Розробка твердої лікарської форми гепатопротекторної дії з екстрактом листя винограду культурного

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

РОЗРОБКА ТВЕРДОЇ ЛІКАРСЬКОЇ ФОРМИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЇ ДІЇ З ЕКСТРАКТОМ ЛИСТЯ ВИНОГРАДУ КУЛЬТУРНОГО

15.00.01 - технологія ліків, організація фармацевтичної справи та судова фармація

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата фармацевтичних наук

СОЛДАТОВ ДМИТРО ПАВЛОВИЧ

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі промислової фармації Національного фармацевтичного університету, Міністерства охорони здоров'я України, м. Харків.

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор ЧУЄШОВ Владислав Іванович,

Національний фармацевтичний університет, професор кафедри промислової фармації.

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор КАЗАРІНОВ Микола Олександрович, Державне підприємство «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції», м. Харків, головний науковий співробітник лабораторії твердих лікарських форм;

доктор фармацевтичних наук, професор БОРЩЕВСЬКА Марина Іллінічна, ВАТ «Фармак», м. Київ, керівник департаменту біотехнологій.

Захист відбудеться « » 2011 р. о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.64.605.02 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).

Автореферат розісланий « » січня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор фармацевтичних наук, професор Д.І. Дмитрієвський

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За світовою статистикою 30% людей земної кулі страждають різними захворюваннями печінки і потребують медикаментозне лікування. Тривале вживання або великі дози алкоголя, застосування гепатотоксичних ліків чинять руйнівну дію на печінку, викликають гепатит. При відсутності лікування або його неефективності гепатит може прогресувати у цироз печінки і гепатоцелюлярну карциному - хвороби, що скорочують тривалість життя хворих.

Асортимент гепатозахисних засобів представлений в основному дорогими закордонними препаратами рослинного і тваринного походження, ессенціальними фосфоліпідами, амінокислотами, синтетичними препаратами. Близько 55% складають препарати рослинного походження, серед яких особливе місце посідають засоби на основі флаволігнанів розторопші плямистої: «Силібор», «Дарсил» (Україна), «Легалон» (Венгрія, Німеччина), «Карсил» (Болгарія), «Гепабене», «Гепатофальк планта» (Німеччина) та ін. Використовувані на цей час гепатопротектори поряд з позитивними якостями мають суттєві недоліки: ефективність існуючих препаратів рослинного походження, фосфоліпідів спостерігається у 40-60% хворих, інші мають протипоказання до застосування та побічну дію.

У Національному фармацевтичному університеті під керівництвом проф. Кисличенко В.С., проф. Вороніної Л.М. проведено дослідження, які показали, що листя винограду містить біологічно активні речовини (БАР), які мають перевагу перед препаратом порівняння силібором за антиоксидантною активністю, запобігають перекисному ушкодженню мембран гепатоцитів, виявляють помірну протизапальну дію.

Враховуючи тенденцію до росту захворювань печінки, комплексну дію БАР листя винограду та доступність сировинної бази, розробка лікарського препарату гепатопротекторної дії з екстрактом листя винограду культурного є актуальною.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету «Фармакогностичне вивчення біологічно-активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження» (№ державної реєстрації 0103U000476) та проблемної комісії “Фармація” МОЗ і АМН України.

Мета та задачі дослідження. Метою роботи є розробка науково-обгрунтованого складу, технології та методик контролю якості таблетованої лікарської форми гепатопротекторної дії з екстрактом листя винограду культурного.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

- провести аналіз сучасних джерел літератури щодо етіології, патогенезу та фармакотерапії захворювань печінки і використання винограду культурного в офіційній і народній медицині;

- провести комплекс фізико-хімічних та технологічних досліджень листя винограду культурного з метою обґрунтування способу та режиму екстракції БАР з нього;

- провести комплекс фізико-хімічних та фармако-технологічних досліджень екстракту листя винограду культурного з метою обґрунтування оптимального складу таблетованого лікарського препарату;

- розробити та обґрунтувати технологію таблеток;

- провести дослідження з встановлення основних показників якості розробленого складу таблеток, обґрунтувати вид упаковки та термін придатності;

- провести мікробіологічні та фармакологічні дослідження розробленого препарату;

- розробити проекти методів контролю якості (МКЯ) та технологічного промислового регламенту на препарат, провести апробацію його технології в умовах промислового виробництва.

Об'єкти дослідження - листя винограду сортів Ізабелла, Каберне, екстракт листя винограду культурного, таблетки з екстрактом листя винограду культурного.

Предмет дослідження - розробка технології екстракту листя винограду культурного, розробка складу та технології таблетованого лікарського препарату гепатопротекторної дії з екстрактом листя винограду культурного, вивчення його специфічної фармакологічної активності та нешкідливості.

Методи дослідження. При вирішенні поставлених у роботі завдань використовували методи оцінки фізико-хімічних та фармако-технологічних властивостей порошків сировини; методи дослідження показників якості таблеток згідно з вимогами Державної фармакопеї України (ДФУ); кольорові реакції для ідентифікації фенольних сполук; методи тонкошарової хроматографії (ТШХ) для ідентифікації флавоноїдів; хімічний метод для кількісного визначення дубильних речовин; спектрофотометричний метод для кількісного визначення флавоноїдів та гідроксикоричних кислот; метод світлової мікроскопії; фармакологічні методи для дослідження специфічної активності та нешкідливості таблеток. Обробку даних експерименту проводили за допомогою методів математичної статистики згідно з вимогами ДФУ.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено дослідження листя винограду культурного з метою створення препарату гепатопротекторної дії, вивчені процес екстракції даної сировини, обґрунтовано використання 40% етанолу як екстрагенту, методу вакуум-фільтраційної екстракції, що дозволяє отримати екстракт за 5-6 годин.

