал запропоновані 2 підходи:

1. Незначність невизначеності калібрування.

Величина ?кал повинна бути незначуща в порівнянні з гранично допустимою повною невизначеністю аналізу ?As, тобто, враховуючи (5):

Дкал ? 0.32 · max ДАs = 0.32 · 3.9 = 1.25%

У цьому випадку невизначеність калібрування Дкал не перевищує максимально припустиму системну похибку.

Виходячи з цього одержуємо значення залишкового стандартного відхилення 0.53% від номіналу 4 ррм, що відповідає SD залиш = 0.021 ррм:

SD залиш ? Дкал / 2.35 = 1.25 / 2.35 = 0.53%

Це співвідношення дозволяє одержати вимоги до коефіцієнту кореляції Rc та його квадрату калібрувальної прямої:

Rc ? 1 - (SDзалиш / SDСо)2 = 1 - (0.53 / 39.53)2 = 0.99982

Rc ? 0.99991.

При розрахунку величини Rc в співвідношенні (9) величини SDзалиш і SDCo можна брати (одночасно) як у відсотках, так і в ppm. Перевагою такого підходу є те, що в цьому випадку невизначеність калібрування можна не враховувати в повній невизначеності аналізу ?As, яка, відповідно до (5), зводиться тільки до Дзраз, тобто:

ДАs ? ? зразка ? max ДАs = 3.90

Це спрощує оцінку результатів проведення валідації. Крім того, такий підхід до допустимої невизначеності аналізу переноситься і на випробовуваний зразок, тобто робить вимоги до аналізу ліберальнішими. Недоліком даного підходу є те, що він пред'являє достатньо жорсткі вимоги (7, 8) до калібрувальної прямої, які далеко не завжди можуть бути реалізовані на практиці. Це пов'язано, зокрема, і з малим числом мір свободи прямої (н = 3), що приводить до достатньо великого коефіцієнта Стьюдента в рівнянні (4).

2. Невизначеність калібрування рівна невизначеності аналізу зразка.

Можна припустити, що невизначеність аналізу калібрувальних розчинів рівна невизначеності аналізу самого зразка, тобто: ?кал = ?зраз (10)

В цьому випадку із рівняння (5) отримаємо:

? As ? * ? кал = * ? зраз = 3.90

? кал = ? зраз = 2.76 %

Тоді з рівнянь (4, 11) отримаємо: SDзалиш ? ? кал / 2.35 = 2.76/2.35 = 1.17 % (12)

Відзначимо, що SDзалиш = 1.17% від номінального значення (4 ppm) відповідає SDзалиш = 0.047 ppm. Співвідношення (12) дозволяє отримати вимоги до коефіцієнта кореляції Rc і його квадрату калібрувальної прямої:

? 1 - (SDзалиш/SDСо)2 = 1 - (1.17/39.53)2 = 0.99912

? 0.99956

При розрахунку величини Rc в рівнянні (13) величини SDзалиш і SDCo можна визначати (одночасно) як у відсотках, так і в ppm.

Таким чином, для подальшого проведення валідації нами обрано значення ДАs= 1.25%, як найбільш вимогливий критерій. Значення коефіцієнту кореляції було обране із другого підходу тобто R2 = 0.99912. Даний підхід пред'являє значно ліберальніші вимоги до калібрування і представляється реальнішим на практиці.

Процес валідації методики кількісного визначення заліза. Валідацію аналітичної методики кількісного визначення заліза у препараті «Жестікер» проводили за наступними показниками: правильність, специфічність, лінійність, діапазон вимірювання, прецизійність.

Критерії прийнятності специфічності. У розчині плацебо і в холостому розчині не повинне визначатися залізо. У разі наявності сигналу, відповідного залізу, концентрація не повинна перевищувати max д = 1,25% від номінального значення. Готували розчин плацебо і холостий розчин (0,1N НСl), в співвідношеннях як для випробовуваного розчину, проводячи не менше 5-ти вимірювань для кожного з розчинів (табл. 2).

