Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: этиология, клиника, диагностика и терапия

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.01.10 - кожные и венерические болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: этиология, клиника, диагностика и терапия

Шаталова Анна Юрьевна

Москва, 2011 г.

Работа выполнена в отделе инфекций, передаваемых половым путем, Федерального государственного учреждения "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, Доцент Рахматулина Маргарита Рафиковна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Профессор Дубенский Валерий Викторович

Кандидат медицинских наук Плахова Ксения Ильинична

Ведущее научное учреждение:

Российский Университет Дружбы Народов, г. Москва

Защита диссертации состоится на заседании Диссертационного совета (Д 208.115.01) при Федеральном государственном учреждении "Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии" Минздравсоцразвития России по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Наталия Константиновна Иванова

Список сокращений

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем

БВ - бактериальный вагиноз

КВВ - кандидоз вульвы и вагины

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ИФА - иммуноферментный анализ

КОЕ/мл - колониеобразующих единиц на миллилитр

АМП - антимикробные препараты

УПМ - условно-патогенные микроорганизмы

ДДМ - диско-диффузионный метод

ПМЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

МПК - минимальная концентрация антимикробного препарата, подавляющая видимый рост исследуемого микроорганизма

Чувствительные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, не превышающие МПК для чувствительных штаммов

Умеренно-резистентные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, превышающая МПК для чувствительных штаммов, но не превышающая МПК для резистентных штаммов

Резистентные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, превышающая МПК для умеренно-резистентных штаммов

Нечувствительные к АМП штаммы - штаммы, у которых определяется МПК конкретного препарата, превышающие МПК для чувствительных штаммов; данный термин объединяет группу умеренно-резистентных и резистентных к АМП штаммов

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из важнейших медико-социальных проблем в настоящее время является инфекционная патология репродуктивной системы женщины. Ведущее место в структуре данной патологии занимают воспалительные процессы, вызванные условно-патогенными микроорганизмами. Так, по данным разных авторов, частота бактериальных инфекций урогенитального тракта достигает 80% среди патологических состояний женской половой сферы (Кира Е.Ф., 2001 г., Тютюник В.Л., 2001 г., Яковлев С.В., 2002 г., Пестрикова Т.Ю. с соавт., 2009 г.).

Многочисленными исследователями установлен полимикробный характер вульвовагинитов, ассоциированных с энтеробактериями, колиформными бактериями, стафилококками и стрептококками. При этом, в большинстве исследований была продемонстрирована роль условно-патогенных микроорганизмов как моновозбудителей воспалительных процессов урогенитального тракта (Мазорчук Б.Ф., 2007, Фофанова И.Ю., 2008). вульвовагинит урогенитальный энтеробактерия

Известно, что возникновению воспалительных процессов вульвы и влагалища способствуют нарушения трофики тканей урогенитального тракта, вызванные эндогенными и экзогенными причинами. Так, установлена корреляционная связь между дисбактериозом, обусловленным кишечной и влагалищной микрофлорой (Савичева А.М., 1996 г., Кира Е.Ф., 2001 г.). Ряд авторов отводит существенную роль снижению иммунологической реактивности организма и неблагоприятному влиянию гиперэстрогении на баланс биотопа урогенитального тракта, но до настоящего времени значение гормонального фона женщины в изменении микрофлоры урогенитального тракта не определено (Newton E.R., 2001 г., Levinson W., 2004 г.). Объектом дискуссий также является и возможность половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов (Воронова О.А., 2004 г., Mumtaz S., 2008 г.).

На сегодняшний день лабораторная диагностика вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, включает микроскопический и культуральный методы исследования (Анкирская А.С., 2000 г., Воропаева Е.А., 2005 г.). Однако культуральный метод сложен, трудоемок, длителен по времени выполнения. Решение проблемы быстрой идентификации бактериальной микрофлоры возможно путем использования передовой технологии ДНК-чипов, позволяющей выявлять микроорганизмы непосредственно в материале соскоба из влагалища, минуя стадию культивирования и выделения чистой культуры. (Степанова Ю.Н., 2003 г., Атрошкина М.Е., 2009 г., Липова Е.В., 2009 г., Palka-Santini M., 2009 г.).

Лечение вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, часто проводится без учета этиологических факторов, что приводит к рецидивам заболевания через непродолжительный период времени и росту резистентности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Так, Johnson L. в 2008 г. была отмечена высокая устойчивость микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae к препаратам группы фторхинолонов, которые широко используются в терапии вульвовагинитов. При этом в настоящее время отсутствуют единые подходы и рекомендации по терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

Цель исследования Оптимизировать тактику ведения женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, на основании определения факторов риска возникновения заболеваний, изучения состава вагинального микробиоценоза, оценки клинической значимости современных методов лабораторной диагностики и анализа показателей чувствительности инфекционных агентов к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Изучить факторы риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

2. Исследовать качественный и количественный состав вагинального микробиоценоза у женщин репродуктивного возраста с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами и определить возможность использования ДНК-чипов для оценки состояния вагинального микробиоценоза.

3. Изучить чувствительность условно-патогенных микроорганизмов - этиологических агентов вульвовагинитов к антибактериальным препаратам.