На підставі результатів фізико-хімічних, фармако-технологічних, фармакологічних досліджень уперше науково обґрунтовано склад і технологію таблеток з сухим екстрактом листя винограду культурного, що відповідають вимогам ДФУ.

Розроблено методики ідентифікації та кількісного визначення флавоноїдів, гідроксикоричних кислот та дубильних речовин у препараті.

Обґрунтовано вибір раціональної упаковки для таблеток, що забезпечує їх стабільність протягом двох років.

Склад таблеток захищений патентом України на корисну модель №48653 (дата публікації 25.03.2010 Бюл. №6).

Практичне значення одержаних результатів. Створено новий лікарський препарат гепатопротекторної дії у формі таблеток на основі екстракту листя винограду культурного для застосування в терапії захворювань печінки, що має комплексну дію на всі ланки патогенезу, виявляє здатність до гальмування процесів вільнорадикального окиснення, нормалізації функції антиоксидантної системи та зменшення цитолітичного синдрому. Розроблено проект технологічного промислового регламенту на виробництво таблеток, проект методів контролю якості (МКЯ).

Технологію препарату апробовано в умовах промислового виробництва на базі Філії товариства з обмеженою відповідальністю «Дослідний завод «ГНЦЛС» (акти впровадження від 20.01.2010, 22.01.2010 р.).

Окремі фрагменти роботи впроваджено у навчальний процес кафедри технології ліків і біофармації Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького (акт впровадження від 25.09.2009 р.), кафедри фармацевтичної технології і біофармації Національної медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (акт впровадження від 20.01.2010 р.), кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології Національного університету «Львівська політехніка» (акт впровадження від 17.03.2009 р.), курсу технології ліків Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського (акт впровадження від 22.01.2010 р.), кафедри промислової фармації Київського національного університету технологій та дизайну (акт впровадження від 18.01.2010 р.), кафедри технології органічних речовин та фармацевтичних препаратів ДВНЗ «Український державний хіміко-технологічний університет» (акт впровадження від 10.11.2009 р.).

Особистий внесок здобувача. Автором проведено патентний пошук і аналіз даних літератури щодо етіології, патогенезу та фармакотерапії захворювань печінки, сучасного стану гепатопротекторних засобів на фармацевтичному ринку України, використання винограду культурного у медицині. Проведено фізико-хімічні та технологічні дослідження листя винограду культурного з метою обґрунтування вибору способу екстракції, досліджено процес екстракції, отримано густий та сухий екстракти з даної сировини, теоретично та експериментально обґрунтовано склад та технологію таблеток з екстрактом листя винограду культурного, вивчено вплив допоміжних речовин та доцільність використання сухого екстракту, розроблено методики ідентифікації та кількісного визначення флавоноїдів, гідроксикоричних кислот та дубильних речовин у препараті, встановлено термін придатності та раціональний вид упаковки. Результати випробувань статистично оброблені, систематизовані та проаналізовані. Розроблено проекти МКЯ та технологічного промислового регламенту на виробництво таблеток. За результатами фармакологічних досліджень обґрунтовано кількість екстракту на одну таблетку. Особистий внесок у наукових працях, опублікованих у співавторстві з Чуєшовим В.І., Грудько В.О., Новосел О.М., Кисличенко В.С., вказується за текстом дисертації, а також в авторефераті в списку фахових публікацій (№№ 1-4).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено та обговорено на: Міжвузівській студентській науковій конференції «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2006); ІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок» (Харків, 2006); Всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні питання створення нових лікарських засобів» (Харків, 2007, 2008); Всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків, 2008); Першій науково-практичній конференції з міжнародною участю «Сучасні досягнення фармацевтичної технології» (Харків, 2008); Ювілейній науково-практичній конференції з міжнародною участю «Фармакогнозія ХХІ століття. Досягнення та перспективи» (Харків, 2009).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 12 робіт, у тому числі: 4 наукових статті у фахових журналах, 1 патент та 7 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 142 сторінках машинопису, складається зі вступу, чотирьох розділів, загальних висновків, списку використаних джерел та додатків. Список використаної літератури містить 177 джерел, у тому числі 35 іноземних авторів. Робота ілюстрована 22 таблицями та 22 рисунками.

виноград лікарський препарат гепатопротектор

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обговорюється актуальність теми, формулюється мета та основні завдання досліджень, визначається наукова новизна і практичне значення отриманих результатів.

У першому розділі проаналізовані етіологія, патогенез та статистика захворювань печінки, охарактеризовані основні сучасні аспекти лікування гепатитів, представлена характеристика та дослідження у галузі створення нових гепатопротекторів. Приведений аналіз стосовно основних ланок порушень роботи гепатобіліарної системи, який дозволив визначити основні напрямки його медикаментозного лікування, біологічно активних речовин винограду культурного, сучасний стан виробництва екстракційних препаратів і таблеток. Доведена доцільність розробки нового препарату гепатопротекторної дії у формі таблеток з екстрактом листя винограду культурного, який запобігає перекисному ушкодженню мембран гепатоцитів, виявляє помірну протизапальну дію, має антиоксидантну активність.

