Цитокінові механізми патогенезу та експериментальна терапія гострих порушень мозкового кровообігу

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ»

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

доктора медичних наук

14.03.05 - фармакологія

ЦИТОКІНОВІ МЕХАНІЗМИ ПАТОГЕНЕЗУ ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ТЕРАПІЯ ГОСТРИХ ПОРУШЕНЬ МОЗКОВОГО КРОВООБІГУ

Супрун Еліна Владиславівна

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі технології ліків та клінічної фармакології з фармацевтичною опікою Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету МОЗ України, м. Харків.

Науковий консультант:

доктор медичних наук, професор ГРОМОВ Леонід Олександрович, Державна установа «Інститут фармакології та токсикології АМН України», м. Київ, завідувач відділу нейрофармакології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор ЯРОШ Олександр Кузьмич, Державна установа «Інститут фармакології та токсикології АМН України», м. Київ, завідувач відділу фармакокінетики;

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України КУЗНЄЦОВА Світлана Михайлівна, Державна установа «Інститут геронтології ім. Д.Ф. Чеботарьова НАМН України», м. Київ, керівник відділу судинної патології головного мозку;

доктор медичних наук, професор МАМЧУР Віталій Йосипович, Державний заклад «Дніпропетровська медична академія МОЗ України», м. Дніпропетровськ, завідувач кафедри клінічної фармакології та фармакоекономіки.

Захист відбудеться “21” грудня 2011 р. об 11⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01 при Державній установі «Інститут фармакології та токсикології АМН України» за адресою: 03680, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Інститут фармакології та токсикології АМН України» за адресою: 03680, м. Київ, вул. Е. Пот'є, 14.

Автореферат розісланий “ ” 2011 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Д 26.550.01,

кандидат біологічних наук І.В. Данова

Анотація

Супрун Е.В. Цитокінові механізми патогенезу та експериментальна терапія гострих порушень мозкового кровообігу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Державна установа «Інститут фармакології та токсикології АМН України». - Київ, 2011.

Дисертація присвячена вивченню молекулярних механізмів цитокінової регуляції постішемічного пошкодження тканини мозку і нейропротективних ефектів цитокінових препаратів інтерлейкінового ряду, а саме - рецепторного антагоністу інтерлейкіну-1 (РАІЛ-1) та інтерлейкіну-2 (Ронколейкін). З використанням єдиного комплексного підходу на моделях ішемічного (фокального і глобального) та геморагічного ушкоджень тканини мозку були розкриті цитокінові молекулярні механізми, що лежать в основі нейропротекторного ефекту цитокінової церебропротекції у щурів. Доведено, що введення РАІЛ-1 і Ронколейкіну сприяє збереженню функціональної активності мітохондрій, нормалізує енергетично-вуглеводний обмін, стабілізує постішемічне вільно-радикальне ушкодження, модифікує співвідношення факторів регуляції нейроапоптозу, що в цілому запобігає розвитку нейродегенеративних процесів, а саме неврологічних дефіцитів. Вперше вивчені мітопротекторний, антиоксидантний, апоптозомодулюючий, нейропротективний та антигіпоксичний ефекти РАІЛ-1 та ІЛ-2 в умовах експериментальної гіпоксії мозку різної етіології. Запропоновано новий оригінальний спосіб терапії ГПМК з використанням цитокінових препаратів інтерлейкінового ряду - РАІЛ-1 та ІЛ-2, який ефективно підвищує стійкість тканини мозку до ушкоджувальної дії гіпоксії ішемічної і геморагічної природи.

Ключові слова: цитокіни, рецепторний антагоніст інтерлейкіну-1, інтерлейкін-2, ішемічний та геморагічний інсульти, церебропротекція.

Аннотация

цитокін інсульт нейропротекція інтерлейкіновий

Супрун Э.В. Цитокиновые механизмы патогенеза и экспериментальная терапия острых нарушений мозгового кровообращения. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Государственное учреждение «Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины». - Киев, 2011.

Диссертация посвящена изучению молекулярных механизмов цитокиновой регуляции постишемического повреждения ткани мозга и нейропротективных эффектов цитокиновых препаратов интерлейкинового ряда, а именно - рецепторного антагониста интерлейкина-1 (РАИЛ-1) и интерлейкина-2 (Ронколейкин).

В работе проводится исследование фундаментальной проблемы нейробиологии, связанной с расшифровкой эндогенных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышение резистентности мозга и организма в целом к патогенному действию неблагоприятных факторов. Совокупность полученных данных имеет весомое значение для развития современных представлений о патогенетической цепи нарушений функционирования мозга, индуцируемой гипоксическим повреждением, и раскрытии лежащих в основе ее формирования внутриклеточных процессов. На основании проведенных исследований обосновывается представление о том, что цитокины интерлейкинового ряда принимают активное участие в повышении устойчивости ткани мозга к эффективному противодействию неблагоприятным факторам путем стимуляции нейроиммунных механизмов адаптации. Это представление вносит значительный вклад в понимание молекулярно-клеточных основ компенсаторных реакций мозга.

Впервые комплексно изучены нейропротективный, антиоксидантный, антигипоксический и апоптозомодулирующий эффекты РАИЛ-1 и ИЛ-2 в условиях экспериментальной гипоксии мозга различной этиологии. Установлено, что применение РАИЛ-1 и Ронколейкина в определенном режиме предотвращает структурно-функциональные повреждения нейронов мозга вслед за ишемией и препятствует развитию постишемических неврологических дефицитов у крыс, что свидетельствует о повышении резистентности мозга к различным повреждающим факторам и об универсальности механизмов воздействия цитокиновых препаратов интерлейкинового ряда.

Впервые с использованием единого комплексного подхода на моделях фокального и глобального ишемического и геморрагического повреждений ткани мозга в значительной мере раскрыты цитокиновые молекулярные механизмы, лежащие в основе нейропротективного эффекта цитокиновой церебропротекции у крыс. Установлено, что введение РАИЛ-1 и ИЛ-2 индуцирует базисные механизмы адаптации, нейропластичности и нейропротекции, направленные на модуляцию участвующих в процессах выживания/гибели внутриклеточных регуляторных механизмов и проадаптивных белков в условиях повреждающего действия ОНМК. В частности, введение РАИЛ-1 и ИЛ-2 способствует сохранению функциональной активности митохондрий, нормализует энерго-углеводный обмен, стабилизирует постишемическое свободно-радикальное повреждение, модифицирует соотношение факторов регуляции нейроапоптоза, что в целом предотвращает развитие нейродегенеративных процессов, а именно неврологических дефицитов.

