Совершенствование подходов к ведению пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса

Размещено на http://www.allbest.ru/

Совершенствование подходов к ведению пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса



Применение в 1943г. американскими учеными Магони, Арнольдом и Гаррисом при лечении сифилиса антибиотика пенициллина произвело определенный переворот в дерматовенерологии и, казалось бы, навсегда решило проблему лечения этого заболевания. Заболеваемость сифилисом в мире стала неуклонно падать, а дальнейшее расширение спектра пенициллиновых препаратов и усовершенствование схем их введения при лечении сифилиса практически полностью перевели проблему сифилиса из медицинской области в социальную (Киселева Г.А., Аковбян В.А., Резайкина А.В. и др., 1999; Дмитриев Г.А., Фриго Н.В., 2004; Лосева О. К., Катунин Г.Л., 2003).

Тем не менее, вопрос о замедлении негативации серологических реакций после полноценного лечения сифилиса остается одним из важных в сифилидологии (Милич М.В., 1987; Соколовский Е.В., 1995; Назаров П.Г., Старченко М.Е., Касаткин Е.В., Данилов С.И., 1996; Мыскин В.С., Магарышкина О.В., 2001; Прохоренков В.И., Аковбян В.А., 2002).

Известно, что замедление негативации серологических реакций после терапии сифилиса с использованием различных методик по данным разных авторов составляет от 15% до 30%. Проблема изучения причин замедления негативации серологических реакций сохраняет свою актуальность, привлекая внимание многих исследователей.

Под замедлением негативации серологических реакций следует понимать: отсутствие 4-кратного снижения титра РМП/РПР через год после полноценного лечения анних форм сифилиса; отсутствие тенденции к снижению титров/степени позитивности РМП/РПР через 1,5 года после полноценного лечения ранних форм сифилиса; отсутствие полной негативации РМП/РПР через 2 года после полноценного лечения ранних форм сифилиса.

В России сформировались две основные позиции на развитие данного состояния с учетом иммунной компетентности. Согласно одной точке зрения, наиболее вероятной причиной замедления негативации серологических реакций является персистенция бледных трепонем в организме, трансформировавшихся в L-формы, цисты или заключенные в полимембранные фагосомы и находящиеся в состоянии сосуществования с организмом хозяина, обеспечивая в то же время антигенную стимуляцию (Данилов С.И., Назаров П.Г., 2000, Дмитриев А.Г., Афонин А.В., 2003, Лосева О.К. Катунин Г.Л., 2003). Среди причин возможной персистенции бледной трепонемы называются: поздно начатое специфическое лечение; введение низких дозировок препаратов (в том числе, частое применение антибиотиков по поводу сопутствующих заболеваний); прерванное лечение; повышение резистентности трепонем к препаратам пенициллина; изменение реактивности организма больного (сопутствующая патология - гепатиты, хронические интоксикации алкоголем и наркотиками, «фоновая иммунодепрессия»).

Согласно другой концепции замедление негативации серологических реакций связывают c иммунопатологическими изменениями (Гарматюк Г.К., 1971, Щербаков М.А., 2001, Элахи А.Р., Ломоносов К.М., Грабовская О.В., Фадеев А.А., 2005, Шушеначева Е.Е., 2006). Авторы рассматривают различные варианты этих нарушений: от иммунодефицитных состояний по клеточному звену и нарушения регуляции функционирования макрофагального звена иммунитета до формирования аутоиммунных реакций в организме больных. Ключевым моментом выдвинутой концепции является выявление антиидиотипических антител (АИА) в крови больных.

Таким образом, сведения о механизмах замедления негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса нередко носят противоречивый характер и требуют дополнительного изучения: это определило цели и задачи данного исследования.

Целью настоящего исследования явилось формирование рационального подхода к ведению пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса на основе комплексной оценки иммунных изменений.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) выявить на основе анамнестических, клинических, лабораторных данных значимость различных факторов, способствующих замедлению негативации серологических реакций после лечения различных форм сифилиса;

2) оценить эффективность различных методик специфической терапии раннего приобретенного сифилиса и дополнительного лечения при замедлении негативации серологических реакций;

3) исследовать состояние гуморального иммунитета у пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса путем изучения содержания в сыворотке крови идиотипических и антиидиотипических антител к кардиолипину и р17 антигенному белку Treponema pallidum;

4) изучить содержание ЛЭ, б₁ПИ и СРБ в сыворотке крови у пациентов с замедлением негативации серологических реакций - индикаторов активности инфекционного процесса - с целью определения вероятности элиминации T.pallidum после лечения ранних форм сифилиса;

5) разработать алгоритм обследования пациентов с замедлением негативации серологических реакций после перенесенного сифилиса для формирования дифференцированного подхода к назначению дополнительного лечения.

Научная новизна.

1) Впервые у пациентов с замедлением негативации серологических реакций показано избирательное повышение уровня антиидиотипических антител (АИАТ) к антигенам T.pallidum - кардиолипину и белку р17 - по сравнению с антителами первого порядка, что является показателем нарушения взаимной регуляции между идиотипическими антителами (ИАТ) и АИАТ; выявленный феномен является иммунохимической основой формирования самоподдерживающегося «порочного круга», способствующего индукции высоких уровней антител к антигенам трепонемы даже после устранения возбудителя.

2) Впервые у пациентов с замедлением негативации серологических реакций комплексно изучено содержание ЛЭ, б₁ПИ и СРБ как ранних и чувствительных индикаторов активности инфекционного процесса после перенесенного сифилиса, что позволяет исследовать вероятность элиминации T.pallidum при замедлении негативации серологических реакций.

3) Впервые разработан алгоритм дифференцированного подхода к назначению дополнительного лечения пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса с учетом комплекса иммунологических критериев.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Регистрация замедления негативации серологических реакций, выявляемой на основании изучения анамнестических, клинических, лабораторных данных 324 пациентов после перенесенного сифилиса демонстрирует, что замедление негативации серологических реакций в большинстве случаев встречается у лиц, получивших лечение по поводу вторичного сифилиса кожи и слизистых, а также раннего скрытого сифилиса малыми дозами дюрантных препаратов пенициллина, чаще с сопутствующими ИППП.