4. Оценить эффективность различных методик терапии пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

5. На основании полученных данных разработать алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Основные положения, выносимые на защиту

I. Основными факторами риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста являются: раннее начало половой жизни; большое количество половых партнеров; применение в сексуальной практике нетрадиционных форм половых контактов при отсутствии барьерной контрацепции или нерегулярном ее использовании; нерациональное и бесконтрольное применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия; нарушение правил личной и/или половой гигиены; гормональный дисбаланс, связанный с гиперэстрогенией и гиперпролактинемией; наличие дисбактериоза и других заболеваний кишечника.

II. Состав вагинального микробиоценоза у женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами, характеризуется преобладанием в структуре Corynebacterium spp. (91,4%), Escherichia coli (54,5%), Enterococcus faecalis (54,0%), Staphylococcus saprophiticus (29,3%), Klebsiella pneumoniae (18,2%), Streptococcus anginosus (18,2%), Streptococcus agalactiae (16,2%) в количестве более 102 - 104 КОЕ/мл и облигатных анаэробов Bacteroides spp. (10,1%), Fusobacterium nucleatum (8,6%), Propionibacterium spp. (8,1%) в ассоциациях 4 и более микроорганизмов.

Состав вагинального микробиоценоза здоровых женщин характеризуется преобладанием в структуре облигатно-анаэробных Lactobacillus spp. (89,4%) и Corynebacterium spp. (42,4%).

При вульвовагинитах, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, происходит замещение облигатно-анаэробных видов лактобактерий на факультативно-анаэробные.

ДНК-чип является современным методом этиологической диагностики вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, позволяющим осуществлять одновременную идентификацию большого числа как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сокращает время обследования пациентов.

Применение технологии ДНК-чипов имеет экономическое преимущество перед микробиологическими исследованиями: стоимость комплексной диагностики состава вагинального микробиоценоза с использованием ДНК-чипов в 1,9 раза меньше себестоимости микробиологических методов исследования.

Чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis и Mycoplasma genitalium) является максимальной (100%). Для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Lactobacillus spp., Esсherichia coli, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Gardnerella vaginalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus anginosus) установлена высокая чувствительность метода ДНК-чипов (97,2-100,0%).

III. Препаратами выбора при лечении вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, являются амоксициллин/клавулоновая кислота, нитрофураны и цефтриаксон. Препараты группы фторхинолонов в терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, необходимо назначать только при подтверждении чувствительности к ним выделенных культур микроорганизмов.

IV. Терапию вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, следует проводить индивидуально с учетом результатов чувствительности выделенных культур микроорганизмов. Целесообразно сочетать системную антибактериальную терапию с назначением местного поликомпонентного антимикробного препарата широгого спектра действия.

Научная новизна При изучении факторов риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста установлено, что гормональный дисбаланс, представленный гиперэстрогенией и гиперпролактинемией способствует нарушению нормоценоза вагинального биотопа.

Определена роль условно-патогенных микроорганизмов в развитии вульвовагинитов у женщин репродуктивного возраста. Продемонстрировано клиническое значение Corynebacterium spp., представителей семейств Enterobacteriaceae, Micrococcaceae и облигатно-анаэробных микроорганизмов (Bacteroides spp., Fusobacterium nucleatum, Propionibacterium spp.) в ассоциации 4 и более инфекционных агентов.

Впервые показана максимальная чувствительность и специфичность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП и высокая чувствительность (97,2-100,0%) для идентификации непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

Впервые изучена экономическая эффективность использования ДНК-чипов для оценки вагинального микробиоценоза, при этом установлены преимущества метода ДНК-чипов по сравнению с микробиологическими методами.

Систематизированы данные по чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам у женщин с вульвовагинитами, при этом установлена высокая чувствительность инфекционных агентов к амоксициллин/клавулоновой кислоте (чувствительны 93,4%-100,0% штаммов), цефтриаксону (чувствительны 93,6%-100,0% штаммов) и нитрофуранам (чувствительны 92,4%-100,0% штаммов).

Показана более высокая эффективность сочетанного применения системного антибактериального препарата с комбинированным антимикробным препаратом местного действия по сравнению с монотерапией, проводимой системным антибактериальным препаратом (p=0,039) или комбинированным антимикробным препаратом местного действия (p=0,005).

Практическая значимость На основании результатов проведенных исследований разработан алгоритм ведения пациенток с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Внедрение в практику метода ДНК-чипов позволяет осуществлять одновременную идентификацию большого числа патогенных, условно-патогенных и непатогенных микроорганизмов непосредственно в биологическом материале, минуя стадию культивирования, что значительно сократит время обследования пациентов и повысит экономическую эффективность исследования.

Результаты изучения чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам позволят оптимизировать схемы терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами.

Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практику работы Консультативно-диагностического центра ФГУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России.

По результатам исследования подготовлены Медицинские технологии "Вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, у пациенток репродуктивного возраста: диагностика и терапия" и "Применение технологии ДНК-чипов в комплексной диагностике инфекций, передаваемых половым путем" (Москва, 2011 г.).

Разработан патент "Способ и ДНК-чип для комплексной диагностики инфекций, передаваемых половым путем" (номер заявки 2009140661 от 05.11.09 года).

Апробация работы Результаты проведенного исследования доложены на:

1. X Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, октябрь 2008г.).

2. Научно-практической конференции ФГУ "Государственный научный центр дерматовенерологии Росмедтехнологий" (Москва, май, 2009 г.).