Получены новые данные о важной роли интерлейкин-зависимых механизмов формирования постишемического повреждения ткани мозга. Впервые показано, что применение РАИЛ-1 и ИЛ-2 в условиях воздействия гипоксии мозга ишемической и геморрагической природы предотвращает возникновение (формирование) дисфункции митохондрий и (последующей) активации патогенетического каскада повреждения нейронов мозга. Установлено, что это осуществляется посредством модификаций механизмов цитокиновой регуляции, способствующей переводу нейроиммунной регуляции в новый режим функционирования. Этот режим характеризуется стабилизацией дисбаланса цитокинов и последующим повышением адаптивных возможностей нейроиммунной регуляции и ткани мозга в целом в условиях постишемического повреждения.

Установлено, что применение РАИЛ-1 и ИЛ-2 предупреждает структурно-функциональные повреждения нейронов мозга после ишемии и блокирует развитие постишемических неврологических дефицитов у крыс, что свидетельствует о повышении резистентности мозга к различным повреждающим факторам.

Предложен новый оригинальный способ терапии ОНМК с использованием цитокиновых препаратов интерлейкинового ряда, а именно РАИЛ-1 и ИЛ-2, эффективно повышающий устойчивость ткани мозга к повреждающему действию гипоксии ишемической и геморрагической природы.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что цитокины интерлейкинового ряда являются важным звеном, запускающим каскад структурно-функциональных повреждений нейронов при гипоксии и оказывающими влияние на формирование различных звеньев патогенеза при церебральном инсульте. Новое направление цитокиновой нейропротекции с использованием препаратов интерлейкинового ряда - РАИЛ-1 и ИЛ-2 - обладает высокой эффективностью и потенциально может быть использовано в клинической практике.

Ключевые слова: цитокины, ОНМК, рецепторный антагонист интерлейкина-1, интерлейкин-2, ишемический инсульт, геморрагический инсульт, церебропротекция.

Annotation

Suprun E.V. Cytokine mechanisms of pathogenesis and experimental therapy of acute brain blood circulation. - Manuscript.

Dissertation for achieving a scientific degree of Doctor of Medicine Sciences by specialty 14.03.05 - pharmacology. - State institution «Institute of pharmacology and toxicology AMN of Ukraine». - Kyiv, 2011.

Thesis devotes to the investigation of molecular mechanisms of cytokine regulation of afterischemic damage of brain tissue and neuroprotective effects of cytokine drugs - namely, the receptor antagonist of interleukin-1 (RAIL-1) and interleukin-2 (IL-2). Using a single integrated approach to models of ischemic (focal and global) and hemorrhagic damage of brain tissue was discovered cytokines molecular mechanisms underlying the neuroprotective effect of cytokine cerebroprotection in rats. Approved that administration of RAIL-1 and IL-2 promotes the preservation of functional activity of mitochondria, normalizes energetic-carbohydrate metabolism, stabilizes postischemic free-radical damage modifies the ratio of factors regulating neuroapoptosis generally prevents the development of neurodegenerative processes, such as neurological deficit.

For the first time mitoprotective, antioxidant, apoptosemodulating, and neuroprotective effects of RAIL-1 and IL-2 in experimental brain hypoxia of different etiologies were studied. A new original method proposed for treatment of ABBC using cytokine drugs - RAIL-1 and IL-2, that effectively increase the resistance of brain tissue to damaging action of ischemic and hemorrhagic hypoxia.

Keywords: cytokines, receptor antagonist interleukin-1, interleukin-2, ischemic stroke, hemorrhagic stroke, cerebroprotection.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В останні десятиріччя спеціалістами більшості економічно-розвинених країн реєструється постійне зростання розповсюдженості цереброваскулярних захворювань, зокрема ішемічних та геморагічних інсультів, при яких формується постішемічний ланцюг патофізіологічних змін тканини мозку [Б.С. Виленский, 2002; С.М. Виничук, т.М. Черенько, 2003; В.И. Черний и соавт., 2007; Т.с. Мищенко, 2007; W. Rosamond et al., 2008]. В осередку гіпоксії/ішемії активуються клітини ендотелію, лейкоцити, макрофаги, які продукують цитокіни, в першу чергу інтерлейкіни (IL). Цитокіни залучені до усіх ланок гуморальної та клітинної імунної відповіді, для них характерні поліфункціональність та значне перекриття функцій, однак біологічна дія деяких цитокінів є оригінальною і не дублюється [C.A. Dinarello, 1987; А.С. Симбирцев, 2002; С.А. Кетлинский, 2008].

Ступінь виразності функціонально-метаболічних змін у тканині головного мозку прогресуючи зменшується від центру до периферії пошкодження і пов'язана з агресивним впливом активізованих ішемією клітин глії на життєздатні нейрони пенумбри шляхом вторинного пошкодження мозку [R. Bisonette et al., 1997; Е.И. Гусев, 1999; S.L. Tokgozoglu et al., 1999; И.А. Завалишин, 2000; М.М. Одинак, 2001]. Серед механізмів вторинного пошкодження тканини мозку особливе значення мають реакції локального запалення навколо зони «ядра» інфаркту, а саме різкий підйом рівнів прозапальних цитокінів [W.A. Pulsinelli et al., 1985; D. Bartko, 1996; A. Blum et al., 1998; С.Л. Медведева, 2003; A. Culebras, 2008]. Першим з них в зоні ішемії мікроглія продукує IL-1. При взаємодії IL-1 з рецепторами активуються ядерні фактори транскрипції AP-1 і NK-kF, що змінює поведінку клітин-мішеней і призводить до розвитку гострофазової клітинної відповіді, метаболічної дисфункції і експресії генів раннього реагування [M. Buttint et al., 1994; C. Eriksson et al., 2000; W. Strober et al., 2006;]. Продукція IL-1 є основним активуючим сигналом для індукції інших прозапальних цитокінів та стимуляції астроцитів до продукції потенційних нейротоксичних речовин (NO, метаболіти арахідонової кислоти) [W.P. Arend, 1998; C.C. Ferri et al., 2003; M. Braddock et al., 2004]. Розвивається трофічна дизрегуляція, що призводить до біохімічної та функціональної дедифференціації нейронів і запуску патобіохімічних каскадів некрозу/апоптозу [J.Z. Liu, 2002; Л.Д. Лукьянова и соавт., 2003; O.Y. Pletjushkina и соавт., 2009; K. Motovilov, 2009]. Встановлено тісний кореляційний зв'язок рівнів деяких прозапальних цитокінів (IL-1в, TNF-б, IL-6, IL-8) з тяжкістю клінічних проявів у пацієнтів з цереброваскулярними захворюваннями [H. Schneider et al., 1998; И.А. Завалишин, 2000; Вернер Хаке и др., 2001; М.З. Беридзе, 2001; М.М. Герасимова и соавт., 2003; В.И. Скворцова, 2003]. При цьому відзначають відносний дефіцит протизапальних цитокінів (IL-1rа, IL-10) та ростових факторів (BDNF, IGF-1, PDGF, IL-2) [Е.И. Гусев, 1999; Г.Н. Крыжановский, 2003; H. Wang et al., 2004; И.Ф. Беленичев и соавт., 2009]. Таким чином, важливе значення для розвитку постішемічного ланцюгу патофізіологічних змін тканини мозку при церебральній ішемії має формування цитокінового дисбалансу - гіперпродукції прозапальних, зокрема IL-1, та відносного дефіциту його рецепторного антагоніста та ростового фактору IL-2.