2. Достоверное повышение уровня АИАТ к кардиолипину и одному из антигенов T.pallidum - белку р17 по сравнению с антителами первого порядка у всех пациентов с замедлением негативации серологических реакций является показателем нарушения взаимной регуляции между ИАТ и АИАТ. Предполагается, что в силу индивидуальных особенностей у ряда пациентов после заражения в организме происходит развитие гипериммунной реакции с выработкой высоких уровней АИАТ к антителам против T.pallidum. Поскольку вариабельные участки АИАТ являются «зеркальным отображением» антигенных детерминант T.pallidum, то организм реагирует на повышенный уровень АИАТ усиленной выработкой антител третьего порядка, которые по своим характеристикам подобны антителам первого порядка к антигенам T.pallidum и могут при тестировании сывороток давать положительные результаты.

3. Избирательное повышение уровня антиидиотипических антител к антигенам T.pallidum является иммунохимической основой для формирования самоподдерживающегося «порочного круга», способствующего индукции высоких уровней антител к антигенам трепонемы даже после устранения возбудителя в результате лечения антимикробными препаратами. В то же время выявленный дисбаланс в «иммунной сети» не может свидетельствовать об элиминации T.pallidum из организма.

4. Активность инфекционного процесса у пациентов с замедлением негативации серологических реакций характеризует содержание ЛЭ, б1-ПИ и СРБ в сыворотке крови, что позволяет выделить три подгруппы:

– подгруппу с нормальными значениями активности ЛЭ, б1-ПИ и концентрации СРБ; вероятно, у пациентов этой подгруппы трепонема в организме отсутствует, а отсутствие негативации серологических реакций обусловлено нарушением идиотип-антиидиотипического равновесия.

– подгруппу с высокими значениями показателей активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ и СРБ) на фоне отсутствия дисбаланса в системе идиотип-антиидиотип с направленностью к антигенам T.pallidum, что косвенно указывает на то, что причиной развития замедления негативации серологических реакций после полноценного лечения может быть сохранение возбудителя сифилиса в организме.

– подгруппу с сомнительными результатами, когда нельзя однозначно судить о наличии или отсутствии инфекционного процесса и, соответственно, трепонемы. Возможно, персистенция T.pallidum в неактивных формах позволяет ей длительное время уклоняться от реакций иммунной системы, вызывая при неблагоприятных условиях периодическую активацию клеточного и гуморального звеньев иммунитета, что и обеспечивает длительное сохранение серопозитивности.

5. Назначение дополнительного лечения пациентам с замедлением негативации серологических реакций после перенесенного сифилиса целесообразно проводить дифференцировано, с учетом активности инфекционного процесса:

– группе пациентов с высокими значениями показателей активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ, СРБ) на фоне отсутствия дисбаланса в идиотип-антиидиотипической системе показана антибиотикотерапия;

– группе пациентов с нормальными значениями показателей активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ, СРБ) на фоне нарушений идиотип-антиидиотипического равновесия показана иммунотропная терапия;

– группе пациентов с сомнительными результатами показано комплексное лечение с использованием антибиотикотерапии и иммуннотропных препаратов.

Практическая значимость.

1) Выявлены факторы, способствующие замедлению негативации серологических реакций после лечения ранних форм сифилиса;

2) Предложен новый метод оценки вероятности элиминации T.pallidum у пациентов с замедлением негативации серологических реакций после перенесенного сифилиса с учетом активности ЛЭ, б₁ПИ и концентрации СРБ.

4) Разработан алгоритм дифференцированного подхода к назначению дополнительного лечения пациентам с замедлением негативации серологических реакций с учетом комплекса иммунных показателей.

Апробация материалов диссертации: материалы диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской конференции, посвященной памяти В.А.Рахманова, ПММГУ (2010, 2011 гг.); научно-практической конференции для врачей ЦВГГ МВД РФ (2010-2013 гг.); Междисциплинарных районных, областных конференциях врачей-дерматовенерологов, акушеров-гинекологов в г. Омск (2010, 2011 гг.), г. Нижний Новгород (2011г.), г.Новосибирск (2012г.).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 1 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации: диссертация состоит из списка сокращений, введения, 7 глав, содержащих обзор литературы, изложение материалов и методов исследования, клиническую характеристику, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографии, содержащей 96 отечественных и 48 иностранных источников.

Материалы диссертации изложены на 146 страницах компьютерного текста, иллюстрированы 25 таблицами, 9 диаграммами.

Материалы и методы исследования

Для выполнения задач исследования проведено комплексное обследование пациентов с замедлением негативации серологических реакций, включающее клинические, дерматологические методы обследования, стандартные лабораторные (биохимические, иммунологические) исследования.

Клинические методы исследования. Обследование пациентов с замедлением негативации серологических реакций проводили по общепринятой методике: сбор анамнеза, общий осмотр, оценка объективного состояния органов и систем.

Серологические методы диагностики включали: нетрепонемные тесты - реакция микропреципитации (РМП) или ее аналоги (RPR-тест, VDRL; TRUST); трепонемные тесты - ИФА; РПГА; РИФ_абс и РИФ₂₀₀; РИБТ; иммуноблоттинг.

Консультации других специалистов (офтальмолога, невролога, оториноларинголога) рекомендовались по показаниям.

Иммунологические методы исследования включали: получение первичных (идиотипических) антител к кардиолипину и белку р17 с помощью иммуноаффинной хроматографии с использованием системы BioLogik LP (Bio-Rad, США). Очищенные антитела концентрировали методом ультрафильтрации на мембране ХМ-100А (Amicon, США) и хранили при температуре -40°С.

Для получения кроличьей антисыворотки к белку р17 T.pallidum проводили иммунизацию кроликов породы шиншилла коммерческим рекомбинантным белком р17 (Abcam, Великобритания).

Для определения антикардиолипиновых идиотипических антител в сыворотке крови в работе использовали методику ИФА, оптимизированную для определения кардиолипиновых антител (Reddel S.W., Krilis S.A., 1999; Caccavo D.et al., 2007; Scalzi V.et al., 2010).

Для определения АИАТ к кардиолипину, идиотипических и антиидиотипических антител к антигеному белку р17 T.pallidum использовали стандартную методику постановки ИФА. Для обработки планшет использовали следующие антигены: F(ab)2-фрагменты АТ к кардиолипину (5 мкг/мл), рекомбинантный белок р17 T.pallidum (5 мкг/мл) (Abcam, Великобритания) и F(ab)2-фрагменты АТ к белку р17 T.pallidum (10 мкг/мл) (Abcam, Великобритания).