3. XI Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, октябрь, 2010 г.).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, 5 глав, содержащих результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, заключение, список литературы. Работа иллюстрирована 38 таблицами и 19 рисунками. Список литературы содержит 133 источника, в том числе 85 отечественных и 47 зарубежных авторов.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. В отделе ИППП ФГУ "ГНЦДК" Минздравсоцразвития России было проведено клинико-лабораторное обследование 264 женщин в возрасте от 18 до 45 лет, из них I группа - 198 (75,0%) пациенток с клиническими и лабораторными признаками вульвовагинита; II группа (группа сравнения) - 66 (25,0%) клинически здоровых женщин.

С использованием ДНК-чипа было проведено исследование биоматериала, полученного от 123 пациенток, в том числе 99 (80,5%) пациенток I группы и 24 (19,5%) пациенток II группы. ДНК-чип представлял собой стеклянный микроскопный слайд, содержащий 12 эрреев (от англ. array - ограниченная зона на слайде, стекле) с набором из 41 олигонуклеотидного зонда. В качестве генов-мишеней для амплификации использовали ген 16S РНК.

Изучение уровня чувствительности 190 выделенных культур условно-патогенных микробных агентов проводилось к цефтриаксону, амоксициллин/клавулоновой кислоте, ципрофлоксацину, клиндамицину, нитрофуранам, левофлоксацину, офлоксацину. Антибактериальная чувствительность определялась к микроорганизмам, наиболее часто выявляемым у пациенток с вульвовагинитами: E. faecalis, E. coli, Staph. saprophiticus, Str. agalactiae, Str. anginosus, Klebsiella pneumonia. Исследование чувствительности проводилось с помощью автоматического микробиологического анализатора Vitek 2 (BioMeriex, Франция) и с помощью диско-диффузионного метода в соответствии с МУК 4.2.1890-04. - М., 2004 "Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам".

Для оценки эффективности различных методик терапии 99 пациенток I группы были разделены на подгруппы: Ia подгруппа - 33 пациентки, которым проводилась терапия антибактериальным препаратом системного действия, Ib подгруппа - 33 пациентки, которым проводилась терапия антибактериальным препаратом системного действия в сочетании с местным комбинированным антимикробным препаратом широкого спектра действия, Ic подгруппа - 33 пациентки, получавшие терапию местным комбинированным антимикробным препаратом.

Для изучения возможности половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов было обследовано 50 мужчин - половых партнеров женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами.

Комплекс лабораторных исследований включал в себя: проведение микроскопического и культурального исследований для идентификации патогенных (N.gonorrhоeae, T.vaginalis) и условно-патогенных микроорганизмов с их количественным определением и определением чувствительности к антибактериальным препаратам. Идентификация C. trachomatis и M. genitalium проводилась методом ПЦР.

С целью изучения влияния гормонального фона на состав вагинального микробиоценоза было проведено исследование методом иммуноферментного анализа уровня фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, эстриола, эстрадиола, тиреотропного гормона, трийодтиронина, тироксина, пролактина, тестостерона, прогестерона.

Статистическая обработка данных в работе осуществлялась с помощью программного пакета SPSS версии 19.0.0 (IBM). Проверка гипотез о различиях между несвязанными выборками производилась с помощью критерия Хи-Квадрат Пирсона или, если не выполнялись условия применения критерия, - точный критерий Фишера (Exact Test пакета SPSS).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ факторов риска развития и клинические особенности вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста.

Согласно результатам исследования, средний возраст пациенток I группы составил 29,7 лет, пациенток II группы - 29,3 лет. Основная часть пациенток I группы (51,0%) находилась в возрасте от 26 до 35 лет.

Наиболее частой причиной обращения пациенток I группы за медицинской помощью являлись патологические выделения из половых путей (у 66,2% обследованных), зуд (у 24,8% обследованных) и жжение (у 13,6% обследованных) в области наружных половых органов. Часть пациенток I группы (14; 7,1%) жалоб на момент обследования не предъявляли, однако имели объективные клинико-лабораторные признаки вагинита: патологические выделения в заднем своде влагалища, гиперемию и отечность в области наружных половых органов, кровоточивость слизистой оболочки наружных половых органов, увеличение количества полиморфноядерных лейкоцитов более 10 в поле зрения при микроскопическом исследовании.

При анализе возможных факторов риска особое внимание уделяли изучению анамнестических данных пациентов (таблица 1).

Таблица 1

Факторы риска развития вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, у женщин репродуктивного возраста

Анализируемые факторы риска	I группа (n=198)	II группа (n=66)	Р
	абс	%	абс	%
Применение антибактериальных препаратов широкого спектра действия в анамнезе	164	82,8	6	9,1	<0,001
Нарушение микрофлоры вагинального биотопа в анамнезе: Бактериальный вагиноз Кандидоз вульвы и вагины Заболевания, вызванные генитальными микоплазмами Неспецифический вульвовагинит	88 27 38 58 19	44,4 13,6 19,2 29,3 9,6	25 5 14 12 -	37,9 7,6 21,2 18,2 -	0,351 0,191 0,721 0,089 0,009
Патология желудочно-кишечного тракта: Дисбактериоз кишечника Другая патология ЖКТ (хронический гастрит, полипы кишечника, синдром раздраженного кишечника и др.)	37 17 24	18,7 8,6 12,1	7 - 7	10,6 - 10,6	0,009 >0,999
Наличие очагов хронической инфекции различной локализации	33	16,7	9	13,6	0,56
Нарушение правил личной и/или половой гигиены	176	88,9	15	22,7	<0,001

Установлено, что большинство (164; 82,8%) пациенток I группы, в отличие от пациенток II группы (6; 9,1%), регулярно получали системные антибактериальные препараты по причине различных инфекционных заболеваний (р<0,001).

