Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДУ «ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ НАМН УКРАЇНИ»

УДК 616-006.4+612.119+616.419

14.01.31 - гематологія та трансфузіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Прогностичний потенціал МАРКЕРІВ ДИФЕРЕНЦІАЦІЇ CD34, CD117, CD33 ТА ВНУТРІШНЬОЯДЕРНОГО МАРКЕРА ПРОЛІФЕРАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ Кі-67 у хворих на мієлодиспластичний синдром

Стародуб Галина Сергіївна

Київ - 2017

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України».

Науковий керівник: доктор медичних наук, старший науковий співробітник, Горяінова Надія Валеріївна, ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України», заступник директора з наукової роботи.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Гайдукова Світлана Миколаївна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, професор кафедри гематології та трансфузіології;

доктор медичних наук, професор, заслужений діяч науки і техніки України Новак Василь Леонідович, ДУ «Інститут патології крові та трансфузійної медицини НАМН України», директор.

Захист відбудеться «____» ____________ 2017 р. о ____ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01, Державної установи «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» (04060, м. Київ, вул. М. Берлинського, 12).

Автореферат розісланий «_____» ________________ 2017 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Р.П. Павлюк

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. Мієлодиспластичний синдром (МДС) належить до клінічно, морфологічно, генетично гетерогенної групи захворювань, що характеризуються клональністю та виникають внаслідок мутації в гемопоетичній клітині-попередниці [D. Bowen et al., 2013; R. Bejar, P. David, 2014]. Диференціювання нащадків такої трансформованої стовбурової клітини призводить до неефективного дозрівання клітин мієлоїдного паростку та диспластичних змін у кістковому мозку (КМ). Зважаючи на те, що МДС характеризується прогресуючим несприятливим перебігом та високою ймовірністю його трансфомації в гостру лейкемію (ГЛ), на поточний момент вибір терапії ґрунтується на відповідності хворого групі ризику прогресування процесу [L. Malcovati, 2013; S.C. Chu, 2014].

Під час визначення групи ризику трансформації МДС в гостру мієлоїдну лейкемію (ГМЛ) приймають до уваги відсоток бластних клітин в КМ, наявність окремих цитогенетичних аномалій та в якій кількості паростків спостерігається цитопенія в периферичній крові (ПК). Наведені показники у 1987 році були систематизовані в Міжнародній прогностичній бальній системі (IPSS) для МДС, яка в 2012 році була оновлена влюченням додаткових цитогентичних аберацій [R. Bejar; 2014]. Інша система для виначення перебігу захворювання - Прогностична бальна система ВООЗ (WPSS) - належить до більш удосконалених інструментів та враховує морфологічний варіант МДС, особливості каріотипу та потребу в гемотрансфузії [L. Peter Greenberg et al., 2012].

Факторами, які потенційно спроможні використовуватись під час оцінки тривалості періоду безпрогресивного перебігу МДС, трансфузійної незалежності та прогнозування резистентності до терапії, є показники експресії кластерів диференціації (CD) на субстратних клітинах. Зокрема, Проточна цитометрична бальна система (FCSS), що розроблена для оцінки прогнозування перебігу МДС, включає в себе відсоток клітин мієлоїдного паростку з атиповою експресією CD45, CD34, CD117, CD33, CD13, CD11b, CD5, CD7, CD19, CD13/16, CD56 та HLA-DR [M.G. Della Porta et al., 2015; T.F. Wang et al., 2011]. Так, хворі на МДС із помірними відхиленнями імунофенотипу, що оцінюються відповідно до FCSS, мають довшу безпрогресивну та загальну виживаність. Натомість наявність мієлоїдних клітин із суттєво аберантним імунофенотипом є предиктором появи трансфузійної залежності та трансформації МДС у ГМЛ [L.E. Brodersen et al., 2014]. Прослідковують залежність між експресією CD34/CD33 клітинами та різними мієлоїдними неоплазіями. Зокрема підтверджено, що найвищій рівень концентрації CD33 антигену та CD34 на субстратних клітинах визначається при ГМЛ, другу позицію займає МДС, а третю - хронічна мієлоїдна лейкемія [Estey E.H., 2013]. Іншими перспективними потенційними предикторами прогресування МДС, його трансформації в ГМЛ, а також фактором формування певних клініко-гематологічних особливостей захворювання є ядерні фактори проліферації, найбільш значущими з яких є Кі-67. Зокрема, за результатами дослідження J. M. Ben-Ezra та співавт., високий рівень ядерної експресія Кі-67 асоціюється з бластозом при МДС [2015].

Дотепер відсутній системний алгоритм оцінки прогнозування перебігу МДС, його трансформації в ГМЛ, а також відповіді на терапію цитостатичними та імуномоделюючими засобами з урахуванням інтенсивності експресії CD33, CD34, CD117 та Кі-67 бластними клітинами. [Aster J.C. et al., 2014]. Тому дослідження впливу інтенсивності експресії CD33, CD34, CD117 та Кі-67 субстратними клітинами на перебіг захворювання та відповіді на терапію цитостатичними та імуномодулюючими засобами дозволить обґрунтовано вдосконалити алгоритм стратифікації пацієнтів відповідно до групи ризику прогресування МДС, а також обрати найбільш оптимальну терапевтичну лінію.