У другому розділі обґрунтований вибір загальної методології досліджень. Наведені характеристики об'єктів дослідження, допоміжних речовин та матеріалів, які визначають технологію виробництва екстрактів і таблеток.

Надмірне накопичення вільних радикалів і продуктів перекисного окислення ліпідів - один з провідних патогенетичних механізмів ураження гепатоцитів унаслідок дії токсинів екзо- і ендогенного походження. Враховуючи основні патогенетичні ланки розвитку гепатитів ми вирішили ввести до складу таблеток сумарний екстракт листя винограду культурного, який має комплексну протизапальну, антиоксидантну та мембраностабілізуючу дію.

Для розробки складу таблеток обирали допоміжні речовини, які широко застосовують у фармацевтичній промисловості, з урахуванням призначення препарату, його ефективності та нешкідливості, біодоступності діючих речовин, технологічних властивостей.

Обґрунтовано вибір методів дослідження: фізико-хімічних, технологічних, хроматографічних, хімічних для ідентифікації та кількісного визначення діючих речовин, методів світлової мікроскопії.

У третьому розділі наведені результати експериментальних досліджень з розробки технології екстракту листя винограду культурного, складу та технології таблеток на його основі.

Лікарська рослинна сировина містить різні хімічні сполуки, які є складовою частиною клітин. В залежності від наявності у них фармакологічної активності їх умовно поділяють на діючі та супутні. Екстракція дозволяє вилучити з лікарської рослинної сировини діючі речовини та ввести їх до складу зручної для застосування лікарської форми. На сьогоднішній час існують різні методи екстракції, ефективність яких в значній мірі залежить від якості рослинної сировини та її технологічних властивостей. Важливою характеристикою цього процесу є вміст екстрактивних речовин, якісний та кількісний склад біологічно активних речовин, які визначають вибір екстрагенту. Перевагу слід надавати методу, який має меншу тривалість у часі та дозволяє досягти максимального виснаження сировини.

Визначені технологічні властивості використовують при розробці промислової технології екстракційних препаратів для масштабування процесів, для розрахунку об'ємів технологічного обладнання. Отримували цілеспрямовано фракцію з розміром часток від 1 до 3 мм та фракцію менше 1 мм. Перша фракція використовується в технології екстракційних препаратів для отримання екстрактів методами мацерації, перколяції з лікарської рослинної сировини - трави, листя. Друга фракція характерна для сучасного методу - вакуум-фільтраційної екстракції, що дозволяє переробляти сировину з невеликим розміром частинок.

Визначені технологічні параметри подрібненого листя винограду сортів Ізабелла та Каберне наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Технологічні параметри подрібненого листя винограду культурного

	Ізабелла	Каберне
1. Подрібненість сировини	менше 1 мм	1-3 мм	менше 1 мм	1-3 мм
2. Питома густина, dп, г/см3	0,92±0,11	1,38±0,12	1,27±0,17	1,32±0,11
3. Об'ємна густина, dо, г/см3	0,54±0,05	0,68±0,08	0,75±0,14	0,81±0,11
4. Насипна густина до усадки, dн, г/см3	0,31±0,01	0,22±0,01	0,31±0,01	0,18±0,01
- після усадки	0,41±0,02	0,31±0,01	0,41±0,01	0,26±0,01
5. Пористість сировини, Пс	0,41	0,51	0,41	0,39
6. Порозність шару до усадки, Пш	0,42	0,68	0,59	0,78
- після усадки	0,24	0,54	0,45	0,68
7. Вільний об'єм до усадки, V	0,66	0,84	0,76	0,86
- після усадки	0,55	0,77	0,68	0,80
8. Коефіцієнт поглинання:
- вода	1,82±0,19	1,98±0,31	1,43±0,38	1,63±0,29
- 40% етанол	1,72±0,07	1,85±0,33	1,47±0,14	1,52±0,19
9. Вологість, %	7,92±0,22	9,18±1,79
10. Плинність, г/с	3,99±1,10	0,31±0,25	3,54±0,90	0,29±0,18
с/100 г	25,25±7,42	349±146	28,38±7,53	358±112
11. Кут укосу, град.	26±2,48	32,33±3,79	31,33±1,43	34,33±7,99
12. Вміст екстрактивних речовин, %
- вода	29,99±0,34	32,55±2,90
- 40% етанол	31,27±3,25	27,98±2,42

Примітка P=95%, n=5

Технологічні параметри мають близькі значення як для сорту Ізабелла, так і для сорту Каберне, отже можливо використання листя винограду обох сортів. Фракції подрібненого листя винограду обох сортів з розміром часток менше 1 мм мають кращі значення насипної густини, вільного об'єму та коефіцієнта поглинання. На основі наведених результатів визначення технологічних параметрів можна зробити висновок, що використання методу фільтраційної екстракції, який дозволяє переробляти сировину з розміром часток менше 1 мм, є більш доцільним, ніж переробка рослинної сировини з розміром часток 1-3 мм.

Якісними реакціями у листі виявлені флавоноїди, дубильні речовини та гідроксикоричні кислоти. Тому в подальших дослідженнях основними групами БАР вважали флавоноїди, дубильні речовини та гідроксикоричні кислоти. Результати якісних реакцій однакові для листя винограду сорту Ізабелла та Каберне, отже можна зробити попередній висновок про наявність однакових груп БАР та взаємозамінність сировини обох сортів.