Таблиця 2 Результати вимірювання поглинання розчину плацебо і холостого розчину:

Назва розчину	Значення абсорбції	?, %	Критерій, %
	1	2	3	4	5	Середнє
Розчин плацебо	0.0009	-0.0003	0.0003	0.0007	0.0012	0.0006	0.6022	?1.25
Розчин порівняння	0.0006	-0.0005	-0.0001	-0.0005	0.0002	-0.0003	0.3011	?1.25

Як видно з таблиці 2, внесок розчину порівняння і розчину плацебо у значення фонового поглинання становить 0,3011% і 0,6022% відповідно, та є незначущим тобто не перевищує mаx значення системної невизначеності. Значення розраховували відносно середнього значення абсорбції зразка (0,0946).

Таким чином, внесок плацебо в сумарну величину фонового поглинання є незначущий і їм можна нехтувати.

Критерії прийнятності лінійності. Нами перевірялась коректність використання лінійної моделі калібрування. Були розраховані та перевірені параметри лінійної залежності аналітичного сигналу від концентрації:

залишкове стандартне відхилення SD0 (SDo ? 0.53 %)

коефіцієнт кореляції R (Rc ? 0.99912 )

Оцінку лінійної залежності проводили на всьому діапазоні використання методики. валідація абсорбційний лікарський хроматографія

Вивчення залежності абсорбції від концентрації проводили з використанням 9 модельних сумішей із вмістом заліза: 50.0, 62.5, 75.0, 87.5, 100.0, 112.5, 125.0, 137.5 і 150.0% від номінального вмісту (28.7 мг/таб).

Для калібрування готували 5 стандартних розчинів в діапазоні 50-150% (тобто маємо 3 міри свободи) з концентрацією заліза: 50.0, 75.0, 100.0, 125.0 і 150.0% від номінального вмісту заліза в препараті, що відповідає Cst,i = 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 і 6.0 ppm в кінцевому розчині.

Нами було вивчено лінійну залежність концентрації (мг/мл або ррм) від абсорбції (табл.3). Результати величин Сi та Аi були оброблені методом найменших квадратів (табл. 4).

Таблиця 3 Результати величин Сi та Аi

Концентрація, мг/мл	Y%=C*100/Cном	X%=Абс*100/Абсном	Yрозр%
2	50	52.25	49.30
3	75	76.23	74.32
4	100	100.00	99.12
5	125	124.61	124.79
6	150	147.12	148.27

Таблиця 4 Статистичні параметри калібрувальної прямої

Параметр	Значення	Вимоги	Значення	Вимоги
	ppm (мг/мл)	%
А	-0.2081	SD=0.0139	-5.2071	SD=0.3458
В	44.1099	SD=0.1380	1.0432	SD=0.0033
SDзалиш	0.0099	?0.021	0.25	?0.53
R2	0.9999	?0.99912	0.9999	?0.99912

Побудову калібрувального графіка проводили в нормалізованих координатах (рис.1)

Рис. 1 Калібрувальний графік

Нами розраховані статистичні значення залишкового стандартного відхилення SDзалиш та коефіцієнту кореляції R2. В таблиці 5 показано, що результати SDзалиш не перевищує, а значення R2 є більшим ніж розраховані значення вимоги до цих параметрів калібрувальної прямої.

Таким чином, вимоги до параметрів лінійної залежності в нашому випадку виконуються на всьому діапазоні застосування методики (50-150 %), тобто для калібрування може бути використана лінійна функція.

Лінійність, правильність, точність для модельних розчинів. Нами були розраховані середні значення абсорбції заліза (Аi) для кожного з модельних розчинів, а також значення «введено» щодо концентрації модельного розчину з номінальною концентрацією 100% (Сi/Сst), «знайдено» щодо інтенсивності абсорбції заліза в модельному розчині з номінальною концентрацією 100% (Аi/Аst).

Для обробки результатів методом найменших квадратів розраховані нормалізовані значення абсорбції X(%) = А*100/А(номінальна), та номінальна концентрації Y(%) = C*100/C.

Результати обробки для модельних розчинів методом найменших квадратів наведені в таблиці 5.

Таблиця 5 Статистична обробка результатів модельних розчинів

Параметр	Значення	SD	Вимоги до параметру	Висновок
А	-2.89844	0.0164
В	1.02078	0.00016
SDrest	0.01426		? 2.1	Відпов.
R2	1.00000		? 0.99638	Відпов.