Проте, незважаючи на досягнення у вивченні патогенезу МДС та збільшення кількості новітніх прогностичних систем і груп ризику, дотепер не досягнуто значного прогресу як у лікуванні МДС, так і у визначенні прогностичних ознак, що передують швидкій трансформації МДС в ГЛ.

Усе вищезазначене зумовлює необхідність подальшого вивчення патогенезу МДС та обґрунтовує актуальне завдання визначення нових критеріїв прогнозу захворювання.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана на базі відділення захворювань системи крові ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» та є фрагментом комплексної науково-дослідної теми 0115U000312 «Визначення клініко-гематологічних, імунологічних та цитогенетичних предикторів прогнозу мієлодиспластичного синдрому», де здобувач був співвиконавцем роботи.

Мета роботи. Встановити критерії прогнозування прогресії МДС та ефективності терапії на підставі визначення предикативної інтенсивності експресії CD34, CD33, CD117, Кі-67 субстратними клітинами ПК та КМ.

Завдання дослідження:

1. Визначити клініко-гематологічні та цитоморфологічні характеристики хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ.

2. Дослідити інтенсивність експресії маркера проліферативної активності Кі-67 у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ до лікування.

3. Встановити рівень експресії Кі-67 у хворих на МДС РАНБ І після лікування імуномодулюючим препаратом (талідомід).

4. Визначити динаміку експресії Кі-67 у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ до та після лікування цитостатичними засобами.

5. Проаналізувати особливості експресії CD34, CD34/CD117, CD33 на субстратних клітинах хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ до лікування.

6. Встановити ефективність лікування імуномодулюючим засобом (талідомід) хворих на МДС РАНБ І.

7. Визначити особливості експресії CD34, CD34/CD117, CD33 на субстратних клітинах хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ після проведення лікування цитостатичними препаратами.

8. Дослідити взаємозв'язок між клініко-гематологічними показниками та експресією Кі-67 на субстратних клітинах у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ.

9. Визначити взаємозв'язок між клініко-гематологічними показниками та експресією CD34, CD34/ CD117, CD33 на субстратних клітинах у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ.

Об'єкт дослідження: МДС РАНБ І та РАНБ ІІ у дорослих хворих, відповідь на терапію, трансформація МДС у ГЛ.

Предмет дослідження: субстратні клітини КМ та ПК, маркери диференціації CD34, CD34/CD117, CD33 на субстратних клітинах ПК та КМ, внутрішньоядерний маркер проліферативної активності Кі-67 субстратних клітин КМ та ПК при МДС, програми терапії, тривалість ремісії.

Методи дослідження: клініко-гематологічні, імунофенотипові, імуногістохімічні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

В результаті проведених досліджень поглиблено знання про перебіг та біологічні особливості МДС РАНБ І та МДС РАНБ ІІ, а саме:

· вперше визначено прогностичну та діагностичну валідність маркерів диференціації субстратних клітин ПК та КМ CD34, CD117, CD33 та внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67 у хворих на МДС РАНБ І і МДС РАНБ ІІ, на підставі чого уточнені додаткові предиктори отримання позитивної відповіді на лікування або прогресування патологічного процесу з трансформацією в ГЛ;

· вперше запропоновано прогностичні критерії перебігу МДС РАНБ І та відповіді на терапію на підставі визначення вмісту субстратних клітин ПК та КМ, що експресують CD34, CD117, CD33;

· отримано нові докази прогностичної ефективності визначення експресії внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67 субстратних клітин КМ та ПК при МДС РАНБ І та РАНБ ІІ;

· на підставі статистичного аналізу розраховано, що ймовірність отримати загальну та повну відповідь на терапію імуномодулюючим препаратом при МДС РАНБ І вища відповідно в 1,89 та 2,39 рази, ніж при застосуванні цитостатичних засобів;

На основі отриманих результатів проведеного дослідження запропоновані нові критерії прогнозу та стратифікації лікування хворих на МДС, які ґрунтуються на визначенні маркерів диференціації та проліферативної активності клітин КМ та ПК.

Практичне значення одержаних результатів. На основі проведення комплексного аналізу визначені найбільш інформативні прогностичні критерії перебігу МДС РАНБ І та РАНБ ІІ. Для гематологічних стаціонарів України запропоновано додаткові вагомі дослідження, за даними яких пацієнтів можна розподіляти на ризик-групи та вчасно призначати оптимальні програми терапії.

Розроблено нові критерії прогнозу МДС РАНБ І та РАНБ ІІ з використанням рівня вмісту субстратних клітин КМ та ПК, що експресують маркери диференціації CD34, CD34/117, CD33. Запропоновано спосіб прогнозування перебігу МДС (деклараційний патент України на корисну модель №1449 u 201700764 від 27 січня 2017 року). Також запропоновано спосіб прогнозування перебігу МДС РАНБ І а РАНБ ІІ на основі визначення вмісту субстратних клітин КМ та ПК з експресією внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67 (деклараційний патент України на корисну модель №1450 u 2017007665 від 27 січня 2017 року).

Застосування в клінічній практиці запропонованих способів прогнозування дає можливість визначити ймовірність отримання загальної або повної відповіді на терапію та призначати, у кожному випадку, лікування.

