Роль біологічно активних речовин яглиці звичайної (Aegopodium Podagraria L.) у нефропротекторній, гепатопротекторній та гіпоурикемічній дії

Размещено на http://www.allbest.ru/

РОЛЬ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН ЯГЛИЦІ ЗВИЧАЙНОЇ (AEGOPODIUM PODAGRARIA L.) У НЕФРОПРОТЕКТОРНІЙ, ГЕПАТОПРОТЕКТОРНІЙ ТА ГІПОУРИКЕМІЧНІЙ ДІЇ

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

КОЙРО ОЛЬГА ОЛЕГІВНА

Харків - 2013

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакології Національного фармацевтичного університету МОЗ України, м. Харків

Захист дисертації відбудеться “____”____________ 2014 р. о _____ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.03 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий “____” _____________2013 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради

д. фарм. н., професор Т. С. Сахарова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Препарати, які виявляють нефро-, гепатопротекторну та гіпоурикемічну дію, застосовуються при захворюваннях сечовидільної, серцево-судинної, травної систем, метаболічних порушеннях. Поширеність подагри становить 0,4% дорослого населення, «безсимптомної» гіперурикемії - до 20% (В. В. Поворознюк, Г. С. Дубецкая, 2012). Остання є фактором ризику розвитку подагри, захворювань нирок, серцево-судинної, гепатобіліарної систем (J. S. Cameron, 2006). Асортимент препаратів із доведеною ефективністю для корекції гіперурикемії обмежений: урикозуричні засоби на фармацевтичному ринку України відсутні, гіпоурикемічні представлені лише алопуринолом.

Важливою проблемою також є захворювання печінки інфекційної, автоімунної етіології або пов?язані з впливом токсинів (В. Н. Козько и соавт., 2010). Зокрема, гепаторенальний сидром зустрічається у 20% пацієнтів із декомпенсованим цирозом печінки та є несприятливою прогностичною ознакою перебігу патологічного процесу (В. І. Русин та співавт., 2010). У 55% пацієнтів на тлі гострої печінкової недостатності прогресує ниркова недостатність (S. J. Munoz, 2008). Гостра ниркова недостатність (ГНН) є частим ускладненням у шпиталізованих пацієнтів та залежно від тяжкості викликає смерть у 7-80% випадків або прогресування та хронізацію захворювання (S. S. Waikar et al., 2008) із появою ускладнень з боку серцево-судинної системи, когнітивними розладами, анемією, порушенням мінерального обміну. Поширеність хронічної хвороби нирок становить 8-16% (V. Jha et al., 2013). Порушення кровобігу при хірургічних втручаннях, тромбозі, атеросклерозі, шокових станах різної етіології також може спричиняти ішемічне ушкодження печінки та нирок (И. Е. Тареева и соавт., 2000; H. Jaeschke, B. L. Woolbright, 2012). Часто виникає проблема корекції гепато- та нефротоксичної дії ліків (R. D. Beger et al., 2010).

Важливим шляхом удосконалення терапії зазначених хвороб є створення препаратів із політропною дією. Перспективним джерелом пошуку таких препаратів є лікарські рослини, які згідно усталеним поглядам відрізняються багатогранною дією та високою безпечністю (В. П. Попович та співавт., 2012). Кількість рослинних гепатопротекторів із доведеною ефективністю обмежена переважно імпортними препаратами розторопші плямистої. Представники нечітко окресленої групи нефропротекторів на фармацевтичному ринку майже відсутні, а інформація щодо нефропротекторної активності окремих препаратів фрагментарна та не завжди доведена (М. Л. Аряєв та співавт., 2012).

Перспективним об'єктом є яглиця звичайна (ЯЗ; Aegopodium podagraria L.) родини селерових, яка має значну сировинну базу в Україні та швидко її поновлює (М. М. Діденко та співавт., 2005). У народній медицині ЯЗ застосовується при подагрі, ревматизмі, хворобах нирок та сечового міхура, травного тракту (А. М. Гродзинський та співавт., 1990). Сировина ЯЗ багата на фенольні сполуки (флавоноїди, гідроксикоричні кислоти, кумарини), вітаміни, мінеральні речовини, поліацетиленові сполуки (О. О. Койро та співавт., 2010; В. А. Агеев, 2013). Відома протизапальна, нефропротекторна, гіпоурикемічна, гіпоглікемічна, антимікробна дія препаратів ЯЗ (О. В. Товчига, 2009, 2012; T. Ojala et al., 2000; R. M. Prior et al., 2007). Проте її вплив на патологію печінки, пуриновий обмін, у т. ч. на активність ксантиноксидази (КО) та роль окремих біологічно активних речовин (БАР) у нефро-, гепатопротекторній та гіпоурикемічній дії дотепер невивчені.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету в рамках теми «Фармакологічне дослідження біологічно активних речовин та лікарських засобів синтетичного та рослинного походження та їх застосування в медичній практиці», державний реєстраційний номер 0103 U 000478. Дисертант є співвиконавцем зазначеної теми.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - експериментально обґрунтувати можливість використання окремих біологічно активних речовин та фармакологічних препаратів яглиці звичайної як засобів із нефропротекторною, гепатопротекторною та гіпоурикемічною активністю, порівняти їхню ефективність і встановити механізми дії.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Одержати БАР та сумарні фармакологічні препарати яглиці звичайної.

2. Охарактеризувати нефропротекторну дію БАР та фармакологічних препаратів яглиці звичайної на моделі етиленгліколевої інтоксикації, поглиблено вивчити ефективність препаратів-лідерів за умов ішемічної гострої ниркової недостатності.

3. Провести скринінг гепатопротекторних властивостей БАР та фармакологічних препаратів яглиці звичайної на моделі тетрахлорметанового гепатиту та виявити найактивніші субстанції для подальшого вивчення.

4. Оцінити гепатопротекторну дію препаратів-лідерів на моделі ушкодження печінки, спричиненого ішемією/реперфузією, дослідити її біохімічні механізми: вплив на стан антиоксидантної системи та процеси пероксидного окиснення ліпідів, глікоген- та білоксинтезувальну функцію печінки, вміст цитокінових медіаторів.

