Протеомные технологии в диагностике грибовидного микоза

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Протеомные технологии в диагностике грибовидного микоза

14.01.10 - кожные и венерические болезни

На правах рукописи

Братцева Екатерина Валериевна

Москва - 2010 г.

Работа выполнена в отделении клинической дерматологии Федерального Государственного учреждения «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» и отделе протеомики Института биомедицинской химии им.В.М. Ореховича РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Анна Алексеевна Кубанова

кандидат биологических наук Сергей Александрович Мошковский

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ирина Борисовна Трофимова

кандидат биологических наук Мария Владимировна Савватеева

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов, г. Москва

Защита диссертации состоится «________» ___________2010 года в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д208.115.01 при Федеральном Государственном учреждении «Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий» по адресу: 107076, г. Москва, ул.Короленко, д.3, стр.6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий».

Автореферат разослан «______» ______________2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Грибовидный микоз (ГМ) является наиболее распространенным видом первичных Т-клеточных лимфом кожи (R. Willemze и соавт., 2005). Диагностика грибовидного микоза, особенно на ранних стадиях (I-II), является одной из наиболее сложных проблем в практике дерматовенеролога. В настоящее время не существует единого диагностического алгоритма грибовидного микоза. Однако большинство авторов считает, что диагностика грибовидного микоза основывается на клинической картине заболевания, данных гистологического и иммунофенотипического исследований. Определение клональной перестройки гена Т-клеточного рецептора методом ПЦР является вспомогательным методом диагностики (Клинические рекомендации. Дерматовенерология, 2008, P. Lenane и соавт., 2007, N. Pimpinelli и соавт., 2005, S.J. Whittaker и соавт., 2003).

Трудности диагностики грибовидного микоза заключаются в разнообразии его клинических проявлений, а также их сходстве с проявлениями хронических воспалительных дерматозов (А.А. Каламкарян, 1983, И.Б. Трофимова, 1997, H.S. Zackheim и соавт., 2002). Более того, некоторые дерматозы имеют сходные с грибовидным микозом иммунопатологические механизмы, например псориаз, как Th1-опосредованное заболевание (E.W.Cowen и соавт., 2007, K. Ghoreschi и соавт., 2007).

Точность клинического диагноза ГМ, подтвержденного гистологическим методом, составляет от 50 до 75% (А.Н. Родионов, 1997, S.J. Whittaker и соавт., 2003). По данным G. Burg и соавт., точность иммунофенотипического исследования на поздних стадиях ГМ достигает 80% (G. Burg и соавт., 2005), однако на ранних стадиях заболевания точность диагностики оказывается ниже. Кроме того, все перечисленные методы диагностики требуют проведения биопсии кожи.

Для своевременной диагностики наиболее перспективным в настоящее время является поиск сывороточных биомаркеров (M.A. Tainsky, 2009). С этой целью успешно применяются протеомные технологии, которые представлены широким спектром различных методов. Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия MALDI-TOF, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков (В.М. Говорун и соавт., 2002, T.C. Poon, 2007). Однако применение масс-спектрометрии ограничивается чувствительностью этого метода. Для изучения белков, представленных в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем находится порог чувствительности масс-спектрометрических методов, возможно применение технологии xMAP. Данный метод дает возможность проводить количественное определение десятков целевых белков одновременно. В качестве целевых белков в настоящем исследовании были выбраны цитокины, так как они играют ведущую роль в патогенезе грибовидного микоза. В этом случае продукция цитокинов осуществляется как атипичными лимфоцитами, так и различными иммунными клетками микроокружения. В отечественной литературе отсутствуют работы, выполненные с применением протеомных технологий при изучении различных аспектов грибовидного микоза, а количество работ иностранных исследователей весьма ограничено, что определило актуальность данного исследования.

Цель исследования: Установить молекулярные маркеры грибовидного микоза на основании результатов изучения протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови с целью разработки алгоритма диагностики заболевания.

Задачи исследования:

1 Провести анализ анамнестических данных больных грибовидным микозом для оценки своевременности диагностики данного заболевания

2 Исследовать протеомные профили сывороток крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров крови методом масс-спектрометрии MALDI-TOF

3 Изучить уровень цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с помощью технологии xMAP на различных стадиях заболевания

4 Провести сравнительное изучение протеомного и цитокинового профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, псориазом и здоровых доноров с целью выявления молекулярных маркеров грибовидного микоза

5 Разработать алгоритм диагностики грибовидного микоза на основании данных, полученных в результате исследования профилей белков и цитокинов сыворотки крови.

Научная новизна

- впервые в России изучен протеомный профиль сыворотки крови больных грибовидным микозом с применением метода MALDI-TOF масс-спектрометрии. При сравнении протеомных профилей сыворотки крови больных грибовидным микозом, больных псориазом и здоровых людей - доноров крови выявлены пики белков, которые достоверно отличаются у обследованных лиц.

