Хіміко-токсикологічний аналіз метформіну

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

нАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

ХІМІКО-ТОКСИКОЛОГІЧНИЙ АНАЛІЗ МЕТФОРМІНУ

Москаленко Валерія Юріївна

Харків - 2014

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі токсикологічної хімії Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України, м. Харків.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор

МЕРЗЛІКІН Сергій Іванович,

Національний фармацевтичний університет, професор кафедри токсикологічної хімії.

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор

ПЕТЮНІН Геннадій Павлович,

Харківська медична академія післядипломної освіти, завідувач кафедри клінічної біохімії, судово-медичної токсикології та фармації;

доктор фармацевтичних наук, професор

ВАСЮК Світлана Олександрівна,

Запорізький державний медичний університет, завідувач кафедри аналітичної хімії.

Захист відбудеться «5» червня 2014 р. 12.00 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий «_29_» __квітня__ 2014 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, проф. В.А. Георгіянц

Анотація

Москаленко В. Ю. Хіміко-токсикологічний аналіз метформіну. - На правах рукопису.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет МОЗ України, Харків, 2014.

Дисертаційна робота присвячена хіміко-токсикологічному дослідженню метформіну. Розроблено умови одержання метформіну основи та триацетилметформіну, як маркерів отруєння препаратом. Досліджено їх фізико-хімічні властивості, хроматографічні та спектральні характеристики. Запропоновано умови виявлення метформіну чутливими та специфічними реагентами та інструментальними методами: ТШХ, ВЕРХ, УФ-, ІЧ- та ПМР-спектроскопії. Розроблено та валідовано методики кількісного визначення метформіну інструментальними методами аналізу в діапазоні токсичних концентрацій препарату. Розроблено індивідуальні методики ізолювання метформіну із тканин печінки, сечі та крові. Досліджено розподіл метформіну в органах отруєних препаратом лабораторних тварин та динаміку змін кількісного вмісту метформіну в біологічному матеріалі при зберіганні. Розроблено схему направленого хіміко-токсикологічного аналізу біологічних об'єктів на вміст метформіну.

Ключові слова: метформін, хіміко-токсикологічний аналіз, біологічні об'єкти, ізолювання з біологічних об'єктів, хроматографічні методи аналізу, спектральні методи аналізу.

Аннотация

Москаленко В.Ю. Химико-токсикологический анализ метформина. - На правах рукописи.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальный фармацевтический университет МЗ Украины, Харьков, 2014.

Диссертационная работа посвящена химико-токсикологическому исследованию антидиабетического средства метформин.

В ходе экспериментальных исследований предложены условия выделения основания метформина из соответствующей хлористоводородной соли методом колоночной ионнообменной хроматографии, как маркера отравления препаратом. Изучены физико-химические свойства, хроматографические (методами ТСХ и ВЭЖХ) и спектральные (методами УФ-, ИК- и ПМР-спектроскопии) характеристики основания метформина, которые были использованы для стандартизации полученного образца данного вещества.

Исследовано взаимодействие метформина с большинством общеосадительных и хромогенных реактивов, которые используются в химико-токсикологическом анализе для обнаружения и идентификации лекарственных веществ в экстрактах из биологических объектов. Предложены чувствительные и специфические реагенты, пригодные для обнаружения метформина в ходе судебно-токсикологических исследований: реактивы Бушарда и Вагнера (предел обнаружения 300 мкг, соответственно; коричневое окрашивание), реактив Сакагучи (предел обнаружения 1,0 мкг; розовое окрашивание), смесь 10 % раствора натрия нитропруссида, 10 % раствора калия феррицианида и 10 % раствора натрия гидроксида (1:1:1) (предел обнаружения 5,0 мкг; красное окрашивание). В тонком слое сорбента их чувствительность повышается в 10 раз.

Изучена хроматографическая подвижность метформина в тонком слое сорбента. Предложены условия для обнаружения метформина методом ТСХ: пластинки Merck Silicagel 60 F₂₅₄ и Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ; система н-бутанол-кислота уксусная ледяная-вода (60:10:30), проявитель - реактив Сакагучи (Rf 0,20 и 0,28, соответственно). После элюирования метформина 90 % метанолом из тонкого слоя, взятого в месте его адсорбции на непроявленной зоне хроматографической пластинки, идентификацию препарата предложено проводить инструментальными методами: ВЭЖХ, УФ-, ИК- и ПМР-спектроскопии; вещество свидетель - стандартный образец основания метформина.

Разработаны и валидированы методики количественного определения метформина в модельных растворах методами: спектрофотометрии (RSD = 3,98 %), ВЭЖХ (RSD = 1,80 %) и экстракционной фотометрии (RSD = 2,23 %) в диапазоне токсических концентраций препарата. По валидационным характеристикам: диапазон применения, предел обнаружения и количественного определения, специфичность и линейность доказана корректность применения данных методик для поставленных целей. Разработанные методики были апробированы при количественном определении метформина в экстрактах из биологических объектов (печень, моча и кровь). метформін отруєння хроматографія

Предложены условия дериватизации (ацетилирования) метформина в соответствующий триацетил-1,1-диметилбигуанид, как маркера острого отравления препаратом; изучены его физико-химические свойства, хроматографические (методами ТСХ и ВЭЖХ) и спектральные (УФ- и ПМР-методами) характеристики. Исследовано влияние природы органического растворителя, рН среды и присутствия электролита на эффективность извлечения метформина и триацетилметформина из водных растворов. Разработаны индивидуальные методики изолирования метформина с практическим выходом из тканей печени до 84 %, мочи - до 85 % и крови - до 56 %, а также способы очистки полученных извлечений от белков и липофильных веществ.