Уровень АТ оценивали по оптической плотности (ОП) и выражали в условных единицах активности (усл.ед.) коэффициентом «К», представляющим собой отношение значения ОП исследуемой сыворотки к среднему значению ОП контрольных сывороток. О наличие повышенного уровня АТ свидетельствовало значение «К», превышающее 1,5 усл.ед.

Для определения активности лейкоцитарной эластазы и б1-протеиназного ингибитора в сыворотках крови применяли спектрофотометрический метод с использованием в качестве хромогенного субстрата N-терт-бутокси-карбонил-аланин-р-нитрофенилового эфира (BOC-Ala-ONp) в присутствии ацетонитрила (Доценко В.Л. и др., 1994; Visser L., Blout E., 1972).

Определение активности б1-ПИ в сыворотке крови проводили на основе взаимодействия этого ингибитора с трипсином при использовании в качестве субстрата N-б-бензоил-L-аргинин-этилового эфира (БАЭЭ): б1-ПИ сыворотки крови образует с трипсином комплекс, не расщепляющий БАЭЭ. Поэтому активность б1-ПИ определяется по степени торможения расщепления трипсином низкомолекулярного субстрата.

С целью определения концентрации С-реактивного белка (СРБ) в сыворотках крови использовали коммерческую тест-систему для количественного определения СРБ методом ИФА (Имтек, Москва, Россия). Измерения проводили согласно Инструкции по применению данной тест-системы.

Статистический анализ полученных результатов проводили по алгоритмам программы «Statistica 6.0». Предварительный анализ данных показал, что распределения всех числовых параметров (результаты лабораторных исследований) оказались далеки от нормального (Гауссовского) распределения. Поэтому при статистической обработке материала использовали непараметрические методы математической статистики. Для сравнения результатов в двух независимых выборках применяли U критерий Манна-Уитни и критерий Колмогорова-Смирнова, для сравнения результатов в двух зависимых выборках или двух зависимых переменных - непараметрический критерий Вилкоксона. Данные критерии позволяют оценить степень различия даже при малой численности групп и не чувствительны к небольшому количеству резко выпадающих значений. Они дают ответ о достоверности различий сравниваемых групп в форме вероятности (р<0,05-0,001). Экспериментальные данные представлены в виде М±SEM, где М - среднее значение, SEM - стандартная ошибка среднего.

Результаты собственных исследований.

Под нашим наблюдением находилось 324 больных с замедлением негативации серологических реакций, развившейся после полноценного лечения сифилиса (таблица 1).



Таблица 1. Распределение пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения сифилиса по полу и возрасту (n=324).

Возрастная группа	Пол	Количество больных
	мужчины	женщины	абс.	%
20-30	19	25	44	13,6
31-40	51	89	140	43,2
41-50	36	40	76	23,5
51-60	23	26	49	15,1
Старше 61	3	12	15	4,6
Всего	128	196	324	100

Группу составили 39,5% мужчин и 60,5% женщин. Большинство обследованных - 43,2% - это молодые люди в возрасте от 31 до 40 лет с преобладанием в исследуемой группе женщин (45,4%).

При оценке социально-профессионального статуса по сведениям, предоставленным самими пациентами, было выявлено, что наибольшее число обследованных были безработными - 70,4%; работающие составили 29,6%, причем из них: офисных служащих - до 11,4%, работников транспорта - до 5,9%, работников торговли - до 5,6%, строителей - до 5,2%, студентов - до 1,5%. В браке состояли лишь 29,9% наблюдаемых, причем на внебрачные параллельные связи указали более половины обследуемых - 60,8%. Анамнестический опрос пациентов показал, что в качестве источника заражения до 61,1% больных указывают на половые контакты с малознакомыми лицами.

При консультации соответствующими специалистами у 45,4% пациентов была выявлена сопутствующая патология: вирусные гепатиты В и С - у 32%, заболевания пищеварительного тракта (гастрит, дуоденит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки) - у 26,5%, патология сердечно-сосудистой системы, в том числе и гипертоническая болезнь - у 18,4%, хронический аднексит у женщин - у 12,9%, хронический пиелонефрит - у 10,2%.

Среди сопутствующих ИППП наиболее часто выявлялись урогенитальные заболевания, ассоциированные с генитальными микоплазмами - у 34% и урогенитальная хламидийная инфекция - у 26,6% обследованных (таблица 2).

Таблица 2. Инфекции, передаваемые половым путем у пациентов с замедлением негативации серологических реакций после лечения сифилиса (n=324).

Инфекции, передаваемые половым путем	Количество больных
	абс.	%
Урогенитальные заболевания, ассоциированные с генитальными микоплазмами	32	34
Урогенитальная хламидийная инфекция	25	26,6
Бактериальный вагиноз	17	18,1
Урогенитальный трихомониаз	12	12,8
ВИЧ	4	4,3
Гонококковая инфекция	3	3,2
Папилломавирусная инфекция человека	1	1
Всего	94	100

По киническим формам сифилиса больные были распределены следующим образом: с первичным сифилисом половых органов - 1,5%, с вторичным сифилисом кожи и слизистых - 12,7% и со скрытым ранним сифилисом - 85,8%. При осмотре отмечено, что стадийное течение сифилиса отмечалось лишь у 9,5%; у 69% -длительное бессимптомное течение инфекции, которая была выявлена на основании положительных результатов серологических реакций крови. Клинические симптомы при первичном и вторичном сифилисе были типичными.

Выявление больных сифилисом происходило различными путями: обследование по контакту - у 30,2%; другими специалистами на амбулаторных приемах - у 19,1%; в стационарах (перед плановыми операциями, абортами и при лечении соматической патологии) - у 18,2%; при оформлении медицинской книжки и вида на жительство - у 9,3% и 8,3% (соответственно); при устройстве на работу - у 5,6%; при плановой диспансеризации - у 4,3%; при самостоятельном обращении - у 2,8%; в женских консультациях при постановке на учет по беременности - у 2,2% пациенток.