Для порівняльного аналізу якісного складу БАР листя винограду обох сортів проводили хроматографічне дослідження. Схема хроматограми витяжок з листя винограду сорту Ізабелла та Каберне з застосуванням різних екстрагентів представлена на рисунку 1.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1 Схема хроматограми витяжок з листя винограду сорту Ізабелла (зліва) та Каберне (зправа)

Значення Rf і забарвлення в УФ-світлі восьми речовин в обох сортах однакові, що дозволило зробити висновок про їх ідентичну хімічну природу. Це речовини, що позначені на схемі хроматограми витяжок з листя винограду Ізабелла номерами 1, 2, 3, 5, 6, 10, 11, 12.

Результати хроматографічного дослідження підтвердили, що листя винограду сорту Ізабелла і сорту Каберне мають схожий флавоноїдний склад і можуть бути взаємозамінними в промисловій технології екстракційних препаратів.

Для обґрунтування вибору екстрагенту визначали здатність вилучати максимальну кількість БАР з листя винограду культурного. Результати кількісного визначення флавоноїдів, дубильних речовин, гідроксикоричних кислот з використанням як екстрагенту води, 20%, 40%, 70% етанолу наведені у табл. 2.

Серед досліджуваних екстрагентів 40% етанол екстрагує найбільшу кількість флавоноїдів, дубильних речовин з листя винограду обох сортів, та гідроксикоричних кислот з сорту Ізабелла. Таким чином, 40% етанол є найбільш доцільним екстрагентом для вилучення максимальної кількості БАР - флавоноїдів, дубильних речовин, гідроксикоричних кислот, саме цей екстрагент використовували в подальших дослідженнях.

Таблиця 2

Кількість біологічно активних речовин, що витягаються різними екстрагентами

БАР	Кількісний вміст БАР у перерахунку на абсолютно суху сировину, %
	вода	20% етанол	40% етанол	70% етанол
Листя винограду сорту Ізабелла
Флавоноїди	0,94±0,03	1,42±0,02	1,75±0,03	1,35±0,02
Дубильні речовини	5,77±0,17	7,39±0,13	8,69±0,22	7,76±0,23
Гідроксикоричні кислоти	2,09±0,06	2,01±0,06	2,25±0,08	2,19±0,05
Листя винограду сорту Каберне
Флавоноїди	1,50±0,05	1,69±0,04	1,85±0,04	1,83±0,04
Дубильні речовини	4,75±0,09	6,39±0,19	7,79±0,23	6,02±0,15
Гідроксикоричні кислоти	1,44±0,05	1,37±0,03	1,38±0,04	1,13±0,03

Примітка P=95%, n=5

Подальшою задачею було обґрунтування методу екстракції. Екстракцію проводили методами мацерації, дробної мацерації, вакуум-фільтраційної екстракції. Листя винограду сортів Ізабелла та Каберне попередньо подрібнювали та просіювали крізь сита для отримання двох фракцій з частинками менше 1 мм та фракції з частинками від 1 до 3 мм. Як екстрагент використовували 40% етанол у співвідношенні 1:10.

Кількісним аналізом нами встановлено вміст основних біологічно активних речовин (БАР) у листі винограду сортів Ізабелла та Каберне: гідроксикоричних кислот - 2,26±0,08% та 1,44±0,05%, конденсованих дубильних речовин - 8,69±0,22% та 7,79±0,23%, суми флавоноїдів - 1,75±0,03% та 1,85±0,04%. Ці дані використовували для розрахунку ступеня виснаження сировини за основними групами БАР.

Вміст БАР у витяжках, отриманих методом мацерації, представлений в табл. 3.

Ступінь виснаження сировини більший для фракцій з розміром частинок менше 1 мм, але не перевищує 57,14%.

Таблиця 3

Вміст БАР при екстракції методом мацерації

Сировина	1 доба	2 доби	3 доби	4 доби	5 діб	Загальна кількість	Ступінь виснаження, %
	Вміст гідроксикоричних кислот, %
Ізабелла <1 мм	0,69±0,06	1,07±0,04	1,07±0,05	1,07±0,05	1,08±0,04	1,08	47,79
Ізабелла 1-3 мм	0,64±0,04	0,99±0,05	0,99±0,04	1,00±0,04	1,00±0,03	1,00	44,25
Каберне <1 мм	0,53±0,05	0,81±0,06	0,82±0,06	0,84±0,05	0,84±0,05	0,84	58,33
Каберне 1-3 мм	0,40±0,05	0,74±0,06	0,74±0,07	0,75±0,06	0,76±0,05	0,76	52,78
	Вміст дубильних речовин, %
Ізабелла <1 мм	3,16±0,06	3,80±0,11	3,85±0,08	3,87±0,07	3,88±0,06	3,88	44,65
Ізабелла 1-3 мм	2,54±0,06	2,90±0,08	2,92±0,08	2,92±0,06	2,93±0,06	2,93	33,72
Каберне <1 мм	1,92±0,06	2,50±0,06	2,53±0,07	2,55±0,05	2,55±0,06	2,55	32,73
Каберне 1-3 мм	1,43±0,09	2,07±0,08	2,10±0,08	2,12±0,06	2,12±0,06	2,12	27,21
	Вміст флавоноїдів, %
Ізабелла <1 мм	0,92±0,08	0,95±0,06	0,97±0,06	0,99±0,06	1,00±0,05	1,00	57,14
Ізабелла 1-3 мм	0,71±0,08	0,95±0,06	0,96±0,05	0,96±0,05	0,97±0,04	0,97	55,43
Каберне <1 мм	0,69±0,06	0,88±0,06	0,91±0,07	0,92±0,06	0,92±0,06	0,92	49,73
Каберне 1-3 мм	0,50±0,06	0,79±0,06	0,83±0,05	0,84±0,05	0,86±0,04	0,86	46,49

Примітка P=95%, n=5

Вміст БАР у витяжках, отриманих методом дробної мацерації, представлений в табл. 4.