Изучено распределение метформина в органах, отравленных препаратом лабораторных животных и динамику изменения количественного содержания метформина в биологическом материале при хранении. Определены оптимальные биологические объекты (печень, почки, моча и кровь) и срок хранения (25 суток) биологического материала для проведения судебно-токсикологических исследований. Разработана схема направленного химико-токсикологического анализа биологических объектов на содержание метформина.

Ключевые слова: метформин, химико-токсикологический анализ, биологические объекты, изолирование из биологических объектов, хроматографические методы анализа, спектральные методы анализа.

Annotation

Moskalenko V.Yu. Chemical-toxicological analysis of metformin. - Manuscript.

Thesis for obtaining of candidate scientific degree in Pharmacy on specialty 15.00.02. - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National University of Pharmacy, Health Ministry of Ukraine, Kharkiv, 2014.

Thesis is devoted to chemical-toxicological analysis of antidiabetic drug Metformin. During the experimental research conditions for obtaining metformin base and triacetylmetformin as markers of metformin poisoning have been proposed. It was also studied its physical-chemical properties, chromatographic and spectral characteristics. Conditions of identification of metformin with sensitive and specific reagents and by instrumental methods (TLC, HPLC, UV-, IR-, NMR-spectroscopy) have been proposed. Methods of quantitative determination of metformin in the range of toxic concentration were developed and validated. Individual methods of metformin isolation from liver tissues, urine and blood have been developed. The allocation of metformin in organs of poisoned animals and the dynamics of metformin quantitative content change in biological material during the storage have been studied. According to obtained results the scheme of chemical-toxicological analysis of biological objects on the content of metformin have been developed.

Key words: metformin, chemical-toxicological analysis, biological objects, isolation from biological objects, chromatographic methods of analysis, spectral methods of analysis.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. За даними токсикологічних служб щорічно у світі реєструється близько 800 тис. отруєнь лікарськими засобами, у більшості психотропними, снодійними та ін., які впливають на ЦНС. Токсикологічно небезпечними також є найбільш споживані та доступні лікарські препарати, зокрема, пероральні антидіабетичні засоби.

Основою сучасної фармакотерапевтичної схеми лікування цукрового діабету 2 типу є Метформін (Глюкофаг, Сіофор, Diformin та ін.). Проте, його застосування за різних обставин може спричинити отруєння з тяжкими наслідками. Серед таких обставин визначають небезпечні для життя побічні дії, передозування препарату, у тому числі з суїцидальною метою та ін. На сайті FDA у період з 2002 по 2013 рр. висвітлено 4784 випадки отруєнь метформіном, з них смертельних за різних обставин - 570.

Аналіз доступних джерел не виявив даних стосовно систематичного хіміко-токсикологічного дослідження метформіну, що свідчить про актуальність обраної теми.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету МОЗ України за темою «Хімічний синтез і аналіз біологічно-активних речовин, створення лікарських засобів синтетичного походження» (номер Державної реєстрації 0103U000475).

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи є проведення систематичого хіміко-токсикологічного дослідження метформіну стосовно розробки методик його ізолювання із біологічних об'єктів, виявлення та кількісного визначення препарату в одержаних вилученнях.

Для досягнення мети було поставлено такі задачі:

? здійснити аналіз джерел літератури щодо токсикологічних властивостей метформіну, випадків та обставин отруєнь препаратом, методів його аналізу та особливостей хіміко-токсикологічного аналізу (ХТА) лікарських речовин;

? розробити умови одержання основи метформіну та триацетилметформіну, як маркерів отруєння препаратом, вивчити їх властивості, хроматографічні та спектральні характеристики;

? вивчити вплив природи органічного розчинника, рН середовища та присутності електроліту на ефективність вилучення метформіну та триацетилметформіну з водних розчинів;

? дослідити можливість ізолювання метформіну загальними методами (підкисленою водою та підкисленим етанолом) та розробити індивідуальні методики ізолювання препарату з біологічних об'єктів: печінки, крові та сечі;

? визначити умови виявлення та ідентифікації метформіну та триацетилметформіну in vitro, в тонкому шарі сорбенту та інструментальними методами ВЕРХ, УФ-, ІЧ- та ПМР-спектроскопії;

? розробити методики кількісного визначення метформіну (методи спектрофотометрії, ВЕРХ та екстракційної фотометрії), визначити деякі їх валідаційні характеристики та опрацювати розроблені методики на вилученнях препарату із біологічних об'єктів;

? дослідити розподіл метформіну в органах отруєних препаратом лабораторних тварин та вивчити динаміку змін його кількісного вмісту в біологічному матеріалі при зберіганні;

? запропонувати схему направленого ХТА біологічних об'єктів на вміст метформіну при отруєнні.

Об'єкт дослідження. Хіміко-токсикологічне дослідження метформіну.

Предмет дослідження. Методики ізолювання метформіну з біологічних об'єктів; способи очищення вилучень від домішок різної природи; методики виявлення, ідентифікації та кількісного визначення метформіну в екстрактах з біологічних об'єктів.