Рис. 3. Графік стандартних розчинів	Рис. 4. Графік модельних розчинів

Експериментальні значення абсорбції підставляли в калібрувальне рівняння Сi= - 0.2081+ 44.1099 * Аi та розраховували значення Срозр, а також їх відношення до введених величин Yввед у відсотках (%) (табл. 6).

Як видно з таблиці 6, значення невизначеності аналізу відрізняються. Перше значення ДAs =1.83 включає невизначеність калібрування, похибку пов'язану з вимірюванням, тобто похибку прибору. Значення ДAs =2.58 розраховано враховуючи теоретичні концентрації заліза у модельних розчинах.

Таким чином, це значення враховує також похибку пробопідготовки.

Нами також розраховані відношення отриманої концентрації від теоретичного значення концентрації модельних розчинів.

Таблиця 6 Результати розрахунків параметрів лінійності

Середнє значення абсорбції	Концентрація знайдена, ррм	Концентрація розрахована, ррм	Знайдено, %	Концентрація знайдена, ррм	Концентрація теоретична, ррм	Знайдено, %
0.0499	2.038	1.993	97.79	2.038	2.003	98.28
0.0611	2.521	2.487	98.65	2.521	2.504	99.33
0.0729	3.031	3.008	99.23	3.031	3.005	99.15
0.0853	3.565	3.554	99.71	3.565	3.506	98.34
0.0967	4.058	4.057	99.98	4.058	4.007	98.74
0.1073	4.516	4.525	100.20	4.516	4.508	99.82
0.1189	5.016	5.037	100.41	5.016	5.009	99.85
0.1286	5.434	5.464	100.56	5.434	5.509	101.39
0.1388	5.875	5.914	100.67	5.875	6.010	102.30
Середнє, %	99.69			99.69
Відносне стандартне відхилення,sz%	0.97			1.36
Критичне значення для збіжності результатів ДAs % ? 3,90	1.83			2.58
Критичне значення систематичної погрішності д ? 1.25	0.31			0.31

Обидва результати відповідають вимогам до невизначеності калібрування та не перевищують його критичного значення 3.90.

Експериментальні значення Х% = 100*Аi/Аном нами підставлялись до калібрувального рівняння Yi = -5.20705+1,04324* Xi та розраховувались значення Yрозр, а також їх відношення до введених величин Yввед в % (табл. 7). Правильність. Для вимірювання правильності проводять випробування при штучно створюваних навантаженнях і визначається ступінь результативності аналізів - пробу, характеристики якої відомі, змішують з наповнювачами, а фактичний параметр препарату зіставляють з результатом контрольного дослідження.

Правильність виражають у величині систематичної похибки або в % погрішності між зміряним і істинним значенням.

Розраховують відхилення введено/знайдено:

di = (Ci/Cтеор) * 100%

Однобічний довірчий інтервал d не повинний перевищувати максимально припустиму невизначеність результатів аналізу:

?d = SC,r (%) * 1.859 ? 3.90

де: SС,r - відносне стандартне відхилення, виражене у відсотках, розраховане для відносин введене/знайдено для всіх 9 розчинів; t - однобічний коефіцієнт Стьюдента для імовірності 95 % і числа ступенів свободи 8.

Таблиця 7 Результати аналізу лінійності модельних розчинів заліза та їх статистична обробка

№ модельного розчину	Х% = 100*Аi/Аном	Yрозрах%	Yввед%	Знайдено/введено, Yрозр/Yввед*100%
1	52.75	49.822	50.95	97.79
2	64.59	62.173	63.03	98.65
3	77.06	75.186	75.78	99.22
4	90.17	88.861	89.13	99.70
5	102.22	101.433	101.45	99.98
6	113.42	113.122	112.90	100.20
7	125.69	125.915	125.40	100.41
8	135.94	136.612	135.85	100.56
9	146.72	147.860	146.88	100.67
Середнє, Хсеред %	99.69
SD%	0.97
Довірчий інтервал ДAs% = t(95%,8)*SD = 1,86*SD	1.80
Критичне значення ДAs%	? 3.9
Систематична похибка д = ¦100 - Хсеред¦	0.31
Статистична незначимість д? ДAs/3 = 1.80/3 = 0.60	0.31 ? 0.60 виконується
Практична незначимость: якщо не виконується 1) д ?? 1.25%	0.31 ? 1.25 виконується
Висновок	Відповідає

Для визначення правильності методики визначення заліза у препараті готували по три зразка для трьох концентрацій: 50, 100 і 150%.