Таблиця 4

Вміст БАР при екстракції методом дробної мацерації

Сировина	1 злив	2 злив	3 злив	4 злив	5 злив	Загальна кількість	Ступінь виснаження, %
	Вміст гідроксикоричних кислот, %
Ізабелла <1 мм	0,64±0,06	0,40±0,06	0,30±0,05	0,16±0,04	0,08±0,04	1,58	69,91
Ізабелла 1-3 мм	0,61±0,05	0,32±0,06	0,22±0,05	0,12±0,04	0,07±0,03	1,34	59,29
Каберне <1 мм	0,51±0,05	0,36±0,06	0,22±0,04	0,12±0,03	0,06±0,03	1,27	88,19
Каберне 1-3 мм	0,36±0,05	0,22±0,04	0,15±0,04	0,09±0,04	0,06±0,03	0,88	61,11
	Вміст дубильних речовин, %
Ізабелла <1 мм	3,12±0,09	1,75±0,08	1,12±0,06	0,60±0,05	0,32±0,04	6,91	79,52
Ізабелла 1-3 мм	2,50±0,06	1,12±0,06	0,87±0,08	0,46±0,06	0,26±0,05	5,21	59,95
Каберне <1 мм	1,90±0,06	1,42±0,08	0,88±0,08	0,47±0,07	0,28±0,06	4,95	63,54
Каберне 1-3 мм	1,39±0,08	0,88±0,08	0,61±0,06	0,34±0,06	0,20±0,05	3,42	43,90
Продовж. табл. 4
	Вміст флавоноїдів, %
Ізабелла <1 мм	0,86±0,06	0,44±0,06	0,26±0,05	0,10±0,04	0,04±0,03	1,70	97,14
Ізабелла 1-3 мм	0,66±0,08	0,37±0,06	0,21±0,06	0,09±0,04	0,03±0,02	1,36	77,71
Каберне <1 мм	0,61±0,06	0,43±0,05	0,29±0,05	0,12±0,04	0,04±0,02	1,49	80,54
Каберне 1-3 мм	0,42±0,05	0,26±0,06	0,17±0,04	0,08±0,03	0,04±0,02	0,97	52,43

Примітка P=95%, n=5

Використання дробної екстракції дозволило досягти більшого виходу БАР у порівнянні з мацерацією за рахунок додавання свіжих порцій екстрагенту, що відновлює рушійну силу масопередачі. Як і при застосуванні попереднього методу зменшення розміру частинок сировини забезпечує більший ступінь виснаження сировини. Найбільшим є ступінь виснаження листя винограду сорту Ізабелла фракції менше 1 мм за флавоноїдами, що складає 97,14%.

Вміст БАР у витяжках, отриманих методом вакуум-фільтраційної екстракції, представлений в табл. 5.

Ступінь виснаження сировини після третього зливу складає для сортів Ізабелла та Каберне відповідно: гідроксикоричних кислот 83,19% та 95,14%, флавоноїдів 93,14% та 80,54%, дубильних речовин 57,77% та 46,47%. Тому подальше екстрагування не є доцільним.

Таблиця 5

Вміст БАР при екстракції вакуум-фільтраційним методом

Сировина	1 злив	2 злив	3 злив	4 злив	5 злив	Загальна кількість	Ступінь виснаження, %
							1-3 зливи	1-5 зливи
	Вміст гідроксикоричних кислот, %
Ізабелла <1 мм	1,03±0,08	0,49±0,06	0,36±0,06	0,14±0,05	0,08±0,04	2,10	83,19	92,92
Каберне <1 мм	0,79±0,06	0,38±0,06	0,20±0,04	0,05±0,04	0,02±0,01	1,44	95,14	100,00
	Вміст дубильних речовин, %
Ізабелла <1 мм	3,23±0,06	1,27±0,08	0,52±0,08	0,22±0,04	0,12±0,04	5,36	57,77	61,68
Каберне <1 мм	2,15±0,08	0,96±0,08	0,51±0,06	0,24±0,06	0,13±0,05	3,99	46,47	51,22
	Вміст флавоноїдів, %
Ізабелла <1 мм	0,93±0,06	0,49±0,08	0,21±0,06	0,09±0,04	0,03±0,01	1,75	93,14	100,00
Каберне <1 мм	0,84±0,05	0,45±0,06	0,20±0,05	0,10±0,03	0,04±0,02	1,63	80,54	88,11

Примітка P=95%, n=5

Оскільки метод вакуум-фільтраційної екстракції дозволяє отримати екстракти за 4-5 годин (з урахуванням допоміжних робіт) при високому ступені виснаження сировини, він є найбільш раціональним у порівнянні з розглянутими методами.