Методи дослідження. Для ізолювання метформіну з біологічних об'єктів (печінка, кров та сеча) застосовували метод рідинно-рідинної екстракції; для виявлення та ідентифікації метформіну в екстрактах з біологічних об'єктів використовували хімічні реакції (загальноосадові та хромогенні реагенти), хроматографічні методи (ТШХ, ВЕРХ) та спектральні (УФ-, ІЧ- та ПМР-методи); для кількісного визначення метформіну - ВЕРХ, спектрофотометричний та екстракційно-фотометричний методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведені систематичні хіміко-токсикологічні дослідження метформіну, які включають розробку індивідуальних методик ізолювання препарату з біологічних об'єктів (печінка, кров, сеча), способів очищення одержаних вилучень від співекстрактивних речовин, чутливих та специфічних методик виявлення та кількісного визначення метформіну в діапазоні токсичних концентрацій.

Запропоновано умови одержання основи метформіну методом іоно-обмінної хроматографії та дериватизації метформіну шляхом ацетилювання його молекули з відповідним одержанням триацетилметформіну, як маркерів отруєння препаратом. Вперше досліджені фізико-хімічні властивості та визначені хроматографічні та спектральні характеристики одержаних речовин методами ТШХ, ВЕРХ, УФ-, ІЧ- та ПМР-спектроскопії.

Науково обґрунтовано умови ізолювання метформіну з біологічних об'єктів (печінки, крові та сечі) та запропоновано способи очищення одержаних вилучень від білків та співекстрактивних ліпофільних речовин.

Науково обґрунтовано умови виявлення та ідентифікації основи метформіну та триацетилметформіну в екстрактах з біологічних об'єктів специфічними та чутливими хімічними реагентами, методами ТШХ, ВЕРХ, УФ-, ПМР-спектроскопії, а також умови кількісного визначення даних речовин методами ВЕРХ, спектрофотометрії та екстракційної фотометрії в діапазоні токсичних концентрацій препарату.

Вперше досліджено розподіл метформіну в органах отруєних препаратом лабораторних тварин, запропоновано доцільні біологічні об'єкти та визначено термін придатності тканин печінки для проведення ХТА на вміст препарату.

На підставі одержаних результатів запропоновано схему направленого ХТА біологічних об'єктів при отруєнні метформіном. Наукову новизну результатів відображено у матеріалах патенту України на корисну модель (заяв. № u201401133 від 6.02.14 р.) та трьох інформаційних листах про нововведення в системі охорони здоров'я (№№ 60-2014, 61-2014, 62-2014).

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено схему ХТА біологічних об'єктів на вміст метформіну при отруєнні, яка включає розроблені методики ізолювання препарату із тканин печінки, сечі та крові, способи очищення одержаних вилучень від білків та ліпофільних речовин, методики виявлення та ідентифікації метформіну та триацетилметформіну в екстрактах із біологічних об'єктів, а також методики кількісного визначення даних речовин в діапазоні токсичних концентрацій препарату.

Фрагменти роботи впроваджено у науково-дослідницьку діяльність кафедр ряду ВНЗ України: кафедри фармацевтичної хімії Тернопільського державного медичного університету ім. Горбачевського, кафедри токсикологічної та аналітичної хімії Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, кафедри біоорганічної, біологічної та фармацевтичної хімії Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, кафедри токсикологічної і неорганічної хімії Запорізького державного медичного університету, кафедри загальної та клінічної фармації Дніпропетровської державної медичної академії, а також до модуля «Фармацевт-токсиколог» Казахського медичного університету ім. Асфендіярова (акти впровадження від 24.01.2014 р., 18.01.2014 р., 04.04.2014 р., 20.01.2014 р., 15.01.2014 р., 10.03.2014 р., відповідно).

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником сформульовано мету і задачі наукових досліджень, обґрунтовано методологію ХТА біологічного матеріалу на вміст метформіну та розроблено схему-алгоритм досліджень. Особисто здобувачем проведений патентно-інформаційний пошук, здійснений огляд джерел літератури, проведено експериментальні дослідження, здійснено їх статистичну обробку та систематизовано одержані результати. Результати власних експериментальних досліджень висвітлено у наукових працях, опублікованих у співавторстві з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Основні теоретичні та практичні результати дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на Всеукраїнських науково-практичних конференціях з міжнародною участю студентів та молодих вчених (Харків, 9-10 квітня, 2009 р. та 23-24 квітня 2009 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Впровадження сучасних наукових досягнень в судову експертизу» (Харків, 10-11 вересня 2009 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 21-22 квітня 2010 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми транспортної медицини: навколишнє середовище; професійне здоров'я; патологія» (Одеса, 15-17 вересня 2010 р.), на VII національному з'їзді фармацевтів України «Фармація України. Погляд у майбутнє» (Харків, 15-17 вересня 2010 р.), на конференції, присвяченій 95 річчю від Дня народження проф. В. П. Крамаренка «Актуальні проблеми профілактичної медицини» (Львів, травень, 2011), ІІІ-му з'їзді токсикологів України «Сучасні проблеми токсикології. Безпека їжі та середовища життєдіяльності людини» (Київ, 18-19 грудня 2011 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів (Харків, 19-20 квітня 2012 р.) та VI науково-практичної конференції з міжнародною участю «Управління якістю в фармації» (Харків, 12 жовтня 2012 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, з них 6 статей у фахових виданнях (в тому числі 1 - за кордоном) та 10 тез доповідей на науково-практичних конференціях.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 235 сторінках машинописного тексту та складається зі вступу, огляду літератури (розд. 1), об'єкти та методи досліджень (розд. 2), розділів власних експериментальних досліджень (розд. 3-5), висновків, додатків та списку використаних джерел. Роботу ілюстровано 57 таблицями та 21 рисунками. Перелік використаної літератури містить 258 джерел, з них 183 - іноземних.

