Размещено на http://www.allbest.ru/

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Декстропропоксифен являє собою наркотичний анальгетик центральної дії, який входить до складу знеболювального препарату «Спазмолекс». Oкрім своїх основних фармакологічних ефектів він має високий аддиктивний потенціал. Тому наркозалежні особи приймають його для полегшення стану відміни після вживання трамадолу, кустарно виготовлених ацетильованих опіатів, а також вікарної наркотизації. Зловживання декстропропоксифеном на території України отримало поширення з 90-х років минулого століття. Це один з розповсюджених “клубних” наркотиків, якій користується великою популярністю серед молоді.

Декстропропоксифен контролюється в багатьох країнах світу. В Україні він також включений до таблиці ІІ списку № 1 Переліку наркотичних засобів, психотропних речовин і прекурсорів.

Незважаючи на таку широку популярність декстропропоксифену як потенційно небезпечного лікарського засобу, аналітичні аспекти його токсикології вивчені недостатньо. Тому вивчення декстропропоксифену як об'єкту хіміко-токсикологічного дослідження є актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України («Розробка нових методів визначення медикаментів, похідних фенілалкіламіну та їх контрольованих аналогів у біологічному матеріалі», номер державної реєстрації: 0103U004671) та проблемної комісії «Фармація» АМН та МОЗ України.

Мета і завдання дослідження. Метою цього дослідження є розробка методів аналітичної діагностики факту прийому або отруєнь декстропропоксифеном, придатних для цілей наркологічної експертизи, клінічної та судово-медичної токсикології.

Для досягнення цієї мети необхідно вирішити наступні завдання:

· розробити методи ізолювання декстропропоксифену із різних біологічних об'єктів;

· вивчити взаємодію декстропропоксифену зі стандартними проявниками, які широко використовуються у токсикологічному скринінгу, а також провести пошук специфічних реактивів-проявників;

· вивчити хроматографічну поведінку декстропропоксифену і лікарських засобів, які приймаються в комбінаціях з ним, і на підставі отриманих даних розробити методику виявлення декстропропоксифену методом тонкошарової хроматографії (ТШХ);

· розробити методики виявлення і визначення декстропропоксифену у біологічному матеріалі методами газорідинної та високоефективної рідинної хроматографій;

· вивчити збереженість декстропропоксифену у біологічному матеріалі, що зазнав гниття;

· на підставі проведених досліджень запропонувати алгоритм проведення судово-токсикологічного аналізу для виявлення і визначення декстропропоксифену у біологічних рідинах живих осіб та трупному матеріалі.

Об'єкт дослідження. Хіміко-токсикологічне дослідження декстропропоксифену гідрохлориду.

Предмет дослідження. Розробка методик пробопідготовки, виявлення та визначення декстропропоксифену в біологічних об'єктах.

Методи дослідження. В дослідженнях були використані методи тонкошарової, газорідинної та високоефективної рідинної хроматографій. Для ізолювання декстропропоксифену із біологічного матеріалу застосовували загальноприйняті методи Стаса - Отто, А.А.Васильєвої, а також спеціальні методики ізолювання.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше було проведено систематичне хіміко-токсикологічне дослідження декстропропоксифену. Встановлено вплив різних факторів на ізолювання декстропропоксифену із біологічного матеріалу. Вперше проведено порівняльне дослідження загальноприйнятих та нових методів ізолювання декстропропоксифену. На основі одержаних даних розроблені методики пробопідготовки біологічних рідин та тканин внутрішніх органів для токсикологічних досліджень.

Вперше вивчені та встановлені хроматографічні параметри декстропропоксифену в системах скринінгу, що рекомендовані Міжнародною асоціацією судових токсикологів (TIAFT) та у вітчизняних системах. Запропоновані селективні рухомі фази, що дозволяють проводити виявлення декстропропоксифену у присутності лікарських засобів, які приймаються в комбінаціях з ним, та представників основних груп речовин, що контролюються.

Вивчені і оптимізовані умови виявлення та визначення декстропропоксифену у біологічному матеріалі методами газорідинної та високоефективної рідинної хроматографії.

Розробленими методами вперше встановлено термін зберігання декстропропоксифену у біологічному матеріалі при його гнитті.

На підставі виконаних досліджень вперше запропоновано алгоритм аналітичної діагностики факту вживання декстропропоксифену живими особами та летальних отруєнь ним.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методики пробопідготовки біологічного матеріалу, виявлення та визначення у ньому декстропропоксифену методами тонкошарової, газорідинної та високоефективної рідинної хроматографії можуть бути використані у практиці токсикологічних лабораторій кабінетів наркологічних експертиз, лікарень та відділень судово-медичної токсикології бюро судово-медичних експертиз при діагностиці факту вживання або отруєнь декстропропоксифеном.

Розроблені методики випробувані та впроваджені у практику відділень судово-медичної токсикології Рівненського, Житомирського, Сумського, Полтавського, Черкаського та Закарпатського обласних бюро судово-медичної експертизи, а також в навчальний процес кафедри токсикологічної хімії Національного фармацевтичного університету (м. Харків), кафедри неорганічної хімії з курсом токсикологічної хімії Запорізького державного медичного університету, кафедри клінічної біохімії, судово-медичної токсикології та фармакології Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Особистий внесок здобувача. Разом з науковим керівником визначила мету і задачі дослідження, розробила методичні підходи, на основі яких були обрані методи виконання експериментальних досліджень. Дисертантка особисто здійснила інформаційний пошук за темою дисертації, експериментальні дослідження, статистичну обробку одержаних експериментальних даних, їх аналіз та систематизацію, сформулювала висновки роботи.