Ретроспективный анамнестический анализ показал, что подавляющее число больных в качестве основного курса лечения сифилиса получили препараты бензатина бензилпенициллина (экстенциллин, ретарпен) - 57,4%; бензилпенициллина натриевую соль - 29,3%, прокаин-бензил-пенициллин - 5,6%, цефтриаксон - 3,7%, антибиотики других групп (тетрациклины и макролиды) - в 2,8% и 1,2% случаев (соответственно). Из общего числа больных, получивших лечение водорастворимым пенициллином в стационаре, курсовую дозу в полном объеме получили лишь 72,6% пациентов, 27,4% - начинали лечение с бензилпенициллина натриевой соли с продолжением терапии в КВД бензатин бензилпенициллином или прокаин-бензил-пенициллином, а 4,2% пациента добровольно прервали курс лечения.

После проведенного лечения отмечалось замедление негативации серологических реакций, причем чаще у лиц в возрасте 31-50 лет (43,2%) с численным превосходством лиц женского пола (60,5%); с сопутствующей соматической патологией (45,4%) и ИППП (29%), получивших лечение по поводу раннего скрытого сифилиса - у 85,8%, при использовании дюрантных препаратов пенициллина - у 48,8% больных; получивших лечение малыми дозами дюрантных препаратов пенициллина (2-3 инъекции по 2,4 млн. ЕД ретарпена или экстенциллина) по поводу вторичного сифилиса кожи и слизистых и раннего скрытого сифилиса.

Нами была проведена ретроспективная оценка эффективности различных методик специфической терапии ранних форм сифилиса и дополнительного лечения пациентов с замедлением негативации серологических реакций.

В группе пациентов с сохранившейся серопозитивностью через 1 год после лечения бензатин бензилпенициллином (экстенциллин, ретарпен, бициллин-3) динамика серологических реакций отсутствовала у 72%, тенденция к снижению титров реагинов наблюдалась у 26,3% обследованных, повышение титров - у 1,6%. В группе после лечения бензилпенициллина натриевой солью преобладали пациенты с отсутствием динамики серореакций - у 62,1%; снижение титров антител отмечено у 36,8%.

Пациенты с отсутствием динамики серологических реакций после лечения прокаин-бензилпенициллином также преобладали - 44,4%; у 38,9% выявлено снижение титра РМП; повышение титров реагинов отмечено у 16,7%.

В группе после лечения цефтриаксоном преобладали пациенты с тенденцией к негативации серореакций: со снижением титров антител в 2, 3 и 4 раза - до 50%; с отсутствием динамики МР - до 25%; с повышением титров - до 25%.

У пациентов после лечения антибиотиками других групп (тетрациклины, макролиды) преобладали пациенты без динамики показателей серореакций - до 61,5%; со снижением титров антител - до 38,5%.

Дополнительное лечение в полном объеме получили 67% пациентов; на очередной КСК не явились 21,3%, самостоятельно прервали курс дополнительного лечения 11,4%.

Для дополнительного лечения пациентов с замедлением негативации серологических реакций чаще применялся водорастворимый пенициллин - у 36,4%; у 25,3% использовали бензатин бензилпенициллина (экстенциллин, ретарпен, бициллин-3) в монотерапии либо в сочетании с иммунотропными препаратами, цефтриаксон - у 14,7%, прокаин-бензил-пенициллин - у 6,9%, антибиотики других групп - у 4,7% и иммунотропные препараты - у 12%.

Длительность КСК после дополнительного лечения пациентов с замедлением негативации серологических реакций составила 3 года. Через 1 год после проведенного дополнительного лечения у 71,9% серореакции были без положительной динамики, тенденция к негативации отмечена у 22,6%, отрицательные результаты серореакций наблюдали лишь у 5,5% пациентов. Эти данные демонстрируют, что применение при дополнительном лечении тех же методик, что и при первичном курсе лечения, не оказывает принципиального влияния на динамику серореакций у пациентов с замедлением негативации серологических реакций. Среди обследованных, получивших лечение водорастворимым пенициллином, полную негативацию серологических реакций получили только у 2,5% больных. При использовании препаратов бензатин бензилпенициллина и прокаин-бензилпенициллина полной негативации серореакций не достигнуто ни в одном случае.

Среди пациентов, получивших терапию цефтриаксоном (14,7%), положительная динамика КСР наблюдалась у 34,4%, при этом у 12,5% полная негативация отмечена через 24 месяца после окончания лечения. Антибиотиками других групп (тетрациклины, макролиды) воспользовались при лечении 4,6% (n=10) пациентов: из них у 1 наступила полная негативация серореакций, у 5 - наблюдалось снижение титров более, чем в 4 раза, у 4 ответа на лечение не получено.

В качестве дополнительного лечения у 12% (n=26) пациентов применялись иммунотропные препараты в виде монотерапии: полиоксидоний - у 16, циклоферон - у 6 и метилурацил - у 4.

После применения полиоксидония полная негативация клинико-серологических реакций выявлена у 15,4% (n=4) пациентов, тенденция к негативации - у 26,9% (n=7). Не отреагировали на лечение 15,4% (n=4), большинство из которых имели резко положительные значения КСР. У 1 пациента после применения препарата регистрировалось значительное снижение показателей КСР, вплоть до отрицательных, которые затем нарастали до первоначальных. После лечения циклофероном отметилось снижение титров более чем в 4 раза у 3-х пациентов, у 3-х - без динамики либо отмечалась незначительная негативация КСР. При использовании метилурацила у 15,4% (n=4) пациентов изменений КСР зарегистрировано не было.

Анализ результатов КСК через 12 месяцев у пациентов, получивших дополнительное лечение по поводу замедления негативации серологических реакций показал, что у 71,9% (n=156) серореакции были без положительной динамики, снижение титров менее, чем в 4 раза наблюдали у 21,7% (n=47), снижение титров более, чем в 4 раза - у 6,4% (n=14), полную негативацию серореакций не наблюдали ни у одного пациента.

Анализ результатов КСК через 24 месяца у лиц, получивших дополнительное лечение продемонстрировал, что у 74,2% (n=161) серореакции были без выраженной динамики, тенденцию к негативации наблюдали у 22,6% (n=49), негативация серореакций отмечена у 3,2% (n=7) пациентов.

Анализ результатов КСК через 36 месяцев у пациентов, получивших дополнительное лечение, показал отсутствие положительной серодинамики у 71,9% (n=156), тенденцию к негативации наблюдали у 22,6% (n=49), а полную негативацию серореакций получили лишь у 5,5% (n=12) пациентов.