2. Основний зміст роботи

У вступі обговорюється актуальність обраної теми дисертаційної роботи, формулюється мета та основні задачі досліджень, відзначається наукова новизна та практичне значення одержаних результатів.

У першому розділі роботи наведений огляд джерел літератури стосовно загальної характеристики пероральних антидіабетичних засобів, фармакологічних та токсикологічних властивостей метформіну, випадків отруєнь метформіном, методів його аналізу та особливостей ХТА лікарських речовин.

На підставі аналізу вивчених джерел сформульовані фактори токсикологічної небезпеки антидіабетичних засобів, у тому числі метформіну, активним фармацевтичних інгредієнтом якого є його хлористоводнева сіль формули:

,

визначено обставини отруєнь даним препаратом та обґрунтовано доцільність проведення його систематичного хіміко-токсикологічного дослідження.

У другому розділі роботи обґрунтовано методологію хіміко-токсикологічного дослідження метформіну зі складанням схеми-алгоритму досліджень, які мали бути здійсненими, та яка містить класичні стадії ХТА лікарських речовин з урахуванням фізико-хімічних властивостей, метаболізму, даних токсикокінетики та ін. метформіну; охарактеризовано об'єкти досліджень, реактиви та методи аналізу, які було використано, зокрема, хроматографічні (ТШХ та ВЕРХ) та спектральні (УФ-, ІЧ- та ПМР-методи).

Третій розділ роботи присвячений розробці методик виявлення та ідентифікації метформіну, придатних для цілей ХТА.

Відповідно загальним принципам та методам ізолювання лікарських речовин із біологічних об'єктів полярними розчинниками, як маркер отруєння метформіном нами запропоновано його основу. Проте, в джерелах літератури відсутні дані про фізико-хімічні властивості даної речовини, оскільки при виробництві одержання основи метформіну не передбачено (П. А. Безуглый, В. В. Болотов, И. С. Гриценко и др.; Под. ред. В. П. Черных, 2005 г.).

Основу метформіну нами виділено з метформіну гідрохлориду методом іонообмінної хроматографії. Досліджено фізико-хімічні властивості одержаної речовини: T_пл. 120-121 °С, рК_а 12,4, легко розчинна у воді та ізопентанолі, мало розчинна у спиртах та гексані, практично не розчинна в органічних розчинниках, а також спектральні (рис. 1-3) та хроматографічні (рис. 4) характеристики. За одержаними результатами основу метформіну було стандартизовано та використано у подальших дослідженнях.



Рис. 1. УФ-спектри метформіну

основи: 1 - у воді (лmax 232±2 нм);

2 - в МеОН (лmax 236±2 нм);

3 - в NaOH (лmax 217±2, 230±2 нм).

Рис. 2. ІЧ-спектр метформіну основи (диск, KBr): 1580, 1620, 1063, 1075, 935, 740 см^-1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 3. ПМР-спектр метформіну основи, д, м.ч.: (CH₃)₂N - 2,85(c, 6H), 2NH₂ - 6.65 (c, 4H), NH - 9,3 (c, 2H)



Рис. 4. Хроматограма метформіну основи в МеОН (С=200 мкг/мл, л=210 нм, час утрим. 2,4 хв.)

Досліджено взаємодію метформіну з більшістю загальноосадових та хромогенних реагентів, які зазвичай застосовуються у ХТА для виявлення лікарських речовин. Серед використаних загальноосадових реагентів найбільш чутливим визначено реактиви Бушарда та Вагнера (межа виявлення 300 мкг, відповідно; коричневе забарвлення), а серед хромогенних найбільш чутливими та специфічними - реактив Сакагучі (межа виявлення 1,0 мкг; рожеве забарвлення) та суміш 10 % розчину натрій нітропрусиду, 10 % розчину калій фериціаниду та 10 % розчину NaOH (межа виявлення 5,0 мкг; червоне забарвлення). У тонкому шарі сорбенту їх чутливість збільшується у 10 разів (межа виявлення 0,1 та 0,5 мкг, відповідно).

З метою розробки методик виявлення метформіну також досліджено його хроматографічну рухливість в тонкому шарі сорбенту з використанням загальноприйнятих систем ТШХ-скринінгу лікарських та наркотичних речовин основного характеру, які рекомендовані Міжнародною асоціацією судових токсикологів (TIAFT): № 1. Метанол-25 % амоніак (100:1,5) - система TA; № 2. Циклогексан-толуен-діетиламін (75:15:10) - система TB; № 3. Хлороформ-метанол (90:10) - система TC; № 4. Ацетон - система TL; № 5. Метанол - система TAE; № 6. Метанол-н-бутанол (60:40) - система TAF; № 7. Хлороформ-этанол (90:10) - система TAJ; № 8. Хлороформ-циклогексан-кислота ацетат. льод. (40:40:20) - система TAK; № 9. Хлороформ-метанол-кислота пропіонова (72:18:10) - система TAL. Системи, які застосовуються для судово-токсикологічних досліджень в країнах СНД: № 10. Хлороформ-діоксан-ацетон-25 % амоніак (47,5:45:5:2,5); № 11. Ацетон-толуен-25 % амоніак-етанол (45:45:2,5:7,5). Спеціальні системи для ідентифікації метформіну: № 12. н-Бутанол-кислота ацетатна льод.-вода (60:10:30); № 13. н-Бутанол-хлороформ-метанол-25 % амоніак (40:15:15:15). Як тонкий шар сорбенту використовували хроматографічні пластинки Merck Silicagel 60 F 254 (Німеччина) та Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ (Росія). Умови дослідження - метод нормально-фазової хроматографії. Результати досліджень наведено в табл. 1.