Для вибору кількості екстрагенту проводили вакуум-фільтраційну екстракцію при співвідношенні сировина - екстрагент - 1:5, 1:10, 1:15. Три зливи об'єднували, та визначали кількість основних груп БАР, за якими розраховували ступінь виснаження сировини. Результати представлені на рис. 2 та 3.

Рис. 2 Ступінь виснаження листя винограду сорту Ізабелла

Рис. 3 Ступінь виснаження листя винограду сорту Каберне

При збільшенні співвідношення сировина - екстрагент ступінь виснаження сировини зростає, але використання кількості етанолу 1:15 є дорогим і не забезпечує значного приросту кількості БАР. Ступінь виснаження при використанні співвідношення сировина - екстрагент 1:5 не перевищує 55%. Тому доцільним є використання співвідношення 1:10.

Технологічні режими вакуум-фільтраційної екстракції наступні: ступінь подрібнення сировини - менше 1 мм, екстрагент - 40% етанол, співвідношення сировина - екстрагент 1:10, трикратна екстракція. Об'єднані витяжки використовували для отримання густого екстракту листя винограду (ГЕЛВ) та сухого екстракту (СЕЛВ).

Одержували ГЕЛВ з вмістом вологи 24%. Вміст біологічно активних речовин у перерахунку на сухий залишок склав відповідно для сортів Ізабелла та Каберне флавоноїдів у перерахунку на рутин 4,45±0,04% і 4,00±0,03%, гідроксикоричних кислот 7,64±0,03% і 6,32±0,03%, дубильних речовин 13,72±0,06% і 9,90±0,05%.

З ГЕЛВ висушуванням під вакуумом отримували СЕЛВ Ізабелла та Каберне з вмістом вологи 3,86% та 4,36% відповідно. Вміст біологічно активних речовин у перерахунку на сухий залишок склав відповідно для сортів Ізабелла та Каберне флавоноїдів у перерахунку на рутин 4,43±0,03% і 3,99±0,02%, гідроксикоричних кислот 7,63±0,03% і 6,31±0,04%, дубильних речовин 13,69±0,05% 9,89±0,06%.

З метою визначення розміру та форми частинок подрібненого екстракту проводили мікроскопічне дослідження. Використовували оптичний мікроскоп «БІОЛАМ». Отримували цифрові знімки екстрактів листя винограду сортів Ізабелла та Каберне за допомогою камери DCM 300 та програмного забезпечення Scope photo. що представлені на рисунку 4.

Рис. 4 Сухий екстракт: а - Ізабелла; б - Каберне

Екстракт обох сортів є аморфними частинками, уламками з формою близькою до ізодіаметричної. Розмір частинок 90 - 210 мкм. Поверхня частинок є шорсткою, що може бути причиною невисокої плинності порошку.

Лікарські засоби для лікування печінки повинні забезпечувати пряме потрапляння лікарських речовин у печінку, не повинні містити речовин, здатних завдати негативного впливу на цей орган. Тому виключається використання настойок через вміст етанолу. Супозиторії не забезпечують первинного надходження діючих речовин екстракту до печінки. Застосування у вигляді розчинів для ін'єкцій потребує участі кваліфікованого медперсоналу.

Для пацієнтів найбільш зручним є пероральний спосіб застосування препаратів. Таблетки мають високу точність дозування діючих речовин, меншу собівартість у порівнянні з капсулами. Вони забезпечують тривале збереження лікарських речовин у спресованому стані, портативність, зручність зберігання і транспортування.

Рослинні екстракти вводять до складу таблеток у вигляді густих екстрактів як зволожувачі, або у вигляді сухих екстрактів, у цьому випадку їх найчастіше отримують методом прямого пресування.

Для розробки складу таблеток використовували допоміжні речовини, які широко застосовують у фармацевтичній промисловості: лактозу, крохмаль, аеросил, цукор, кроскармелозу, колідон, кальцію стеарат. ГЕЛВ використовували як зволожувач, для отримання гранул, з яких пресували плоскоциліндричні таблетки з фаскою та рискою діаметром 12 мм. Таблетки аналізували за показниками: стійкість до роздавлювання, розпадання, стираність.

Склад дослідних зразків таблеток, які отримували методом вологої грануляції, та їх технологічні властивості наведені у табл. 6. Вміст ГЕЛВ зазначений у перерахунку на сухі речовини.

Таблиця 6

Технологічні властивості таблеток з густим екстрактом

№ складу	Склад, %	Показники якості
	ГЕЛВ	Лактоза	Крохмаль	Аеросил	Цукор	Кроскармелоза	Колідон	Кальцію стеарат	Стійкість до роздавлювання, Н	Розпадання, хв	Стираність, %
1	40	40	19	-	-	-	-	1	100,2±0,8	24,0±0,5	0,30±0,02
2	40	36	20	3	-	-	-	1	74,4±0,6	20,2±0,4	0,35±0,04
3	40	36	15	3	5	-	-	1	56,6±0,6	25,4±0,2	0,40±0,03
4	40	36	10/5	3	5	-	-	1	70,2±0,8	17,5±0,2	0,42±0,04
5	40	41	10/5	3	-	-	-	1	68,6±0,4	24,0±0,4	0,40±0,04
6	40	40,5	15	3	-	0,5	-	1	105,2±0,8	20,5±0,2	0,34±0,02
7	40	39	15	3	-	1/1	-	1	60,4±0,6	19,0±0,2	0,43±0,01
8	40	32	10/5	5	5	1/1	-	1	94,8±0,6	15,0±0,2	0,38±0,02
9	40	44	10	3	-	-	1/1	1	102,0±0,4	17,5±0,4	0,32±0,01

Примітка: кількість речовини у чисельнику вводять до суміші, що зволожують, а у знаменнику - до складу суміші для опудрювання.