Таким образом, выбор препарата в зависимости от стадии сифилиса влияет на число пациентов с замедлением негативации серологических реакций, однако многие факторы патогенеза данного состояния после полноценного лечения остаются не ясными.

Основная концепция данного исследования состояла в изучении возможности поддержания высокого гуморального иммунного ответа к антигенам трепонемы без «участия» самой трепонемы и ее антигенов. Было сделано предположение, что «образ» различных антигенных детерминант трепонемы при развитии иммунного ответа на данный возбудитель, отраженный вариабельными участками F(ab)₂-фрагментов соответствующих антител, при определенных условиях может быть индуктором самоподдерживающегося иммунного ответа. Вероятно, существует индивидуальная предрасположенность к таким гиперергическим реакциям организма на определенные антигены, обусловленная наличием определенных генов гистосовместимости. Ведь указанные вариабельные участки антител сами по себе обладают антигенными свойствами и, согласно сетевой теории регуляции иммунного ответа, являются индукторами синтеза соответствующих АИАТ или антител второго порядка. Известно, что сосуществование идиотипов и комплементарных антиидиотипов в циркуляции является условием саморегуляции иммунного ответа. В свою очередь, вариабельные участки антител второго порядка (АИАТ) могут быть индукторами антител третьего порядка, которые по своим характеристикам связывания с антигеном близки к антителам первого порядка или идиотипам, хотя, по имеющимся в литературе данным, аффинность их связывания с антигеном на порядок меньше. В то же время есть все основания для того, чтобы рассматривать их в качестве аналогов идиотипов.

Для проверки нашего предположения был создан ряд иммуноферментных тест-систем для определения идиотипических и соответствующих АИАТ к антигенам трепонемы. В связи с тем, что серопозитивность образцов сыворотки после перенесенного сифилиса обусловлена не снижающимся или слабо снижающимся уровнем антител к кардиолипину, в первую очередь, такие тест-системы были созданы для определения ИАТ и АИАТ к кардиолипину.

С целью уменьшения неспецифических реакций, обусловленных липидными компонентами, входящими в состав ряда специфических белков трепонемы, для создания иммуноферментных тест-систем в настоящее время используются рекомбинантные аналоги белков T.pallidum - TmpA, 47, 17 и 15 кДa или соответствующие синтетические пептиды.

Были разработаны четыре иммуноферментные тест-системы для определения ИАТ и АИАТ к кардиолипину и белку р17 T.pallidum.

Перед анализом сывороток пациентов с замедлением негативации серологических реакций нами были исследованы сыворотки здоровых доноров (n=120) на наличие ИАТ и АИАТ к кардиолипину и белку р17 с помощью созданных тест-систем. Значения иммунореактивности сывороток для каждого вида антител рассчитывались в виде коэффициента («К» усл. ед.) (таблица 3).

Таблица 3. Содержание ИАТ и АИАТ к кардиолипину и белку T.pallidum р17 у здоровых доноров.

Антиген	ИАТ «К» усл. ед.	АИАТ «К» усл. ед.
Кардиолипин	0,9±0,1	1,0±0,1
Рекомбинантный белок р17	1,0±0,2	1,1±0,1

Оказалось, что уровни четырех видов определяемых антител у здоровых доноров составляют около 1 усл.ед. Полученные значения коэффициента «К», в соответствии с изложенной выше методикой его расчета (см. Материалы и методы исследования) свидетельствовали о том, что у здоровых доноров повышения уровней ИАТ и АИАТ к кардиолипину и рекомбинантному белку р17 не наблюдалось.

Кроме того, мы проанализировали соотношение АИАТ к ИАТ с направленностью к указанным антигенам, так как первоначально сделали предположение, что возможная гиперпродукция соответствующих АИАТ по сравнению с ИАТ может создать условия для инициации самоподдерживающегося иммунного процесса в отсутствие антигенов трепонемы. При вычислении коэффициентов АИАТ/ИАТ значение оптической плотности (ОП) исследуемой сыворотки (в % от контроля), полученное при определении уровня АИАТ, делили на соответствующее значение ОП (в % от контроля) той же сыворотки при определении ИАТ.

Нами было установлено, что в норме соотношения ИАТ к АИАТ находятся в пределах 0,75-1,25 как в отношении к кардиолипину, так и к белку р17, т.е. идиотип-антиидиотипическая система находится в состоянии равновесия.

Далее были исследованы 172 сыворотки пациентов, у которых по истечении 1 года после полученной полноценной терапии сифилиса сохранялись положительные результаты КСР. Для сравнения были исследованы 118 сывороток на наличие изучаемых антител у пациентов с полной негативацией серореакций (НСР) после специфической терапии.

Было выявлено, что у пациентов с замедлением негативации серологических реакций были достоверно (р<0,001) повышены уровни ИАТ и АИАТ к кардиолипину и р17 антигенному белку T.pallidum по сравнению с контрольными группами сывороток (здоровые доноры и пациенты с НСР). Причем уровни АИАТ как к кардиолипину, так и к белку р17 были значительно выше, чем соответствующие ИАТ (р<0,02, р<0,01), что говорит о существенном дисбалансе между антителами первого и второго порядка у пациентов с замедлением негативации серологических реакций (таблица 4).

сифилис терапия серологический

Таблица 4. Содержание ИАТ и АИАТ к кардиолипину и белку р17 T.pallidum в сыворотке крови у пациентов с замедлением негативации серологических реакций (ЗНСР) после лечения сифилиса.

Где: *р<0,001 по сравнению с контрольными группами (доноры и пациенты с НСР);

# р<0,02 между уровнем ИАТ и АИАТ к кардиолипину;

¤ р<0,01 между уровнем ИАТ и АИАТ к белку р17.

Уровни ИАТ и АИАТ в группе пациентов с НСР достоверно не отличались от показателей в группе здоровых доноров, хотя и были немного выше контрольных, особенно к белку р17. Можно сказать, что после лечения у данной группы пациентов произошло восстановление уровней ИАТ и АИАТ к изучаемым антигенам, а незначительно повышенный фон служит свидетельством контакта организма с возбудителем сифилиса в прошлом.

Расчет коэффициентов соотношения АИАТ к ИАТ также подтвердил, что АИАТ к кардиолипину и белку р17 значительно преобладают над ИАТ у пациентов с замедлением негативации серологических реакций (рисунок 1, 2). Для наглядности на диаграммах показаны коэффициенты соотношения АИАТ к ИАТ.