У 37 (18,7%) пациенток I группы регистрировались различные заболевания желудочно-кишечного тракта, в том числе и дисбактериоз, при этом у 17 (8,6%) женщин, вульвовагинит, вызванный условно-патогенными микроорганизмами, протекал на фоне дисбактериоза кишечника.

У большинства (176; 88,9%) пациенток основной группы с наибольшей достоверностью (p<0,001) были отмечены нарушения личной и половой гигиены (использование для ежедневной интимной гигиены косметических средств, не предназначенных для ухода за слизистыми оболочками половых органов; чрезмерная интимная гигиена более 2 раза в день; отказ от барьерной контрацепции, либо неправильное ее использование, особенно в практике орально-генитально-анальных контактов; регулярная обработка половых органов различными антисептиками).

При анализе акушерско-гинекологического анамнеза было установлено, что у пациенток как I, так и II группы, имел место высокий процент медицинских прерываний беременности (38,4% и 50,0% соответственно). В анамнезе у пациенток обеих групп наблюдались фоновые заболевания шейки матки: у 62 (31,3%) и 17 (25,8%) обследованных I и II группы соответственно. Второе место в структуре гинекологической патологии занимал сальпингоофорит - у 14 (7,1%) и 6 (9,1%) обследованных соответственно. При этом статистически достоверной разницы в частоте гинекологической патологии среди пациенток сравниваемых групп выявлено не было.

Исследование гормонального фона продемонстрировало, что у 77,4% пациенток I группы вульвовагиниты, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, протекали на фоне гиперэстрогеновой активности, а у 54,7% пациенток - на фоне повышения уровня пролактина.

Анализ данных сексуального анамнеза показал, что у пациенток I группы достоверно чаще (р<0,001), чем у пациенток II группы регистрировался ранний возраст полового дебюта (до 18 лет) и большое количество (более 5) половых партнеров в течение сексуальной практики (116; 58,6%). Пациентки I группы чаще (89,4%) практиковали нетрадиционные формы половых контактов, чем пациентки II группы (53,0%), при этом пренебрегая барьерной контрацепцией или используя ее нерегулярно (85,3%) (рисунок 1). Таким образом, представляется возможным предположить возможность контаминации условно-патогенными микроорганизмами несвойственных для их существования привычных экологических ниш, что приводит к воспалительным процессам нижних отделов урогенитального тракта.

Рисунок 1. Формы половых контактов, практикуемые пациентками I и II групп (n=264), p<0,001

При изучении клинической картины вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, было установлено, что наиболее частыми объективными проявлениями заболевания у пациенток являлись патологические выделения: сливкообразного (113; 57,1%) и слизисто-мутного характера (77; 38,9%), а также гиперемия (129; 65,2%) и кровоточивость (37; 18,7%) слизистых оболочек наружных половых органов. Значение рН вагинального отделяемого у 114 (57,6%) пациенток I группы превышали 4,5. У пациенток группы сравнения выделения в заднем своде влагалища в основном носили характер скудных слизистых прозрачных (у 59 (89,4%) обследованных), рН варьировала в пределах нормы (100,0%).

Результаты изучения качественного и количественного состава вагинального микробиоценоза у пациенток исследуемых групп

При микроскопическом исследовании вагинального и цервикального экссудата у пациенток I группы достоверно чаще (у 151; 76,3% обследованных во влагалище и у 134; 67,7% - цервикальном канале) было выявлено увеличение количества полиморфноядерных лейкоцитов более 10 в поле зрения, увеличение количества эпителиальных клеток и слизи, которое чаще носило умеренный характер (у 72,7% обследованных во влагалище и у 56,1% - в цервикальном канале), нежели обильный (у 18,7% обследованных во влагалище и у 12,6% - в цервикальном канале), изменение соотношения полиморфноядерных лейкоцитов к эпителиальным клеткам более чем 1:1 (у 148; 74,8% обследованных). Обильная коккобациллярная микрофлора была выявлена у большинства пациенток I группы, при этом отмечалось преобладание грамотрицательной бациллярной (71,2%) и грамположительной кокковой (59,6%) микрофлоры, которая достоверно чаще выявлялись у пациенток I группы в обильном количестве (p<0,001).

У большинства (49; 74,2%) пациенток II группы отмечалось преобладание грамположительной лактобациллярной микрофлоры.

При анализе качественного соотношения условно-патогенных микроорганизмов было показано, что наиболее часто у пациенток I группы выделялись Corynebacterium spp. (181; 91,4%) в обильном и умеренном количестве. Следующими по частоте выявления являлись представители семейства Enterobacteriaceae: E.сoli (108; 54,5%), Klebs.pneumoniae (36; 18,2%) и семейства Micrococcaceae: E.faecalis (107; 54,0%), S.saprophiticus (58; 29,3%), S.epidermidis (53; 26,8%), Str.anginosus (36; 18,2%), Str.agalactiae (32; 16,2%). Рост прочих представителей данных семейств (S.aureus, Str.eptococcus constellatus, Str.mitis, Klebs.oxitoca, E.aerogenes, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Serratia marcescense, Acinetobacter baumannii, Proteus mirabilis, E.faecium, Str.pyogenes, и др.) регистрировался реже (у 0,5% - 4,5% пациенток). Из представителей анаэробной микрофлоры у пациенток I группы в наибольшем проценте наблюдений выделялись микроаэрофилы (G.vaginalis - у 24; 12,1% пациенток) и облигатные неспорообразующие микроорганизмы (Bacteroides spp. - у 20; 10,1% пациенток, Propionibacterium spp. - у 16; 8,1% пациенток, Fusobacterium nucleatum - у 17; 8,6% пациенток, Clostridium spp. - у 6; 3,0% пациенток).