Впровадження отриманих результатів. Результати дослідження впровадженні в роботу гематологічних відділень 1 та 2 Київської міської клінічної лікарні № 9, Військово-медичному управлінні Служби безпеки України, Обласній клінічній лікарні м. Івано-Франківська.

Особистий внесок здобувача. Автором проведено аналіз наукових літературних джерел за темою роботи, обґрунтовано актуальність дослідження, обрано мету та сформовано його дизайн, а також завдання, оцінено отримані результати і співставлено дані клінічних, лабораторних та імунофенотипових предикторів між собою, сформовано електронну базу обстежуваних хворих на МДС, проведена статистична обробка, оцінка результатів лікування та інтерпретація одержаних даних, написано всі розділи дисертації і сформульовано всі наукові положення, висновки та практичні рекомендації.

Імунофенотипування зразків ПК та КМ хворих на МДС РАНБ І, РАНБ ІІ проведено у лабораторії онкогематології ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» та, частково, в приватній лабораторії Євролаб.

Автор щиро вдячний завідувачу лабораторії онкогематології доктору біологічних наук Гордієнко А.І. та співробітникам лабораторії Кубаровій В.О. і Шоропу Е.В. за допомогу в проведенні дослідженнь.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи представлені та обговорені на: конференції «Актуальні питання фармацевтичноїі медичної науки і практики», м. Запоріжжя, 2010; Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій Всесвітньому дню здоров'я «Стійкість до протимікробних препаратів», м. Київ, 2011; міжнародному конгресі «Актуальні проблеми сучасної медицини», м. Київ, 2011; VI Міжнародному медичному форумі «Інновації в медицині - здоров'я нації», м. Київ, 2015; VIІ Міжнародному медичному формі «Інновації в медицині - здоров'я нації», м. Київ, 2016; Міжнародній науково-практичній конференції «Медична наука та практика: актуальні питання взаємодії», м. Київ, 2016; Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні тенденції розвитку медичної науки та медичної практики», м. Львів, 2016.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 18 наукових праць: 9 статей, із них 6 - в журналах і збірниках наукових праць, які рекомендовані ДАК України, 3 - у закордонних виданнях; 7 тез доповідей на з'їздах та наукових конференціях, 2 патенти України на корисну модель.

Структура та об'єм роботи: Дисертаційна робота викладена на 183 сторінках (160 сторінок основного тексту) і складається зі вступу, огляду літератури, розділу «матеріали і методи дослідження», розділів за результатами власних дослідень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел літератури, який містить 134 першоджерела (4 кирилицею, 130 латиницею). Робота ілюстрована 27 таблицями та 49 рисунками.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Об'єктом дослідження було 113 хворих на МДС, із них МДС РАНБ І - 83 пацієнти, МДС РАНБ ІІ - 30 осіб відповідно до ФАБ класифікації, які перебували на лікуванні у гематологічному відділенні та консультативній поліклініці ДУ «Інститут гематології та трансфузіології НАМН України» і гематологічних відділеннях 1 та 2 КМКЛ № 9. Тривалість захворювання на МДС РАНБ I та РАНБ II на час включення в дослідження варіювала від 4 до 30 місяців та від 3 до 25 місяців відповідно.

Верифікація діагнозу проводилась на підставі загальноклінічних, цитоморфологічних, гістологічних, цитогенетичних методів обстеження.

Для кількісної та якісної оцінки стану гемопоезу у хворих на МДС проводили підрахунок гемограми та мієлограми з оцінкою диспластичних змін у клітинах крові та кісткового мозку. Для ідентифікації імунофенотипового профілю пухлинних клітин КМ і ПК використовувалися відповідні моноклональні антитіла (МКА) фірми Becton Dickinson (USA), що кон'юговані з двома різними флюорохромами - флюоресцеінізотіоціанатом (FITC) і фікоеритрином (PE). Поряд з цим, проводилося детектування антигенів стовбурових клітин-попередників за допомогою анти-CD34, анти-CD117 та анти-СD 33. Для визначення внутрішньоядерного білка Ki-67 використовували МКА FITC-njugated Armenian Hamster IgG Monoclonal Isotype Control і FITC.

Для статистичної обробки отриманих даних використано: тест Стьюдента, Фішера, Пуассоновське розподілення, метод Каплана-Мейера, модель Кокса, а також ROC-криві. Цифрові дані аналізували за допомогою програмного забезпечення пакету Statistica 10.0 (StatSoft, США), MedCalc 12.5.00 (MedCalc Software, Ostend, Бельгія) та за допомогою програми “Excel” з пакету “Microsoft Office 2010”.

Результати власних досліджень їх аналіз та узагальнення. Поширеність підтипів захворювання відрізняється між собою за кількістю хворих у кожній групі, які включені у дослідження.