Рисунок 1.

Соотношение уровней антиидиотипических антител и антител первого порядка к кардиолипину в сыворотке крови у пациентов с замедленной негативацией серологических реакций (ЗНСР) и негативацией серореакций после терапии сифилиса.

Рисунок 2.



Соотношение уровней антиидиотипических антител и антител первого порядка к белку р17 T.pallidum в сыворотке крови у пациентов с замедленной негативацией серологических реакций (ЗНСР) и негативацией серореакций после терапии сифилиса.

Однако, у 7,4 % (n=24) пациентов с замедлением негативации серологических реакций соотношение АИАТ/ИАТ было в норме.

Проведенные исследования показали, что у пациентов с замедлением негативации серологических реакций отмечено не только повышение по сравнению с контрольными группами АИАТ к кардиолипину и белку р17 T. Pallidum, но и нарушение структуры «иммунной сети», проявляющееся нарушением «идиотип-антиидиотипического» равновесия. Иными словами, уровни исследуемых АИАТ в исследуемых группах значительно превышали уровни соответствующих ИАТ, которые, в свою очередь, были тоже повышены по сравнению с контрольными группами. Наблюдаемая ситуация создает иммунохимические предпосылки для усиленной индукции антиидиотипами синтеза антител третьего порядка, которые подобны ИАТ.

Обнаруженная нами гиперпродукция АИАТ к кардиолипину и рекомбинантному белку р17 у обследуемых пациентов, с одной стороны, косвенно подтверждает одну из теорий сохранения высоких титров АТ при замедлении негативации серологических реакций, согласно которой это явление объясняется патологическими иммунными реакциями в отсутствие возбудителя, но, в то же время, не может свидетельствовать об отсутствии трепонемы в организме.

Существует и другая теория, объясняющая данный феномен. Так, по данным ряда авторов, одной из причин длительного сохранения сероположительных реакций является персистенция трепонемы в организме в неактивной форме (L-формы, цисты, нахождение внутри полимембранных фагосом), которая нечувствительна к антибактериальным препаратам. При неблагоприятных условиях происходит и переход возбудителя в активную спиралевидную форму, что влечет за собой активацию как клеточного неспецифического, так и гуморального иммунного ответа.

Как известно, клеточное звено врожденного иммунитета представлено моноцитами/макрофагами, гранулоцитами, дендритными клетками и натуральными киллерами. Клетками первичной защиты при инфекционных процессах являются нейтрофилы. При воздействии различных стимулов экзогенной и эндогенной природы происходит выброс во внеклеточное пространство протеолитических ферментов и цитотоксических соединений, содержащихся в гранулах нейтрофилов. Одним из таких протеолитических ферментов, секретируемых нейтрофилами в ходе развития неспецифического иммунного ответа, является лейкоцитарная эластаза (ЛЭ).

Активность ЛЭ регулируется с помощью б1-протеиназного ингибитора (бl-ПИ), который снижает протеолитическую активность ЛЭ в месте воспаления и играет важную регуляторную роль в антивоспалительных процессах. Повышенная активность ЛЭ отражает выраженность деструктивного процесса в тканях. Увеличение по сравнению с контролем активности б1-ПИ, направленное на ограничение деструктивных реакций, характеризует сохранность антипротеолитического потенциала; сниженная активность б1-ПИ является прогностически неблагоприятным признаком в плане дальнейшего развития деструктивного процесса.

Одним из центральных участников острой фазы воспаления является СРБ, который является наиболее чувствительным индикатором активности инфекционного процесса, и определение концентрации СРБ широко применяется для мониторинга и контроля эффективности терапии различных инфекций.

С целью исследования вероятности присутствия трепонемы в организме была проведена оценка активности ЛЭ, б1-ПИ и содержания СРБ: были протестированы сыворотки крови пациентов с замедлением негативации серологических реакций (n=172), с НСР (n=118) и здоровых доноров (n=120).

По степени активности ЛЭ сыворотки крови каждой исследуемой группы были разделены на четыре подгруппы (таблица 5).

Таблица 5. Активность лейкоцитарной эластазы у пациентов с замедлением негативации серологических реакций (ЗНСР), негативацией серореакций (НСР) и здоровых доноров.

В группе здоровых доноров у большинства обследуемых (92,5%, n=111) показатели активности ЛЭ не превышали 105-200 нмоль/минЧмл, что соответствует нормальным значениям активности ЛЭ. У пациентов с замедлением негативации серологических реакций нормальными показатель активности ЛЭ был у 31,4% (n=54) пациентов; у 25,6% пациентов этой группы (n=44) - значения находились в пределах 201-250 нмоль/минЧмл, т.е. активность ЛЭ была слабо повышена; у 28,5% (n=49) - показатели были умеренно повышены и находились в пределах 251-300 нмоль/минЧмл. Резко повышенная активность ЛЭ (более 300 нмоль/минЧмл) наблюдалась у 14,5% (n=25) пациентов с замедлением негативации серологических реакций. В группе пациентов с НСР 90,7% (n=107) сывороток имели показатели в пределах нормы и только у 9,3% (n=11) было выявлено некоторое повышение этого показателя.

Таким образом, наиболее выраженные изменения содержания ЛЭ были в группе с замедлением негативации серологических реакций, где 68,6 % пациентов имели повышенные показатели активности ЛЭ по сравнению с нормой.

Значения активности б1-ПИ в группах пациентов с замедлением негативации серологических реакций, НСР также были неоднородными. В зависимости от степени активности б1-ПИ каждая из этих групп делилась на три подгруппы (таблица 6).