У 66 (100,0%) пациенток группы сравнения идентифицировались Lactobacillus spp.. Следующими по частоте выявляемости микроорганизмами являлись Corynebacterium spp. (28; 42,4%). В незначительном числе наблюдений в биоматериале, полученном у пациенток II группы, выявлялись S.epidermidis (10; 15,2%), E.faecalis (6; 9,1%), S.saprophiticus (3; 4,5%), E.coli (3; 4,5%), Str.agalactiae (2; 3,0%).

У большинства обследованных пациенток отмечался рост микроорганизмов в ассоциации, при этом были определены достоверно значимые различия между исследуемыми группами (p<0,001) (рисунки 2,3).

У 168 (84,9%) пациенток I группы микробные ассоциации были представлены 4 и более условно-патогенными микроорганизмами, при этом доминировали представители семейств Enterobacteriaceae и Micrococcaceae (168; 84,9%) и Corynebacterium spp. (158; 90,0%).

Рисунок 2. Частота выявления микробных ассоциаций у пациенток I и II групп (%), р<0,001



Рисунок 3. Варианты микробных ассоциаций у пациенток I и II групп (%), р<0,001

Ассоциации представителей факультативной и облигатной микрофлоры наблюдались у 54 (32,1%) обследованных. У 28 (14,1%) пациенток выявлялся сочетанный рост 2-3 микроорганизмов, который также в большинстве наблюдений (26; 92,9%) был представлен ассоциацией различных аэробов, а у 2 (6,9%) пациенток - факультативных и облигатных микроорганизмов. Рост микроорганизмов в монокультуре отмечался у 2 (1,0%) пациенток и был представлен E. сoli и Ent. faecalis.

Видовая структура условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у пациенток группы сравнения, оказалась менее разнообразной, чем у пациенток I группы и была в основном представлена облигатно-анаэробными лактобактериями в монокультуре (40,9%), либо в ассоциации 2-3 микроорганизмов (57,6%), весомую долю которых также составляли облигатно-анаэробные лактобактерии (60,6%).

Рост факультативно-анаэробной лактобациллярной микрофлоры регистрировался у 61 (30,8%) пациентки I группы, в отличие от пациенток II группы, у которых чаще (59; 89,39%) выявлялись облигатно-анаэробные Lactobacillus spp. и только у 7 (10,6%) - факультативно-анаэробные. Таким образом, установлено, что при вульвовагинитах, вызванных грамвариабельными аэробными условно-патогенными микроорганизмами, количество лактобациллярной микрофлоры снижается и/или происходит замещение облигатно-анаэробных видов лактобацилл на факультативно-анаэробных их представителей.

Анализ количественного содержания выявленных микроорганизмов продемонстрировал, что при росте микробных агентов в ассоциации 4 и более условно-патогенные микроорганизмы выделялись не только в количестве более 104 КОЕ/мл, но и в количестве 102-104 КОЕ/мл: Corynebacterium spp. - 41,9%, Enterococcus faecalis - 24,2%, Escherichia coli - 18,2%, Staphylococcus epidermidis - 16,2%, Staphylococcus saprophiticus - 15,7%, Streptococcus agalactiae - 8,6%, Streptococcus anginosus - 7,1%, Klebsiella pneumoniae - 5,6% (таблица 2). При этом достоверной разницы в клинической картине и результатах микроскопического исследования у пациенток исследуемых групп выявлено не было, что свидетельствует о клинической значимости условно-патогенных микроорганизмов в количестве 102-104 КОЕ/мл при ассоциации 4 и более инфекционных агентов.

Таблица 2

Результаты количественного определения условно-патогенных микроорганизмов

Анализируемые микроорганизмы	Ассоциации микроорганизмов
	4 и более	2-3	1
	>104 КОЕ/мл абс./%	102-104 КОЕ/мл абс./%	>104 КОЕ/мл абс./%	102-104 КОЕ/мл абс./%	>104 КОЕ/мл абс./%	102-104 КОЕ/мл абс./%
Corynebacterium spp.	77/38,9	83/41,9	11/5,6	10/5,1	-	-
Escherichia coli	64/32,3	36/18,2	4/2,0	3/1,5	1/0,5	-
Enterococcus faecalis	52/26,3	48/24,2	4/2,0	2/1,0	-	1/0,5
S.saprophiticus	24/12,1	31/15,7	2/1,0	1/0,5	-	-
Klebsiella pneumoniae	23/11,6	11/5,6	-	2/1,0	-	-
Str. anginosus	20/10,6	14/7,1	1/0,5	1/0,5	-	-
Staph. epidermidis	17/8,6	32/16,2	-	4/2,0	-	-
Str. agalactiae	11/5,6	17/8,6	1/0,5	3/1,5	-	-

Согласно задачам исследования было проведено клинико-лабораторное обследование 50 мужчин - половых партнеров 50 женщин с вульвовагинитами, вызванными условно-патогенными микроорганизмами. При культуральном исследовании уретрального отделяемого наиболее часто отмечался рост E.faecalis (у 22,0% мужчин), E.coli (у 20,0% мужчин), Str.agalactiae (у 10,0% мужчин), Klebs.pneumonia (у 6,0% мужчин), Streptococcus spp. (у 2,0% мужчин). У 27 (54,0%) сексуальных пар было установлено, что состав микрофлоры уретры пациента соответствовал составу микроценоза их половых партнерш, на основании чего можно предполагать возможность половой трансмиссии условно-патогенных микроорганизмов. Однако достоверных различий между парами, у которых состав микробиоценоза урогенитального тракта являлся идентичным и различался, выявлено не было (рисунок 4).

