Ушкодження дезоксирибонуклеїнової кислоти нейронів при дії ресвератрола за умов моделювання хронічної судинної патології головного мозку у мишей

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 612.8-092:616.005:615.03

Національний військовий медичний клінічний центр «Головний військовий клінічний госпіталь»

УШКОДЖЕННЯ ДНК НЕЙРОНІВ ПРИ ДІЇ РЕСВЕРАТРОЛА ЗА УМОВ МОДЕЛЮВАННЯ ХРОНІЧНОЇ СУДИННОЇ ПАТОЛОГІЇ ГОЛОВНОГО МОЗКУ У МИШЕЙ

Хронічна гіпоперфузія головного мозку (ГМ) є патогенетичним механізмом та фактором ризику розвитку захворювань центральної нервової системи (ЦНС). Встановлення механізмів ушкодження ГМ при хронічній судинній патології та можливість впливу на неї є актуальною проблемою. Оклюзійно-стенотична патологія брахіоце- фальних артерій, зокрема, атеросклеротичного характеру, є важливою причиною гіпоперфузії ГМ. Механізми ушкодження ГМ при хронічних його захворюваннях на молекулярно- генетичному рівні остаточно не встановлені. Існують дані, які вказують на ушкодження ДНК нейронів у механізмах ішемічного інсульту та дегенеративних процесів ГМ. В цих умовах тканина ГМ піддається оксидативному стресу, що викликає пошкодження ДНК, геному нейронів, їх заги ДНК-комет, ресвератрол бель. При цьому, ступінь пошкодження та регенерації ДНК корелює зі ступенем нейрогенезу та функціонального відновлення при ураженні нервово-судинної системи [7].

Ресвератрол (РВ) (відомий природний поліфенол) має нейропротекторну дію при ішемічному інсульті, субарахноїдальному крововиливі, черепно-мозковій травмі [4]. Показані протизапальні та антиоксидантні властивості РВ, які пов'язані з індукцією антиоксидантних ферментів [8]. Молекулярно-генетичні механізми дії РВ в умовах хронічної патології ЦНС висвітлені в літературі недостатньо. Тому, метою нашої роботи було встановити ступінь ушкодження ДНК нейронів мишей та вплив на нього нейромодулятора РВ в умовах експериментальної хронічної оклюзії загальної сонної артерії (ХОЗСА).

Матеріали і методи

Дослідження були проведені на самцях мишей лінії С57Bl (m=15-18), які знаходились на стандартному раціоні віварію Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця при стандартному світловому режимі (12 годин - день, 12 годин - ніч), згідно міжнародним конвенціям по захисту тварин, яких застосовують у експериментальних та інших наукових цілях (Страсбург, 1985), та положенням Комітету по біоетиці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця.

Тварини були розподілені на 3 групи: 1 - контрольна (n=10), 2 - тварини, яким моделювали створення ХОЗСА (n=10), 3 - тварини, яким на фоні ХОЗСА вводили i.p. ресвератрол (10 мг/кг) на протязі 10 днів (7 діб до та 3 після створення оклюзії ЗСА) (n=10). При моделюванні ХОЗСА мишам під кетаміновим наркозом (1 мл / 300 г) здійснювали перев'язку лівої ЗСА, після чого рану ушивали.

Через 8 тижнів після накладення лігатури у тварин вивчали особливості пошкодження ДНК в обох півкулях ГМ. Після декапітації ГМ промивали охоложденим розчином, подрібнювали та гомогенізували у розчині PBS (pH 7.4, 4°С). Пошкодження клітин при виділенні перевіряли шляхом їх забарвлення трипановим синім. Оцінювали близько 200 клітин за допомогою люмінесцентного мікроскопа «Люмам И-1» (ЛОМО, Росія). Клітини ресуспендіювали у PBS і використовували у аналізі ДНК-комет.

Для встановлення ушкодження ДНК у ядрах нейронів обох півкуль ГМ мишей використовували метод лужного гель-електрофорезу ізольованих клітин (метод ДНК-комет - «DNA-comet assay») за Afanasieva та співавт. [1] з модифікаціями, за яким розміри хвоста ДНК-комети позитивно корелюють зі ступенем ушкодження ДНК [2]. Електрофорез препаратів проводили за допомогою приладу Multiphor II («LKB», Швеція). Аналіз ДНК-комет на електрофореграмах, забарвлених флуоресцентним барвником DAPI, здійснювали візуально, використовуючи люмінесцентний мікроскоп «Люмам И-1» (ЛОМО, Росія). Застосовували напівкількісний метод оцінки інтенсивності забарвлення та довжини хвостів комет, на кожному мікропрепараті аналізували не менше ніж 100 окремо розташованих ДНК-комет. За співвідношенням ДНК у “голові” та “хвості” комети поділяли за загальновизнаною класифікацією на 5 класів з числовим значенням від 0 до 4 [2].

Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою програми GraphPad Prism version 5.00 for Windows (GraphPad Software, США); р<0,05 вважали статистично вірогідним.