В наукових роботах, що були опубліковані у співавторстві, дисертанткою наведені результати власних експериментальних досліджень, прийнято участь в аналізі та узагальненні отриманих даних, у написанні статей.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладено та обговорено на науково-практичних конференціях різного рівня: науково-практичній конференції з міжнародною участю «Стан, перспективи судово-токсикологічної служби та наукових досліджень» (м. Харків, 2005); конференції молодих вчених ХМАПО «Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини» (м. Харків, 2005); науково-практичній конференції «Теорія та практика судової експертизи і криміналістики: збірник науково-практичних матеріалів» (м. Харків, 2005); науково-практичній конференції з міжнародною участю, присвяченій 200-річчю кафедри судової медицини та основ права Харківського державного медичного університету «Актуальні питання та перспективи розвитку судової медицини та криміналістики» (м. Харків, 2005); науково-практичній конференції «Теорія та практика судової експертизи і криміналістики: збірник науково-практичних матеріалів» (м. Харків, 2006); науково-практичній конференції «Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практика: збірник наукових статей» (м. Запоріжжя, 2007); VІІ Національному з'їзді фармацевтів України «Фармація України. Погляд у майбутнє» (м. Харків, 2010).

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи опубліковані у 12 наукових працях, з них 5 - статті у наукових фахових виданнях та 7 тез доповідей на науково-практичних конференціях.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальних досліджень, загальних висновків, списку використаної літератури та додатків. Обсяг основного тексту дисертації складає 112 сторінок. Робота ілюстрована 20 рисунками і 16 таблицями. Список використаних літературних джерел містить 179 найменувань, з яких 143 іноземні.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі викладено актуальність теми, мету та основні задачі досліджень, наукову новизну і практичне значення одержаних результатів.

У першому розділі проаналізовані та узагальнені дані первинних джерел щодо фізико-хімічних, фармакологічних та токсикологічних властивостей, методів виявлення та визначення у біологічному матеріалі декстропропоксифену (ДПФ), який за своєю хімічною структурою є гідрохлоридом б-(+)-4-диметиламіно-1,2-дифеніл-3-метил-2-бутанол пропіонату та його метаболіту - нордекстропропоксифену (нор-ДПФ):

На підставі аналізу літературних джерел обґрунтована доцільність проведення експериментальних досліджень декстропропоксифену як одного з токсикологічно важливих об'єктів.



У другому розділі наведені експериментальні дані та обговорено вивчення крос-реактивності широко вживаних у практиці токсикологічних лабораторій тест-систем до ДПФ та проведення скринінгу методом тонкошарової хроматографії.

Тест-системи для експрес-діагностики наркотиків у сечі широко використовуються в даний час як перший етап токсикологічного дослідження. Однак, відомо, що внаслідок природних причин вони не відрізняються високою селективністю. Тому завжди є вірогідність отримання хибно-позитивних результатів. У літературі відсутні дані про крос-реактивність основних тест-систем на наркотики до декстропропоксифену. Проведені дослідження тест- систем на амфетамін, метамфетамін, МДМА, опіати, метадон виявились достатньо селективними і не давали хибно-позитивних результатів при наявності у сечі декстропропоксифену та нордекстропропоксифену.

Як відомо, «Спазмолекс» вживають не тільки для досягнення стану наркотичного сп'яніння, але і для купірування абстинентного синдрому, викликаного прийомом ацетильованих опіатів та трамадолу. Тому були проведені дослідження з вивчення селективності зареєстрованої в Україні тест-системи "Пропоксифен" фірми "Instant-View" (США).

Зі всіма зразками сечі наркоманів, які приймали трамадол, були отримані позитивні результати. Таким чином, тест-системи "Пропоксифен", які призначені для виявлення декстропропоксифену, мають перехресну реактивність до трамадолу та його метаболітів і можуть давати помилково-позитивні результати із зразками сечі, що містять метаболіти трамадолу.

Далі були проведені дослідження декстропропоксифену та його метаболіту у рамках методу ТШХ скринінгу. Визначення хроматографічної рухливості декстропропоксифену та нордекстропропоксифену проводили методами нормально-фазової хроматографії в загальновідомих системах скринінгу наркотичних та токсичних речовин основного характеру, прийнятих в Україні (№1-8) та рекомендованих Міжнародною асоціацією судових токсикологів (№3,6-9), а також в системі, запропонованій нами (№10):

1) бензол - етанол - діетиламін (90:10:10); 2) циклогексан - толуол - діетиламін (75:15:10); 3) хлороформ - метанол (90:10); 4) гексан - діетиловий ефір - діетиламін (50:50:5); 5) гексан - ацетон - 25% розчин амоніаку (50:50:5); 6) етилацетат - метанол - 25% розчин амоніаку (85:10:5); 7) метанол - 25% розчин амоніаку (100:1,5); 8) метанол; 9) толуол - ацетон - етанол - 25% розчин амоніаку (45:45:7,5:2,5); 10) ізопропанол - вода - 25% розчин амоніаку (60:30:0,2).

При розробці методики виявлення токсикантів методом тонкошарової хроматографії завжди необхідно приймати до уваги можливий вплив інших контрольованих речовин, які можуть застосовуватися спільно з цільовою речовиною та заважати її виявленню. Так, спільно з ДПФ наркомани використовують опіати та трамадол, тому для вивчення селективності усі згадані речовини були залучені до досліджень.

Результати дослідження представлені у таблиці 1.