Рисунок 4. Результаты лабораторных исследований половых партнеров

Результаты изучения возможности использования ДНК-чипов для оценки состояния вагинального микробиоценоза.

Согласно поставленным задачам исследования были определены этапы исследования.

I этап заключался в определении спектра микроорганизмов для включения в состав ДНК-чипов. На основании результатов проведенного клинико-лабораторного обследования пациенток исследуемых групп, для включения в состав ДНК-чипа, предназначенного для оценки вагинального микробиоценоза был определен спектр патогенных (N.gonorrhоeaе, C.trachomatis, M.genitalium), условно-патогенных (E.coli, Ent.faecalis, Str.anginosus, Streptococcus spp., Bact.caсcae, Bact. fragilis, Bact.vulgatus, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus сurtisii, Bact.stercoris, Porphyromonas asacchoralytica, Fusobacterium nucleatum, Ent.faecium, Bact.uniformis, Bact.distasonis, Bact.eggerthii, G.vaginalis, M.hominis, U.urealyticum, Clost.ramosum, S.aureus, Veillonella parvilа, Prev.bivia, Moraxella catarrhalis, Prev.disiens, Prev.melanogenica, Actinobac.actinomycetemcomitans, Peptostreptococcus anaerobius, Bact.merdae, Bact.ovatus, Bact. thetaiotaomicron) и непатогенных (Lactobacillus spp., L.gasseri, L.vaginalis, L.plantarum, L.salivarius, L.brevis, L.fermentus) агентов, включающий в себя 41 микроорганизм.

Включение в ДНК-чип большого количества облигатно-анаэробных микроорганизмов обусловливалось трудностью их культивирования.

На II этапе исследования были подобраны олигонуклеотидные зонды для идентификации микроорганизмов.

На III этапе были оценены результаты, полученные при исследовании методом ДНК-чипов. Установлено, что у пациенток I группы наиболее часто выявлялись ассоциации микроорганизмов в количестве 3-5 (55; 55,6%). Ассоциации из 6-10 микроорганизмов выявлялись у 27 (27,3%) пациенток, более чем из 11 микроорганизмов - у 10 (10,1%) пациенток. В структуре аэробных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов были выделены: E.faecalis (59,6%), E.coli (51,5%), Str.anginosus (19,2%), Streptococcus spp. (6,1%), E.faecium (3,0%), S.aureus (1,0%). Среди анаэробных микроорганизмов выявлялись представители рода Bacteroides: B.distasonis (11,1%), B.caсcae (6,1%), B.eggerthii (7,1%), B. fragilis (6,1%), B.thetaiotaomicron (5,1%), B.vulgatus (4,0%), B.merdae (3,0%), B.stercoris (3,0%), B.uniformis (3,0%) и B.ovatus (1,0%). Так же были идентифицированы Peptostreptococcus anaerobius (20,2%), Mobiluncus mulieris (19,2%), Fusobacterium nucleatum (18,2%), Prev.melanogenica (13,1%), Prev.bivia (11,1%), Porphyromonas asacchoralytica (8,1%), Mobiluncus сurtisii (7,1%), Prev.disiens (6,1%), Veillonella parvilа (4,0%), Moraxella catarrhalis (3,0%), Act. actinomycetemcomitans (2,0%), Clostridium ramosum (2,0%). Микроаэрофилы (G. vaginalis) были выявлены у 19 (19,2%) пациенток.

У 14 (58,3%) пациенток группы сравнения методом ДНК-чипов достоверно чаще выявлялись ассоциации 1-2 микроорганизмов, основную долю которых составили представители лактобактерий (Lactobacillus spp., Lactobacillus gasseri, Lactobacillus plantarum). У 10 (41,7%) пациенток были выявлены ассоциации 3 и более микроорганизмов, в составе которых были идентифицированы E. coli и Ent.faecalis. (таблица 3).

Статистически чаще (p<0,001) у пациенток II группы были выявлены Lactobacillus spp.. При этом в частоте выявления отдельных представителей семейства Lactobacteriaceae характерных различий выявлено не было, следовательно, не удалось определить доминантное значение какого-либо конкретного представителя семейства лактобациллярной микрофлоры в поддержании колонизационной резистентности вагинального биотопа.