Критерій практичної незначущості у разі невиконання (1): (17)

Правильність вивчали для 9 концентрацій модельних розчинів, які рівномірно охоплюють діапазон ± 20 % від номінальної концентрації. Точність та правильність оцінюють за даними для лінійності.

Специфічність. В розчині плацебо препарату не повинно визначатися Fe. У разі наявності аналітичного сигналу, розрахована відповідна концентрація повинна бути незначущою у порівнянні з максимально припустимою невизначеністю результатів аналізу.

Внутрішньолабораторна прецизійність. Аналізували модельний розчин препарату в різні дні, і оцінювали різницю знайденого вмісту заліза.

Робасність. Визначали стабільність розчинів та відтворюваність результатів.

Придатність аналітичної системи. Для усіх одержаних в процесі валідації результатів виконуються вимоги до RSD.

У п'ятому розділі за допомогою проведених досліджень був запропонований алгоритм методики визначення водорозчинних вітамінів і жиророзчинних вітамінів. Визначення достовірності вітамінно-мінеральних препаратів методом ВЕРХ засноване на зіставленні хроматографічний рухливості випробовуваного зразка з рухливістю стандарту (табл.8).

Таблиця 8 Хроматографічні умови

Вітаміни	Довжина хвилі, нм	Закол, мкл	Рухома фаза	Швидкість потоку мл/хв	Час утримування, хв.
1 колонка
В1 ст	254	20	ацетонітрил/0,005М гептансульфонова к-та	1,5	21,647
В1зр	254	20		1,5	21,350
2 колонка
В2 ст	270	10	метанол/20µМ калію фосфат з рН 3,5	1,0	17,137
В2 зр	270	10		1,0	17,107
В3ст	270	10	метанол/20µМ калію фосфат з рН 3,5	1,0	5,058
В3 зр	270	10		1,0	5,097
В6 ст	270	10	метанол/20µМ калію фосфат з рН 3,5	1,0	7,333
В6 зр	270	10		1,0	7,327
В9 ст	270	50	метанол/20µМ калію фосфат з рН 3,5	1,0	15,660
В9 зр	270	50		1,0	15,515
В12 ст	550	100	метанол/20µМ калію фосфат з рН 3,5	1,0	15,713
В12 зр	550	100		1,0	15,673
3 колонка
D3 ст	265	20	ацетонітрил:метанол (91:9)	1,2	9,123
D3 зр	265	20		1,2	9,205
E ст	265	20	ацетонітрил:метанол (91:9)	1,2	13,410
Е зр	265	20		1,2	13,515

На основі монографій USP були розроблені одностадійні селективні методики кількісного визначення вітамінів методом ВЕРХ. В якості стандартів використовували вітаміни фармакопейної якості (USP).

На основі проведених досліджень в якості рухомої фази для кількісного визначення вітаміну В1 вибрана суміш ацетонітрилу і 0,005 М водного розчину гептансульфонової кислоти. Як елюент для кількісного визначення вітамінів В2, В3, В6, В9 і В12 вибрана суміш метанолу з 20 мМ калію фосфорнокислого однозаміщеного. Оптимальне значення кислотності розчину встановлювали за допомогою ортофосфорної кислоти до значення рН = 3,5. Розчини дегазували і фільтрували через фільтр з розміром пір 0,45мкм. Рухомою фазою для кількісного визначення вітамінів Е, D3 була вибрана ізократична суміш ацетонітрил/ метанол (91:9).

Хроматографічне визначення проводили на хроматографі ВЕРХ - Termo Finnigan Surveyor UV detector (USA) з детектором із змінною довжиною хвилі. Колонка - (4,6х 150) мм, сорбент - силікагель С18 із зерненням порядку 5 мм, об'єм проби, що вводиться, 10-20 мл. Швидкість рухомої фази -1,0-1,5 мл/хв. Управління приладом і обробка результатів здійснюється з використанням програми Chrom Quest, Thermo Electron Corporation (USA).

Хроматографічне визначення вітаміну В1 проводили при температурі 25єС відповідно умов приведених в табл.8 на колонці №1: л 254 нм; швидкість потоку 1,5 мл/хв; об'єм інжекції 20 µл, час утримування вітаміну В1 складає 21,647 хв.