5. Охарактеризувати вплив препаратів-лідерів на гістоструктуру печінки та нирок за ішемії/реперфузії.

6. Вивчити вплив БАР та фармакологічних препаратів яглиці звичайної на обмін сечової кислоти в інтактних тварин та за умов експериментальної гіперурикемії.

7. Оцінити роль окремих БАР у фармакологічній активності сумарних фармакологічних препаратів яглиці звичайної.

Об'єкт дослідження. Фармакологічна корекція ушкоджень нирок, печінки та порушень обміну сечової кислоти.

Предмет дослідження. Нефропротекторна, гепатопротекторна та гіпоурикемічна дія біологічно активних речовин та фармакологічних препаратів яглиці звичайної.

Методи дослідження. Фітохімічні, фармакологічні, патофізіологічні, біохімічні, гістологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше з використанням стандартних методик отримано БАР (білково-полісахаридний комплекс (БПСК) та ліпофільну фракцію листя, ефірну олію квіток, флавоноїд трифолін), настойки та сухі екстракти кореневищ, листя, квіток ЯЗ та порівняти їхню нефро- та гепатопротекторну активність на моделях токсичного та ішемічного ушкодження нирок і печінки. Встановлено, що найактивнішими за нефропротекторною активністю є трифолін, БПСК листя та сухий екстракт кореневищ ЯЗ, які не поступаються за ефективністю сухому екстракту листя ЯЗ та перевершують «Хофітол». З'ясовано, що найбільш виразна гепатопротекторна активність притаманна трифоліну, БПСК та сухому екстракту листя ЯЗ. Вперше визначено вплив БАР та фармакологічних препаратів кореневищ, листя та квіток ЯЗ на обмін сечової кислоти (СК) в нормі та за оксонат-індукованої гіперурикемії, доведено, що їхня гіпоурикемічна дія реалізується за рахунок інгібування ксантиноксидази та збільшення ниркової екскреції СК. Доведено значну роль БПСК та трифоліну в реалізації фармакологічних ефектів ЯЗ, про що свідчить їхня потужна урикодепресивна та органопротекторна дія.

За результатами дослідження отримано патент України на корисну модель «Застосування екстракту з листя яглиці звичайної як лікувально-профілактичного засобу з гепатопротекторною дією» № 63764 від 25.10.2011 р.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати обґрунтовують доцільність створення препаратів із метаболічною та органопротекторною дією на основі сировини ЯЗ, оскільки їй притаманні потужні гіпоурикемічні, нефро- та гепатопротекторні властивості. За результатами роботи видано інформаційний лист про нововведення в сфері охорони здоров'я «Використання екстракту листя яглиці звичайної для розробки лікарського засобу гепатопротекторної дії» № 437-2012 (2013 р.). Фрагменти роботи впроваджено в

науково-педагогічний процес кафедри експериментальної та клінічної фармакології ВДНЗУ «Українська медична стоматологічна академія» (м. Полтава), кафедри фармакології Вінницького національного медичного університету

ім. М. І. Пирогова (м. Вінниця), кафедри фармакології Національного фармацевтичного університету (м. Харків).

Сухий екстракт листя ЯЗ, який виявив високу активність на усіх використаних моделях патологічних станів, планується до впровадження у виробництво як нефропротекторний та гіпоурикемічний засіб на ТОВ «Харківська фармацевтична фабрика», м. Харків (акт впровадження № 77 від 20.09.2013 р.).

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто провів інформаційно-патентний пошук, проаналізував літературу за темою роботи, разом із науковим керівником визначив мету та задачі, обрав методи дослідження. Власноруч отримав БАР, препарати ЯЗ та стандартизував їх під керівництвом к. фарм. н., доц. С. І. Степанової. Самостійно виконав усі серії експериментів. Морфологічні дослідження проведено за консультативної допомоги начальника Чернігівського обласного патологоанатомічного бюро В. О. Синиці, імуноферментні - за допомоги д. біол. н., доц. Т. В. Горбач (ХНМУ). Дисертант самостійно обробив результати статистично, проаналізував їх та підготував публікації до друку.

Апробація результатів дисертації відбулася на XXVI науково-практичній конференції «Ліки - людині» (м. Харків, 2009 р.); 3-ій Міжнародній науковій конференції «Экспериментальная и клиническая фармакология» (м. Мінськ, 2009 р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення лікарських засобів» (м. Харків, 2011, 2012 рр.); Науково-практичній конференції «Фармакологія, фізіологія і патологія нирок» (м. Чернівці, 2012 р.); Міжнародній науковій конференції «Физиология и патология почек и водно-солевого обмена» (м. Владикавказ, 2012 р.); Національному конгресі «Клінічна фармація: 20 років в Україні» (м. Харків, 2013 р.); XX International Scientific and Practical Conference of young scientists and students «Actual questions of development of new drugs» (м. Харків, 2013 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 статей, серед яких 6 у фахових наукових журналах, рекомендованих МОН України, 1 - у закордонному виданні; 1 деклараційний патент України на корисну модель, 1 інформаційний лист, 7 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація містить вступ, огляд літератури, опис матеріалів та методів дослідження, 3 розділи власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів, висновки та перелік використаних джерел, серед яких 112 із кириличною графікою, 286 - із латинською. Роботу викладено на 188 сторінках друкованого тексту (без додатків), враховуючи 36 рисунків, 28 таблиць.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

яглиця звичайний препарат фармакологічний

Матеріали та методи дослідження. Досліджували сухі екстракти (далі - екстракти) та настойки (екстрагент - 70% спирт) кореневищ, листя та квіток ЯЗ, окремі групи БАР, а саме БПСК та ліпофільну фракцію листя, ефірну олію квіток ЯЗ, флавоноїд 3-О-в-D-галактопіранозид кемпферолу (трифолін), отримані особисто автором. Препарати порівняння: «Силібор-35» у дозах 200 мг/кг та 1 г/кг (ТОВ «Фармацевтична компанія «Здоров'я», Україна), «Хофітол» у дозі 5 мл/кг (Laboratories Rosa-Phytopharma, Франція), «Корвітин» у дозах 10 та 50 мг/кг (ЗАТ НВЦ «Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод», Україна), фуросемід (Авентіс Фарма Лімітед, Індія), алопуринол (Sandoz, Швейцарія). Дози обрано на підставі даних літератури (Р. У. Хабриев и соавт., 2005; C. G. Huang et al., 2008; О. В. Товчига, 2009; Д. С. Харченко та співавт., 2009).