Група хворих на МДС РАНБ І представлена 47 (56,63 %) чоловіками та 36 (43,37%) жінками, а когорта МДС РАНБ ІІ - 17 (56,66 %) чоловіками та 13 (43,34%) жінками. Вік хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ коливався від 39 до 80 років та від 45 до 77 років відповідно, а його середнє значення становило 67,05 ± 11,17 та 66,73 ± 8,44 років відповідно. Тривалість захворювання пацієнтів на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ на час включення в дослідження, варіювала від 4 до 30 місяців та від 3 до 25 місяців відповідно. Медіана загального клінічного спостереження за хворими на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ складала 15,00 міс (25-процентиль - 11,00 міс та 75-процентиль - 18,00 міс) та 10,75 міс (25-процентиль - 6,20 міс та 75-процентиль - 15,00 міс) відповідно.

Проведено аналіз лабораторно-гематологічних даних, зокрема цитоморфологічного дослідження крові з підрахунком лейкограми та мієлограми хворих на МДС. Під час аналізу враховували, яка саме специфічна терапія ініціально була призначена хворим на МДС РАНБ І - цитостатична або імуномодулююча талідомідом. Всім пацієнтам з МДС РАНБ ІІ проводилась терапія цитостатичними засобами. Звертали увагу на факт трансфузійної залежності. Окремо оцінено ефективність лікування імуномодулюючим засобом - (талідомідом) 27 хворих на МДС РАНБ І, відповідно до критеріїв Міжнародної робочої групи з оцінки відповіді МДС, переглянутих у 2006 році.

Рис. 1. Експресія Кі-67 в клітинах - попередниках мієлоїдного паростку у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ.

Проаналізовано особливості експресії Кі-67 у клітинах мієлоїдного походження в 59 хворих на МДС РАНБ І та у 12 пацієнтів з МДС РАНБ ІІ до призначення їм специфічного лікування.

Показано, що у пацієнтів із МДС РАНБ І, порівняно з хворими на МДС РАНБ ІІ, спостерігається менший відсоток Кі-67 в ядрі клітин мієлоїдного паростку, як у ПК, так і в КМ. Це свідчить про вищій проліферативний потенціал клональних клітин мієлоїдного паростку при МДС РАНБ ІІ, ніж при МДС РАНБ І.

Поміж симптомів, що враховувались у нашому дослідженні, перші три позиції в групі хворих на МДС РАНБ І на момент верифікації діагнозу займали: загальна слабкість, збільшення розміру печінки, що визначено пальпаторно, запаморочення, а в когорті пацієнтів із МДС РАНБ ІІ - загальна слабкість, запаморочення, геморагічний синдром та втрата ваги на 10 % за останні 6 місяців.



Рис. 2. Діаграма частоти симптомів у хворих на МДС РАНБ І (знизу) та РАНБ ІІ (вгорі) на момент верифікації діагнозу.

При аналізі показників ПК виявлено статистично значимо більшу абсолютну кількість еритроцитів та, на межі статистичної доведеності (р = 0,074), відносну кількість мієлоцитів у пацієнтів із МДС РАНБ І, порівняно з хворими на МДС РАНБ ІІ.

Натомість у хворих на МДС РАНБ ІІ, на момент верифікації діагнозу, в ПК визначено більшу відносну кількість бластів та промієлоцитів, ніж у пацієнтів із МДС РАНБ І.

Таблиця 1 Показники ПК у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ

Показники	МДС РАНБ І n = 83; M ± m	МДС РАНБ ІІ n = 30; M ± m	р
Еритроцити, 1012/л	2,35 ± 0,32	2,11 ± 0,39	0,004
Гемоглобін, г/л	66,89 ± 9,03	66,51 ± 10,89	0,794
Тромбоцити, 109/л	63,93 ± 35,35	64,33 ± 15,10	0,122
Лейкоцити, 109/л	2,51 ± 0,66	2,53 ± 0,44	0,892
Бласти, %	0,51 ± 1,09	1,75 ± 0,56	? 0,0001
Промієлоцити, %	0,26 ± 1,19	1,75 ± 0,58	0,004
Мієлоцити, %	2,72 ± 3,18	1,61 ± 1,84	0,074
Метамієлоцити, %	1,10 ± 2,77	0,98 ± 2,36	0,829
Палочкоядерні та сегментоядерні нейтрофіли, %	53,95 ± 13,07	61,13 ± 6,12	0,004

Поміж усіх показників мієлограми у групі хворих на МДС РАНБ ІІ констатовано тільки більше середнє значення загального відсотка бластів та мієлобластів у порівнянні з групою пацієнтів із МДС РАНБ І.

Підсумовуючи наведене, у всіх хворих на МДС РАНБ І, які були включені в дослідження, функціональний статус відповідав ECOG 1 та ECOG 2. Так, 21 (24,41 %) із 86 пацієнтів із МДС РАНБ І мали статус ECOG 1, а отже статус ECOG 2 спостерігався в 65 (75,59 %) хворих.

У групі МДС РАНБ ІІ усі пацієнти мали функціональний статус на рівні ECOG 2 та ECOG 3. 7 (23,33 %) та 23 (76,67 %) із 30 хворих на МДС РАНБ ІІ відповідали статусу ECOG 3 та ECOG 2 відповідно.

Рис. 3. Експресія Кі-67 в клітинах-попередниках мієлоїдного паростку у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ.

У рамках аналізу особливостей експресії Кі-67 у хворих на МДС РАНБ І при лікуванні імуномодулюючим препаратом (талідомід) визначено відсоток даного маркеру проліферації в клітинах мієлоїдного походження у 27 хворих із різним рівнем відповіді на терапію.