Таблиця 1 Параметри хроматографічної рухливості досліджуваних речовин

Рухома фаза	Rf ±0,05
	Речовина
	Морфін	Кодеїн	ДПФ	Нор-ДПФ	Трамадол	Метаболіти трамадолу
1	0,25	0,63	0,84	0,76	0,84	0,68; 0,49
2	0,06	0,30	0,81	0,54	0,84	0,80; 0,14
3	0,36	0,36	0,57	0,14	0,33	0,58;0,52; 0,43; 0,14
4	0,06	0,19	0,85	0,88	0,88	0,76; 0,14
5	0,10	0,30	0,81	0,91	0,72	0,65; 0,23
6	0,13	0,26	0,82	0,73	0,81	0,91; 0,74; 0,49
7	0,46	0,55	0,69	0,81	0,44	0,69
8	0,15	0,17	0,69	0,89	0,44	0,41
9	0,23	0,38	0,80	0,63	0,69	0,79; 0,51; 0,32
10	0,33	0,33	0,74	0,88	0,43	0,76; 0,45; 0,20

Вивчення хроматографічної рухливості (табл.1) свідчить про те, що декстропропоксифен та нордекстропропоксифен добре відділяються від морфіну та кодеїну в усіх системах, тому вони не заважатимуть їх виявленню. При одночасній присутності трамадолу та його метаболітів розділити їх у системах № 6 та № 9, які використовують для первинного скринінгу речовин основного характеру, не вдається. Задовільне розділення забезпечують системи № 5 та № 8. Найбільш селективною є система № 8, в якій трамадол та його метаболіти виходять практично однією плямою та добре відділяються від декстропропоксифену та нордекстропропоксифену.

Крім того, ряд рухомих фаз селективних для ДПФ і нор-ДПФ можуть розглядатися як не корелюючі (наприклад, пари 2, 3, 6 та 7-10). Як відомо, застосування в токсикологічному аналізі не корелюючих рухомих фаз прирівнюється до використання іншого методу дослідження, що у результаті значно підвищує достовірність ідентифікації.

Оскільки у структурі нордекстропропоксифену присутня вторинна аліфатична аміногрупа, він буде давати характерне забарвлення з розчином нінгідрину, що може призводити до помилково-позитивного відкриття амфетамінів. Тому було проведене дослідження, спрямоване на вивчення хроматографічної рухливості нордекстропропоксифену та деяких фенілалкіламінів у системах, які зазвичай використовуються для виявлення амфетамінів:

6) етилацетат - метанол - 25% розчин амоніаку (85:10:5); 7) метанол - 25% розчин амоніаку (100:1,5); 9) толуол - ацетон - етанол - 25% розчин амоніаку (45:45:7,5:2,5).

Отримані результати представлені в таблиці 2.

Таблиця 2 Значення Rf аналізованих речовин

Речовина	Rf ±0,05
	Рухома фаза
	6	7	9
Декстропропоксифен	0,82	0,69	0,80
Нордекстропропоксифен	0,73	0,81	0,63
Метамфетамін	0,53	0,34	0,33
Амфетамін	0,70	0,66	0,62
Меткатінон	0,71	0,66	0,53
Ефедрин	0,44	0,30	0,30
Псевдоефедрин	0,68	0,63	0,65
Норпсевдоефедрин	0,52	0,6	0,71
Фенілефрин	0,63	0,50	0,56
МДМА	0,53	0,49	0,33
ДМА	0,42	0,40	0,66

Як свідчать дані таблиці 2, у системі 7 нордекстропропоксифен добре відокремлюється від більшості препаратів групи фенілалкіламінів, але декстропропоксифен має близьку рухливість з амфетаміном, меткатіноном та псевдоефедрином. Однак, він добре відділяється від усіх амфетамінів у системах 6 та 9, в той час як нор-ДПФ у цих системах майже не відділяється від деяких амфетамінів. Також треба відмітити, що усі три системи (№ 6,7,9) є такими, що не корелюють стосовно пари ДПФ - нор-ДПФ, що, як вже відзначалось вище, підвищує вірогідність дослідження.

Таким чином, проводячи дослідження у вказаних системах, можна надійно диференціювати ДПФ і нор-ДПФ від амфетаміну та його похідних.

Наступним етапом досліджень було пошук реактивів-проявників для візуалізації ДПФ та нор-ДПФ на платівках. Забарвлення, які виникають з загальними реактивами-проявниками, наведені у таблиці 3. Вивчення реагентів показало, що найбільш чутливими з них є реактиви Драгендорфа, Бургера та кислий йодплатинат калію, а найбільш специфічним - реактив Маркі.

Таблиця 3 Забарвлення плям декстропропоксифену та чутливість реакцій

Реагент	Забарвлення плям	Межа відкриття (мкг у плямі)
Реактив Драгендорфа (за Мун'є)	жовто-гаряче	0,2
Реактив Бургера	коричневе	0,2
Розчин йодплатинату кислий	жовто-коричневе	0,2
Реактив Маркі	чорно-фіолетове зелене	4
Тест Лібермана	коричневе	2
Тест Манделіна	зелено-коричневе	2
Ферриціанід мідний	рожеве	2
Розчин бромкрезолового зеленого	блакитне	2

Як вище вже наголошувалося, основну проблему при виявленні ДПФ та нор-ДПФ становлять трамадол і його метаболіти. Тому, представлялося цікавим диференціювати їх не тільки використанням селективних рухомих фаз, але й використанням специфічних реактивів-проявників. Проведені дослідження, результати яких наведені в таблиці 4, довели, що диференціювати декстропропоксифен та нордекстропропоксифен від трамадолу та його метаболітів можливо використовуючи для проявлення реактив Маркі або послідовним нанесенням розчину нінгідрину в ацетоні та реактиву Маркі.