Досліди виконано на 810 білих рандомбредних мишах обох статей масою 20-25 г та 218 білих рандомбредних щурах-самцях масою 170-190 г, яких утримували у віварії ЦНДЛ НФаУ, сертифікованому ДЕЦ МОЗ України (посвідчення № 21 від 30.04.2009 р.). Дотримувалися «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (Україна, 2001 р.), гармонізованих із «Європейською конвенцією про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985 р.). Дотримання зазначених вимог засвідчено висновком комісії НФаУ з біоетики (протокол № 3 від 20.03.2013).

Препарати-лідери за нефропротекторною активністю визначали на моделі етиленгліколевої ГНН (10 мл/кг підшкірно одноразово). Оцінювали виживаність протягом 14 днів. Скринінг гепатопротекторних властивостей виконували на моделі гострого тетрахлорметанового (ТХМ) гепатиту (50% олійний розчин, 10 мл/кг у шлунок одноразово). Лідери досліджували на моделі ішемії/реперфузії (І/Р) органів. Ішемічну ГНН відтворювали під етамінал-натрієвим наркозом, накладаючи кліпси на ниркові ніжки на 75 хв, І/Р печінки - під амітал-натрієвим наркозом, накладаючи кліпсу на судинну ніжку печінки з холедохом на 30 хв, із реперфузією 24 год. Гіперурикемію викликали внутрішньоочеревинним уведенням інгібітору урикази - калію оксонату (Aldrich, Німеччина) у дозі 250 мг/кг (Z. Yu et al., 2006). Через 1 год після ін'єкції визначали показники видільної функції нирок (ВФН) в умовах водного діурезу. За добу тварин декапітували та збирали кров на піці гіперурикемії - через 2 год після введення інгібітору урикази (S.-F. Mo et al., 2007).

У дослідах на інтактних мишах та щурах, а також при вивченні нефропротекторної активності за ішемічної ГНН у плазмі крові та сечі визначали креатинін за реакцією Яффе, сечовину - з діацетилмонооксимом, натрій та калій - методом фотометрії полум'я, білок у сечі - з сульфосаліциловою кислотою, у плазмі крові - з біуретовим реактивом. Розраховували швидкість клубочкової фільтрації (ШКФ), реабсорбцію води, натрію, екскрецію креатиніну, сечовини, білка, натрію та калію (Е. Б. Берхин, Ю. И. Иванов, 1972). При дослідженні гепатопротекторної дії в плазмі крові щурів вимірювали активність АлАТ та АсАТ за Райтманом-Френкелем, лужної фосфатази, вміст холестеролу - ферментативним методом, креатиніну - за реакцією Яффе, сечовини - з діацетилмонооксимом, глюкози - глюкозооксидазним методом, церулоплазміну (ЦП) - за методом Равіна з використанням наборів реактивів виробництва НВП «Філісіт-Діагностика» (Україна), загального білка - за методом Лоурі (O. H. Lowry, 1951). Досліджували вміст глікогену в печінці (М. И. Прохорова и соавт., 1982). У плазмі крові, гомогенатах печінки та нирок визначали вміст ТБК-позитивних речовин (И. Д. Стальная, Т. Г. Гаришвили, 1977); у печінці та нирках - активність каталази (М. А. Королюк и соавт., 1988), супероксиддисмутази (СОД) (Т. В. Сирота, 1999), загальний вміст SH-груп та вміст SH-груп низько- та високомолекулярних сполук (С. Е. Северин, Г. А. Соловьева, 1989). Визначали активність сорбітолдегідрогенази, вміст у плазмі крові молекул середньої маси (МСМ), ІL-4, ІL-1б, TNF-б, розчинного Fas-ліганду та 8-ізопростану з використанням наборів реактивів «Bender Medsystems», «US Biological» (США). Розраховували коефіцієнт де Рітіса (Камышников В. С., 2009) та співвідношення між цитокінами з проти- та прозапальною активністю (В.М. Кононов, 2010). Гістологічно нирки та печінку вивчали методом світлової мікроскопії (забарвлення гематоксиліном та еозином, мікроскоп «Гранум Р60-Люкс», об'єктив Ч10, Ч40, окуляр EW10X/22). СК визначали в плазмі крові уриказним методом, у сечі, печінці та нирках - із фосфорно-вольфрамовим реактивом (набори реактивів виробництва НВП «Філісіт-Діагностика» та ТОВ «СпайнЛаб», Україна), розраховуючи її екскрецію, а активність КО - за утворенням із ксантину 1 мкмоль СК за 1 хв на 1 г білка за методом (X. B. Chen et al., 1996). Використовували колориметр-нефелометр КФК-2МП, спектрофотометр СФ-26, імуноферментний аналізатор FaxStart (CША), аналізатор рідин ПАЖ-3.

Результати обробляли за допомогою програми Statistica 6.0 за критерієм

t Ст'юдента у випадку нормального розподілу, за критерієм U Mанна-Уітні - за його відсутності. Внутрішньогрупові відмінності аналізували за парним критерієм TЮ Вілкоксона, альтернативні (виживаність, наявність/відсутність певної ознаки) - за кутовим перетворенням Фішера ц, зв'язок між показниками - за коефіцієнтом кореляції Спірмена с, визначали коефіцієнт варіації (С. Гланц, 1998).