Доведено, що лікування талідомідом знижує кількість Кі-67-позитивних клітин в ПК та КМ хворих на МДС РАНБ І порівняно з ініціальним періодом.



Рис. 4. Експресія Кі-67 клітинами попередниками мієлоїдного паростку у хворих на МДС РАНБ І і РАНБ ІІ до та після терапії цитостатичними засобами.

Динаміку експресії маркера проліферації Кі-67 субстратними кітлинами проведено у 32 хворих на МДС РАНБ І та 12 пацієнтів із МДС РАНБ ІІ, які лікувались цитостатичними засобами.

Проведеним дослідженням встановлено, що лікування цитостатичними препаратами знижує кількість Кі-67-позитивних клітин в ПК та КМ хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ.

Рис. 5. Кумулятивна пропорція безпрогресивної виживаності при терапії цитостатичними та імуномодулюючим препаратом талідомід.

У рамках оцінки ефективності лікування талідомідом у 27 хворих на МДС РАНБ І проведено порівняння загальної кумулятивної безпрогресивної виживаності з періодом перебігу захворювання без прогресії у 56 пацієнтів із наведеним нозологічним профілем, що отримували терапію цитостатичними препаратами. Підтверджено, що у всіх хворих на МДС РАНБ І, у яких констатовано повну відповідь на терапію талідомідом, спостерігався відсоток Кі-67-позитивних клітин у ПК менше 1,2 % (7 із 7 проти 0 із 20; р ? 0,0001) та в КМ менше 6,9 % (7 із 7 проти 0 із 20; р ? 0,0001), натомість, у всіх пацієнтів з іншою відповіддю на лікування виявлено вище значення наведеного показника.

Отже ймовірність того, що у хворого на МДС РАНБ І із Кі-67-позитивними клітинами у ПК менше 1,2 % та в КМ менше 6,9 % буде спостерігатись повна відповідь на терапію талідомідом у 39,37 (95 % ДІ = 2,53-612,51) разів більша, ніж у пацієнтів з вищім рівнем зазначеного показника.

У всіх хворих на МДС РАНБ І з відсутністю відповіді на терапію або прогресією на лікуванні в РАНБ ІІ, спостерігався вміст Кі-67-позитивних клітин у ПК більше 6,3 % (9 із 9 проти 9 із 18; р = 0,011) та в КМ більше 9,8 % (9 із 9 проти 4 із 18; р ? 0,0001), натомість тільки у 50,0 % та 22,22 % пацієнтів відповідно, з іншим рівнем відповіді на лікування та без прогресії виявлено більше значення наведеного показника внутрішньоядерного маркеру проліферації.

Відносний ризик того, що у хворого на МДС РАНБ І із Кі-67-позитивними клітинами у КМ більше 9,8 % буде відсутня відповідь на терапію імуномодулюючим препаратом у 39,37 (95 % ДІ = 2,53-612,51) разів вищій порівняно з пацієнтами з нижчим рівнем зазначеного показника.

У хворих на МДС РАНБ І, що отримували лікування талідомідом, визначався триваліший перебіг захворювання без прогресії, ніж у пацієнтів на терапії цитостатичними препаратами.



Рис. 6. Експресія маркерів диференціації на субстратних клітинах в КМ у хворих на МДС РАНБ І до та після терапії талідомідом.

Вивчення динаміки експресії CD34, CD34/117, CD33 на субстратних клітинах КМ у хворих на МДС РАНБ І після проведення лікування імуномодулюючими препаратами проведено у 27 хворих.

На першому етапі дослідження порівняно відсоток CD34+, CD34+/117+ та CD33+ клітин у хворих на МДС РАНБ І до терапії та після неї.

Визначено, що у хворих на МДС РАНБ І після лікування талідомідом зменшується відсоток CD34-позитивних та збільшується кількість CD33-позитивних клітин у КМ порівняно з дотерапевтичним етапом. Рівень CD34+ клітин ? 13,6 %, CD34+/117+ клітин ? 12,2 та CD33+ клітин > 20,1 % у КМ є найбільш оптимальним, із відмінним рівнем ефективності (ППК = 0,95, ППК = 0,90 та ППК = 1,00 відповідно) для прогнозування повної відповіді на терапію талідомідом у хворих на МДС РАНБ І. Натомість показником із дуже добрим рівнем ефективності (ППК = 0,85) для предикції невдачі на терапію імуномодулятором при МДС РАНБ І, а також прогресії в МДС РАНБ ІІ протягом 10,00 міс виявилось значення CD34+ клітин > 15,3 %. Медіана клінічного спостереження за пацієнтами, яким проводилась терапія талідомідом, складала 10,00 міс (25- та 75-процентиль становить 8,00 міс та 22,00 міс відповідно), а кількість хворих, в яких визначалась прогресія з МДС РАНБ І у РАНБ ІІ, становила 9 (33,33 %) із 27 осіб.



Рис. 7. Експресія маркерів диференціації на субстратних клітинах у хворих на МДС РАНБ І і РАНБ ІІ до та після терапії цитостатичними препаратами.