Ще однією групою контрольованих засобів, яка може заважати виявленню нордекстропропоксифену при загальному скринінгу, є амфетаміни, тому представлялось важливим знайти специфічні реактиви, що дозволяють усунути цю проблему. При вивченні взаємодії вищезазначених речовин з реактивами на аміногрупи (реактиви Саймона та тривкий чорний Д) виявилось, що ні ДПФ, ні нор-ДПФ не дають з ними забарвлення, і використання цих реактивів дозволяє надійно відрізнити фенілалкіламіни від декстропропоксифену та нордекстропропоксифену (табл. 5).

Таблиця 4 Результати візуалізації препаратів проявниками

Реактив	Речовина
	ДПФ	Нор-ДПФ	Трамадол	Метаболіти трамадолу
Реактив Маркі	чорно-фіолетове зелене	чорно-фіолетове зелене	буро-коричневе	буро-коричневе
Послідовне нанесення реактиву Маркі та води	чорно-фіолетове зелене	чорно-фіолетове зелене	буро-коричневе смарагдово-зелене	буро-коричневе смарагдово-зелене
1% розчин нінгідрину в ацетоні + реактив Маркі	рожеве чорно-зелене	фіолетове чорно-зелене	темно-блакитне буро-коричневе	темно-блакитне буро-коричневе

Таблиця 5 Результати візуалізації препаратів

Речовина	1% розчин нінгідрину в ацетоні	Реактив тривкий чорний Д	Реактив Саймона
Декстропропоксифен	рожеве	---	---
Нордекстропропоксифен	фіолетове	---	---
Метамфетамін	фіолетово-коричневе	жовто-гаряче	блакитне
Амфетамін	фіолетово-коричневе	фіолетове	коричневе
Меткатінон	фіолетове	фіолетове	блакитне
Ефедрин	фіолетове	жовто-гаряче	блакитне
Псевдоефедрин	фіолетове	жовто-гаряче	блакитне
Норпсевдоефедрин	фіолетове	фіолетове	блакитне
Фенілефрин	фіолетове	жовто-гаряче	блакитне
МДМА	фіолетово-коричневе	жовто-гаряче	темно-блакитне
ДMA	жовте	фіолетове	рожеве

Таким чином, результати проведених досліджень дозволяють на стадії скринінгу ідентифікувати декстропропоксифен та його метаболіти у присутності опіатів, трамадолу та похідних фенілалкіламінів, використовуючи метод хроматографії в тонких шарах сорбенту в поєднанні з приведеними реактивами-проявниками.

Обернено-фазова хроматографія заснована на іншому принципі розділення, тому цікаво було вивчити можливості цього виду хроматографії для вирішення поставлених завдань. Дослідження методом обернено-фазової хроматографії проводилися на платівках «Плазмохром RP-3» в системах:

11) оцтова кислота - вода (15:85); 12) н-бутанол - оцтова кислота - вода (4:1:5); 13) етанол - вода (8:2).

Як проявники використовували реактив Маркі та кислий розчин йодплатинату. Результати представлені у таблиці 6.

Таблиця 6 Значення Rf аналізованих речовин

Рухома фаза	Речовина, Rf ±0,05
	ДПФ	Нор-ДПФ	Метаболіти трамадолу	Трамадол
11	0,08	0	0,25	0,31
12	0,33	0,80	0,38	0,44
13	0,53	0,85	0,8; 0,75; 0,32	0,40

Як видно з даних таблиці 6 деяка інформація може бути отримана в системі № 11, в якій декстропропоксифен та його метаболіти залишаються практично на старті, на відміну від трамадолу та його метаболітів. В інших системах ці речовини не розділяються.

Розділ 3 дисертації присвячений розробці методик виявлення та визначення декстропропоксифену методом газорідинної хроматографії, яка є одним з основних підтверджуючих методів у судово-медичній токсикології.

Декстропропоксифен є термічно нестійкою речовиною, тому його пряме визначення методом газорідинної хроматографії вважається проблематичним. Враховуючи, що декстропропоксифен є естером, ми розробили методику його виявлення методом реакційної хроматографії за продуктом гідролізу - 4-диметиламіно-1,2-дифеніл-3-метил-2-бутанолу:

Вивчення процесу гідролізу декстропропоксифену показало, що він повністю закінчується через 1 годину після початку в умовах, що використовуються для підготовки проб при виявленні опіатів та 1,4-бензодіазепінів. Тому для виявлення ДПФ немає необхідності робити гідроліз з окремою порцією біологічного матеріалу, а можливо використовувати гідролізат, отриманий на першому етапі скринінгу.

Дослідження проводились на газовому хроматографі “Shimadzu-2014” за наступних умов: газ носій - гелій, режим інжектора - без поділу потоку, температура інжектора - 240 0С, детектор ПІД, температура 260 0С, колонка капілярна HP-5 (довжиною 25 м, внутрішнім діаметром 0,2 мм, товщиною плівки 0,11 мкм), швидкість газу носія - 1 мл/хв. Температура термостату 150 0С, з утриманням 4 хв., потім приріст температури з швидкістю 10 0С/хв до 250 0С. Об`єм проби - 1мкл.

Було встановлено, що вибрані умови хроматографування забезпечують добру селективність - час утримання декстропропоксифену та вихідного аміноспирту (4-диметиламіно-1,2-дифеніл-3-метил-2-бутанолу) складає 9,2 та 7,5 хв., відповідно (рис.2). Структура 4-диметиламіно-1,2-дифеніл-3-метил-2-бутанолу (ДДМБ) встановлена методом хроматомас-спектрометрії (рис.1).