- впервые изучен широкий профиль из 27 цитокинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом с применением технологии xMAP. Выявлена прямая корреляционная связь концентрации цитокинов IP-10 и IL-10, а также обратная корреляционная связь концентрации цитокина RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что подтверждает патогенетическую значимость данных цитокинов.

- впервые в сыворотке крови больных грибовидным микозом установлено достоверное увеличение концентрации цитокина IP-10 по сравнению с концентрацией этого цитокина у больных псориазом, а также увеличение концентрации цитокинов IP-10, IL-4, IL-1ra и G-CSF по сравнению с их концентрацией в сыворотке крови здоровых доноров. На основании проведенных исследований установлено, что цитокин IP-10 может использоваться в качестве диагностического маркера грибовидного микоза.

- впервые разработан алгоритм диагностики грибовидного микоза, обладающий высокой точностью и основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокина IP-10. При дифференциальной диагностике грибовидного микоза и псориаза алгоритм основывается на последовательном определении концентрации в сыворотке крови концентрации цитокинов IP-10 и IL-6 и имеет вид «древа принятия решений».

Практическая значимость:

В сыворотке крови обследованных больных выявлены молекулярные маркеры грибовидного микоза. С применением данных маркеров разработан алгоритм, позволяющий диагностировать грибовидный микоз и, в необходимых случаях, провести его дифференциальную диагностику с псориазом. Применение алгоритма диагностики грибовидного микоза позволит своевременно выявить больных «группы риска» по развитию данного заболевания для диспансерного наблюдения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что длительность периода от момента появления первых симптомов заболевания у пациентов до постановки диагноза «грибовидный микоз» составляет от 1 месяца до 23 лет (5,5 лет ± 0,84 года), при этом у 23,1% больных грибовидный микоз диагностируется на третьей стадии заболевания.

2. Выявлены масс-спектрометрические пики белков, являющиеся молекулярными маркерами грибовидного микоза. Точность диагностики с применением данных маркеров составляет 69-75%, качество диагностики по данным ROC-анализа расценивается как хорошее (AUK>0,7).

3. Выявлены 4 цитокина (IP-10, IL-4, IL-1ra и G-CSF), уровень экспрессии которых достоверно отличается у больных грибовидным микозом и здоровых доноров крови (р<0.05). Уровень экспрессии цитокина IP-10 у больных грибовидным микозом достоверно выше, чем у больных псориазом (р<0,001), что позволяет использовать его в дифференциальной диагностике этих заболеваний.

4. Установлена прямая корреляция концентрационная связь цитокинов IP-10 и IL-10 и обратная корреляционная связь цитокинов RANTES в сыворотке крови больных грибовидным микозом со стадиями заболевания, что свидетельствует об их патогенетической роли при данном заболевании.

5. Показана высокая точность разработанного алгоритма диагностики грибовидного микоза, а также возможность выявления с его помощью больных, относящихся к группам риска по развитию грибовидного микоза.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ «Протеомные технологии в дерматовенерологии» (Москва, 2007 г.)

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в лекционный курс кафедры дерматовенерологии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета и врачей ординаторов ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы, из них 1 - в журнале, входящем в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клиническая характеристика больных. Обследование пациентов проводилось в консультативно-диагностическом центре ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», в условиях стационара городской клинической больницы №14, в отделении химиотерапии гематологических заболеваний и интенсивной терапии Гематологического научного центра РАМН.

В работу включено 39 больных грибовидным микозом, среди которых было 23 женщины и 16 мужчин (59% и 41% соответственно) в возрасте 28 - 82 лет, средний возраст которых составил 57,4 ± 2,2 лет [M±m].

Из 39 пациентов 18 (46,2%) имели первую стадию грибовидного микоза, вторую стадию имели 13 (33,3%) человек, третью стадию - 8 (20,6%). У всех больных грибовидным микозом была диагностирована классическая форма Алибера-Базена (в соответствии с классификацией WHO-EORTC, 2008).

В лабораторное исследование с применением протеомных технологий было включено 23 больных грибовидным микозом, в соответствии со следующими критериями:

· возраст от 18 лет и старше,

· информированное согласие на участие в исследовании;

· стадия грибовидного микоза I-III без генерализации патологического процесса (без вовлечения периферической крови и внутренних органов);

· диагноз грибовидный микоз, подтвержденный гистологическим и иммунофенотипическим методами;

· отсутствие терапии грибовидного микоза не менее 2-х недель до участия в исследовании;

· отсутствие следующих патологических состояний (тяжелый инфекционный процесс, наличие онкологических заболеваний, беременность), а также отсутствие серопозитивности в тестах на ВИЧ-инфекцию.

В группу сравнения вошли 29 больных псориазом: 8 женщин и 21 мужчина (28% и 72% соответственно) в возрасте от 21 до 76 лет (средний возраст 45,9 ± 2,9 лет). У всех больных был диагностирован распространенный псориаз, среднее значение индекса PASI составило 30,4 ± 1,37.