Раціональна нейропротекція полягає у перериванні патологічних каскадів, які визивають дисфункцію і загибель нейронів, на більш ранніх рівнях, для чого потрібен системний та комплексний аналіз формування патогенетичних ланок «інсультної катастрофи» [K.R. Lees et al., 2002; М. Фишер, 2001; В.Д. Лук'янчук, 2001; С.М. Кузнецова и соавт., 2005; В.И. Мамчур и соавт, 2006; A.R. Young et al., 2007]. Однак нез'ясовною залишається роль цитокінів інтерлейкінового ряду в комплексі патогенетичного ланцюга порушень функціонування мозку при цереброваскулярних захворюваннях взагалі та церебральних інсультах ішемічної та геморагічної природи зокрема. В сучасній літературі існують лише окремі, дуже суперечливі дані про характер змін балансу цитокінів та їх ефектів при ішемічних і геморагічних інсультах. Фрагментарними є відомості про вплив цитокінів інтерлейкінового ряду на окремі показники патофізіологічних нейродеструктивних порушень при цереброваскулярних захворюваннях.

Таким чином, подальші дослідження впливу цитокінових препаратів інтерлейкінового ряду на формування ланок нейродеструктивного каскаду постішемічного пошкодження тканини мозку становить значний науковий інтерес і дозволить здійснити розробку комплексної терапії, спрямованої на корекцію мітохондріальної дисфункції, енергетичного та вуглеводного дисбалансу, вільно-радикального ушкодження та стабілізацію нейрональних втрат шляхом некрозу/апоптозу. Наведені обставини обгрунтовують актуальність, наукову новизну та практичне значення даного дисертаційного дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідної програми Національного фармацевтичного університету «Фармакологічні дослідження біологічно активних речовин і лікарських засобів синтетичного та природного походження, їх застосування у медичній практиці» (№ держ. реєстрації 0103U000478). Дисертант є співвиконавцем вказаної науково-дослідної роботи.

Мета роботи: вивчення молекулярних механізмів впливу цитокінових препаратів інтерлейкінового ряду - рецепторного антагоністу інтерлейкіну-1 (РАІЛ-1) та інтерлейкіну-2 (Ронколейкіну) - на формування ланок нейродеструктивного каскаду постішемічного пошкодження тканини мозку для експериментального обгрунтування можливості використання їх в якості ефективних нейропротективних засобів.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі завдання:

1. Визначити роль цитокінів інтерлейкінового ряду в патогенетичному ланцюгу порушень функціонування мозку при церебральному інсульті.

2. Дослідити в експерименті виразність протективних ефектів РАІЛ-1 та Ронколейкіну - можливість підвищувати виживаність тварин і впливати на динаміку неврологічного статусу на моделях ішемічного та геморагічного гострих порушень мозкового кровообігу (ГПМК).

3. Визначити антигіпоксичну активність РАІЛ-1 та Ронколейкіну.

4. Оцінити ефективність цитокінової нейропротекції РАІЛ-1 та Ронколейкіну у тварин з використанням морфологічних досліджень.

5. Вивчити молекулярні механізми цитокінової нейропротекції інтерлейкінових препаратів при пошкоджувальній дії гіпоксії - вплив на внутрішньоклітинні процеси нейропластичності та виживання/загибелі нейронів, а саме:

- функціональну активність мітохондрій,

- зміст аденілових нуклеотидів та показники лактат-ацидозу;

- активність системи оксиду азоту;

- виразність вільно-радикального пошкодження;

- стан факторів регуляції нейроапоптозу.

Для уточнення механізмів нейропротективних ефектів РАІЛ-1 та Ронколейкіну вивчили їх вплив на виразність постгіпоксичних змін, а саме на виживання експериментальних тварин та термін часу до їх загибелі (на моделях гострої гіперкапнічної та гемічної нітратної гіпоксії на мишах), стан енергозабезпечення міокарду, активність процесів вільно-радикального ушкодження, формування цитотоксичних зміни міокарду та функціональну спроможність міокардіоцитів (на моделі хронічної гемічної нітратної гіпоксії на щурах), виразність постгіпоксичних змін електрофізіологічної активності міокарду та прояви цереброкардіального синдрому - ЦКС (на моделі гострої церебральної ішемії на щурах).

Об'єкт дослідження: ішемія головного мозку.

Предмет дослідження: нейропротективна активність цитокінових препаратів інтерлейкінового ряду - рецепторного антагоністу інтерлейкіну-1 (РАІЛ-1) та інтерлейкіну-2 (Ронколейкін).

Методи дослідження: фармакологічні, біохімічні, гістоморфометричні, імуноферментні, електрофізіологічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше з використанням єдиного комплексного підходу на моделях ішемічного (фокального і глобального) та геморагічного ушкоджень тканини мозку були розкриті цитокінові молекулярні механізми, що лежать в основі нейропротекторного ефекту цитокінової церебропротекції у щурів, та розроблена схема реалізації внутрішньоклітинних сигнальних шляхів IL-1/IL-1ra та IL-2.

Доведено, що введення РАІЛ-1 і Ронколейкіну індукує базисні механізми адаптації, нейропластичності та нейропротекції, які спрямовані на модуляцію внутрішньоклітинних регуляторних механізмів і проадаптивних білків, що беруть участь у процесах виживання/загибелі в умовах ушкоджуючої дії ГПМК. Зокрема, введення РАІЛ-1 і Ронколейкіну сприяє збереженню функціональної активності мітохондрій, нормалізує енергетично-вуглеводний обмін, стабілізує постішемічне вільно-радикальне ушкодження, модифікує співвідношення факторів регуляції нейроапоптозу, що в цілому сприяє виживаності експериментальних тварин та запобігає розвитку нейродегенеративних процесів, а саме неврологічних дефіцитів.