Вітаміни В2, В3, В6 , В9 і В12 визначали на колонці №2 : л 270 нм; швидкість потоку 1,0 мл/хв; об'єм інжекції для В2, В3, В6 складає10 µл; для фолієвої кислоти -50 µл, час утримування 5.01 хв. складає для В3; 7.33 хв. - для В6; 15.52 хв. - для В9, 17,11 хв. - для В2. Визначення вітаміну В12 проводили при л 550 нм; швидкість потоку 1.0 мл/хв., об'єм інжекції - 100 µл; час утримування - 15,67 хв.

Хроматографічне визначення вітамінів D3 і Е проводили на колонці №3 при температурі 25єС, л 265 нм, швидкість потоку 1,2 мл/хв., об'єм інжекції 20 мл; час утримування вітаміну D3 і Е складає 9.21 хв. і 13.52 хв. відповідно.

Таким чином, використовуючи переваги рідинного хроматографа Termo Finnigan Surveyor - можливість багатохвильової детекції і гнучкого підбору градієнтного режиму елюції, - нам вдалося підібрати хроматографічні умови визначення найважливіших водорозчинних вітамінів і в ізократичному - жиророзчинних вітамінів. Використання спектральних відносин (відносин площ піків при різних довжинах хвиль) для ідентифікації вітамінів на додаток до ідентифікації по часах утримування дозволяє відмовитися від застосування стандартів в кожній серії визначень. Вміст вітамінів відповідає вимогам АНД.

У шостому розділі наведені результати аналізу активних інгредієнтів у спеціалізованих ВМК Жестікер, Вітакап, Вітірон Суськапс. Висвітлені також фармакологічні аспекти сумісності і взаємодії деяких вітамінів і мікроелементів, таких як кальцій, який знижує засвоєння заліза. Проблеми несумісності компонентів у препараті Жестікер вирішувалися за рахунок використання двофазної лікформи, яка дозволяє поступово вивільняти компоненти, що входять до складу однієї таблетки, повністю засвоїться і не взаємодіяти з компонентами наступної фази. Так, залізо вивільняється при рН шлунку, тоді як кишкове покриття затримує вивільнення кальцію і дозволяє розчиняти його в тонкій кишці при pH of 5.5 or higher. рН 5,5 і вище. Таким чином, двофазна лікформа дозволяє уникнути інтерференцію абсорбції кальцію і заліза, вивільняючи ці елементи в різних частинах шлунково-кишкового тракту, забезпечує швидке настання ефекту і тривалу дію інгредієнтів, оскільки дія вітамінно-мінерального препарату є сумісною дією його компонентів.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та вирішення наукової задачі, що виявляється у розробці та валідації методик кількісного визначення компонентів вітамінно-мінеральних препаратів.

1. Вперше запропонована стандартизована процедура валідації методики кількісного визначення заліза методом ААС із застосуванням калібрувального графіку в умовах аналітичних лабораторій.

2. Вперше розраховані критерії прийнятності метрологічних характеристик для методик кількісного визначення заліза методом ААС з використанням калібрувального графіку.

3. Вперше обґрунтовані підходи до валідації методик кількісного визначення мікроелементів методом ААС з використанням калібрувального графіку.

4. Вперше створено підходи проведення валідації методики, яка одночасно придатна для випробувань кількісного визначення та розчинення мікроелементів методом атомної абсорбції відповідно до найширшого діапазону застосування та більш критичних вимог до максимально припустимої невизначеності методики аналізу.

5. На основі розроблених підходів здійснена валідація методики кількісного визначення та розчинення мікроелементів у вітамінно-мінеральних препаратах методом атомно-абсорбційної спектрометрії із застосуванням калібрувального графіку.

6. Визначені оптимальні хроматографічні умови і запропонований алгоритм методики визначення водорозчинних вітамінів в градієнтному режимі і в ізократичному - жиророзчинних вітамінів.

7. Розроблені та апробовані селективні методики визначення вітамінів в складних багатокомпонентних вітамінно-мінеральних комплексах. Перевагою запропонованих методик є можливість одночасного якісного і кількісного контролю водо- і жиророзчинних вітамінів, відсутність складного алгоритму пробопідготовки, точність і селективність, низька вартість серійних аналізів.