Проаналізовано результати імунофенотипування субстратних клітин до та після лікування цитостатиками 24 хворих на МДС РАНБ І та 18 пацієнтів із МДС РАНБ ІІ. Підтверджено, що у хворих на МДС РАНБ І при лікуванні цитостатичними препаратами підвищується відсоток CD33+ клітин у КМ, у пацієнтів із МДС РАНБ ІІ - також зростає рівень CD33+ клітин, та знижується кількість CD34+/117+ клітин порівняно з дотерапевтичним етапом.

Дискримінаційний аналіз використано для розрахунку, яка саме кількість CD34+, CD34+/117+, CD33+ клітин у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ є значущою для прогнозування відповіді на терапію та прогресії захворювання в РАНБ ІІ і трансформації в ГМЛ.

Доведено, що вміст CD34+ клітин ? 14,6 % характеризується середньою потужністю (ППК = 0,76), кількість CD34+/117+ клітин ? 18,9 % - дуже доброю ефективністю (ППК = 0,86), а CD33+ клітин > 28,1 % - відмінною дискримінаційною здатністю (ППК = 1,00) для предикції повної відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ І.

цитоморфологічний мієлодиспластичний лікування імуномодулюючий



Рис. 8. Кумулятивні криві виживаності.

Для прогнозування відсутності відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ І доречно враховувати відсоток CD34+ клітин > 14,6 % та CD33+ клітин ? 9,8 %, що характеризується відмінною потужністю (ППК = 0,95 та ППК = 1,00 відповідно), а також відсоток CD34+/117+ клітин > 28,9 % - дуже доброю ефективністю (ППК = 0,89).

Встановлено, що у хворих на МДС РАНБ І із повною відповіддю на терапію вміст CD34+ клітин ? 14,6 % (7 із 7 осіб проти 6 із 17 осіб, р = 0,005), CD34+/117+ клітин ? 18,9 % (7 із 7 осіб проти 5 із 17 осіб, р = 0,004), CD33+ клітин > 28,1 (7 із 7 осіб проти 6 із 17 осіб, р ? 0,0001) зустрічався доведено частіше, ніж у пацієнтів з іншим рівнем відповіді на терапію. Ймовірність часткової відповіді на терапію цитостатиками при рівні CD33+ клітин > 28,1 зростає в 21,66 (95 % ДІ = 1,40-333,42) рази.

Доведено, що кількість CD34+ клітин ? 33,2 %, CD34+/117+ клітин ? 46,5 та CD33+ клітин > 29,9 % характеризується відмінною потужністю (ППК = 1,00, ППК = 1,00 та ППК = 0,92 відповідно) для прогнозування часткової відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ ІІ. Відповідно для прогнозування відсутності відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ ІІ відсоток CD34+ клітин > 33,2 %, CD34+/117+ клітин > 46,5 та CD33+ клітин ? 29,9 % також характеризується відмінною потужністю (ППК = 1,00, ППК = 0,97 та ППК = 0,97 відповідно).

У хворих на МДС РАНБ ІІ із частковою відповіддю на терапію кількість CD34+ клітин ? 33,2 % (8 із 8 осіб проти 0 із 10 осіб, р ? 0,0001), CD34+/117+ клітин ? 46,5 (8 із 8 осіб проти 0 із 10 осіб, р ? 0,0001), CD33+ клітин > 29,9 % (8 із 8 осіб проти 5 із 10 осіб, р = 0,035) зустрічалась доведено частіше, ніж у пацієнтів з іншим рівнем відповіді на терапію. Ймовірність часткової відповіді на терапію цитостатиками при наявності відсотка CD34+ клітин ? 33,2 % та CD34+/117+ клітин ? 46,5 в КМ хворих на МДС РАНБ ІІ зростає в 20,77 (95 % ДІ = 1,37-313,12) рази.

Вміст CD34+ клітин > 14,6 % та CD33+ клітин ? 19,2 % характеризується відмінною потужністю (ППК = 0,95 та ППК = 1,00 відповідно), а відсоток CD34+/117+ клітин - дуже доброю ефективністю (ППК = 0,89) для предикції прогресії МДС РАНБ І у РАНБ ІІ на терапії цитостатичними препаратами протягом 18,0 міс.

У хворих на МДС РАНБ ІІ із кількістю CD33+ клітин більше ніж 29,9 % спостерігалась довша загальна безпрогресивна виживаність (р ? 0,0001) та більша її медіана (6,50 міс; 25-процентиль - 4,50 міс та 75-процентиль - 9,50 проти 5,00 міс; 25-процентиь - 4,00 міс та 75-процентиль - 7,00 міс; р ? 0,0001), а також визначалось скорочення ймовірності трансформації в ГМЛ (HR = 0,16, 95 % ДІ = 0,01-0,94), порівняно з пацієнтами з меншим відсотком зазначеного показника імунофенотипування КМ.

Вища загальна кумулятивна безпрогресивна виживаність у хворих на МДС РАНБ ІІ на терапії цитостатичними препаратами спостерігається при наявності у КМ вмісту CD34+ клітин менше ніж 33,2 % та CD34+/117+ менше ніж 46,5 %, у порівнянні з пацієнтами із вищім рівнем зазначених маркерів диференціації. У хворих на МДС РАНБ ІІ із кількістю CD33+ клітин більше 29,9 %, порівняно з пацієнтами з меншим їх відсотком, спостерігалась довша загальна безпрогресивна виживаність та її медіана (6,50 міс проти 5,00 міс), а також скорочення ймовірності трансформації в ГМЛ (HR = 0,16).