Таблица 3

Спектр микроорганизмов, идентифицированных методом ДНК-чипа, у пациенток исследуемых групп (n=123)

№	Анализируемые микроорганизмы	I группа (n=99) абс./%	II группа (n=24) абс./%	№	Анализируемые микроорганизмы	I группа (n=99), абс./%	II группа (n=24) абс./%
1.	Lactobacillus spp.*	79/79,8	24/100	19.	Bact. uniformis	3/3,0	-
2.	Lаct. gasseri	43/43,4	9/27,5	20.	B. thetaiotaomicron	5/5,1	1/4,2
3.	Lact. vaginalis	15/15,2	3/12,5	21.	Bact. ovatus	1/1,0	-
4.	Lact. plantarum	19/19,2	6/25,0	22.	Bact. stercoris	3/3,0	-
5.	Lact. salivarius	15/15,2	6/25,0	23.	Bact. distasonis	11/11,1	3/12,5
6.	Lact. brevis	24/24,2	4/16,7	24.	Prevotella bivia	11/11,1	-
7.	Lact. fermentus	10/10,1	2/8,3	25.	Veillonella parvilа	4/4,0	-
8.	E. coli*	51/51,5	2/8,3	26.	Mor. catarrhalis	3/3,0	1/4,2
9.	E. faecalis*	59/59,6	1/4,2	27.	G. vaginalis	19/19,2	1/4,2
10.	E. faecium	3/3,0	-	28.	Prev. disiens	6/6,1	-
11.	Str. anginosus*	19/19,2	-	29.	Prev. melanogenica	13/13,1	1/4,2
12.	Staph. aureus	1/1,0	-	30.	Bact. vulgatus	4/4,0	-
13.	Streptococcus spp.	6/6,1	-	31.	Bact. eggerthii	7/7,1	3/12,5
14.	P.asacchoralytica	8/7,1	1/4,2	32.	Fusob.nucleatum	18/18,2	3/12,5
15.	Pept. anaerobius	20/20,2	4/16,7	33.	Act.actinomycetem.	2/2,0	-
16.	Bacteroides fragilis	5/5,1	-	34.	Mobiluncus mulieris	19/19,2	5/20,8
17.	Bacteroides caсcae	6/6,1	-	35.	Mobiluncus сurtisii	7/6,2	1/4,2
18.	Bact. merdae	3/3,0	-	36.	Clostr.amosum	2/2,0	-

*р<0,05

На IV этапе исследования был проведен анализ чувствительности и специфичности метода ДНК-чипа относительно культурального метода исследования. Чувствительность ДНК-чипа для идентификации микроорганизмов оценивали отдельно для группы патогенных, непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов. С целью изучения специфичности метода ДНК-чипов в исследование дополнительно были включены 14 женщин, у которых при обследовании выявлялись возбудители ИППП: N.gonorrhoeae - у 2 (14,3%) пациенток, C.trachomatis - у 11 (78,6%) пациенток, M.genitalium - у 3 (21,4%) пациенток. У 8 (57,1%) пациенток была выявлена U.urealyticum.

Согласно результатам исследования, установлена максимальная (100,0%) чувствительность метода ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП и высокая (97,2-100,0%) чувствительность для выявления ряда непатогенных и условно-патогенных микроорганизмов (таблица 4).

Таблица 4

Результаты оценки чувствительности и специфичности метода ДНК-чипов

Анализируемые микроорганизмы	ДНК-чип	Культура-льн.метод	Специфич-ность	Чувствитель-ность
Neisseria gonorrhoeae	1,5%	1,5%	100,0%	100,0%
Chlamydia trachomatis	8,0%	8,0%	100,0%	100,0%
Mycoplasma genitalium	2,2%	2,2%	100,0%	100,0%
Lactobacillus spp.	78,8%	47,5%	60,2%	100,0%
Gardnerella vaginalis	15,3%	14,6%	95,2%	100,0%
Esсherichia coli	40,1%	40,1%	100,0%	100,0%
Enterococcus faecalis	47,4%	45,9%	96,9%	97,2%
Enterococcus faecium	2,2%	2,2%	100,0%	100,0%
Staphylococcus aureus	0,7%	0,7%	100,0%	100,0%
Streptococcus spp.	4,4%	3,6%	83,3%	100,0%
Streptococcus anginosus	14,6%	12,4%	85,0%	100,0%
Fusobacterium nucleatum	16,1%	14,6%	86,4%	99,1%

В связи с тем, что непатогенные и условно-патогенные микроорганизмы идентифицировались с помощью всех примененных методов исследования как у пациенток I группы, так и у пациенток II группы, интерпретация специфичности определения данных микроорганизмов на ДНК-чипе представляла затруднения. Поэтому специфичность метода оценивалась по отношению к возбудителям ИППП. На основании того, что результаты идентификации патогенных микроорганизмов на ДНК-чипе у 14 пациенток, дополнительно включенных в исследование, полностью совпали с результатами, полученными микробиологическими методами и методом ПЦР, их специфичность была оценена как 100,0%.

На V этапе исследования было проведено изучение экономической целесообразности использования ДНК-чипа для оценки вагинального микробиоценоза в сравнении с микробиологическими методами и методом ПЦР. С этой целью был проведен расчет себестоимости различных методов исследования в соответствии с "Методическими рекомендациями по расчету себестоимости медицинских услуг в учреждениях здравоохранения".

В результате исследований установлена себестоимость метода ДНК-чипов для оценки вагинального микробиоценоза в размере 713,95 рублей, для микробиологических исследований - в размере 1392,12 рублей, для исследований методом ПЦР - в размере 762,98 рублей.