Вперше доведені мітопротекторний, енерготропний, антиоксидантний, апоптозомодулюючий, нейропротективний та антигіпоксичний ефекти РАІЛ-1 та Ронколейкіну в умовах експериментальної гіпоксії мозку різної етіології. Показано, що стабілізуючий вплив РАІЛ-1 та Ронколейкіну на ранні постішемічні зміни мембранного потенціалу мітохондрій та формування мітохондріальних пор відновлює баланс макроергічних фосфатів клітин головного мозку щурів з ішемічним, геморагічним та фокальним інсультами, нормалізує вуглеводний обмін і попереджає розвиток лактат-ацидозу та набряку мозку. Встановлено, що застосування РАІЛ-1 і Ронколейкіну призвело до зниження активності системи оксиду азоту, процесів перекісного окислення ліпідів та білків, стабілізації активності ферментів антиоксидантної системи в тканині головного мозку щурів, що запобігає структурно-функціональним ушкодженням нейронів мозку слідом за ішемією, перешкоджає розвитку постішемічних неврологічних дефіцитів у щурів та свідчить про підвищення резистентності мозку до дії нейродеструктивних чинників. Доведено, що в умовах експериментального ішемічного інсульту фармакодинамічні характеристики РАІЛ-1 забезпечують його проникливість через гематоенцефалічний бар'єр та створення необхідної концентрації як в плазмі крові, так і в тканині головного мозку.

Вперше за допомогою системного аналізу встановлена специфіка динаміки та кореляційні зв'язки поміж відповідних метаболічних показників, морфофункціонального стану головного мозку та виживаності експериментальних тварин, лікованих РАІЛ-1 і Ронколейкіном в умовах ГПМК. Доведено, що фармакотерапія експериментального ішемічного та геморагічного інсультів РАІЛ-1 і Ронколейкіном викликає кардинальну перебудову архітектоніки патологічної функціональної системи організму і переорієнтування її на формування адекватних адаптаційних реакцій та відновлення порушеного гомеостазу організму тварин. При цьому в гострому періоді після ішемічного та геморагічного інсультів в першу чергу стабілізується система енергозабезпечення. Встановлено, що на моделі ішемічного інсульту регуляція адаптаційних процесів більш адекватною була в групі РАІЛ-1, на моделі геморагічного інсульту - в групі Ронколейкіну.

В експерименті продемонстровано, що РАІЛ-1 та Ронколейкін мають протигіпоксичну захисну дію. Вони подовжують тривалість життя експериментальних тварин на моделях гострої гіперкапнічної та гемічної гіпоксій та збільшують їх виживаність (при гострій гемічній гіпоксії). На моделі хронічної гемічної гіпоксії введення РАІЛ-1 та Ронколейкіну щурам оптимізує енергозабезпечення міокарду, стабілізує активність процесів вільно-радикального ушкодження на тлі активації антигіпоксичного захисту міокарда, блокує цитотоксичні зміни міокарду та відновлює функціональну активність міокардіоцитів. Захисний вплив РАІЛ-1 та Ронколейкін на виразність постгіпоксичних змін електрофізіологічної активності міокарду на моделі гострої церебральної гіпоксії у щурів запобігає проявам цереброкардіального синдрому.

На підставі отриманих даних запропоновано новий оригінальний спосіб терапії ГПМК з використанням цитокінових препаратів інтерлейкінового ряду - РАІЛ-1 та Ронколейкіну, який ефективно підвищує стійкість тканини мозку до ушкоджуючої дії гіпоксії ішемічної і геморагічної природи.

Новизна проведених досліджень захищена 4 патентами України.

Практичне значення одержаних результатів. Робота присвячена дослідженню фундаментальної проблеми нейробіології, пов'язаної з розшифровкою молекулярних механізмів, що забезпечують підвищення резистентності мозку до патогенної дії несприятливих чинників. Сукупність отриманих даних має вагоме значення для розвитку сучасних уявлень про патогенетичний ланцюг порушень функціонування мозку, який індукується гіпоксичним пошкодженням, і розкритті внутрішньоклітинних процесів, що лежать в основі її формування. На підставі проведених досліджень обґрунтовується уявлення про те, що цитокіни інтерлейкінового ряду беруть активну участь у підвищенні стійкості тканини мозку до ефективної протидії несприятливим факторам шляхом стимуляції нейроімунних механізмів адаптації. Це подання вносить значний внесок у розуміння молекулярно-клітинних основ компенсаторних реакцій мозку.

Теоретична значущість проведеного дослідження також визначається тим, що встановлено широкий спектр нейропротективних ефектів запропонованого способу цитокінової нейропротекції на різних рівнях (від молекулярних та морфологічних змін нейронів до поведінки і неврологічних функцій), а також виявлено внутрішньоклітинні каскадні механізми, за допомогою яких реалізується нейропротективна дія досліджуваних інтерлейкінових препаратів. Ці відомості істотно розширюють сучасні уявлення про нейрональні механізми нейропластичності, що лежать в основі підвищення адаптивних можливостей тканини мозку до екстремальних впливів.

Практична значущість роботи визначається тим, що вперше експериментально доведено та продемонстровано високий нейропротективний потенціал оригінального способу цитокінової нейропротекції з використанням інтерлейкінових препаратів РАІЛ-1 та Ронколейкіну, що відкриває широкі можливості для впровадження запропонованого способу в медичну практику в якості нової, ефективної патогенетичної медикаментозної стратегії, спрямованої на комплексну активацію інтерлейкін-залежних нейропротективних механізмів, порушених при ГПМК.

Згідно з результатами отриманих досліджень, спосіб цитокінової нейропротекції з використанням інтерлейкінових препаратів може становити безсумнівний інтерес для практичного застосування з метою профілактики та лікування ішемічних і геморагічних ГПМК. Разом з тим, виявлені механізми нейропротективної дії інтерлейкінових препаратів можуть сприяти створенню нового покоління ефективних фармакологічних препаратів, що надають спрямовану дію на ключові ланки внутрішньоклітинних захисних механізмів.

Результати дослідження впроваджені в навчальний процес кафедр фармакології, клінічної фармації та клінічної фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, кафедри фармакології, клінічної фармакології та фармакоекономіки Дніпропетровської державної медичної академії, кафедри технології ліків та клінічної фармакології з фармацевтичною опікою Інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету, кафедри фармакології та медичної рецептури Запорізького державного медичного університету, а також в науковий процес ДУ «Інститут неврології, психіатрії та наркології НАМН України».