8. Розроблена методика кількісного визначення у складному вітамінно-мінеральному комплексі аскорбінової кислоти методом титрування із застосуванням реактиву Тільманса.

9. Розроблені та відвалідовані методики включені до АНД на вітамінно-мінеральний препарат та захищені заявками на видачу патенту на винахід та корисну модель. Результати валідації підтверджують, що методики відповідають своєму призначенню щодо визначення якості вітамінно-мінеральних комплексів.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Левашова О.Л. Організація системи внутрішнього контролю якості в аналітичній лабораторії /О.Л.Левашова, С.М.Коваленко //Управління, економіка та забезпечення якості в фармації. - 2009.- № 6. - С 23-30.

2. Левашова О.Л. Изучение активных ингредиентов пренатального мультивитаминного комплекса «Жестикер»/ О.Л. Левашова //Укр. журнал клінічної та лабораторної медицини -2010. - №3. - С.16-20.

3. Pharmaceutical analysis of multvitamin complex Gesticare / O.L. Levashova, S.N. Kovalenko // Фармація України. Погляд у майбутнє: матер. VII Нац. з'їзду фармацевтів України (15-17 верес.2010 р.) - Х.:НФаУ. - 2010. - Т.1.- С 122-123.

4. Левашова О.Л. Вплив мультивітамінів на вагітність / О.Л. Левашова //Молодь - медицині майбутнього: тез. доп. міжнар.наук.конф. студ. та молодих вчен. (22-23 квітня 2010 р.). - Одеса. - 2010. - С. 200-201.

5. Левашова О.Л. Методи аналізу мультивітамінного комплексу для вагітних / О.Л. Левашова //Фармацевтична наука: історичні аспекти формування та шляхи вдосконалення: матер. VI Регіон. наук-практ. конф. молодих вчених та студентів (28-29 квітня 2010 р.) - Луганськ: ТОВ «Вертуальна реальність. - 2010. - С.126-127.

6. Левашова О.Л. Пренатальний вітамінно-мінеральний комплекс / О.Л. Левашова //100 років Укр. лікарському товариству: матер. ХІІІ Конгресу СФУЛТ (30 верес.-03 жовтня 2010 р.). - Львів-Київ-Чикаго. - 2010. - С.176-177.

7. Левашова О.Л. Особенности определения аскорбиновой кислоты в витаминно-минеральном комплексе «Жестікер» / О.Л. Левашова, С.Н.Коваленко // Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики. - 2011. - вип.24, № 2. - С. 26-29.

8. Левашова О.Л Валідація методики визначення заліза у вітамінно-мінеральному комплексі. Повідомлення 1. /О.Л. Левашова, С.М.Коваленко // Управління, економіка та забезпечення якості в фармації. - 2011.- № 2. - С.16-20.

9. Левашова О.Л. Визначення мікроелементів у вітамінно-мінеральному комплексі /О.Л. Левашова, С.М.Коваленко //Укр. біофармац.журнал. - 2011. - № 3. - С. 46-51.

10. Валідація методики кількісного визначення заліза у вітамінно-мінеральному препараті / Левашова О.Л. //Управление качеством в фармации: Матер. V науч.-практ. конф. (24 мая 2011) - Х. НФаУ. - 2011. - С.40

АНОТАЦІЯ

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 - стандартизація і організація виробництва лікарських засобів. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2011.

Дисертаційна робота присвячена розробці та валідації методик контролю якості вітамінно-мінеральних препаратів.

Вперше обґрунтовано розрахунок критеріїв прийнятності для валідаційних характеристик з урахуванням вимог до невизначеності аналітичної методики кількісного вмісту мікроелементів у препаратах методом атомно-абсорбційної спектрометрії з використанням калібрувального графіку. Вперше обґрунтовані підходи до валідації та розроблено раціональну схему процесу валідації, яка одночасно придатна для випробувань кількісного визначення та розчинення мікроелементів методом атомно-абсорбційної спектрометрії відповідно до найширшого діапазону застосування та більш критичних вимог до максимально припустимої невизначеності методики аналізу. Визначені оптимальні умови і запропонований алгоритм методики визначення водорозчинних вітамінів в градієнтному режимі і в ізократичному - жиророзчинних вітамінів методом ВЕРХ. Результати валідації підтверджують, що методики відповідають своєму призначенню щодо визначення якості вітамінно-мінеральних препаратів.