Рис.1 . Мас-спектр 4-диметиламіно-1,2-дифеніл-3-метил-2-бутанолу.

В основу методу кількісного визначення декстропропоксифену було покладено метод абсолютного градуювання. Для встановлення градуювальної залежності була виготовлена серія розчинів з концентраціями декстропропоксифену від 1,0 до 50,0 мг/л.

Рис. 2. Хроматограма екстракту крові з ДПФ та продуктом гідролізу.

Паралельно були досліджені контрольні проби екстрактів з чистої крові та екстрактів з трупної крові і печінки, які містили декстропропоксифен. Було встановлено, що компоненти матриці не заважають визначенню 4-диметиламіно-1,2-дифеніл-3-метил-2-бутанолу (рис.2).

При побудові градуювального графіку використовували залежність співвідношення площі піку (S) продукту гідролізу декстропропоксифену від концентрації (С, мг/л) декстропропоксифену, який піддавали гідролізу. Отримані дані були оброблені методом найменших квадратів. При цьому було встановлено, що лінійність спостерігається у всьому досліджуваному діапазоні від 1 мг/л до 50 мг/л і має вигляд:

S = 759,99 * Х, де

Х - концентрація (мг/ л);

S - площа піку

Для визначення метрологічних характеристик методики використовували три модельні розчини крові з вмістом декстропропоксифену у концентраціях 2,0; 28,0; 45,0 мг/л. Хроматографування проводили у вищезазначених умовах.

Таблиця 7 Результати кількісного визначення декстропропоксифену та метрологічні характеристики

Введено декстропропоксифену (мг/л)	Виявлено декстропропоксифену	Метрологічні характеристики
	мг/л	%
2,0	0,81	41,50	=43,19 S=2,17 S = 1,25 Д= 5,39 е = ±12,49% ± Д=43,19±5,39
28,0	11,60	42,43
45,0	18,74	45,64

З отриманих даних виходить, що відносна похибка середнього результату при кількісному визначенні декстропропоксифену методом ГРХ не перевищує припустимих для біоаналітичних методів 20%.

Розроблений метод було застосовано для вивчення такої важливої токсикологічної задачі, як визначення ефективності методів ізолювання декстропропоксифену з різного біологічного матеріалу. Результати досліджень представлені у таблиці 8.

Таблиця 8 Результати ізолювання декстропропоксифену з тканин біологічного матеріалу

Метод ізолювання	Внесено / Знайдено (мг/100г)	Вихід декстропропоксифену, (%)
Васильєвої	5,0 / 1,4	28
Стаса-Отто	5,0 / 0,95	19

Таким чином, вихід декстропропоксифену з біоматеріалу, одержаний використанням методу Васильєвої, перевищує результати використання методу Стаса-Отто.

Розділ 4 дисертації присвячений розробці методик дослідження з виявлення та визначення декстропропоксифену у біологічних об'єктах методом високоефективної рідинної хроматографії. У сучасній судово-медичній токсикології і терапевтичному лікарському моніторингу немає більш універсального методу, ніж високоефективна рідинна хроматографія. Цей метод посідає важливе місце серед інших аналітичних методів завдяки своїй високій чутливості, можливості визначення лікарських засобів не тільки в чистому вигляді, але і у біологічних об'єктах, а також дозволяє визначати їх метаболіти не тільки на якісному, але й на кількісному рівні. Тому нами були проведені дослідження по вивченню можливості виявлення та визначення декстропропоксифену у біологічному матеріалі методом високоефективної хроматографії.

Дослідження проводились на рідинному хроматографі «Agilent 1100» в режимі градієнтного елюювання - від 5% А до 95% Б за 40 хв. Рухома фаза: елюент А - перхлорат літію (0,2 М LiClO4 - 0,005M HClO4), елюент B - ацетонітрил. Температура колонки - 40єС. Колонка довжиною 150 мм х 4,6 мм з нерухомою фазою Prontosil 120-5C18AQ, УФ-детектування в діапазоні хвиль 210-300 нм. Об'єм проби - 50 мкл (автосамплер). Швидкість рухомої фази - 1 мл/хв. декстропропоксифен токсикологічний лікарський трупний

Для визначення параметрів утримання декстропропоксифену та можливого впливу компонентів матриці були досліджені етанольні розчини декстропропоксифену, зразки «чистої» крові і екстрактів з трупної крові та печінки, які містили декстропропоксифен. Середній час утримання декстропропоксифену склав 21,70,1хв, а нордекстропропоксифену - 20,40,1хв (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограма екстракту крові з ДПФ та продуктом метаболізму.

Для кількісного визначення декстропропоксифену у біологічному матеріалі було вибрано метод абсолютного градуювання і виготовлено серію градуювальних розчинів декстропропоксифену з концентраціями від 0,05 мг/л до 50,0 мг/л.

Отримані дані були оброблені методом найменших квадратів. При цьому було встановлено, що у досліджених діапазонах є дві лінійні залежності: від 0,05 мг/л до 1 мг/л та від 1 мг/л до 50 мг/л, що мають вигляд:

Н0.05-1 = 0,1212 * С

Н1-50 = 0,2517 * С,

де С - концентрація розчину, мг/л; Н - висота піку

Метрологічні характеристики методу визначались на модельних зразках крові з відомим вмістом декстропропоксифену.

Таблиця 9 Результати кількісного аналізу декстропропоксифену у розчинах методом ВЕРХ

Введено декстропропоксифену (мг/л)	Виявлено декстропропоксифену	Метрологічні характеристики
	мг/л	%
0,20	0,19	99,00	=98,10 S=7,37 S = 3,29 Д = 8,47 е = ±8,63% ± Д=98,10±8,47
0,50	0,44	87,40
1,00	0,96	95,70
10,00	10,75	107,49
50,00	50,44	100,89

Відносна невизначеність середнього результату при кількісному визначенні декстропропоксифену не перевищує 8,63 %, що відповідає вимогам до методів визначення речовин у біологічному матеріалі.