Результати та їх обговорення

В умовах моделювання ХОЗСА в обох півкулях ГМ відмічалась фрагментація ДНК нейронів ГМ, при цьому відбувалось достовірне зменшення живих клітин (класи 0-1 ДНК-комет) за рахунок збільшення пошкоджених нейронів (класи 3-4 ДНК-комет). Найбільші відмінності рівнів фрагментації ДНК нейронів ГМ реєстрували в симптомній гемісфері (Рис.1).

Отримані нами дані про фрагментацію ДНК нейронів ГМ при ХОЗСА свідчать про патологічні зміни в ЦНС, для яких характерна загибель клітин. Застосування РВ як нейропротектора з метою профілактики та лікування захворювань ЦНС матиме важливе медичне значення. Тому нами була досліджена дія РВ на тканину ГМ мишей в умовах ХОЗСА, а саме на ДНК нейронів ГМ. головний мозок оклюзія артерія

Проведені нами дослідження показали, що дія РВ в умовах моделювання ХОЗСА відновлює показники ушкодження ДНК нейронів до показників контрольної групи. Особливо важливими ці результати є з унілатеральної сторони, що вказує на захисні властивості РВ, який зменшує ушкодження ДНК нейронів (за рахунок збільшення класів 0-1 ДНК-комет) в обох півкулях ГМ. Зміни рівнів фрагментації ДНК нейронів при дії РВ статистично не відрізнялись від контрольних значень

Даних про вплив РВ на пошкодження ГМ на молекулярно-генетичному рівні майже не зустрічається. Можливо, описана нами дія РВ реалізується завдяки антизапальному та нейропротек- торному його ефектам через модуляцію експресії деяких мікроРНК (miRNome), через активацію апуринової / апіримідинової ендонуклеази 1, яка представляє собою багатофункціональний фермент, сприяючий відновленню основ видаленням окисної ДНК та редокс-активації транскрипційних факторів, пов'язаних з виживанням нейронів при гіпоксично-ішемічному пошкодженні ГМ, а також через активацію SIRT1 [3;5;6].

Таким чином, введення ресвератролу за умов ХОЗСА у мишей призводить до зменшення ушкодження Днк нейронів обох півкуль ГМ, що вказує на його нейропротекторний вплив за даних патологічних умов.

Література

1. Afanasieva K. Kinetics of comet formation in single-cell gel electrophoresis: Loops and fragments / K. Afanasieva, M. Zazhytska, A. Sivolob // Electrophoresis. - 2010. - Т.31. - С.512- 519.

2. Collins A.R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations / A.R. Collins // Mol. Biotechnol. - 2004. - Vol. 26, №3. - Р.249-261.

3. de Queiroz K.B. Resveratrol Acts anti-inflammatory and neuroprotective in an infant rat model of pneumococcal meningitis by modulating the hippocampal miRNome / K.B. de Queiroz, T. Dos Santos Fontes Pereira, M.S.S. Araj [et al.] // Mol. Neurobiol. - 2018. - Vol. 55, №4. - P.4037-4045.

4. Girbovan C. Repeated resveratrol administration confers lasting protection against neuronal damage but induces dose-related alterations of behavioral impairments after global ischemia / C. Girbovan, L. Morin, H. Plamondon // Behav. Pharmocol. - 2012. - Vol. 23. - P.1-13.

5. Jia J.Y. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) contributes to resveratrol induced neuroprotection against oxygen glucose deprivation and re oxygenation injury in HT22 cells: Involvement in reducing oxidative DNA damage / J.Y. Jia, Z.G. Tan, M. Liu // Mol. Med. Rep. - 2017. - Vol. 16, №6. - Р.9786-9794.

6. Koronowski K.B. Resveratrol preconditioning induces a novel extended window of ischemic tolerance in the mouse brain / K.B. Koronowski, K.R. Dave, I. Saul [et al.] // Stroke. - 2015. - Vol. 46. - P.2293-2298.

7. Li P. Oxidative stress and DNA damage after cerebral ischemia: Potential therapeutic targets to repair the genome and improve stroke recovery / P. Li, R.A. Stetler, R.K. Leak [et al.] // Neuropharmacol. - 2017. - pii: S0028-3908(17). - P.3052030528.