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота являє собою самостійну завершену наукову працю. Дисертанту належить вирішальна роль у визначенні мети дослідження, шляхів її реалізації, плануванні та проведенні експериментальних досліджень, обробці результатів, інтерпретації та узагальненні одержаних результатів, формуванні основних положень та висновків, що захищаються. Крім того, проведено аналіз наукової літератури сучасного стану дослідження нових нейропротективних препаратів для профілактики та лікування ішемічних та геморагічних інсультів та інших цереброваскулярних захворювань. Проаналізовано дані про сучасний стан досліджень та використання у клінічній практиці нових цитокінових препаратів. Експериментальні результати отримано автором особисто та разом зі співробітниками центральної науково-дослідної лабораторії Національного фармацевтичного університету та центральної науково-дослідної лабораторії Запорізького державного медичного університету.

Апробація результатів дисертації. Основні результати викладені та обговорені за період з 2004 по 2011 рік на симпозіумах та конференціях - VI з'їзді фармацевтів України «Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України» (м. Харків, 28-30 вересня 2005р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених (м. Харків, 16-17 квітня 2005р), III Національному з'їзді фармакологів України «Фармакологія 2006 - крок у майбутнє» (м. Одеса, 17-20 жовтня 2006р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених (м. Харків, 23-24 квітня 2009р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених (м. Харків, 21-22 квітня 2010р.), VII міжнародної медико-фармацевтичної конференції студентів і молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (84-й щорічний науковий форум)(м. Чернівці, 8-9 квітня 2010р.), XXVIII Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Ліки-людині. Сучасні проблеми створення, вивчення та апробації лікарських засобів» (м. Харків, 3 лютого 2011р.).

Публікації. За результатами виконаної дисертації опубліковано 40 наукових робіт, з них 26 статей у фахових наукових журналах (15 - одноосібно), отримано 4 патенти України на корисну модель, 10 робіт у матеріалах з'їздів та конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 396 сторінках комп'ютерного друку, складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали та методи дослідження», 7 розділів власних досліджень, розділу, присвяченого аналізу та узагальненню результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел, який включає 462 найменування, з них 215 - кирилицею, 247 - латиницею. Дисертація ілюстрована 72 таблицями та 74 рисунками.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проводили на білих нелінійних мишах масою 18-20 гр. та щурах масою 180-200 гр. Щури отримані з розплідника ІФТ АМН України. В експерименті використовували тварин після проходження карантину в умовах віварію протягом 14 днів. Всі процедури та оперативні втручання здійснювали відповідно до «Положення про використання лабораторних тварин в біомедичних дослідженнях».

Дослідження проводили в Центральній науково-дослідній лабораторії НФаУ, яка сертифікована ДФЦ МОЗ України (посвідчення № 34 від 29.12.2005 р.) та центральній науково-дослідній лабораторії Запорізького державного медичного університету, сертифікованій ГФЦ МОЗ України (посвідчення № 19 від 29.01.2009 р.). Робота з тваринами проводилась згідно з міжнародними вимогами про гуманне ставлення до тварин та з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин, а також «Методическими рекомендациями по выведению лабораторных животных из эксперимента» [Киев, 1986]. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію при природній зміні дня і ночі. Доступ тварин до води був вільним. Усі маніпуляції, які можуть завдати болю, проведені під етамінал-натрієвим наркозом [О.В. Стефанов, 2001]. Комітетом з біоетики НФаУ (протокол № 5/1 від 10.12.2008 р.) встановлено, що проведені дослідження не суперечать загальноприйнятим біоетичним нормам з дотримання відповідних міжнародних положень стосовно проведення експериментальних досліджень.

Матеріалом дослідження служили рекомбінантні цитокінові препарати інтерлейкінового ряду - рецепторний антагоніст інтерлейкіну-1 (РАІЛ-1) та інтерлейкін-2 (Ронколейкін).

Рекомбінантний рецепторний антагоніст інтерлейкіну-1 отримано в Санкт-Петербурзькому ФДУП «ДержНДІ ОЧБ (особливо чистих біопрепаратів)». Рецепторний антагоніст ІЛ-1 (РАІЛ-1) є вперше описаним, природно існуючим, рецепторним антагоністом ІЛ-1. Він інгібує дію ІЛ-1 шляхом конкурентного зв'язування мембранного типу I ІЛ-1 рецепторів та передумовлює взаємодію рецептора ІЛ-1 з його акцесорним білком, що призводить до припинення проведення сигналу від ІЛ-1 всередину клітини. Сам РАІЛ-1 після зв'язування рецептору не інтерналізується в клітину, перебуваючи в пов'язаному з рецептором стані. Методами білкової хімії встановлена ідентичність отриманого рекомбинантного білку природному аналогу. Механізм дії препарату заснований на блокуванні ІЛ-1 шляхом конкурентного зв'язування зі специфічними рецепторами типів IL-1RI та IL-1RII. Рецепторний антагоніст ІЛ-1 людини є діючим началом препарату РАІЛ-1. Нейропротективну дію РАІЛ-1 вивчали при внутрішньом'язовому введенні експериментальним тваринам в дозах від 1 мг/кг до 15 мг/кг.

Рекомбінантний препарат інтерлейкіну-2 (Ронколейкін) - структурний та функціональний аналог ендогенного інтерлейкіну-2. Клініко-фармакологічна група: L03АС01. Інтерлейкін. Препарат з протипухлинною та імуномодулюючою активністю. Інтерлейкін-2 є одним з основних учасників реалізації специфічного сигналу від антигену і костимулюючого сигналу від В7 антигенпрезентуючих клітин. ІЛ-2 спрямовано діє на ріст, диференціювання та активацію Т- та В-лімфоцитів, моноцитів, макрофагів, олігодендрогліальних клітин, епідермальних клітин Лангерганса. Від його присутності залежить розвиток цитолітичної активності натуральних кілерів та цитотоксичних Т-лімфоцитів. ІЛ-2 викликає утворення лімфокін-активованих кілерів та активує пухлинно-інфільтруючі клітини. Також встановлено, що IL-2 стимулює синтез і секрецію цілого ряду інших лімфокінів: IL-4, IL-6, гамма-інтерферону, колоній-стимулюючих факторів (CSFs), факторів некрозу пухлин (TNFs). Розширення спектру лізуючої дії ефекторних клітин обумовлено елімінацією різноманітних патогенних мікроорганізмів, інфікованих та малігнізованих клітин, що обумовлює імунний захист, спрямований проти пухлинних клітин, а також збудників вірусної, бактеріальної та грибкової інфекції. Показання до призначення Ронколейкіну - імунокорекція при патологічних станах, що обумовлені чи супроводжуються вторинною імунною недостатністю.