Таблиця 1 Результати дослідження хроматографічної рухливості метформіну

№ системи	Метформін*	Кофеїн**	Rs
	Sorbfil	Merck	Sorbfil	Merck	Sorbfil	Merck
1.	0,11±0,01	0,07±0,02	0,92±0,01	0,80±0,02	0,12±0,01	0,09±0,02
2-11.	На старті	На старті	0,47-0,87 ±0,01	0,39-0,82 ±0,02	-	-
12.	0,28±0,01	0,20±0,02	0,66±0,01	0,42±0,02	0,42±0,01	0,47±0,02
13.	0,08±0,01	0,04±0,02	0,82±0,01	0,82±0,02	0,09±0,01	0,05±0,02

Примітки: * - проявник реактив Сакагучі;

** - хроматографічна система вважається придатною, якщо на хроматограмі чітко видно плями кофеїну (проявник реактив Драгендорфа).

Результати табл. 1 свідчать, що при хроматографуванні у системі № 12 забезпечується найбільш задовільна хроматографічна рухливість метформіну, тоді як при хроматографуванні у системах № 2-11 метформін залишається на старті. Відтворюваність одержаних результатів ТШХ-досліджень підтверджено шляхом перевірки розділювальної здатності використаних хроматографічних пластин за ДФУ, вид. 1. Специфічність розроблених умов ТШХ-досліджень доведено шляхом застосування специфічного для метформіну реактива Сакагучі. Придатність використаної хроматографічної системи доведено шляхом хроматографування у присутності стандартної речовини кофеїну. Запропоновано умови ідентифікації метформіну інструментальними методами в метанольному елюаті, який одержаний з вилученого з місця адсорбції досліджуваної речовини тонкого шару сорбенту з непроявленої зони хроматографічної пластинки після елюювання. Одержані спектральні (УФ-, ІЧ- та ПМР-методами) та хроматографічні (ВЕРХ) характеристики проб елюату були відповідними характеристикам метформіну основи (див. рис. 1-4).

Четвертий розділ роботи присвячений розробці та валідації методик кількісного визначення метформіну в модельних розчинах інструментальними методами. При розробці методики кількісного визначення метформіну методом спектрофотометрії як прилад використовували спектрофотометр СФ-46 ЛОМО. Спектри досліджуваних розчинів препарату вимірювали за довжини хвилі 232±2 нм у кюветах завтовшки 10 мм. Для побудови градуювального графіку використовували водні розчини метформіну. Лінійна залежність градуювального графіку при визначенні спостерігалась в межах 1,0-32,5 мкг/мл (рис. 5).

С, мкг/мл

Рис. 5. Графік градуювальної залежності оптичної густини випробуваного розчину метформіну від концентрації

Метрологічні характеристики розробленої методики наведено у табл. 2.

Таблиця 2 Метрологічні характеристики методики кількісного визначення метформіну методом спектрофотометрії

r	b	a	S2	S	Дb	Дa
0,9996	0,028±0,004	0,11	1,42*10-9	3,77*10-5	3,67*10-4	5,57*10-3

За результатами кількісного визначення метформіну у випробуваних розчинах відносна невизначенність середнього результату не перевищувала ± 4,18 %, RSD - 3,98 %. За дослідженими валідаційними характеристиками методику визначено коректною, оскільки в діапазоні токсичних концентрацій препарату 0,025-0,175 г/л доведено її специфічність та лінійність (r=0,9963). Межа виявлення метформіну за даних умов становила 0,01 мкг/мл, межа кількісного визначення - 0,02 мкг/мл.

При розробці методик кількісного визначення метформіну методом ВЕРХ використовували умови: оберненофазна колонка ProntoSIL (Німеччина) Ш2 Ч 75 мм; елюент А - [0,2 М LiClO₄ - 0,005 M HClO₄] - H₂O (5:95); елюент Б - ацетонітрил; лінійний градієнт 2 %-100 % ацетонітрил - 40 хв, 100 % ацетонітрилу - 3 хв; швидкість потоку - 100 мкл/хв; температура колонки 40°С, максимальний тиск 4,0 МПа. Об'єм проби інжектора - 4,0 мкл.

Лінійна залежність градуювального графіку при визначенні спостерігалась в межах 1,0-400,0 мкг/мл (рис. 6).

За результатами кількісного визначення метформіну у випробуваних метанольних розчинах відносна невизначеність середнього результату не перевищувала ±2,34 %, RSD - 2,23 %.

За дослідженими валідаційними характеристиками методику визначено коректною, оскільки в діапазоні токсичних концентрацій препарату 0,025-0,175 г/л доведено її специфічність та лінійність (r=0,9997). Межа виявлення метформіну за даних умов становила 0,005 мкг/мл, межа кількісного визначення - 0,01 мкг/мл.

С, мкг/мл

Рис. 6. Графік градуювальної залежності площі піку від концентрації метформіну

Метрологічні характеристики розробленої методики наведено в табл. 3.