Результати та їх обговорення. Роль біологічно активних речовин яглиці звичайної у реалізації нефропротекторної активності її сумарних препаратів. Фармакологічні препарати ЯЗ виявляють складний вплив на ВФН у інтактних мишей. Його виразність зменшується при тривалому застосуванні, ймовірно, за рахунок контррегуляторних механізмів. Ренальні ефекти препаратів залежать від хімічного складу, обумовленого вибором різних екстрагентів.

На скринінговій моделі етиленгліколевої нефропатії високу ефективність виявляють екстракт листя ЯЗ (1 г/кг), екстракт кореневищ ЯЗ (1 г/кг), трифолін (50 мг/кг) та БПСК (200 мг/кг), які попереджують ранню летальність та підвищують загальну виживаність мишей (рис. 1), перевершуючи за ефективністю «Корвітин» (10 та 50 мг/кг) та не поступаючись «Силібору» (200 мг/кг та 1 г/кг). За ішемічної ГНН екстракт листя (1 г/кг), кореневищ ЯЗ (1 г/кг),

трифолін (50 мг/кг) та БПСК (200 мг/кг) зменшують летальність, перевершуючи «Хофітол» (5 мл/кг), попереджують анурію та прогресування азотемії, знижують протеїнурію, нормалізують парціальні функції нирок (рис. 2). Про збереження концентраційної функції нирок свідчить типова від'ємна кореляція між діурезом та вмістом креатиніну в сечі с = -0,83 (p < 0,05), с = -0,94 (p < 0,05),

с = -0,83 (p < 0,05) на тлі екстракту листя, кореневищ та БПСК відповідно проти с = -0,76 (p < 0,05) у інтактних тварин. Трифолін, як і «Хофітол», знижує виразність поліурії, проте кореляція між цими показниками не сягає значущого рівня (с = -0,50; p > 0,05 та с = -0,77; p > 0,05). У групі модельної патології (МП) коефіцієнт кореляції становить лише с = -0,36 (p > 0,05), що означає порушення механізмів концентрування сечі. Незважаючи на значний вміст калію в екстракті кореневищ та екстракті листя ЯЗ, вони не підвищують ризик гіперкаліємії, забезпечуючи адекватний калійурез. Вплив на протеїнурію є невід'ємною ланкою нефропротекторної терапії (А. В. Смирнов и соавт., 2008). Саме тому виразне зниження як екскреції, так і концентрації білка в сечі за обох режимів функціонування нирок свідчить на користь антипротеїнуричної дії препаратів ЯЗ.

За ішемічної ГНН препарати та БАР ЯЗ нормалізують гістоструктуру нирок: відсутні виразні зміни нефротелію, зменшується білкова інфільтрація просвіту канальців, що узгоджується зі збереженням реабсорбції та зниженням протеїнурії. Менша антипротеїнурична дія екстракту кореневищ ЯЗ на 2-3 добу ГНН порівняно з першою добою корелює з морфологічними ознаками (зерниста дистрофія нефротелію з атрофією епітелію окремих канальців та наявність білкового інфільтрату в останніх можуть бути наслідком дисбалансу між фільтраційною здатністю клубочків та функціональною спроможністю канальців, коли кількість профільтрованого білка перевершує здатність ушкоджених канальців до реабсорбції). Проте для цього висновку необхідні дослідження у віддалені терміни ГНН. БАР та фармакологічні препарати ЯЗ, як і «Хофітол» (5 мл/кг), попереджують некроз та некробіоз гепатоцитів. Покращання гістоструктури печінки за ішемічної ГНН свідчить про її захист від гемодинамічних порушень.

Сприятливий вплив трифоліну та БПСК на перебіг ішемічної ГНН вказує на їх важливу роль у реалізації нефропротекторної дії екстракту листя ЯЗ.

Гепатопротекторна дія препаратів яглиці звичайної та провідні групи біологічно активних речовин, що її забезпечують. На моделі гострого ТХМ-індукованого гепатиту інтегральним показником ефективності більшості препаратів ЯЗ є значуще зниження летальності. Проте, виходячи з активності трансаміназ, стримують цитоліз лише препарати листя: настойка (1 та 5 мл/кг), екстракт (200 мг/кг та 1 г/кг), БПСК (200 мг/кг) та трифолін (50 мг/кг). Екстракт листя не поступається «Силібору» в дозі 200 мг/кг, а настойка, трифолін та БПСК навіть перевершують його. На тлі кожного з них виживаність складає 100% проти 66,7% у групі МП (p < 0,05). Достовірно знижується ферментемія: активність АлАТ становить 2,38 ± 0,14 ммоль/(год•л) та 2,20 ± 0,11 ммоль/(год•л) у групі настойки (1 та 5 мл/кг); 3,61 ± 0,14 ммоль/(год•л) та 3,84 ± 0,03 ммоль/(год•л) у групі екстракту (200 мг/кг та 1 г/кг); 2,29 ± 0,10 ммоль/(год•л) на тлі БПСК (200 мг/кг); 2,40 ± 0,15 ммоль/(год•л) на тлі трифоліну (50 мг/кг) проти 4,32 ± 0,06 ммоль/(год•л) у групі МП (p < 0,01), 3,17 ± 0,18 ммоль/(год•л) у групі «Силібору» (200 мг/кг) та 1,39 ± 0,26 ммоль/(год•л) у інтактних тварин. Вони не тільки ефективно знижують ферментемію, а й нормалізують коефіцієнт де Рітіса, що є сприятливою ознакою перебігу гепатиту та доводить їх гепатопротекторну дію. Достовірні відмінності вмісту загального білка в плазмі крові відсутні.

Гепатопротекторні властивості цих препаратів підтверджено за І/Р печінки. Екстракт (1 г/кг), БПСК (200 мг/кг) листя та трифолін (50 мг/кг) достовірно зменшують летальність (табл. 1). Настойка (5 мл/кг), екстракт (1 г/кг), БПСК

(200 мг/кг), трифолін (50 мг/кг), як і «Силібор» (200 мг/кг), стримують цитоліз та нормалізують коефіцієнт де Рітіса. Всі БАР та препарати ЯЗ сприятливо впливають на вуглеводневий обмін, зменшуючи глікемію. Тільки екстракт листя (1 г/кг) та трифолін (50 мг/кг), крім того, достовірно підвищують здатність печінки накопичувати глікоген, що свідчить про пом'якшення ішемії органу.