Ключові слова: контроль якості, валідаційні характеристики, критерії прийнятності, вітаміни, мікроелементи, вітамінно-мінеральні препарати.

Диссертация на получение научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03 - стандартизация и организация производства лекарственных средств. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2011.

Диссертационная работа посвящена решению научной задачи, которая осуществляется в разработке и валидации аналитических методик контроля качества витаминно-минеральных препаратов.

Разработана методика количественного определения железа и предложена методика одновременного определения кальция и цинка методом атомно-абсорбционной спектрометрии с использованием калибровочного графика. Для количественной оценки содержания микроэлементов применяли калибровочный график, который отображает качественный и количественный состав растворов стандартных веществ. Построение калибровочного графика проводили в нормализованных координатах. Для детектирования и измерения были определены условия измерения микроэлементов в сложной матрице витаминно-минеральных препаратов. Впервые обоснованы подходы к валидации и предложена стандартизированная процедура валидации методики количественного определения железа методом атомно-абсорбционной спектрометрии с использованием калибровочного графика. Для определения критериев величины неопределенности калибровки предложены два подхода: в первом варианте величина неопределенности калибровки должна быть незначительной в сравнении с предельно допустимой неопределенностью анализа (Дкал ? 0.32 · max ДАs). Это упрощает оценку результатов проведения валидации. Кроме того, такой подход к допустимой неопределенности анализа переносится и на испытуемый образец, те есть делает требования к анализу более либеральными. Недостатком данного подхода является то, что он предъявляет достаточно жесткие требования к калибровочной прямой, которые далеко не всегда могут быть реализованы на практике. Это связано, в частности и с малым числом степеней свободы прямой ( = 3), которая приводит к достаточно большому коэффициенту Стьюдента.

Второй подход основывается та том, что точность анализа калибровочных растворов равна точности анализа образца (Дкал = Добр). Данный подход предъявляет значительно более либеральные требования к калиброванию и представляется реальнее на практике. Впервые обоснован расчет критериев приемлемости для валидационных характеристик с учетом требований к неопределенности аналитической методики количественного содержания микроэлементов в препаратах.

Разработана рациональная схема процесса валидации для одновременного оценивания характеристик специфичности, линейности и прецизионности, которая одновременно пригодная для испытаний количественного определения и растворения микроэлементов методом атомной абсорбции в соответствии с самым широким диапазоном применения и более критических требований к максимально допустимой неопределенности методики анализа. На основе разработанных подходов осуществлена валидация методики количественного определения и растворения микроэлементов в витаминно-минеральных препаратах методом атомно-абсорбционной спектрометрии с применением калибровочного графика.

На основании проведенной процедуры валидации предложена оптимизированная методика количественного определения железа методом атомно-абсорбционной спектрометрии с использованием калибровочного графика, которая позволяет контролировать качество препаратов, в состав которых входит железо.

Определены оптимальные хроматографические условия и предложен алгоритм методики определения водорастворимых витаминов в градиентном режиме и в изократическом - жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Селективные аналитические методики позволяют проводить определение 6 водо- и 2 жирорастворимых витаминов в сложной матрице препаратов.

Разработаны и апробированы селективные методики определения витаминов в сложных многокомпонентных витаминно-минеральных препаратах. Преимуществом предлагаемых методик является возможность одновременного качественного и количественного контроля водо- и жирорастворимых витаминов, отсутствие сложного алгоритма пробоподготовки, точность и селективность, низкая стоимость серийных анализов. Разработана методика количественного определения аскорбиновой кислоты методом титрования с применением реактива Тильманса.

Результаты валидации подтверждают, что методики отвечают своему назначению относительно определения качества витаминно-минеральных препаратов.

Ключевые слова: контроль качества, валидационные характеристики, критерии приемлемости, витамины, микроэлементы, витаминно-минеральные препараты.

This thesis for the obtaining of scientific degree of the Candidate of pharmaceutical science on specialty 15.00.03 - standardization and organization of drug manufacturing. National University of Pharmacy, Kharkov, 2011.

Dissertation is devoted to the development and vali...