Розроблений метод було застосовано для вивчення такої важливої токсикологічної задачі, як визначення ефективності методів ізолювання декстропропоксифену з крові. Результати досліджень представлені у таблиці 10.

Як видно з даних таблиці 10, найкращі виходи були отримані при використанні для ізолювання органічних розчинників у присутності сульфату натрію. Однак ці екстракти були забруднені компонентами матриці та потребували додаткового очищення.

Оптимальним для використання як депротеїнізатора і екстрагенту виявився ацетонітрил, якій забезпечував належне співвідношення вихід-чистота екстрактів. Використання ацетонітрилу слід вважати позитивним моментом, враховуючи подальше застосування ВЕРХ у якості кінцевої аналітичної операції. Інші осаджувачі приводили до значних втрат декстропропоксифену при депротеїнізації.

Таблиця 10 Кількість декстропропоксифену, виявленого в крові

Осаджувач білку	Введено ДПФ, мг	Знайдено ДПФ, мг	Вихід, %
1 М CCl3COOH	10	1,86	18,60
10% HCl	10	1,53	15,29
Етанол	10	2,40	23,76
Ацетонітрил	10	3,87	38,68
З безв. Na2SO4	Хлороформ	10	6,07	60,70
	Етанол	10	5,12	51,22
	Ацетон	10	4,63	46,34
	Ефір	10	3,08	30,75

На основі розробленого методу було проведено дослідження з вивчення збереженості декстропропоксифену у біологічному матеріалі. Результати представлені у таблиці 11.

Таблиця 11 Збереженість декстропропоксифену у гнилісно-зміненому матеріалі

Місяці зберігання	Концентрація декстропропоксифену, мг/л (середнє з трьох досліджень)	Виявлено декстропропоксифену (% від початкового)
0	0,396	99,00
1	0,338	84,50
2	0,231	57,75
3	0,083	20,75
4	0,041	10,25
5	0,033	8,25

Як виходить з даних таблиці отримані результати вказують на можливість надійного визначення декстропропоксифену у гнильно-зміненому біологічному матеріалі за терміном до трьох місяців включно.

У п'ятому розділі результати проведених досліджень представлені у вигляді алгоритму токсикологічного аналізу при підозрі на отруєння ДПФ. З метою судово-токсикологічних досліджень використовують тканини органів та біологічні рідини(сеча та кров); для наркологічних та клініко-токсикологічних досліджень - переважно сечу.

Враховуючи, що при летальних отруєннях концентрація ДПФ в органах є достатньо великою, його виявлення в екстрактах, отриманих методом Васильєвої, при загальному ході судово-токсикологічних досліджень цілком можливим. Причому, приймаючи до уваги його основні властивості, дослідженню піддається «лужний» екстракт.

Як було показано у розділі 2 внаслідок метаболізму у сечі декстропропоксифен виявляється у вигляді дезметильованого похідного - нордекстропропоксифену. Останній також має основні властивості і виявляється у «лужному» екстракті.

Після хроматографування платівку оброблюють реактивами Драгендорфа та Маркі. Якщо з'явилися плями чорно-фіолетового кольору, що змінюють окрас у зелений з Rf=0,80±0,05 (ДПФ) та Rf=0,63±0,05 (нор-ДПФ), переходять до хроматографування у системах № 1 та № 2(див. алгоритм), які є некорелюючими по відношенню до скринінгової системи: ацетон - етанол - 25% розчин амоніаку (45:45:7,5:2,5), оскільки їх використання значно підвищує достовірність ідентифікації декстропропоксифену.

Як проявник на даному етапі знов застосовують реактив Маркі. Поява плям чорно-фіолетового кольору, що переходить у зелений в: системі 1: Rf=0,54±0,05 (нор-ДПФ); Rf=0,81±0,05 (ДПФ) та в системі 2: Rf=0,81±0,05 (нор-ДПФ); Rf=0,69±0,05 (ДПФ), вказує на наявність у досліджуваному об'єкті декстропропоксифену.

При отриманні результатів, які описані вище, можна зробити висновок про попереднє виявлення у біологічному матеріалі декстропропоксифену.

Підтверджуюче дослідження необхідно проводити методом газорідинної хроматографії в умовах розроблених нами.



У разі потреби визначення рівня декстропропоксифену у крові слід проводити дослідження методом високоефективної рідинної хроматографії методом, розробленим нами. На цьому етапі судово-токсикологічні дослідження завершуються висновком про встановлення (або невстановлення) факту наявності декстропропоксифену.

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі проведено комплекс хіміко-токсикологічних досліджень по розробці методів аналітичної діагностики отруєнь декстропропоксифеном, який включає методики пробопідготовки та ізолювання декстропропоксифену з біологічного матеріалу, виявлення його методами тонкошарової, газорідинної і високоефективної рідинної хроматографій, та визначення рівня його вмісту у крові.

1. Вивчена можливість виявлення декстропропоксифену у присутності деяких наркотичних речовин, що можуть заважати його ідентифікації. Результати проведених досліджень дозволяють на стадії скринінгу ідентифікувати декстропропоксифен та його метаболіт у присутності опіатів, трамадолу та похідних фенілалкіламінів, використовуючи метод хроматографії в тонких шарах сорбенту в поєднанні з специфічними реактивами-проявниками.