З огляду на провідну роль процесів вільнорадикального окиснення у патогенезі І/Р печінки (H. Jaeschke, 2012), цінним є позитивний вплив препаратів ЯЗ на стан пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) та антиоксидантної системи (АОС)

Таблиця 1

Порівняльна ефективність БАР, фармакологічних препаратів

листя яглиці звичайної та «Силібору» при ішемії/реперфузї печінки (n = 47)

Примітка. n - кількість спостережень; АлАТ - аланінамінотрансфераза, АсАТ - аспартатамінотрансфераза; достовірні відмінності: з групою контролю (псевдооперація) - ^* (p < 0,05), ^** (p < 0,01), ^*** (p<0,005); з групою модельної патології -

^# (p < 0,05), ^## (p < 0,01), ^## (p < 0,005); з групою «Силібору», 200 мг/кг - ^{^} (p < 0,05).за І/Р (табл. 2).

Порівняно з псевдооперованими тваринами у групі МП рівень ТБК-реактантів збільшується на 50,5% у плазмі (p < 0,005), на 183% - у печінці (p < 0,01) та на 27,3% - у нирках (p > 0,05). Про виснаження АОС свідчить і достовірне зниження активності каталази, СОД печінки та концентрації ЦП у плазмі крові. І/Р зменшує резерв тіолової частини АОС, тенденцію до падіння має переважно вміст SH-груп низькомолекулярних сполук (переважно відновленого глутатіону - на 83% (p < 0,005) та 50% (p > 0,05) у печінці та нирках відповідно). Про поліпшення стану АОС свідчить зростання активності каталази та СОД у печінці на тлі препаратів ЯЗ проти таких у групі МП, особливо в групі БПСК, де відмінності статистично значущі (p < 0,01). Лише у групі МП співвідношення між каталазою та СОД зсувається у бік останньої, що вказує на виразні порушення балансу ПОЛ-АОС. Вміст ТБК-реактантів у біосубстратах на тлі досліджуваних фармакологічних препаратів знижується у всіх групах порівняно з МП. Виразність міжгрупових відмінностей змінюється в ряді плазма крові > печінка > нирки. За впливом на рівень ТБК-реактантів у печінці настойка

Таблиця 2

Вплив біологічно активних речовин та фармакологічних препаратів яглиці звичайної на прооксидантно-антиоксидантний баланс у щурівіз ішемією/реперфузією печінки (n = 47)

Примітка. n - кількість спостережень; ЦП - церулоплазмін, СОД - супероксиддисмутаза, ТБК - тіобарбітурова кислота; достовірні відмінності: з групою контролю (псевдооперація) - ^* (p < 0,05), ^** (p < 0,01), ^*** (p < 0,005); з групою модельної патології - ^# (p < 0,05), ^## (p < 0,01); з групою силібору, 5 мл/кг - ^{^} (p < 0,05);

поступається екстракту в дозі 200 мг/кг, який поряд із БПСК та трифоліном є найактивнішим. У нирках вміст ТБК-реактантів дозозалежно знижується на тлі екстракту листя ЯЗ, БПСК та трифоліну, що підтверджує нефропротекторну дію цих препаратів. Крім того, сприятливий вплив трифоліну та силібору на АОС виявляється у нормалізації рівня ЦП. Відмічається тенденція до підвищення концентрації останнього на тлі екстракту в дозі 1 г/кг та БПСК, проте відмінності статистично недостовірні. Решта показників ПОЛ-АОС нирок змінюється у вигляді тенденції. Постішемічний оксидативний стрес - провідний фактор, який ініціює каскад реакцій, що призводять до загибелі клітин. Тому його пригнічення є дієвим механізмом дії гепатопротекторів. Протидія досліджуваних препаратів ушкодженню печінки активними формами кисню підтверджується зменшенням вмісту в плазмі крові 8-ізопростану - маркера оксидативного стресу (табл. 3).

Екстракт листя ЯЗ (1 г/кг) та трифолін нормалізують вміст у плазмі крові цитокінів: прозапальних TNF-б, IL-1б та протизапального IL-4 (див. табл. 3). У нелікованих тварин існує значуща сильна додатна кореляція між вмістом прозапальних цитокінів TNF-б та IL-1б в плазмі крові (с = +0,90; p < 0,05). Вона

Таблиця 3

Вплив трифоліну та екстракту листя яглиці звичайної на вміст цитокінів, маркерів апоптозу, ендогенної інтоксикації та оксидативного стресу в плазмі крові щурів із ішемією/реперфузією печінки (n = 47)

Примітка. n - кількість спостережень; н/в - не визначається; IL-1б - інтерлейкін-1б, IL-4 - інтерлейкін-4, sFаsL - розчинний Fаs-ліганд, TNF-б - фактор некрозу пухлин б; МСМ - молекули середньої маси; достовірні відмінності відносно контролю - ^* (p < 0,05); відносно МП - ^# (p < 0,05), ^## (p < 0,01), ^### (p < 0,005).