Таблица 6. Активность б1-протеиназного ингибитора у пациентов с замедлением негативации серологических реакций (ЗНСР), негативацией серореакций (НСР) и здоровых доноров

Исследуемая группа	Норма 28-32 ИЕ/мл	Выше 32 ИЕ/мл	Ниже 28 ИЕ/мл
Здоровые доноры (n=120)	95,8% (n=115)	1,7% (n=2)	2,5% (n=3)
ЗНСР (n=172)	33,1% (n=57)	18,6% (n=32)	48,3% (n=83)
НСР (n=118)	86,4% (n=102)	10,2% (n=12)	3,4% (n=4)

Активность б1-ПИ у 95,8% (n=115) здоровых доноров была в пределах нормы от 28 до 32 ИЕ/мл, у 4,2% (n=5) незначительно отклонялась от нормы в обе стороны. В группе пациентов с замедлением негативации серологических реакций у 48,3% (n=83) было отмечено понижение активности б1-ПИ - т.е. менее 28 ИЕ/мл; у 18,6% (n=32) обнаружили повышенные значения - более 32 ИЕ/мл, нормальные показатели активности б1-ПИ наблюдались у 33,1% (n=57) пациентов. В подгруппе с НСР имелось 10,2% (n=12) повышенных результатов, снижение активности б1-ПИ наблюдалось у 3,4% (n=4) обследованных, остальные 86,4% (n=102) пациентов имели нормальные показатели активности б1-ПИ.

В итоге, и в случае измерения активности б1-ПИ наиболее выраженные отклонения от нормы наблюдались в группе пациентов с замедлением негативации серологических реакций (таблица 6).



Таблица 7. Содержание С-реактивного белка в сыворотке крови пациентов с замедлением негативации серологических реакций (ЗНСР), негативацией серореакций (НСР) и здоровых доноров

Концентрация СРБ в сыворотках крови у 96,7% (n=116) здоровых доноров в среднем по группе составила 3,1±0,2 мг/л, т.е. не превышала нормальных значений (менее 5 мг/л), у остальных 5% (n=6) обнаружилось незначительно повышенная концентрация СРБ. В группе пациентов с замедлением негативации серологических реакций значения концентрации СРБ распределились следующим образом: нормальные значения были у 37,2% (n=64), среднее значение концентрации СРБ было 4,2±0,3 мг/л; у 20,3% (n=35) среднее значение данного показателя составило 9,1±0,4 мг/л, т.е. СРБ был слабо повышен; 12,8% (n=22) имели высокую концентрацию СРБ, в среднем равную 19,7±0,7 мг/л. Концентрация СРБ со средним значением 45,1±0,9 мг/л обнаружилась у 18,6% (n=32) пациентов с замедлением негативации серологических реакций, а у 11% (n=19) были зарегистрированы очень высокие показатели концентрации СРБ (более 50 мг/л).

В группе пациентов с НСР 13,5% (n=16) имели незначительно повышенный уровень СРБ (в пределах 6,5 - 12,4 мг/л), у 86,4% (n=102) показатель в среднем составил 3,7±0,5 мг/л (таблица 7).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что наиболее выраженные изменения показателей активности ЛЭ и б1-ПИ, а также концентрации СРБ наблюдались в группе пациентов с замедлением негативации серологических реакций. В группе пациентов с НСР повышенное содержание СРБ и незначительное повышение активности ЛЭ и б1-ПИ у небольшого числа обследуемых можно связать с какими-либо иными инфекционными процессами в организме, не связанными с сифилисом. Незначительное отклонение от нормы исследуемых показателей у некоторых доноров возможно связано с индивидуальными особенностями организма. При комплексном анализе полученных результатов пациентов с замедлением негативации серологических реакций выяснилось, что изменения активности ЛЭ и б1-ПИ и концентрации СРБ не всегда четко коррелировали между собой. В зависимости от обнаруженных изменений исследуемых показателей неспецифического иммунного ответа пациенты разделились на несколько подгрупп (таблица 8).

Таблица 8. Распределение пациентов с замедлением негативации серологических реакций (ЗНСР) в зависимости от значений активности ЛЭ, б1-ПИ и концентрации СРБ в сыворотке крови.

Количество пациентов с ЗНСР	активность ЛЭ	активность б1-ПИ	концентрация СРБ
%	абс.
43%	74	Повышена: – сильно (n=15) – слабо (n=10) – умеренно (n=49)	понижена	Повышена: – сильно (n=59) – слабо (n=15)
28,5%	49	норма	норма	норма
14%	24	Повышена: – сильно (n=7) – слабо (n=17)	повышена	Повышена: – сильно (n=14) – слабо (n=10)
4,7%	8	слабо повышена	повышена	норма
2,9%	5	норма	понижена	слабо повышена
2,9%	5	слабо повышена	норма	слабо повышена
2,3%	4	слабо повышена	понижена	норма
1,7%	3	повышена сильно	норма	норма

В пределах нормы все три показателя были лишь у 28,5% (n=49) пациентов этой группы, 14% (n=24) имели повышенную активность ЛЭ и б1-ПИ, а также высокую концентрацию СРБ в сыворотке крови. Повышенная активность ЛЭ на фоне сниженной активности б1-ПИ наблюдалась у 43% (n=74) пациентов с замедлением негативации серологических реакций, из них у 59 человек была сильно повышена концентрация СРБ. Снижение активности б1-ПИ, по-видимому, указывает на истощение антипротеиназной защиты организма из-за длительного периода высокой активности ЛЭ.

Слабо повышенная активность ЛЭ при повышенной активности б1-ПИ и нормальных показателях концентрации СРБ наблюдалась у 4,7% (n=8). У 1,7% (n=3) обследуемых обнаружилась очень высокая активность ЛЭ при нормальных показателях б1-ПИ и СРБ, а у 2,9 % (n=5) слабо повышенная активность ЛЭ и слабо повышенная концентрация СРБ сочеталась с нормальными значениями активности б1-ПИ. Остальные 5,2% (n=9) пациентов имели пониженную активность б1-ПИ, у части из них (n=5) активность ЛЭ была в пределах нормы, но был незначительно повышен СРБ, у других (n=4) наоборот нормальные показатели СРБ сочетались со слабо повышенной активностью ЛЭ.

Проанализировав полученные данные, мы пришли к выводу, что всех обследуемых пациентов с замедлением негативации серологических реакций можно разделить на три подгруппы по значениям показателей активности инфекционного процесса (рисунок 3).

Рисунок 3. Распределение пациентов с замедленной негативацией серологических реакций по признаку наличия инфекционного процесса.



Первую подгруппу - 52,3% (n=90) составили пациенты, у которых соотношение АИАТ/ИАТ было в норме, но были повышены значения показателей активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ и СРБ). Есть все основания полагать, что у этого контингента трепонема полностью не элиминирована из организма.

Вторую подгруппу составили пациенты - 28,5% (n=49) с нормальными значениями активности ЛЭ, б1-ПИ и концентрации СРБ. По-видимому, у этих пациентов трепонема в организме отсутствует, а отсутствие негативации серологических реакций обусловлено иммунными нарушениями, описанными ранее.