Таблетки мають високі значення стійкості до роздавлювання, що свідчить про високі зв'язувальні властивості ГЕЛВ. В той же час ці властивості перешкоджають розпаданню, таблетки мають високі значення цього критерію якості і не задовольняють вимогам ДФУ. Подальші дослідження направлені на обґрунтування складу таблеток з використанням СЕЛВ для прямого пресування.

Таблетки отримували методом прямого пресування. Використовували допоміжні речовини для покращення плинності, розпушуючі, протиприлипаючі: лактоза, ПВП, крохмаль картопляний, аеросил, колідон, макрогол-4000, МКЦ, тальк, кальцію стеарат. СЕЛВ і допоміжні речовини ретельно змішували до отримання однорідної суміші. Пресували плоскоциліндричні таблетки з фаскою та рискою діаметром 12 мм.

Склад дослідних зразків таблеток, які отримували методом прямого пресування з використанням СЕЛВ, та їх технологічні властивості наведені в табл. 7.

Таблиця 7

Технологічні властивості таблеток з сухим екстрактом

№ складу	Склад, %	Показники якості
	СЕЛВ	Лактоза	ПВП	Крохмаль	Аеросил	Колідон	Макрогол-4000	МКЦ	Тальк	Кальцію стеарат	Стійкість до роздавлювання, Н	Розпадання, хв	Стираність, %
1	40	54	5	-	-	-	-	-	-	1	104,2±0,8	22,6±0,5	0,50±0,01
2	40	49	-	10	-	-	-	-	-	1	*/**	*/**	*/**
3	40	46	-	10	3	-	-	-	-	1	*/**	*/**	*/**
4	40	54	-	-	3	2	-	-	-	1	*/**	*/**	*/**
5	14,2	-	-	45,4	5	-	2,6	28,8	3	1	82,6±0,4	1,0±0,2	0,82±0,02
6	15	-	-	46	3	-	-	32	3	1	74,4±0,6	0,6±0,1	0,84±0,04
7	17,75	-	-	50,75	2,5	-	-	25	3	1	62,0±0,4	2,0±0,2	0,86±0,02
8	15	28	-	33	2	-	-	18	3	1	72,2±0,8	1,6±0,2	0,84±0,01
9	17,75	31,25	-	35	2	-	-	10	3	1	61,4±0,4	1,5±0,1	0,88±0,02
10	25	31,5	-	30	2	-	-	7,5	3	1	62,2±0,6	2,0±0,2	0,86±0,01
11	28	36	-	23	2	-	-	7	3	1	**	**	**
12	33	33,5	-	20	2,5	-	-	7	3	1	**	**	**
13	40	29	-	18	3	-	-	6	3	1	**	**	**
14**	28	32	-	27	2	-	-	7	3	1	106,0±0,8	8,0±0,4	0,76±0,04

Примітка: * таблетка при пресуванні розшарувалася на дві частини,

** таблетка прилипала до прес-інструменту.

Таблетки складу №1 мають стійкість до роздавлювання 104,2±0,8 Н, час розпадання 22,6±0,5 хв, тому введення додаткових зв'язуючих речовин, таких як полівінілпіролідон (ПВП) не є доцільним, оскільки сам екстракт має зв'язуючі властивості. Таблетки складу №2, 3, 4 прилипають до прес-інструмента через високий вміст екстракту. Тому необхідно зменшити вміст СЕЛВ, та ввести до складу додатково змащуючі речовини. В технології прямого пресування широко застосовується мікрокристалічна целюлоза (МКЦ), що забезпечує міцність таблетки та швидке розпадання. Комбінація допоміжних речовин крохмалю та мікрокристалічної целюлози у складі № 5 забезпечили міцність таблетки та час розпадання, що задовольняє вимогам ДФУ. В наступних складах збільшено вміст СЕЛВ.

Склад № 10 з вмістом СЕЛВ 25% дозволяє отримати таблетки, що відповідають вимогам ДФУ за стійкістю до роздавлювання, розпаданням і стираністю. Фармакологічними дослідженнями, що проведені на кафедрі біохімії під керівництвом проф. Вороніної Л.М. встановлена кількість СЕЛВ на одну таблетку - 200 мг. З урахуванням цього нами запропоновано наступний склад таблеток під умовною назвою «Вітацефол»:

Склад на одну таблетку	мг	%
СЕЛВ	200	25,00
Лактоза	252	31,50
Крохмаль картопляний	240	30,00
Аеросил	16	2,00
Целюлоза мікрокристалічна	60	7,50
Тальк	24	3,00
Кальцію стеарат	8	1,00
Всього	800	100,00

Враховуючи обладнання Філії ТОВ «Дослідний завод «ГНЦЛС» нами розроблені технологічні схеми виробництва сухого екстракту листя винограду культурного та таблеток на його основі (рис. 5).

Четвертий розділ присвячений розробці методик якісного та кількісного аналізу діючих речовин, вивченню стабільності та обговоренню результатів фармакологічних досліджень таблеток під умовною назвою «Вітацефол».