Анотація

Метою цієї роботи було вивчення змін фрагментації ДНК ядер нейронів в обох півкулях головного мозку мишей за умов моделювання хронічної унілатеральної оклюзії загальної сонної артерії при дії ресвератролу. Методи. Дослідження проводили на мишах лінії С57 в контрольній групі, при моделюванні хронічної унілатеральної оклюзії загальної сонної артерії, при введенні ресвератролу (10 мг/кг, i. p., 7 діб до та 3 доби після оклюзії) на фоні хронічної унілатеральної оклюзії загальної сонної артерії. Хронічна унілатеральна оклюзія загальної сонної артерії викликалась перев'язкою лівої загальної сонної артерії. Через 8 тижнів у наркотизованих тварин вилучали мозок та вивчали пошкодження ДНК ядер нейронів методом ДнК-комет в обох півкулях головного мозку. Результати. В умовах моделювання хронічної унілатеральної оклюзії загальної сонної артерії зменшується рівень живих клітин (класи 0-1 ДНК-комет) в обох півкулях головного мозку за рахунок збільшення пошкоджених нейронів (класи 3-4 ДНК-комет) переважно з унілатеральної сторони до 17,20±0,29% (р<0.05). Введення ресвератролу при моделюванні хронічної унілатеральної оклюзії загальної сонної артерії збільшує кількість живих клітин (класи 0-1 ДнК-комет) особливо з симптомної сторони до 90±0,37% за рахунок зменшення рівня ушкоджених клітин до 1,33±0,09%, відновлюючи показники фрагментації дНк до контрольної групи (р<0.05). Висновок. Хронічна оклюзія загальної сонної артерії супроводжується фрагментацією ДНК нейронів обох півкуль головного мозку переважно з уні- латеральної сторони. Введення ресвератролу зменшує пошкодження ДНК, що свідчить про його нейропротекторний вплив за даних патологічних умов.

Ключові слова: хронічна оклюзія загальної сонної артерії, метод

Целью данной работы было изучение изменений фрагментации ДНК ядер нейронов обоих полушарий головного мозга мышей в условиях моделирования хронической унилатеральной окклюзии общей сонной артерии при действии ресвератрола. Методы. Исследования проводили на мышах линии С57 в контрольной группе, при моделировании хронической унилатеральной окклюзии общей сонной артерии, при введении ресвератрола (10 мг/кг, i. p., 7 дней до и 3 дня после окклюзии) на фоне хронической унилатеральной окклюзии общей сонной артерии. Хроническая унилатеральная окклюзия общей сонной артерии вызывалась перевязкой левой общей сонной артерии. Через 8 недель у наркотизированных животных выделяли мозг и изучали повреждение ДНК ядер нейронов методом ДНК-комет в обоих полушариях головного мозга. Результаты. В условиях моделирования хронической унилатеральной окклюзии общей сонной артерии уменьшается уровень живых клеток (классы 01 ДНК-комет) в обоих полушариях головного мозга за счет увеличения повреждения нейронов (классы 3-4 ДНК-комет) преимущественно с унилатеральной стороны до 17,20±0,29% (р<0.05). Введение ресвератрола при моделирования хронической унилатеральной окклюзии общей сонной артерии увеличивало количество живых клеток (классы 0-1 ДНК-комет) особенно с симптомной стороны до 90±0,37% за счет уменьшения уровня поврежденных клеток до 1,33±0,09%, восстанавливая показатели фрагментации ДНК до контрольной группы (р<0.05). Выводы. Хроническая окклюзия общей сонной артерии сопровождается фрагментацией ДНК нейронов обоих полушарий головного мозга преимущественно с унилатеральной стороны. Введение ресвератрола уменьшает повреждение ДНК, что свидетельствует о его нейропротекторном действии в данных патологических условиях.

Ключевые слова: хроническая окклюзия общей сонной артерии, метод ДНК-комет, ресвератрол

The purpose of this work was to investigate changes in DNA fragmentation of neuron nuclei in both cerebral hemispheres of mice subjected to chronic unilateral occlusion of common carotid artery under action of resveratrol. Methods. The study covered 3 groups of C57 male mice: control grpup; mice subjected to modelled chronic unilateral occlusion of common carotid artery; mice subjected to modelled chronic unilateral occlusion of common carotid artery under resveratrol action (10 mg/kg, intaperitoneally, 7 days before and 3 day after the modelled occlusion). Chronic unilateral occlusion of common carotid artery was performed by applying left common carotid artery ligation. In 8 weeks, brain tissues samples were taken from left and right hemispheres of narcotized animals and neuron nuclear DNA damages were investigated by DNA-comet assay. Results. Under conditions of chronic unilateral occlusion of the common carotid artery modelling, the level of living cells (classes 0-1 of DNA-comet) in both cerebral hemispheres lowered due to an increase in damaged neurons (classes 3-4 DNA-comet), mainly on the unilateral side up to 17.20±0.29% (p<0.05). The administration of resveratrol during the modelled chronic unilateral occlusion of the common carotid artery increased the number of living cells (classes 0-1 of the DNA-comet), especially from the symptomatic side to 90±0.37%, by reducing the level of damaged cells to 1.33±0.09% and restoring the DNA fragmentation parameters to the relevant findings of the control group (p<0.05). Conclusion. Chronic occlusion of the common carotid artery was accompanied by DNA fragmentation of the neurons in both cerebral hemispheres mainly from the unilateral side. The introduction of resveratrol reduces the DNA damage that indicates its neuropro- tective effect in these pathological conditions.

Key words: chronic occlusion of common carotid artery, DNA-comet assay, resveratrol

Размещено на Allbest.ru