Экономических преимуществ применения технологии ДНК-чипов перед исследованием методом ПЦР не выявлено, однако в отличие от метода ПЦР использование ДНК-чипов позволяет достичь:

- сокращения в десятки раз времени комплексной идентификации микроорганизмов за счет проведения общей, а не отдельной для каждого микроорганизма реакции амплификации вариабельного района гена 16S РНК, общего для всех микроорганизмов;

- сокращения времени детекции и анализа результатов за счет флуоресцентной детекции и применения программного обеспечения;

- сокращения площади рабочего места, необходимого для выполнения исследования;

- значительного снижения вероятности ошибок, обусловленных "человеческим" фактором и, в связи с этим, более высокого качества проводимых исследований.

Анализ показателей чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам.

В ходе исследования было установлено, что наибольшую чувствительность выделенные культуры аэробных микроорганизмов (E.faecalis, E.coli, S.saprophiticus, S.epidermidis, Streptococcus spp., Str.agalactiae, Klebsiella pneumoniae) показали к амоксициллин/клавулоновой кислоте (91,7% - 100,0% штаммов) (таблица 5).

Таблица 5

Чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Процент чувствительных штаммов микроорганизмов	Антибактериальные препараты
	Амоксицил./ клавулонат	Нитро- фураны	Цефтриаксон	Ципро-флоксацин	Лево-флоксацин	Офлоксацин	Клиндамицин
Esсherichia coli	94,7%	92,4%	93,6%	87,7%	93,8%	92,5%	-
Ent. faecalis	93,4%	93,4%	6,4%	58,9%	81,4%	75,0%	-
St. saprophiticus	91,7%	83,3%	100%	83,3%	75,0%	100%	83,3%
St. epidermidis	100%	100%	90,9%	100%	75,0%	66,7%	100%
Streptococcus spp.	100%	100%	100%	80,0%	-	-	60,0%
Str. аgalactiae	100%	100%	100%	50,0%	50,0%	66,7%	71,4%
Klebs. pneumonia	100%	0,0%	-	50,0%	50,0%	75,0%	-

К цефтриаксону так же были отмечены высокие показатели чувствительности многих выделенных культур микроорганизмов (93,6% - 100,0% штаммов), за исключением культур E.faecalis, у которых был выявлен наибольший процент (93,6%) нечувствительных штаммов. Так же большинство штаммов E.faecalis оказались нечувствительными к доксициклину (76,2%). К нитрофуранам в 92,4% - 100,0% была отмечена чувствительность штаммов E.faecalis, E.coli, S.epidermidis, Streptococcus spp., Str.agalactiae. Однако, 100,0% культур штаммов Klebsiella pneumoniae оказались нечувствительны к препаратам данной группы.

Процент нечувствительных штаммов большинства микроорганизмов к фторхинолонам составил соответственно: к офлоксацину - 7,5%-33,3%, к ципрофлоксацину - 12,3%-50,0% и к левофлоксацину - 6,3%-50,0% штаммов. Ввиду невысокого процента (у 50,0% - 83,3% штаммов) чувствительных к фторхинолонам культур микроорганизмов, назначение этих препаратов для терапии вульвовагинитов, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, рекомендовано только после определения чувствительности выделенного изолята.

Результаты изучения эффективности различных методик лечения.

Выбор антибактериального препарата системного действия базировался на основании результатов определения чувствительности выделенных культур микроорганизмов к антибактериальным препаратам. У 22 пациенток препаратами выбора являлись амоксициллин/клавулоновая кислота (625 мг 3 раза в день перорально в течение 10 дней), у 22 пациенток - ципрофлоксацин (250 мг 2 раза в день перорально в течение 7 дней), у 22 пациенток - нифурател (200 мг 3 раза в день перорально в течение 10 дней). Из комбинированных противомикробных препаратов местного действия у 66 пациенток использовался неомицин/тернидазол/нистатин/преднизолон, который назначался ежедневно интравагинально по 1 таблетке в течение 10 дней.

Анализ результатов проведенного исследования продемонстрировал эффективность проведенной терапии для 25 (75,8%) пациенток Ia подгруппы, 31 (93,9%) пациентки Ib подгруппы и 22 (66,7%) пациенток Ic подгруппы, у которых при контрольном обследовании отсутствовали клинико-лабораторные признаки вульвовагинита, а микробиоценоз был представлен в основном Corynebacterium spp., S.epidermidis, S.saprophiticus в количестве, не превышающем 102 КОЕ/мл, и Lactobacillus spp. - в количестве более 104 КОЕ/мл. Однако у 8 (24,2%) пациенток Ia подгруппы после проведенной терапии были выявлены клинические и лабораторные признаки кандидозного вульвовагинита. У 2 (6,1%) пациенток Ib и 11 (33,3%) Ic подгрупп лечение было расценено как неэффективное (сохранение клинико-лабораторных признаков вульвовагинита, идентификация условно-патогенных микроорганизмов (E.coli, E.faecalis, Klebsiella pneumoniae, Str.agalactiae и др.) в количестве более 104 КОЕ/мл и при ассоциации 3 и более микроорганизмов).

Наибольшая клиническая эффективность была достигнута у пациенток Ib подгруппы (93,9%), в отличие от пациенток Ia (75,8%) и Ic (66,7%) подгруппы. Микробиологическая эффективность также была наиболее высокой (97,0%) у пациенток Ib по сравнению с пациентками подгруппы Ia (75,8%) и Ic (66,7%) подгрупп. Таким образом, лечебные мероприятия, применяемые в Ib подгруппе, оказались наиболее эффективными в отличие от терапии, проведенной в Ia ...