зберігається на тлі застосування екстракту (с = +0,90; p < 0,05), але не в групі трифоліну (с = +0,30; p > 0,05) та контролю (с = +0,20; p > 0,05). ІL-4 зменшує запалення, бо пригнічує активність макрофагів і біосинтез у них IL-1, TNF-б, ІL-6 (M. Vasse et al., 1996). Рівень ІL-4 у плазмі від'ємно корелює з IL-1б у псевдооперованих щурів (с = -1,0; p < 0,05) та на тлі трифоліну (с = -1,0; p < 0,05), але під впливом екстракту сила цього зв'язку зменшується (с = -0,3; p > 0,05). Це може свідчити про різні механізми захисної дії екстракту листя ЯЗ та трифоліну за І/Р печінки. Зростання концентрації TNF-б, IL-1б у плазмі тварин групи МП та падіння рівня IL-4 вказує на активний запальний процес. Зменшення запалення підтверджує зниження співвідношення цитокінів із про- та протизапальною активністю (IL-1б/IL-4 та TNF-б/IL-4), особливо на тлі екстракту, де вони достовірно не відрізняються від показників псевдооперованих тварин. Коефіцієнт ІL-1б/ІL-4 дорівнює 2,56 ± 0,24 на тлі екстракту, 8,26 ± 1,49 на тлі трифоліну проти 3,12 ± 0,67 у псевдооперованих щурів. Коефіцієнт TNF-б/ІL-4 становить 0,47 ± 0,06, 1,90 ± 0,32 та 0,60 ± 0,14 відповідно. Крім того, екстракт листя ЯЗ

(1 г/кг) та трифолін достовірно знижують вміст у плазмі крові маркера апоптозу - розчинного Fas-ліганду в 2,5 та 1,5 разу порівняно з таким у групи МП (p < 0,01).

За І/Р у печінці щурів групи МП наявні значні ділянки некрозу та некробіозу гепатоцитів (рис. 3). Екстракт (1 г/кг) та БПСК листя ЯЗ (200 мг/кг), як і силібор (200 мг/кг), зберігають гістоструктуру органу. Екстракт (200 мг/кг) та настойка (1 та 5 мл/кг) менш ефективно за решту препаратів впливають на виживаність та біохімічні маркери, не нормалізують гістоструктуру печінки. Висока виживаність та нормалізація біохімічних показників на тлі трифоліну (50 мг/кг), незважаючи на відсутність значущого впливу на гістоструктуру печінки, як і на тлі екстракту листя ЯЗ (1 г/кг), ймовірно, пов'язані з впливом на її дезінтоксикаційну функцію, про що свідчить зниження вмісту в плазмі крові МСМ (у 1,5 та 3,7 разу відповідно порівняно з МП, p < 0,01). Можливо, зменшення тяжкості інтоксикації за І/Р асоційоване зі здатністю зберігати вміст глікогену в печінці.

Гіпоурикемічна дія біологічно активних речовин та препаратів яглиці звичайної у нормі та за гіперурикемії. У інтактних мишей тенденційний гіпоурикемічний ефект чинять не усі БАР та препарати ЯЗ (табл. 4). Настойка листя (5 мл/кг), екстракт листя (1 г/кг) та трифолін знижують концентрацію СК у плазмі крові, ймовірно, завдяки інгібуванню КО. Настойка кореневищ

(5 мл/кг) та екстракт квіток (1 г/кг) пригнічують фермент та збільшують екскрецію СК. Екстракт кореневищ (1 г/кг), БПСК (200 мг/кг) та ефірна олія квіток (1 мг/кг) майже не впливають на обмін СК. Решта препаратів (настойка кореневищ (1 мл/кг) та настойка квіток в обох дозах), незважаючи на вплив на ниркову екскрецію та синтез СК, не змінюють урикемію, що, можливо, пов'язано з гомеостатичними реакціями організму. В мишей із гіперурикемією зменшення рівня СК у плазмі крові на тлі трифоліну (50 мг/кг), настойки кореневищ в

Таблиця 4

Вплив біологічно активних речовин, препаратів яглиці звичайної та алопуринолу на вміст сечової кислоти в плазмі крові та активність ксантиноксидази в нормі та за оксонат-індукованої гіперурикемії у мишей (n = 230)

Примітка. n - загальна кількість тварин, використана у досліді; ГУ - гіперурикемія, СК - сечова кислота, КО - ксантиноксидаза; достовірні відмінності: з групою інтактного контролю - ^* (p < 0,05), ^** (p < 0,01), ^*** (p < 0,005),

^**** (p < 0,001); з групою алопуринолу, 10 мг/кг - ^# (p < 0,05), ^## (p < 0,01),

^### (p < 0,005), ^#### (p < 0,001); з контролем гіперурикемії - ^{^} (p < 0,05);

^{^^} (p < 0,01); ^{^^^} (p < 0,005), ^{^^^} (p < 0,001).

обох дозах, листя (5 мл/кг) та екстракту кореневищ (1 г/кг) відбувається за рахунок інгібування КО, під впливом настойки квіток (1 мл/кг) - за рахунок ниркових механізмів. Гіпоурикемічна дія настойки листя (1 мл/кг), квіток

(5 мл/кг), екстракту листя (1 г/кг), квіток (1 г/кг), БПСК листя (200 мг/кг) та ефірної олії квіток (1 мг/кг) пов'язана з підвищенням екскреції СК, та, більшою мірою, із пригніченням КО. Трифолін та БПСК за інгібувальною здатністю наближаються до алопуринолу. Проте гіпоурикемічний ефект останнього максимальний у нормі та за гіперурикемії.

Комплекс отриманих результатів свідчить про перспективність використання сировини ЯЗ для створення препаратів із нефро-, гепатопротекторною та гіпоурикемічною дією.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення наукової задачі, яке полягає в експериментальному обґрунтуванні доцільності використання препаратів яглиці звичайної при захворюваннях нирок, печінки та порушеннях обміну сечової кислоти. Розширено знання про фармакологічні ефекти препаратів яглиці звичайної, роль окремих біологічно активних речовин у механізмі їхньої дії. Встановлено перспективні субстанції для подальшого дослідження, найактивнішою серед яких є екстракт листя яглиці звичайної, з метою створення на їх основі нефро-, гепатопротекторних та гіпоурикемічних препаратів.

1. З лікарської рослинної сировини яглиці звичайної одержано флавоноїд трифолін, білково-полісахаридний комплекс та ліпофільну фракцію листя, ефірну олію квіток, настойки та сухі екстракти кореневищ, листя та квіток. Вивчено їх фармакологічні властивості.