В нашому дослідженні використовувався Ронколейкін виробництва ЗАТ «Трудовий колектив Київського підприємства по виробництву бактерійних препаратів «Біофарма» (м. Київ, вул. М. Амосова, 9). Нейропротективну дію Ронколейкіну вивчали при внутрішньом'язовому введенні експериментальним тваринам у дозі 0,01 мг/кг.

Нейропротективну дію препаратів вивчали на 3 експериментальних моделях, адекватних клінічним проявам ГПМК ішемічної та геморагічної природи. Для відтворення клінічної картини глобального ішемічного інсульту обрана модель необоротної білатеральної оклюзії загальних сонних артерій, яку ми використовували на білих щурах. Клінічну картину геморагічного інсульту відтворювали введенням щурам аутокрові під тверду мозкову оболонку головного мозку. Клінічну картину фокальної ішемії відтворювали на моделі двостороннього фотоіндукованого тромбозу судин, при якому утворюється постійне за обсягом та локалізацією вогнище ішемії.

Для визначення мітопротекторної активності у мітохондріальній фракції тканини мозку визначали відкриття мітохондріальної пори (МП) після ініціації циклоспорином-А та зміни мембранного потенціалу заряду мітохондрій (МПЗМ) у присутності сафроніна-О [Акопова Л.В., Сагач В.Ф., 2004]. Видалену тканину мозку промивали в сольовому середовищі (0,15 М KCl) при температурі +4єС та гомогенізували в розчині для гомогенізації (250 мМ сахароза, 20 мМ трисамінометан, 1 мМ ЕДТА, рН 7,4) за допомогою скляного гомогенізатору (співвідношення тканини та розчину 1:10). Мітохондріальну фракцію тканини мозку виділяли методом диференційованого центрифугування - гомогенату мозку протягом 7 хвилин при 700 g та супернатанту (після видалення осаду) протягом 15 хвилин при 11000 g при температурі +4єС. В інкубаційній суміші суспензії мітохондрій (1 мг білку в зразку) при +25єС після ініціації циклоспорином-А (0,5 мл) та постійного перемішування протягом 25 хвилин відкриття МП визначали спектрофотометрично при 540 нм. Зміни МПЗМ в суспензії мітохондрій (1 мг білка в зразку) визначали спектрофотометрично у присутності сафроніна-О (9 мкМ) в якості потенціал-залежної мітки як різницю світопоглинання при 515 нм та 525 нм.

Стан вуглеводно-енергетичного обміну (гліколіз, окислення в циклі Кребса) визначали за рівнем макроергічних фосфатів (АТФ, АДФ, АМФ) та лактату, пірувату, малату [Прохорова М.И., 1986]. Для більш детальної оцінки процесів енергетичного обміну в тканині мозку на підставі отриманих даних розраховували додаткові показники енергозабезпечення - енергетичний заряд, енергетичний потенціал, коефіцієнт порівняння, індекс фосфорилювання, термодинамічний контроль дихання [Мецлер Д., 1980].

Для оцінки інтенсивності вільно-радикального окислення в тканинах мозку визначали стан перекисного окислення ліпідів (за змістом дієнових кон'югатів (ДК), тріенкетонов (ТК) [Коган B.C., 1988] і малонового діальдегіду (МДА) [Андреева Л.Н., 1988]) та маркери окислювальної модифікації білку - альдегидфенілгідразони (АФГ) та карбоксилфенілгідразони (КФГ) [Halliwell B., 1999]. Антиоксидантний захист оцінювали за активністю в тканини мозку щурів супероксиддисмутази (СОД) [Чевари С., 1986], каталази [Королюк В.А., 1988], глутатіонпероксидази (ГПР) [Асатиани В.С., 1969].

Продукцію та стан метаболізму оксиду азоту вивчали за активністю NO-синтази [Колесник Ю.М., Бєленічев І.Ф., 2006] та вмістом нітратів і L-аргініну [Горбунов Н.В., 1995].

Для вивчення активності тіол-дісульфідної системи визначали рівні відновлених та окислених тіолів та глутатіону [Кулинский В.И., 2005], активність глутатіонпероксидази та глутатіонредуктази [Асатиани В.С., 1969] в гомогенаті головного мозку щурів з фокальною ішемією в ранньому та віддаленому постішемічних періодах.

Для проведення гістоімунохімічних досліджень головний мозок експериментальних тварин поміщали на 24 години у фіксатор Буена і після стандартної гістологічної проводки тканину розміщували у парафін [Пирс Э., 1962]. На ротаційному мікротомі виготовляли 14-мікронні зрізи гіпоталамуса, які депарафінували за стандартною методикою. Для виявлення експресії c-fos та Bcl-2-білку в корі та гіпоталамусі використовували імуногістохімічний метод непрямої імунофлюоресценції [Johnstone A.P., 1997]. На флуоресцентному мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина) досліджували Fos-імунопозитивні нейрони та Bcl-2-імунопозитивні нейрони за допомогою відеокамери COHU-4922 (COHU Inc., США) та вводили в систему цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина).

Для морфологічних досліджень після завершення терміну спостерігання наркотизованих тварин декапітували, витягали мозок, 24 години фіксували його в фіксаторі Карнуа та далі за стандартною схемою заливали в парафінні блоки, з яких готували серійні фронтальні 5-мікронні гістологічні зрізи в області СА1 зони гіппокампу [Пирс Э., 1962]. Зображення кори мозку отримували на мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина) та за допомогою 8-бітної CCD-камери COHU-4922 (COHU Inc., США) вводили в комп'ютерну систему аналізу зображень VIDAS-386 (Kontron Elektronik, Німеччина). Морфометричний аналіз клітин мозку здійснювали в автоматичному режимі за допомогою мікропрограми, розробленою в спеціалізованому середовищі програмування VIDAS-2,5 (Kontron Elektronik, Німеччина).

Визначали наступні показники [Kolesnik Y.M., 2005]: щільність нейронів, гліальних клітин, апоптотичних та деструктивно-змінених нейронів (кількість клітин на 1 мм² площі зрізу кори мозку); клітинний склад в області IV-V слоїв кори в процентах; площу нейронів, гліальних клітин, апоптотичних та деструктивно-змінених нейронів (мкм²); концентрацію РНК в нейронах, гліальних клітинах, апоптотичних та деструктивно-змінених нейронах (одиниці оптичної щільності - О_ОЩ, які розраховували як логарифм співвідношення оптичної щільності тіла клітини до оптичної щільності міжклітинної речовини); індекс відношення кількості нейронів, що вижили, до кількості апоптотичних та деструктивно-змінених нейронів.