Для ідентифікації діючих речовин запропоновані кольорова якісна реакція з розчином хлориду заліза (ІІІ), ТШХ зі стандартними зразками рутину і гіперозиду. Для кількісного визначення флавоноїдів і гідроксикоричних кислот запропоновано спектрофотометрію з перерахунком на рутин та хлорогенову кислоту; дубильних речовин - титрометрію. Розроблені методики хімічної та хроматографічної ідентифікації, спектрофотометричного кількісного аналізу є доступними, що полегшує можливість їх впровадження у контрольно-аналітичні лабораторії.

Рис. 5. Технологічна схема виробництва таблеток з сухим екстрактом листя винограду культурного

Дослідження з розробки методик ідентифікації проведені на кафедрі хімії природних сполук НФаУ від керівництвом проф. Кисличенко В.С., кількісного визначення діючих речовин - на кафедрі фармацевтичної хімії НФаУ під керівництвом доц. Грудько В.О., випробування мікробіологічної чистоти проведені в «Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова АМН України» ст.н.с. Осолодченко Т.П.

Фармакологічні дослідження, що були проведені на кафедрі біохімії НФаУ під керівництвом проф. Вороніної Л.М., підтвердили гепатопротекторну дію та нешкідливість розроблених таблеток у порівнянні з препаратом - силібор, таблетки по 0,25 г.

Для вивчення стабільності таблетки з екстрактом листя винограду культурного зберігали при температурі 15-25°С в контурних чарункових упаковках та контейнерах полімерних для фармацевтичного застосування.. Таблетки контролювали за показниками якості кожні 3 місяці. Результати визначення стабільності свідчать, що препарат відповідає параметрам якості протягом двох років при зберіганні при температурі 15-25°С в контурних чарункових упаковках і контейнерах полімерних. За результатами фізико-хімічних досліджень на таблетки під умовною назвою «Вітацефол» розроблено проект методів контролю якості (МКЯ).

ВИСНОВКИ

1. Уперше на підставі проведених технологічних, фізико-хімічних та фармакологічних досліджень науково обґрунтовано та експериментально підтверджено склад, технологію та методики контролю якості таблеток гепатопротекторної дії з екстрактом листя винограду культурного.

2. В результаті аналізу сучасних джерел літератури щодо етіології, патогенезу та фармакотерапії захворювань печінки і використання винограду культурного у медицині обґрунтована доцільність створення нового гепатопротекторного препарату на основі екстракту листя винограду культурного.

3. На підставі визначення технологічних властивостей подрібненого листя винограду культурного, хроматографічних досліджень, якісних реакцій та кількісного визначення флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин для даної сировини обрано екстрагент - 40% етанол, трикратну вакуум-фільтраційну екстракцію при співвідношенні сировина-екстрагент 1:10.

4. В результаті визначення стійкості до роздавлювання, розпадання, стиранності модельних таблеток доведено доцільність використання сухого екстракту, обрано метод прямого пресування.

5. Проведеними фармако-технологічними випробуваннями, дослідженнями мікроскопії обрано допоміжні речовини для отримання таблеток: аеросил 2%, крохмаль 30%, лактозу 31,5%, целюлозу мікрокристалічну 7,5%, тальк 3%, кальцію стеарат 1%.

6. За результатами вивчення гепатопротекторної активності сухого екстракту у фармакологічному дослідженні обґрунтовано його дозу - 200 мг на одну таблетку.

7. Розроблені методики ідентифікації діючих речовин у препараті за допомогою кольорових реакцій та ТШХ, кількісного визначення флавоноїдів, гідроксикоричних кислот методом спектрофотометрії, дубильних речовин - титрометрії.

8. За результатами проведення фармако-технологічних випробувань, визначення кількісного вмісту флавоноїдів, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин у препараті при зберіганні у контурних чарункових упаковках і контейнерах полімерних доведена його стабільність протягом двох років.

9. Проведеними фармакологічними дослідженнями встановлена гепатопротекторна дія таблеток «Вітацефол», що не поступається препарату порівняння таблеткам силібор. При вивченні гострої токсичності препарату його віднесено до класу практично нешкідливих речовин.

10. За результатами проведених досліджень розроблено проекти МКЯ та технологічного промислового регламенту. Технологія виробництва екстракту і таблеток «Вітацефол» апробовано в умовах виробництва ТОВ «Дослідний завод «ГНЦЛС» (акти апробації від 20.01.2010, 22.01.2010 р.). Фрагменти роботи включені до навчального процесу ряду вищих навчальних медичних і фармацевтичних закладів України. За одержаними результатами отримано патент України на корисну модель №48653 (25.03.2010 Бюл. №6).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Солдатов Д. П. Визначення технологічних параметрів подрібненого листя винограду культурного / Д. П. Солдатов, В. І. Чуєшов // Вісник фармації. - 2009. - № 3. - С. 34-37 (Особистий внесок: проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень, оформлення статті).

2. Солдатов Д. П. Обґрунтування методу екстракції листя винограду культурного / Д. П. Солдатов, В. І. Чуєшов, В. О. Грудько // Збірник наукових праць співробітників НМАПО імені П.Л. Шупика. - 2009. - Вип. 18, № 3. - С. 493-497. (Особистий внесок: підготовка зразків, проведення експериментальних досліджень, аналіз та узагальнення результатів дослідження, оформлення статті).

3. Солдатов Д. П. Обгрунтування складу та технології таблеток з екстрактом листя винограду культурного / Д. П. Солдатов, В. І. Чуєшов // Запорізький медичний журнал....