2. На скринінговій моделі етиленгліколевої нефропатії найефективнішими є екстракт кореневищ (1 г/кг) та екстракт листя (1 г/кг), білково-полісахаридний комплекс листя яглиці звичайної (200 мг/кг) та трифолін (50 мг/кг). Вони підвищують виживаність до 42,9%, 66,7%, 50%та 42,9% відповідно проти 8,3% в групі модельної патології (p < 0,05), не поступаючись або перевершуючи за активністю «Корвітин» у дозах 10 та 50 мг/кг (0%) та «Силібор» у дозах 200 мг/кг (22,2%) та 1 г/кг (42,9%).

3. Ефективність екстракту листя (1 г/кг), екстракту кореневищ (1 г/кг), білково-полісахаридного комплексу листя яглиці звичайної (200 мг/кг) та трифоліну (50 мг/кг) підтверджено за ішемічної гострої ниркової недостатності. Вони попереджують падіння швидкості клубочкової фільтрації, знижують гіперазотемію та протеїнурію, перевершуючи «Хофітол» у дозі 5 мл/кг (p < 0,05).

4. За гепатопротекторною дією на моделі тетрахлорметанового гепатиту

5. найефективнішими є настойка (1 та 5 мл/кг), екстракт (200 мг/кг та 1 г/кг), білково-полісахаридний комплекс листя яглиці звичайної (200 мг/кг) та трифолін (50 мг/кг). Вони збільшують виживаність (100% проти 66,7% в групі модельної патології, p < 0,05), знижують активність АлАТ у 1,8; 2,0; 1,2; 1,1; 1,8; 1,9; 1,4 разу відповідно порівняно з модельною патологією проти 1,4 разу на тлі «Силібору» (200 мг/кг).

6. За ішемії/реперфузії печінки екстракт (1 г/кг), білково-полісахаридний комплекс листя яглиці звичайної (200 мг/кг) та трифолін (50 мг/кг) збільшують виживаність тварин (85,7% (p<0,05), 85,7% (p<0,05) та 100% (p < 0,005) відповідно проти 27,8% у групі модельної патології), зменшують активність трансаміназ до рівня інтактних тварин, нормалізують прооксидантно-антиоксидантний баланс знижуючи вміст ТБК-реактантів, збільшуючи активність каталази та супероксиддисмутази. За більшістю досліджуваних показників препарати яглиці звичайної не поступаються «Силібору» або перевершують його.

7. У механізмі гепатопротекторної дії екстракту листя яглиці звичайної та трифоліну, окрім зменшення оксидативного стресу, бере участь збереження глікогенсинтезувальної функції печінки (p < 0,05), нормалізація вмісту в плазмі крові про- та протизапальних цитокінових медіаторів - TNF-б, ІL-1б, ІL-4, розчинного Fas-ліганду (p < 0,05 порівняно з модельною патологією) та балансу між ними.

8. За ішемічної гострої ниркової недостатності екстракт листя (1 г/кг), екстракт кореневищ (1 г/кг), білково-полісахаридний комплекс листя яглиці звичайної (200 мг/кг) та трифолін (50 мг/кг) попереджують розвиток некрозу та некробіозу в ниркових канальцях та печінці. За ішемії/реперфузії печінки екстракт (1 г/кг) та білково-полісахаридний комплекс листя яглиці звичайної (200 мг/кг), як і «Силібор» (200 мг/кг), зберігають гістоструктуру печінки.

9. На моделі оксонат-індукованої гіперурикемії гіпоурикемічна дія трифоліну

10. (50 мг/кг), настойки кореневищ (1 та 5 мл/кг), настойки листя (5 мл/кг) та екстракту кореневищ яглиці звичайної (1 г/кг) відбувається переважно за рахунок інгібування ксантиноксидази (p < 0,05 порівняно з контролем гіперурикемії), під впливом настойки квіток (1 мл/кг) - за рахунок збільшення ниркової екскреції сечової кислоти. Вплив настойки листя (1 мл/кг), настойки квіток (5 мл/кг), екстракту листя (1 г/кг), екстракту квіток (1 г/кг), білково-полісахаридного комплексу листя (200 мг/кг) та ефірної олії квіток яглиці звичайної (1 мг/кг) на урикемію поєднує ці механізми. Найефективнішим гіпоурикемічним препаратом є екстракт кореневищ у дозі 1 г/кг (p < 0,05 порівняно з контролем гіперурикемії). Здатність інгібувати ксантиноксидазу може долучатися до механізмів нефро- та гепатопротекторної дії біологічно активних речовин та фармакологічних препаратів яглиці звичайної.

11. Роль сполук, які входять до складу ліпофільних витягів із сировини яглиці, доволі незначуща, тимчасом як білково-полісахаридний комплекс листя та трифолін відіграють важливу роль у реалізації нефро-, гепатопротекторної та гіпоурикемічної дії: знижують летальність, нормалізують біохімічні та функціональні показники у тварин із токсичним та ішемічним ушкодженням печінки та нирок, чинять урикодепресивну дію.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Миші як об'єкт досліджень видільної функції нирок / С. Ю. Штриголь,

2. О. В. Товчига, Н. Г. Аракелян, Ю. Ю. Лабузова, О. М. Панова, О. О. Койро, Н. С. Чорна, С. І Степанова // Клінічна фармація. - 2008. - Т. 12, № 3. - С. 56-60. (Особистий внесок: участь у виконанні експерименту, аналізі даних).

3. Койро О. О. Експериментальне обґрунтування застосування екстракту яглиці звичайної при сполучному токсичному ураженні печінки та нирок /

4. О. О. Койро, О. В. Товчига, С. Ю. Штриголь // Український біофармацевтичний журнал. - 2011. - № 2 (13). - С. 24-28. (Особистий внесок: виконання експерименту, участь в аналізі даних, підготовці статті).