2. Вперше проведено порівняльне дослідження методів ізолювання декстропропоксифену з біологічного матеріалу. Показано, що методами Стаса-Отто та А.А.Васильєвої ізолюється лише приблизно 19 та 28% декстропропоксифену, відповідно.

3. Досліджено вплив різних депротеїнізаторів на вихід декстропропоксифену з крові та оптимізовані умови проведення процесу пробопідготовки. Встановлено, що оптимальне співвідношення вихід-чистота екстрактів забезпечується при використанні як осаджувача білків та екстрагенту ацетонітрилу.

4. Розроблено методику виявлення та визначення декстропропоксифену в крові методом високоефективної рідинної хроматографії зі спектрофотометричним детектуванням. Встановлено, що діапазон лінійних концентрацій методики знаходиться в межах від 0,05 мг/л до 50 мг/л та перекриває увесь діапазон від терапевтичних до летальних концентрацій.

5. Вивчено збереженість декстропропоксифену в гнильно-зміненому біологічному матеріалі. Отримані результати вказують на можливість надійного визначення декстропропоксифену у гнильно-зміненому біологічному матеріалі за термін до трьох місяців включно.

6. Розроблено методику газохроматографічного виявлення та визначення декстропропоксифену в біологічному матеріалі на капілярній колонці НР-5. Встановлено, що відносна похибка середнього результату при кількісному визначенні не перевищує ± 12,5%, а діапазон лінійних концентрацій методики знаходиться в межах від 1,0 до 50,0 мг/л.

7. На основі проведених досліджень розроблено алгоритм проведення хіміко-токсикологічного дослідження для виявлення і визначення декстропропоксифену у біологічному матеріалі, придатний для використання у наркологічній, судово-токсикологічній експертизі та клінічній токсикології.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Петюнін Г.П. Виявлення декстропропоксифену та його метаболітів методом хроматографії в тонких шарах сорбенту / Г.П. Петюнін, О.В. Хіжніченко // Вісник фармації. - 2008. ? №4(56). ? С. 9-12. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів та прийнята участь у написанні статті).

2. Петюнін Г.П. Визначення декстропропоксифену в біологічному матеріалі методом високоефективної рідинної хроматографії / Г.П. Петюнін, О.В. Хіжніченко // Фармацевтичний журнал. - 2011. - Вип. 3.- С. 65-70. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів та прийнята участь у написанні статті).

3. Петюнін Г.П. Визначення декстропропоксифену у біологічному матеріалі методом газорідинної хроматографії / Г.П. Петюнін, О.В. Хіжніченко // Фармацевтичний журнал. - 2011. - Вип. 4. - С. 64-66. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів та прийнята участь у написанні статті).

4. Хіжніченко О.В. Хіміко-токсикологічне дослідження нових лікарських засобів - потенційних обґєктів немедичного використання методом хроматографії у тонких шарах сорбенту / О.В. Хіжніченко, Н.В. Гузенко, О.В. Чубенко // Фармацевтичний журнал. - 2012. - Вип. 6. - С.74-78. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів та прийнята участь у написанні статті).

5. Хижниченко О.В. Разработка алгоритма аналитической диагностики факта употребления или отравления декстропропоксифеном / О.В. Хижниченко, Г.П. Петюнин // Український медичний альманах. - 2013. - Том 16, №1. ? С. 103,104. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка результатів та прийнята участь у написанні статті).

6. Хижниченко О.В. Идентификация декстропропоксифена и некоторых запрещенных веществ / О.В. Хижниченко // Стан, перспективи судово-токсикологічної служби та наукових досліджень. - Х., 2005. ? С. 55, 56. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

7. Хіжніченко О.В. Розробка аналітичної діагностики фату вживання декстропропоксифену / О.В. Хіжніченко // Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини. - Х., 2005. ? С. 97. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

8. Петюнин Г.П. Идентификация декстропропоксифена методом хроматографии в тонких слоях сорбента / Г.П. Петюнин, О.В. Хижниченко // Теорія та практика судової експертизи і криміналістики: Збірник науково-практичних матеріалів Харківського НДІ судових експертиз ім. Засл. проф. М.С. Бокаріуса. - 2005. - Вип. 5. ? С. 348-350. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

9. Петюнин Г.П. Идентификация декстропропоксифена и некоторых запрещенных веществ при их совместном присутствии / Г.П. Петюнин, О.В. Хижниченко // Актуальні питання та перспективи розвитку судової медицини та криміналістики. - Х., 2005. ? С. 145-147. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

10. Хижниченко О.В. Обнаружение декстропропоксифена, трамадола, их метаболитов в биологическом материале / О.В. Хижниченко // Теорія та практика судової експертизи і криміналістики: Збірник науково-практичних матеріалів Харківського НДІ судових експертиз ім. Засл. проф. М.С. Бокаріуса. - 2006. - Вип. 6. ? С. 287-291. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

11. Хижниченко О.В. Обнаружение декстропропоксифена, опиатов, фенилалкиламинов, трамадола и их метаболитов при совместном присутствии в биологическом материале / О.В. Хижниченко, Г.П. Петюнин // Актуальні питання фармацевтичної та медичної науки та практики. Збірник наукових статей. Випуск ХХ. / М-во охорони здоров'я України, Запорізький Держ. мед. Ун-т. - З. : ЗДМУ, 2007. - С. 309. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

12. Хижниченко О.В. Обнаружение и определение декстропропоксифена в биологическом материале методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / О.В. Хижниченко, Г.П. Петюнин // Фармація України. Погляд у майбутнє : матеріали VІІ Національного з'їзду фармацевтів України, 15-17 верес. 2010 р. У 2 т. / М-во охорони здоров'я України, Нац. фармац. Ун-т ; ред. В.П. Черних. - Х. : НФаУ, 2010. - Т. 1. - С. 181. (Особисто дисертантом виконані експериментальні дослідження та прийнята участь у підготовці тезисів).