Контрольную группу составили 22 здоровых человека - доноров крови: 16 женщин и 6 мужчин (73% и 27% соответственно) в возрасте от 29 до 71 года (средний возраст 50,9 ± 2,4 года).

При попарном сравнении групп по возрасту выявлены статистически значимые различия между группами больных грибовидным микозом и псориазом (p<0.05). В работе мы допускаем, что возраст больных не оказывает значимого влияния на результаты исследования (E.W. Cowen и соавт., 2007). При сравнении группы больных грибовидным микозом с группами контроля по полу статистически значимых различий не выявлено.

Протокол получения сывороток крови. Взятие венозной крови (8 мл) у пациентов производили путем стандартной флеботомии в пластиковые пробирки без наполнителя. Пробирки находились при комнатной температуре в течение 2 часов до образования сгустка, затем их центрифугировали в течение 15 мин при 2,5 тыс. об./мин. Сыворотку крови разделяли на аликвоты по 1 мл, которые замораживали и хранили при температуре - 800C. При транспортировке замороженных сывороток использовали сухой лед.

Масс-спектрометрическое исследование. Профилирование проводили на масс-спектрометре Autoflex, «Bruker Daltonics» в линейном режиме в диапозоне масс 2-30 кДа. Для калибровки использовали следующие внешние стандарты: гирудин (6964 Да), убиквитин, цитохром C (12230 Да), карбангидраза (14511,5 Да) миоглобин (16951 Да). Спектры снимали вручную, по крайней мере, в двух повторениях до суммарной интенсивности около 105. В работе использовали нормальнофазовые чипы NP20, в качестве матрицы - насыщенный раствор ?-циано-4-гидроксикоричной кислоты (Ciphergen) в 50% (об./об.) ацетонитриле, содержащем 0,5% (об./об.) трифторуксусной кислоты, разведенный в два раза тем же растворителем. Для анализа масс-спектрометрических пиков была использована программа Biomarker Wizard™ (Ciphergen Biosystems) со следующими настройками: соотношение сигнал/шум (первая ступень) 10, соотношение сигнал/шум (вторая ступень) 5, пороговая интенсивность пика 0%, допустимая ошибка в определении массы 0,2%. Массы пиков и их интенсивности экспортировали в таблицы MS Excel, значения интенсивностей в повторных измерениях усредняли.

Исследование с применением метода мультиплексного анализатора. Для анализа на мультиплексном анализаторе Bio-Plex 200 System (Bio-Rad, США), основанном на технологии хМАР, была выбрана панель из 27 цитокинов в составе коммерческой тест-системы Bio-Plex Pro Human Cytokine 27-Plex Panel (Bio-Rad, США). В исследуемую панель входили следующие цитокины: PDGF-bb, IL-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, Eotaxin, FGF basic, G-CSF, GM-CSF, IFN-?, IP-10, MCP-1(MCAF), MIP-1a, MIP-1b, RANTES, TNF-a, VEGF. Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Для анализа сывороток на приборе Bio-Plex образцы размораживали, центрифугировали 10 мин при 13.2 тыс. об./мин. и 40 С и разводили в 4 раза.

Для построения стандартной калибровочной кривой лиофилизованную смесь стандартов растворяли в 500 мкл sample diluent и готовили серию из 8 разведений в standard diluent. Измерения проводили с низким и высоким разрешением. В качестве контролей использовали standard diluent и sample diluent. Все измерения проводили двух повторах.

Результаты измерений были представлены с помощью программы Bio-Plex Manager 5.0. При статистической обработке значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимались за 0 пг/мл. Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю границу чувствительности, то его концентрацию принимали равной верхней границе.

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета Statistica 6.0 и языка программирования R. Для описания групп больных использовались стандартные методы описательной статистики. Статистическая проверка данных на нормальность осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилкса, проверка гипотез о значимости различий в исследуемых группах по количественному признаку - с помощью дисперсионного анализа (тест Шеффи) и U-критерия Манна Уитни с поправкой Бонферрони, по качественным признакам - с помощью критерия Фишера с поправкой Бонферрони. Выбранный критический уровень значимости р<0,05.

Оценка диагностического качества выбранных маркеров оценивалось с помощью ROC-анализа. Качество диагностических маркеров оценивалась по экспертной шкале для значений AUC (J.A. Hanley и соавт., 1982, M.H. Zweig и соавт., 1993).

Сравнение диагностического исследования (маркера) с референтным диагнозом. Для выявленных маркеров рассчитывали показатели точности, чувствительности, специфичности и прогностической ценности положительного диагноза (PPV). Расчет производился по формулам, представленным в таблице 1.

Таблица 1. Формулы расчета показателей точности, специфичности, чувствительности и PPV изучаемого маркера