Таблиця 3. Метрологічні характеристики методики кількісного визначення метформіну методом ВЕРХ

r	b	a	S2	S	Дb	Дa
0,9999	0,0025	1,03*10-3	1,5*10-10	1,22*10-5	1,25*10-5	2,35*10-3

Розроблено умови кількісного визначення метформіну методом екстракційної фотометрії: реагенти - бромтимоловий синій, тетрабутиламонію гідроксид в метанолі, екстрагент - метиленхлорид. Лінійна залежність градуювального графіку при кількісному визначенні спостерігалась в межах 10,0-100,0 мкг/мл (рис. 7).

За результатами кількісного визначення метформіну у випробуваних розчинах відносна невизначеність середнього результату не перевищувала ±2,34 %, RSD - 2,23 %.

Розроблені методики опрацьовані при кількісному визначенні метформіну в екстрактах з біологічних об'єктів. За одержаними результатами їх визначено придатними для цілей ХТА.

С, мкг/мл

Рис. 7. Графік градуювальної залежності оптичної густини випробуваного розчину метформіну від концентрації

Метрологічні характеристики розробленої методики наведено в табл. 4.

Таблиця 4 Метрологічні характеристики методики кількісного визначення метформіну методом екстракційної фотометрії

r	b	a	S2	S	Дb	Дa
0,9961	0,0091	0,088	4,68*10-7	6,84*10-4	3,97*10-4	2,57*10-2

У п'ятому розділі роботи наведено результати за розробкою методик ізолювання метформіну з біологічних об'єктів, дослідженням розподілу метформіну в органах отруєних препаратом лабораторних тварин та вивченням динаміки змін кількісного вмісту метформіну в біологічному матеріалі при зберіганні.

Досліджено залежність ефективності вилучення метформіну з водних розчинів від органічного розчинника, рН середовища та присутності електроліту. Встановлено, що найбільш придатним розчинником є суміш ізопентанол-бутанол (1:1), яка забезпечує вилучення досліджуваної речовини на рівні 75 %, при рН 13, у присутності 25 % натрію хлориду. Одержані результати стали основою для розробки методик ізолювання метформіну з біологічних об'єктів.

Спираючись на дані джерел (Р. Г. Мансурова, М. В. Кубасова, З. А. Газизова, 2010 г.), нами проведені дослідження за ізолюванням метформіну з модельного зразка печінки загальними методами: підкисленою водою та підкисленим етанолом.

Позитивних результатів було досягнуто тільки при подальшому дослідженні водного вилучення, вільного від токсикантів кислого та лужного характеру. Як екстрагент використовували суміш ізопентанол-бутанол (1:1). Метформін екстрагували при рН 13, у присутності 25 % NaCl, з подальшим очищенням сухого екстракту методом ТШХ (елюент 90 % метанол). За таких умов при ізолюванні підкисленою водою із тканин печінки виділено 65-68 % метформіну. В залежності від методу кількісного визначення RSD становило від 5,2 до 6,9 %. При ізолюванні підкисленим етанолом - виділено 46-47 % метформіну, RSD - від 5,7 до 6,6 %.

Розроблено індивідуальну методику ізолювання метформіну із тканин печінки водою, придатну при направленому ХТА. Для очищення водного вилучення від білків запропоновано амонію сульфат, а для очищення від співекстрактивних ліпофільних речовин суміш гексан-толуен (1:1), трикратне екстрагування. Очищений водний шар тричі екстрагували сумішшю ізопентанол-бутанол (1:1) при рН 13, у присутності 25 % NaCl, з подальшим очищенням сухого екстракту методом ТШХ, елюент - 90 % метанол. За розробленою методикою ізолюється 82-84 % метформіну. В залежності від методу кількісного визначення RSD становило від 4,08 до 5,35 %.

Саме такі умови були використані при розробці індивідуальних методик ізолювання метформіну з біологічних рідин. З донорської сечі виділено 70-74 % метформіну. В залежності від методу кількісного визначення RSD становило від 5,08 до 6,80 %. З донорської крові виділено 51-56 % метформіну, RSD становило від 4,50 до 6,70 %.

Для підвищення ефективності вилучення метформіну з сечі здійснено дериватизацію його молекули шляхом ацетилювання аміногруп сумішшю ацетилхлорид-кислота ацетатна льодяна (1:1), з відповідним одержанням триацетил-1,1-диметилбігуаніду (триацетилметформіну) формули:

За фізико-хімічними властивостями триацетилметформін, на відміну від метформіну, не розчинний у воді та розчинний в органічних розчинниках (хлороформ, метиленхлорид та діетиловий ефір). Хімічну будову доведено методами УФ- та ПМР-спектроскопії (рис. 8 та 9), а чистоту - визначено методом ВЕРХ (рис. 10).

Визначені спектральні та хроматографічні характеристики запропоновано для ідентифікації триацетилметформіну в екстрактах з біологічних рідин (сеча).

Досліджено хроматографічну рухливість триацетилметформіну в тонкому шарі сорбенту. Визначені умови для виявлення даної речовини в екстрактах з біологічних рідин (сеча) та очищення одержаних вилучень від біогенних домішок: пластинки Merck Silicagel 60 F 254 та Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ, система метанол-бутанол (60:40), Rf 0,73 та 0,68, відповідно, елюент - метанол.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8. УФ-спектри триацетилметформіну: 1 - в МеОН (217±2 нм, 227±2 нм та 270±2 нм); 2 - в NaOH (218±2 нм та 270±2 нм)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. ПМР-спектр триацетилметформіну, д, м.ч.: 1.85 (c, 3H)2.20 (c, 6H)3.05 (c, 6H)10.05 (c, 1H)11.95 (уш. с, 1Н)

Рис. 10. Хроматограма триацетилметформіну (л = 220 нм, МеОН, час утрим. 8,3 хв.)