Таблиця 2 Динаміка експресії маркерів диференціації на субстратних клітинах КМ у хворих на МДС РАНБ ІІ з різною відповіддю на терапію

Клітини, %	Часткова відповідь на терапію (n = 8)	Відсутність відповіді на терапію (n = 10)	р
	% ( ± %)	% ( ± %)
CD34+	30,81 ± 1,76	48,80 ± 1,85	? 0,0001
CD34+/117+	39,52 ± 4,16	64,21 ± 4,25	? 0,0001
CD33+	28,75 ± 5,95	20,06 ± 6,64	0,0003

Дискримінаційний аналіз використано для розрахунку, яка саме кількість CD34+, CD34+/117+, CD33+ клітин у хворих на МДС РАНБ І та РАНБ ІІ є значущою для прогнозування відповіді на терапію та прогресії захворювання в РАНБ ІІ та трансформації в ГМЛ відповідно.

Доведено, що відсоток CD34+ клітин ? 14,6 % характеризується середньою потужністю (ППК = 0,76), відсоток CD34+/117+ клітин ? 18,9 % - дуже доброю ефективністю (ППК = 0,86), а CD33+ клітин > 28,1 % - відмінною дискримінаційною здатністю (ППК = 1,00) для предикції повної відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ І.

Для прогнозування відсутності відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ І доречно застосовувати відсоток CD34+ клітин > 14,6 % та CD33+ клітин ? 9,8 %, що характеризується відмінною потужністю (ППК = 0,95 та ППК = 1,00 відповідно), а також відсоток CD34+/117+ клітин >28,9 % - дуже доброю ефективністю (ППК = 0,89).

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі на основі комплексу клініко-гематологічних даних та динаміки маркерів диференціації CD34, CD34/CD117, CD33 і внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67 здійснено теоретичне узагальнення та представлено нове вирішення актуальної задачі - прогнозування перебігу МДС і визначення групи ризику як додаткових предикторів формування відповіді на лікування.

1. Встановлено, що у пацієнтів із МДС РАНБ І, порівняно з хворими на МДС РАНБ ІІ, спостерігається менший відсоток Кі-67 в ядрі клітин мієлоїдного паростку, що виявлені як в ПК (5,9 % проти 10,6 %), так і в КМ (11,4 % проти 16,5 %). Найбільш патогномонічний саме для МДС РАНБ І відсоток Кі-67-позитивних клітин у ПК становить ? 8,5 % (ППК = 0,96), а в КМ - ? 14,7 % (ППК = 0,97). Доведено, що при МДС РАНБ І ймовірність наявності Кі-67 позитивних клітин в ПК ? 8,5 % в 5,94 рази, а в КМ ? 14,7 % - 23,41 вища, ніж при РАНБ ІІ.

2. Показано, що дискримінаційно значущим, із відмінним рівнем ефективності, для прогнозування повної відповіді на терапію талідомідом при МДС РАНБ І є відсоток Кі-67-позитивних клітин в ПК ? 1,2 % (ППК = 1,00), а в КМ - ? 6,9 % (ППК = 1,00).

3. Доведено, що прогностичним критерієм відсутності відповіді на терапію і прогресії МДС є вміст Кі-67-позитивних клітин у ПК та КМ відповідно: більше 6,3 % (ППК = 0,80) і 9,8 % (ППК = 0,92) при лікуванні талідомідом та більше 4,3 % (ППК = 0,85) і 9,8 % (ППК = 0,83) - при терапії цитостатичними засобами.

4. Визначено, що відсоток CD34+ клітин ? 13,6 %, CD34/117 клітин ? 12,2 та CD33+ клітин > 20,1 % у КМ є найбільш оптимальним рівнем, із відмінним рівнем ефективності (ППК = 0,95, ППК = 0,90 та ППК = 1,00 відповідно), для прогнозування повної відповіді на терапію талідомідом у хворих на МДС РАНБ І.

5. Показником із дуже добрим рівнем ефективності (ППК = 0,85) для предикції невдачі на терапію імуномодулятором при МДС РАНБ І, а також прогресії в МДС РАНБ ІІ виявилось значення CD34+ клітин > 15,3 % у КМ.

6. Дискримінаційно значущими щодо прогнозування прогресії МДС РАНБ І в РАНБ ІІ на терапії цитостатичними засобами є відсотки CD34+ та CD 34+/117+ клітин > 14,6 % (ППК = 0,95) та > 18,9 % (ППК = 1,00) відповідно, а CD33+ клітин - ? 19,2 % (ППК = 0,89).

7. Дискримінаційно значущими щодо прогнозування трансформації МДС РАНБ ІІ у ГМЛ на терапії цитостатичними препаратами є відсотки CD34+ клітин > 33,2 % (ППК = 1,00) та CD34+/117+ клітин > 46,5 % (ППК = 1,00), а CD33+ клітин - ? 29,9 % (ППК = 0,92).