5. Койро О. О. Вплив препаратів яглиці звичайної (Aegopodium podagraria L.) та 3-о-галактозиду кемпферолу на обмін сечової кислоти в мишей у нормі та за гіперурикемії / О. О. Койро, С. Ю Штриголь // Фармакологія та лікарська токсикологія. - 2012. - № 3 (28). - С. 47-52. (Особистий внесок: виконання експерименту, участь в аналізі даних, підготовка статті).

6. Новые перспективы нефропротекции / C. Ю. Штрыголь,

7. О. В. Товчига, О. О. Койро, Е. Г. Щёкина, В. С. Штрыголь, Е. В. Бондарев,

8. Н. А. Домар // Буковинський медичний вісник. - 2012. - Т. 16., № 3 (63), ч.2. - С. 35-37. (Особистий внесок: участь в проведенні експерименту, аналізі літератури).

9. Study of the composition of the goutweed flowers essential oil, its renal effects and influence on uric acid exchange / O. O. Koyro, O. V. Tovchiga, S. I. Stepanova,

10. S. Yu. Shtrygol' // Pharmacognosy Communications. - 2012. - Vol. 2, № 3. - P. 46-49. (Особистий внесок: виконання експерименту, участь в аналізі даних, підготовці статті).

11. Койро О. О. Гепатопротекторний потенціал яглиці звичайної (Aegopodium podagraria L.): скринінгове дослідження / О. О. Койро, С. Ю. Штриголь // Запорожский медицнский журнал - 2013. - № 3. - С. 35-37. (Особистий внесок: виконання досліду, аналіз даних, підготовка статті).

12. Койро О.О. Захисний вплив препаратів яглиці звичайної (Aegopodium podagraria L.) і трифоліну при ішемії-реперфузії печінки у щурів /

13. О. О. Койро, С. Ю. Штриголь // Фармаком. - 2013. - № 1 (13). - C. 59-65. (Особистий внесок: виконання експерименту, аналіз даних, підготовка статті).

14. Яглиця звичайна (Aegopodium podagraria L.) чинить гепатопротекторну дію при пошкодженні печінки ішемічного ґенезу / О. О. Койро, С. Ю. Штриголь, Т. В. Горбач, С. І. Степанова // Український біофармацевтичний журнал. - 2013. - № 3 (26). - С. 15-20. (Особистий внесок: участь у виконанні експерименту, аналіз даних, підготовка статті).

15. Патент України № 63764 на корисну модель, МПК A61K 36/23 (2006.01), A61K 127/00 (2006.01). Застосування екстракту з листя яглиці звичайної як лікувально-профілактичного засобу з гепатопротекторною дією / Койро О. О.,

16. Штриголь С. Ю. - № u 2011 01332; заявл. 07.02.2011; опубл. 25.10.2011; Бюл. № 20, 2011 р. - 4 с. (Особистий внесок: виконання експерименту, участь в аналізі даних, оформленні патенту).

17. Дослідження хімічного складу та ренальних ефектів ефірної олії квіток яглиці звичайної / О. О. Койро, О. В. Товчига, С. І.Степанова, С. Ю. Штриголь // Ліки - людині. Сучасні проблеми створення, дослідження та апробації лікарських засобів : матеріали XXVI наук.-практ. конф., 12 берез. 2009 р. - Х. : НФаУ, 2009. - С. 49-50.

18. Получение экстрактов и белково-полисахаридных комплексов из разных видов сырья сныти обыкновенной (Aegopodium podagraria L.), их нефротропные эффекты / О. О. Койро, О. В. Товчига, С. И. Степанова, С. Ю. Штрыголь // Экспериментальная и клиническая фармакология : материалы 3-й междунар. науч. конф., 23-24 июн. 2009 г. - Минск, 2009. - С. 59-60.

19. Койро О. О. Отримання, дослідження хімічного складу та нефротропних ефектів ліпофільної фракції листя яглиці звичайної (Aegopodium podagraria L.) / О. О. Койро, С. І. Степанова, С. Ю. Штриголь // Актуальні питання створення нових лікарських засобів : матеріали Всеукр. наук.-практ. конф. студ. та мол. вчених, присвяч. 140-річчю з дня народження д-ра фармац. та хім. наук, проф. М.О. Валяшка, 21-22 квіт. 2011 р. - Х. : НФаУ, 2011. - С. 201.

20. Койро О. О. Інгібування ксантиноксидази печінки препаратами яглиці звичайної (Aegopodium podagraria L.) у нормо- та гіперурикемічних мишей /

21. О. О. Койро, С. Ю. Штриголь // Актуальні питання створення нових лікарських засобів: матер. Всеукр. наук.-практ. конф. студ. та мол. вчених, 19-20 квіт. 2011 р. - Х. : НФаУ, 2012. - С. 383.

22. Койро О. О. Ренальные эффекты суммарных препаратов сныти обыкновенной (Aegopodium podagraria L.) и ее биологически активных веществ в здоровом организме, их влияние на течение острой почечной недостаточности токсического ґенеза / О. О. Койро, С. Ю. Штрыголь // Физиология и патология почек и водно-солевого обмена : материалы междунар. научн. конф., посвящ. 100-летию со дня рожд. проф. Н. Н. Прониной, Владикавказ, 19-20 дек. 2012 г. - Владикавказ : ИПК «Литера», 2012. - С. 144-149.

23. Койро О.О. Гепатопротекторна дія препаратів яглиці звичайної (Aegopodium podagraria L.) при ішемічному ушкодженні печінки / О. О. Койро,

24. С. Ю. Штриголь // Клінічна фармація: 20 років в Україні : матеріали нац. конгр, 21-22 берез. 2013 р. - Харків, 2013. - С. 133.

25. Perspectives of the development of drugs based on goutweed (Aegopodium podagraria L.) / О. О. Коyro, S. Yu. Shtrygol', O. V. Tovchiga, S. I. Stepanova // Actual questions of development of new drugs: book of abstracts of XX International Scientific and Practical Conference of young scientists and students, devoted to the 90th anniversary of doctor of science in pharmacy, professor Dmitri Pavlovych Salo, April 25-26, 2013. - Kharkiv : NUPh, 2013. - Р. 162.