При розробці методики кількісного визначення триацетилметформіну методом ВЕРХ були використані саме такі ж умови, як для метформіну. Метрологічні характеристики розробленої методики наведено в табл. 5.

Таблиця 5 Метрологічні характеристики методики кількісного визначення триацетилметформіну методом ВЕРХ

r	b	a	S2	S	Дb	Дa
0,9998	0,022	-0,8	9,54*10-9	9,77*10-5	1,74*10-4	1,39*10-2

Досліджено залежність ефективності вилучення триацетилметформіну з водного розчину метформіну після дериватизиції від природи органічного розчинника та рН середовища. Встановлено, що метиленхлоридом та хлороформом при рН 9 екстрагується до 92 % речовини. Одержані результати використано при розробці методик ізолювання метформіну із сечі у вигляді деривату. Для очищення біологічної рідини від білків запропоновано амонію сульфат, а для очищення від ліпофільних речовин - суміш гексан-толуен (1:1). Одержаний сухий екстракт додатково очищували методом ТШХ (елюент - метанол). Результати ізолювання метформіну наведено в табл. 6.

Таблиця 6 Метрологічні характеристики деривативного ізолювання метформіну із сечі

, мкг	S			е	RSD, %
85,05	6,29	0,033	7,82	20,57	7,4

Для кількісного визначення триацетилметформіну, який виділений з сечі, використовували розроблену ВЕРХ-методику. Одержані результати свідчать про збільшення практичного виходу речовини на 11 %. Дану методику нами включено до розробленої схеми направленого ХТА біологічних об'єктів при отруєнні метформіном.

Досліджено розподіл метформіну в органах отруєних препаратом лабораторних тварин (щури) через 24 год після внутрішлункового введення в дозі у 5 разів вищої за його LD₅₀ (5000 мг/кг маси тіла тварини). За одержаними результатами визначені оптимальні для проведення хіміко-токсикологічних досліджень біологічні об'єкти: печінка, нирки, кров та сеча (рис. 11).

Рис. 11. Дослідження розподілу метформіну в органах отруєних препаратом лабораторних тварин

Встановлено термін зберігання метформіну в тканинах печінки. Через 25 діб даний орган визначено непридатним для хіміко-токсикологічних досліджень метформіну (Рис. 12).

На підставі одержаних результатів запропоновано схему направленого ХТА біологічних об'єктів на вміст метформіну (рис. 13).



Рис. 12. Дослідження зберігання метформіну в тканинах печінки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та експериментальне вирішення наукової задачі, що виявляється у проведенні систематичного хіміко-токсикологічного дослідження метформіну з відповідною розробкою ефективних методик його ізолювання з біологічних об'єктів, способів очищення одержаних вилучень від домішок різної природи, чутливих та специфічних методик виявлення та кількісного визначення метформіну в діапазоні токсичних концентрацій.

1. На підставі аналізу джерел літератури стосовно токсикологічних властивостей метформіну, випадків та обставин отруєнь препаратом, сформульовані фактори токсикологічної небезпеки антидіабетичних засобів та обґрунтовано доцільність проведення систематичного хіміко-токсикологічного дослідження метформіну.

2. Розроблено умови одержання основи метформіну та триацетилметформіну, як маркерів отруєння препаратом. Досліджено їх фізико-хімічні властивості, хроматографічні (методами ТШХ та ВЕРХ) та спектральні (УФ-, ІЧ- та ПМР-методами) характеристики.

3. Розроблено чутливі та специфічні умови виявлення та ідентифікації метформіну хімічним реагентами in vitro, в тонкому шарі сорбенту та методами ВЕРХ, УФ-, ІЧ- та ПМР-спектроскопії.

4. Розроблено та валідовано методики кількісного визначення метформіну в модельних розчинах інструментальними методами аналізу: спектрофотометрії, ВЕРХ та екстракційної фотометрії. За валідаційними характеристиками доведено коректність їх застосування в діапазоні токсичних концентрацій метформіну 0,025-0,175 г/л. Розроблені методики опрацьовано при кількісному визначенні метформіну в екстрактах з біологічних об'єктів (печінка, кров та сеча).

5. Досліджено вплив природи органічного розчинника, рН середовища та присутності електроліту на ефективність екстракції метформіну та триацетилметформіну з водних розчинів. За одержаними результатами розроблено індивідуальні методики ізолювання метформіну із тканин печінки, сечі та крові. Запропоновано способи очищення одержаних вилучень від білків та співекстрактивних ліпофільних речовин.

6. Досліджено розподіл метформіну в органах отруєних препаратом тварин та динаміку змін кількісного вмісту метформіну в біологічному матеріалі при зберіганні. За одержаними результатами визначено оптимальні біологічні об'єкти: печінка, нирки, кров та сеча, а також термін зберігання біологічного матеріалу (до 25 діб, печінка), доцільного для проведення хіміко-токсикологічних досліджень на метформін.

7. Розроблено схему направленого ХТА біологічних об'єктів на метформін. Результати досліджень впроваджено у науково-дослідницьку діяльність кафедр ряду ВНЗ України та Казахстану.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Мерзлікін С. І. Інформаційний огляд щодо обґрунтування хіміко-токсикологічного дослідження на метформін // С. І. Мерзлікін, В. Ю. Москаленко // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2010. - № 1-2 (14-15). - С. 3-10. (Особистий внесок - пошук джерел літератури, аналіз та узагальнення одержаних даних, підготовка статті).