Показники психофізіологічного стану щурів вивчали в гострому періоді постішемічного ушкодження тканини мозку (4 доба) та в періоді відновлення (18 доба). Неврологічний дефіцит у тварин визначали за шкалою stroke-index C.P. McGrow - тварин тестували щодня, виставляючи суму балів [McGrow C.P., 1997]. Реєстрували показники орієнтовно-дослідних інстинктів в умовах «відкритого поля» [Буреш Я., 1991]. Протягом 3 хвилин реєстрували горизонтальну (кількість квадратів, які перетинала тварина), вертикальну (кількість вертикальних рухів - «стійок») та дослідницьку активність (кількість заглядань в «норки»). Також вплив препаратів на ВНД вивчали на моделі однократного навчання - умовного рефлексу пасивного уникання (УРПУ) без застосування анестезуючого фактору - в віддаленому постішемічному періоді на 18 добу дослідження [Буреш Я., 1991]. Критеріями церебропротективної ефективності досліджуваних сполук служили також термін загибелі тварин (в днях) та їх виживаність (у %), а також клінічні особливості перебігу ГПМК в динаміці.

Антигіпоксичну активність препаратів вивчали на моделях гострої гіперкапнічної та гемічної гіпоксії на мишах, хронічної гемічної гіпоксії [Стефанов А.В., 2002] та гострої церебральної ішемії на щурах [Чекман И.С., Губский Ю.И., 2010]. На моделі гострої гіперкапнічної та гемічної гіпоксії білих мишей проводили облік виживання тварин та визначали термін часу до загибелі тварин. На моделі хронічної гемічної гіпоксії у щурів оцінювали стан інтенсивності ПОЛ і антиоксидантної системи серця за результатами визначення вмісту в гомогенаті серця МДА, ДК та рівня ВГ. Також оцінювали функціональний стан міокарду за даними показників ЕКГ, які фіксували на 90 хвилині після моделювання гемічної гіпоксії в II стандартному відведенні, виразність метаболічних і дистрофічних змін серцевого м'яза - за показником АсАТ, масового коефіцієнта серця та вмістом глікогену в міокарді. На моделі гострої ішемії головного мозку у щурів оцінювали виживаність щурів протягом тижня, масу мозку тварин та розвиток ЕКГ-проявів церебро-кардіального синдрому (ЦКС).

Вивчення гострої токсичності (LD₅₀) РАІЛ-1 проводили на мишах при внутрішньочеревинному введенні в об'ємі 1 мл одноразово за методом Cr. Karber. Ступінь токсичності визначали за загальноприйнятими таблицями [К.К. Сидоров, 1973], ефективну дозу (ЕD₅₀) розраховували за методом Cr. Karber. Можливу загальнотоксичну дію на органи і системи вивчали згідно з Методичними рекомендаціями ДФЦ МОЗ України (2001). Вивчали вплив на загальний стан тварин, який оцінювали за динамікою маси і температури тіла тварин та даними патологоанатомічного дослідження.

Середньосмертельну і середньоефективну дози препаратів визначали на двох видах лабораторних тварин - нелінійних білих мишах і білих щурах за умов внутрішньочеревинного та внутрішньошлункового введення за методом Cr. Karber.

Експериментальне вивчення фармакокінетики РАІЛ-1 проводили на моделі глобальної ішемії у щурів методом імуноферментного аналізу з використанням імуноферментної тест-системи для визначення РАІЛ-1 людини (ІФА - IL-1Ra). Розрахунок фармакокінетичної моделі проводили із застосуванням програми “Borgia” [Соловьев В.Н., Фирсов А.А., 1980].

Статистичну обробку результатів проводили з використанням пакету статистичних програм Statistica 6.0 (Statistica Inc., США). Достовірність відмінностей в групах визначали з використанням критерію Стьюдента (t), достовірними вважали відмінності з рівнем значущості більше 95% (р<0,05).

Результати досліджень та їх обговорення. Вплив РАІЛ-1 та Ронколейкіну на формування мітохондріальної дисфункції. Виразність нейродеструктивних процесів при ГПМК залежить від локального зниження кровопостачання та характеризується на першому етапі формуванням енергетичного дефіциту та лактат-ацидозу. Стан енергозабезпечення клітин мозку залежить від рівней макроергічних фосфатів - АМФ, АДФ та АТФ. Основний синтез АТФ відбувається в мітохондріях. Саме дисфункція мітохондріальних ферментів в умовах недостатнього надходження кисню визначає енергетичні порушення клітин головного мозку, що призводить до пригнічення аеробного синтезу енергії або біоенергетичної (тканинної) гіпоксії. Тому першим етапом нашого дослідження було вивчення показників функціональної активності мітохондрій в тканини мозку щурів з експериментальним ішемічним, геморагічним та фокальним інсультом на тлі фармакологічної корекції рекомбінантними цитокіновими препаратами - РАІЛ-1 та Ронколейкін.

В експерименті в мітохондріальній фракції, виділеній з гомогенату тканини мозку експериментальних тварин, визначали мембранний потенціал заряду мітохондрій (МПЗМ) у присутності сафроніна-О та відкриття циклоспорин-А-залежної мітохондріальної пори (МП).

Більш активні прояви мітохондріальної дисфункції відзначено у щурів з експериментальним ішемічним інсультом. Результати проведеного дослідження доводять (рис.1), що в умовах глобальної церебральної ішемії зниження показника МПЗМ в контрольній групі прогресувало з 67% від рівня умовно оперованих (УО) тварин в гострому постішемічному періоді (р^УО<0,05) до 76% на 18-ту добу (р^УО<0,05), що відображає негативні зміни функціонального стану внутрішньої мембрани мітохондрій. При цьому збільшується її проникність та відбувається відкриття МП.

Рис. 1. Мембранний потенціал заряду мітохондрій (МПЗМ) у тканині мозку щурів з ішемічним (А) та геморагічним (Б) інсультами: УО - умовно оперовані тварини; К - контроль (неліковані тварини з ГПМК). Вірогідні відмінності (р<0,05) відносно умовно оперованих тварин позначено знаком (*), відносно тварин контрольної групи - знаком (^Д). Тут і на рис. 2-11.

Нами визначено відкриття МП в мітохондріях тканин головного мозку щурів з ішемічним інсультом на 4-ту добу експерименту на 74% відносно групи УО (р^УО<0,05), в віддаленому постішемічному періоді цей показник збільшився до 79% (р^УО<0,05), що відображає динамічне зростання у постішемічному періоді порушень проникливості мітохондріальної мембрани.