В третью подгруппу были отнесены 19,2% (n=33) пациентов с сомнительными результатами, где однозначно судить о наличии или отсутствии инфекционного процесса и, соответственно, трепонемы не представляется возможным.

Таким образом, на данном этапе исследований удалось установить, что у значительной части пациентов с замедлением негативации серологических реакций в организме имеет место некий инфекционный процесс, что косвенно служит показателем присутствия в организме инфекционного агента, которым, возможно, является T.pallidum.

Выводы

1. На основании изучения анамнестических, клинических, лабораторных данных 324 пациентов с замедлением негативации серологических реакций установлено, что замедление негативации серологических реакций регистрируется в большинстве случаев у лиц в возрасте 31-50 лет, преимущественно женщин, лечившихся по поводу раннего скрытого сифилиса, а также вторичного сифилиса кожи и слизистых; чаще с сопутствующей соматической патологией и ИППП.

2. Анализ значительного клинического материала показывает, что замедление негативации серологических реакций чаще регистрируется у пациентов с ранним приобретенным сифилисом, получавших при первичном курсе терапии дюрантные препараты пенициллина. Следует отметить, что применение при дополнительном лечении тех же лекарственных препаратов, что и при первичном курсе лечения, не оказывает принципиального влияния на динамику серологических реакций у пациентов с замедлением негативации серологических реакций. Наиболее эффективными препаратами при лечении были: водорастворимый пенициллин (выраженное снижение титров у 24 пациентов, полная негативация - у 2-х) и цефтриаксон (выраженное снижение титров у 11 пациентов, полная негативация - у 4-х больных).

3. Для пациентов с замедлением негативации серологических реакций характерно достоверное повышение уровня АИАТ к кардиолипину и одному из антигенов T.pallidum - белку р17 по сравнению с антителами первого порядка, что является показателем нарушения взаимной регуляции между ИАТ и АИАТ. Формирование самоподдерживающегося «порочного круга» может длительное время обеспечивать высокие уровни антител к T.pallidum даже после устранения возбудителя в результате лечения антимикробными препаратами. Выявленный дисбаланс в идиотип-антиидиотипической регуляции может являться важным иммунохимическим механизмом замедления негативации серологических реакций при сифилисе, однако данный факт не может свидетельствовать об элиминации T.pallidum из организма.

4. Изучение содержания показателей, характеризующих активность инфекционного процесса -ЛЭ, б1-ПИ и СРБ в сыворотке крови при замедлении негативации серологических реакций позволило выделить три подгруппы пациентов:

– подгруппу с отсутствием признаков неспецифической реакции иммунной системы - с нормальными значениями активности ЛЭ, б1-ПИ и концентрации СРБ; есть основания полагать, что у пациентов этой подгруппы трепонема в организме отсутствует, а отсутствие негативации серологических реакций обусловлено нарушением идиотип-антиидиотипического равновесия.

– подгруппу с высокими значениями показателей активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ и СРБ), что косвенно указывает на то, что причиной замедления негативации серологических реакций после полноценного лечения может быть сохранение возбудителя сифилиса в организме.

– подгруппу с сомнительными результатами, когда нельзя однозначно сказать о наличии или отсутствии инфекционного процесса и, соответственно, трепонемы.

5. Проведенное исследование позволяет сформировать дифференцированный подход к назначению дополнительного лечения пациентам с замедлением негативации серологических реакций после перенесенного сифилиса:

– группе пациентов с высокими значениями показателей активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ, СРБ) показана антибиотикотерапия;

– группе пациентов с нормальными показателями активности инфекционного процесса (ЛЭ, б1-ПИ, СРБ) на фоне нарушений идиотип-антиидиотипического равновесия с направленностью к антигенам трепонемы показана иммунотропная терапия;

– группе пациентов с сомнительными результатами показателей активности инфекционного процесса на фоне нарушений идиотип-антиидиотипического равновесия с направленностью к антигенам трепонемы показано комплексное лечение с использованием антибиотикотерапии и иммуннотропных препаратов.

практические рекомендации

1. Мерами профилактики замедления негативации серологических реакций является выбор рационального подхода к проведению специфического лечения сифилиса - необходимо анализировать алгоритм лечения - взаимосвязь формы сифилиса и назначаемого антибиотика.

2. Пациенты с ранними формами сифилиса старше 45 лет, с сопутствующими ИППП, получившие лечение малыми дозами дюрантных препаратов должны рассматриваться как группа риска замедления негативации серологических реакций.

3. Комплексная оценка активности ЛЭ, б1ПИ и содержания СРБ позволяет оценить вероятность этиологического излечения пациентов с замедлением негативации серологических реакций, а также решить вопрос о проведении дополнительного антибактериального лечения.

4. Применение алгоритма дифференцированного назначения дополнительного лечения с учетом комплекса иммунологических показателей позволит оптимизировать подходы к ведению пациентов с замедлением негативации серологических реакций после перенесенного сифилиса.



Список работ

сифилис терапия серологический

1.Волкова Е.Н. Серорезистентность при сифилисе: актуальность проблема сохраняется. / Е.Н.Волкова, Е.В. Митичкина, В.В.Платонов и др. // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2010. - №4. - С. 51-54.

2.Волкова Е.Н. Проблема серорезистентности при сифилисе. / Е.Н.Волкова, С.Г.Морозов, Е.В. Митичкина и др. // Сборник материалов III междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». - 2010. - С. 24-25.

3.Митичкина Е.В. Проблема серорезистентности при сифилисе: актуальность сохраняется. / Е.В. Митичкина, Е.Н.Волкова, С.Г.Морозов. // Сборник материалов IV Российской научно-практической конференции с международным участием «Санкт-Петербургские дерматологические чтения», посвященной 125-летию Санкт-Петербургского научно-практического общества дерматовенерологов В.М. Тарновского. - 2010. - С. 99-100.

4.Волкова Е.Н. Серорезистентность при сифилисе как междисциплинарная проблема. / Е.Н.Волкова, С.Г.Морозов, А.Н.Проценко, Е.В. Митичкина. // Сборник материалов ХI международного конгресса «Здоровье и образование ХХI веке: научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образ жизни»». - 2010. - С. 194-195.

...