2. Москаленко В. Ю. Розробка умов рідинної хроматографії для хіміко-токсикологічного аналізу метформіну / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Запорожский медицинский журнал. - 2011. - Т. 13, № 3. - С. 86-88. (Особистий внесок - проведення експериментальних досліджень, аналіз, статистична обробка та узагальнення результатів, підготовка статті).

3. Москаленко В. Ю. Дослідження хроматографічної поведінки метформіну в умовах загального ТШХ-скринінгу лікарських речовин / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Фармацевтичний часопис. - 2013. - № 4 (29). - С. 58-62. (Особистий внесок - проведення хроматографічних досліджень, аналіз, статистична обробка та узагальнення одержаних результатів, підготовка статті).

4. Москаленко В. Ю. Разработка и стандартизация методов обнаружения метформина для судебно-токсикологических исследований / В. Ю. Москаленко, С. И. Мерзликин // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. - 2013. - № 25 (168), выпуск 24/1. - С. 126-130. (Особистий внесок - розробка та стандартизація методів виявлення метформіну, підготовка статті).

5. Москаленко В. Ю. Ізолювання метформіну з біологічних об'єктів / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Український біофармацевтичний журнал. - 2013. - № 6 (29). - С. 70-74. (Особистий внесок - розробка умов ізолювання метформіну та методів кількісного визначення препарату).

6. Москаленко В. Ю. Розробка та стандартизація умов аналітичної діагностики гострих отруєнь метформіном / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Управління, економіка та забезпечення якості в фармації. - 2013. - № 6 (32). - С. 15-20. (Особистий внесок - синтез деривату метформіну, проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення одержаних даних, підготовка статті).

7. Москаленко В. Ю. Аналіз випадків отруєнь / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Сучасні проблеми судово-токсикологічної науки і практики: Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю (9-10 квітня 2009 р, м. Харків). - Харків: Вид-во НФаУ, 2009. - С. 55-57.

8. Москаленко В. Ю. Обґрунтування доцільності хіміко-токсикологічного дослідження метформіну / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (23-24 квітня 2009 року). - Харків: Вид-во НФаУ, 2009. - С. 111.

9. Москаленко В. Ю. Аналіз випадків отруєнь антидіабетичними засобами / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Матеріали доповідей Всеукраїнської науково-практичної конференції з міжнародною участю «Впровадження сучасних наукових досягнень в судову експертизу» (10-11 вересня 2009 р., м. Харків). - Харків: ТОВ «Оберіг», 2009. - С. 304-305.

10. Москаленко В. Ю. Причини та наслідки отруєння метформіном / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: Матеріали доповідей Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (21-22 квітня 2010 р., м. Харків). - Харків: Вид-во НФаУ, 2010. - С. 129.

11. Москаленко В. Ю. Реакції виявлення метформіну у хіміко-токсикологічному дослідженні / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Актуальні проблеми транспортної медицини: навколишнє середовище; професійне здоров'я; патологія. - 2010. - додаток до № 3 (21). - С. 100.

12. Мерзлікін С. І. Розробка умов екстракційного концентрування основи метформіну / С. І. Мерзлікін, В. Ю. Москаленко // Фармація України. Погляд у майбутнє: Матеріали VII Національного з'їзду фармацевтів України (15-17 вересня 2010 р., м. Харків). - Харків: Вид-во НФаУ, 2010, в 2 томах. - Т. 1. - C. 166.

13. Мерзлікін С. І. Інформаційний огляд щодо виявлення випадків та причин отруєнь метформіном / С. І. Мерзлікін, В. Ю. Москаленко, І. О. Журавель // Актуальні проблеми профілактичної медицини: Збірник наукових праць конференції, присвяченій 95 річчю від Дня народження проф. В.П. Крамаренка (травень), вип. 9-й. - Львів, 2011. - С. 164-175.

14. Москаленко В. Ю. Розробка методик аналітичної діагностики отруєнь метформіном / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін, І. О. Журавель // Сучасні проблеми токсикології: Матеріали ІІІ з'їзду токсикологів України «Сучасні проблеми токсикології. Безпека їжі та середовища життєдіяльності людини» (18-19 грудня 2011 р., м. Київ). - Київ: ІВО «Медицина України». - С. 149.

15. Москаленко В. Ю. Розробка умов виявлення метформіну, прийнятних для аналітичної діагностики отруєння / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін, І.О. Журавель // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: матер. Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених (19-20 квітня 2012 р.). - Х.: НФаУ, 2012. - С. 155.

16. Москаленко В. Ю. Розробка та валідація умов виявлення метформіну методом тонкошарової хроматографії / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Матеріали VI науково-практичної конференції з міжнародною участю «Управління якістю в фармації» (12 жовтня 2012 р.). - Х.: НФаУ, 2012. - С.110.

17. Москаленко В. Ю. Розробка та стандартизація методик аналітичної діагностики отруєнь метформіном / В. Ю. Москаленко, С. І. Мерзлікін // Матеріали Української науково-практичної конференції, присвяченої 100-річчю з дня народження доктора хімічних наук, проф. П. О. Петюніна (24-25 квітня 2014 р.). - Х.: НФаУ, 2014. - С. 95.

Размещено на Allbest.ru

...