АНОТАЦІЯ

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2014.

Дисертаційна робота присвячена хіміко-токсикологічному дослідженню наркотичного анальгетика - декстропропоксифену.

Вперше проведені порівняльні дослідження методів ізолювання декстропропоксифену з біологічних об'єктів, різних депротеїнізаторів на вихід декстропропоксифену із трупної крові та оптимізовані умови проведення пробопідготовки.

Розроблена методика проведення токсикологічного скринінгу на декстропропоксифен методом ТШХ, що дозволяють виявляти його та його метаболіт - нордекстропропоксифен у біологічному матеріалі.

Розроблено методики виявлення та визначення декстропропоксифену в біологічному матеріалі методами газорідинної та високоефективної рідинної хроматографії, визначені їх метрологічні характеристики та границі використання.

На основі проведених досліджень розроблено алгоритм проведення хіміко-токсикологічного дослідження на декстропропоксифен.

Ключові слова: декстропропоксифен, тонкошарова хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія, газо-рідинна хроматографія, біологічний матеріал, скринінг, методи ізолювання, пробопідготовка.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2014.

Диссертационная работа посвящена химико-токсикологическому исследованию наркотического анальгетика - декстропропоксифена и разработке методов аналитической диагностики приема и отравлений этим препаратом, пригодных для целей наркологической экспертизы, клинической и судебно-медицинской токсикологии.

Изучена селективность зарегистрированных в Украине тест-систем «Экстази», «Барбитураты», «Фенциклидин» «Опиаты», «Амфетамин», «Метамфетамин», «Кокаин», «ТСН», «Метадон», «Бупренорфин» в отношении декстропропоксифена. Установлено отсутствие перекрестной чувствительности перечисленных тест-систем к последнему. В то же время показано, что иммунохроматографические системы "Пропоксифен", предназначенные для обнаружения декстропропоксифена, имеют перекрестную реактивность к трамадолу и его метаболитам и могут давать ложно-положительные результаты даже при отсутствии декстропропоксифена в биоматериале.

Исследованы возможности различных видов тонкослойной хроматографии для обнаружения декстропропоксифена в биологическом материале. Установлено, что обнаружить декстропропоксифен и его метаболит - нордекстропропоксифен в присутствии ряда других контролируемых средств в условиях стандартных скрининговых подвижных фаз не удается. Предложены селективные хроматографические системы для идентификации целевых веществ, а также специфические проявители, которые позволяют надежно обнаруживать нордекстропропоксифен и декстропропоксифен в присутствии веществ, употребляемых совместно.

Разработана методика обнаружения и определения декстропропоксифена в биологическом материале методом реакционной газожидкостной хроматографии по продукту гидролиза. Структура продукта гидролиза была подтверждена методом хроматомасс-спектрометрии. Диапазон линейных концентраций методики находится в пределах от 1,0 до 50,0 мг/л. Относительная неопределенность среднего результата не превышает ±12,5%.

Проведено сравнительное изучение изолирования декстропропоксифена из биологического материала методами Стаса-Отто и Васильевой. Выходы декстропропоксифена составили 19 и 28%, соответственно.

Разработана методика обнаружения и определения декстропропоксифена методом микроколоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием. Линейность методики перекрывает диапазоны - от терапевтических до летальных концентраций. Относительная погрешность не превышает допустимые при исследовании биологических объектов значения.

Изучено влияние депротеинизаторов на изолирование декстропропоксифена из крови, а также экстракция органическими растворителями из сухой смеси крови с безводным натрия сульфатом. Установлено, что оптимальное соотношение выход-чистота экстрактов обеспечивается при использовании в качестве осадителя белка и экстрагента ацетонитрила.

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии изучена сохраняемость дектропропоксифена в гнилостно-измененном биологическом материале в условиях, имитирующих природное захоронение. Предельный срок возможного обнаружения декстропропоксифена в гнилостно-измененном биологическом материале ограничен тремя месяцами.

По результатам проведенных исследований предложен алгоритм проведения аналитической диагностики отравлений декстропропоксифеном, основанный на разработанных методиках пробоподготовки биологического материала, обнаружении его скрининговыми исследованиями методом тонкослойной хроматографии и подтверждающих исследований методами газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, пригодный для использования в наркологической и судебно-токсикологической экспертизе, клинической токсикологии.

Ключевые слова: декстропропоксифен, биологический материал, скрининг, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, газожидкостная хроматография, методы изолирования, пробоподготовка.

Dissertation for the degree of pharmaceutical sciences, specialty 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National Рharmaceutical University, Kharkiv, 2014.

The thesis is devoted to chemical-toxicological investigation narcotic analgesics - propoxyphen.

A comparative study of methods of propoxyphen isolation from biological objects, various deprotonating agents on the propoxyphen output of cadaveric blood and optimized conditions of sample preparation was carried out.

Developed method for toxicologycal screening of propoxyphen and its metabolite-norpropoxyphene in biological material by TLC method.

The methods of detection and identification of propoxyphen in biological material by of gas-liquid and high performance liquid chromatography were developed and identified their metrological characteristics and limits of use.

The research algorithm of chemical-toxicological studies on propoxyphen, based on the carried out investigations is developed.

Keywords: propoxyphen, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, gas-liquid chromatography, biological material, screening, isolation methods, sample preparation.

Размещено на Allbest.ru

...