Введення тваринам з церебральною ішемією РАІЛ-1 стабілізувало функціональну активність мітохондрій головного мозку щурів, що підтверджується зростанням мембранного потенціалу заряду мітохондрій (на 18-ту добу в 2 рази перевищує показники контрольних тварин (р^К<0,05)) та блокуванням відкриття мітохондріальних пор (в відновлювальному періоді відновлення до 74% від рівня групи УО (р^УО<0,05)). Мітопротекторна активність Ронколейкіну співпадає з РАІЛ, але менш виразна.

Аналогічні результати відносно формування мітохондріальної дисфункції та протекторного впливу на неї РАІЛ-1 та Ронколейкіну отримані на моделях геморагічного та фокального інсультів у щурів. Таким чином, на моделях ішемічного, геморагічного та фокального інсультів у щурів доведена наявність у РАІЛ-1 та Ронколейкіну мітопротекторного ефекту. Максимальна виразність мітопротекторної дії РАІЛ-1 та Ронколейкіну відзначена в віддаленому постішемічному періоді.

Вплив РАІЛ-1 та Ронколейкіну на формування енергетичного дефіциту. Мітохондріальна дисфункція корелює з фазними змінами у змісті аденілових нуклеотидів - АТФ, АДФ і АМФ, які випереджають зміни інших функціонально-метаболічних показників життєдіяльності клітини. Беручи до уваги, що формування постішемічного каскаду патофізіологічних змін взаємопов'язано з енергетичним дефіцитом, одним із завдань цієї роботи було вивчення впливу РАІЛ-1 та Ронколейкіну на динаміку показників енергозабезпечення тканини мозку в мовах ГПМК ішемічної та геморагічної природи.

Стан енергетичного забезпечення клітин мозку визначали за рівнем макроергічних фосфатів - АТФ, АДФ, АМФ. Для більш детальної оцінки процесів енергетичного обміну в тканині мозку на підставі отриманих даних розраховували додаткові показники енергозабезпечення - енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), коефіцієнт порівняння (КП), індекс фосфорилювання (ІФ) та термодинамічний контроль дихання (ТКД).

На моделі необоротної білатеральної оклюзії загальних сонних артерій у щурів (рис.2) встановлено, що наслідком ішемічного ушкодження стали зміни енергетичного забезпечення тканини мозку, а саме дисбаланс макроергічних фосфатів. Відмічено значне зниження вмісту АТФ - до 30% від початкового рівня на 4-ту добу експерименту (р^УО<0,05) з частковим відновленням до 50% в відновлювальному періоді (р^УО<0,05). Рівень АМФ в умовах експериментальної ішемії був вірогідно підвищений протягом всьому експерименту адекватно зниженню в ці періоди АТФ, що відображає посилений розпад останнього при ішемічному пошкодженні тканини мозку.

Рис. 2. Вміст макроергічних фосфатів - АТФ (А) та АМФ (Б) у тканині мозку щурів з ішемічним інсультом.

Формування енергетичного дефіциту в постішемізованій тканини мозку підтверджується також зниженням показників додаткових параметрів енергозабезпечення ЕП, ЕЗ, КП, ІФ та ТКД на 52-78% протягом всього періоду дослідження (рис. 3).

РАІЛ-1 та Ронколейкін стабілізують енергетичний стан клітин мозку після церебральної ішемії, що підтверджується зростанням рівней АТФ та АДФ на тлі зниження вмісту АМФ. Аналіз додаткових параметрів енергозабезпечення свідчить, що РАІЛ-1 та Ронколейкін підвищують ступінь заповнення системи АТФ-АДФ-АМФ високоенергетичними зв'язками (за збільшенням ЕП), запобігають зниженню швидкості мітохондріального дихання (за збільшенням ЕЗ), активують прямі реакції перетворення АДФ з синтезом АТФ (за збільшенням КП), корегують дисбаланс співвідношення окремих макроергічних фосфатів (за збільшенням ІФ) та інтенсивність фосфорилювання аденілнуклеотидної системи в цілому (за збільшенням ТКД).

Рис. 3. Показники енергозабезпечення тканини мозку щурів з ішемічним інсультом - енергетичний заряд (ЕЗ), енергетичний потенціал (ЕП), коефіцієнт порівняння (КП), індекс фосфорилювання (ІФ) та термодинамічний контроль дихання (ТКД) на 4-ту (А) та 18-ту (Б) добу дослідження.

Аналогічні результати стосовно ефективного протективного впливу РАІЛ-1 і Ронколейкіну на формування постішемічного енергетичного дефіциту тканини мозку отримані на моделях геморагічного та фокального інсультів у щурів. На досліджених моделях ГПМК енерготропна активність РАІЛ та Ронколейкіну співпадають. Максимальна виразність енерготропного (метаболітного) ефекту РАІЛ-1 та Ронколейкіну на моделях ішемічного, геморагічного та фокального інсультів у щурів відзначена в віддаленому постішемічному періоді.

Вплив РАІЛ-1 та Ронколейкіну на формування лактат-ацидозу. У період стадії енергетичних порушень зниження вмісту АТФ в ішемізованій тканині мозку призводить до компенсаторної активації анаеробного гліколізу і посиленому утворенню лактату та іонів водню, що зумовлює розвиток метаболічного ацидозу. В експерименті стан вуглеводного обміну визначали за рівнем пірувату, лактату та малату.

Доведено, що на моделі глобальної церебральної ішемії у щурів постішемічне ушкодження тканини мозку супроводжувалось розвитком некомпенсованого лактат-ацидозу - в гострому постішемічному періоді в контрольній групі відзначено підвищення лактату в 2,7 разу (р^УО<0,05) на тлі зниження практично в 2 рази вмісту пірувату (р^УО<0,05) і малату (р^УО<0,05), на 18-ту добу дослідження лактат-ацидозний дисбаланс істотно не змінився.

Введення експериментальним тваринам на тлі двосторонньої перев'язки загальних сонних артерій РАІЛ-1 призвело до зниження відносно контрольних показників вмісту лактату - на 24% на 4-ту добу (р^К<0,05) і майже в 2 рази на 18-ту добу (р^К<0,05). При цьому на 4-ту добу дослідження підвищився відносно контрольних показників рівень пірувату на 39% (р^К<0,01) та малату на 44%, що свідчить також про збільшення синтезу АТФ за рахунок аеробного та анаеробного шляхів окислення. В віддаленому постішемічному періоді рівні пірувату та малату перевищують контрольні показники відповідно на 73% (р^К<0,05) та на 93% (р^К<0,01).