8. Показано, що вміст CD34+ клітин у КМ ? 14,6 % характеризується середньою потужністю (ППК = 0,76), CD34+/117+ клітин ? 18,9 % - дуже доброю ефективністю (ППК = 0,86), а CD33+ клітин > 28,1 - відмінною дискримінаційною здатністю (ППК = 1,00) для предикції повною відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ І. Ймовірність повної відповіді на таке лікування дорівнює 21,66 (ВР = 21.66). Вміст CD34+ клітин ? 33,2 %, CD34+/117+ клітин ? 46,5 % та CD33+ клітин > 29,9 % характеризується відмінною потужністю (ППК = 1,00, ППК = 1,00 та ППК = 0,92 відповідно) для прогнозування повної відповіді на терапію цитостатиками при МДС РАНБ ІІ, при цьому ймовірність становить 20,77 (ВР = 20,77).

Практичні рекомендації

1. До існуючого комплексу обстежень хворих на МДС РАНБ I та РАНБ II рекомендується включати визначення маркерів диференціації CD34, CD34/117, CD33 та внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67, що експресуються субстратними клітинами ПК та КМ.

2. При призначенні імуномодулюючих засобів, зокрема талідоміду, хворим на МДС РАНБ I необхідно враховувати, що ймовірність отримання повної відповіді можлива при рівні Кі-67 позитивних клітин у ПК ? 1,2%, у КМ ? 6,9%

3. Рекомендується враховувати рівень вмісту субстратних клітин у КМ, котрі експресують антигени CD34 ? 13,6, CD34/117 ? 12,2 та CD33 > 20,1%, що є прогностично значущими для отримання повної відповіді при лікуванні талідомідом хворих на МДС РАНБ I.

4. Для призначення оптимальної програми цитостатичної терапії хворим на МДС РАНБ I та РАНБ II рекомендується досліджувати маркери диференціації субстратних клітин у КМ, враховуючи, що предиктором негативної відповіді або прогресування патологічного процесу є рівень еспресії субстратними клітинами CD34 > 14,6%, CD 34/117 > 18,9% та CD33 < 19,2%.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Третяк Г.С. Формування імунітету при хронічних мієлопроліферативних захворюваннях // Український науково-медичний молодіжний журнал. - 2010. - № 2. - С. 53-54.

2. Гордієнко А.І. Роль імунорегуляторних субпоауляцій Т-лімфоцитів в прогресуванні хронічної мієлоцитарної лейкемії / Гордієнко А.І., Кубарова О.В., Стародуб Г.С., Третяк Н.М., Горяінова Н.В. // Гематологія і переливання крові: міжвідомчий збірник. - К., 2014. - Випуск 37. - С.73-78. (Здобувачем проведено відбір пацієнтів для дослідження, аналіз клініко-гематологічних даних, створено електронну базу даних, написано частину статті, зроблено висновки).

3. Стародуб Г.С. Взаємоз'язок клініко-гематологічних та імунологічних показників у хворих на мієлодиспластичний синдром / Г.С. Стародуб О.В. Басова, Н.В. Горяінова, Н.М. Третяк А.І. Гордієнко // Сімейна медицина. - 2016. - № 3 (65). - С. 26-30. (Здобувачем здійснено відбір пацієнтів для дослідження, збір клінічного матеріалу, аналіз клініко-лабораторних показників, зроблено висновки).

4. Стародуб Г.С. Ефективність застосування талідоміду у хворих на мієлодиспластичний синдром / Стародуб Г.С. Горяінова Н.В., Перехрестено Т.П. // Молодий вчений. - 2016. - № 12.1 (40). - С. 238-246. (Дисертантом сформульована ідея дослідження, створено електронну базу даних, проведено статистичну обробку матеріалів, проаналізовані результати, написано статтю).

5. G.S. Starodub Proliferative activity of haematopoietic cells of the bone marrow and peripheral blood and event-free survival of patients with myelodysplastic syndrome - refractory anaemia with excess of blasts-1 (RAEB-1) / G.S. Starodub // Hematology. Transfusiology. Eastern Europe. - 2016. - vol.2, №2. - Р. 211-216.

6. G.S. Starodub Kі-67 as a prognostic factors of myelodysplastic syndrome / G.S. Starodub, N.V. Goryainova, T.P. Perekhrestenko, O.V. Basova, N.M. Tretiak, A.I. Gordiienko // Український науково медичний молодіжний журнал. - 2016. - № 2 (95). - С. 5-8. (Дисертанту належить ідея дослідження, аналіз клініко-лабораторних і статистичних даних, написання статті, узагальнення результатів).

7. G. S. Starodub Peculiarities of changes in expression of ki-67 proliferation marker by hematopoietic peripheral blood and bone marrow cells in patients with myelodysplastic syndrome // G. S. Starodub Fundamental and applied researches in practice of leading scientific school/ [електронний ресурс] доступ http:orcid.org/ 0000-0003-4037-9652 Issue: 6 (12)- co-publ.: 2015. - Р. 145-151;

8. Starodub G.S. Population and subpopulation composition of the peripheral blood in patients with myelodysplastic syndrome - refractory anemia with excess of blasts-1 (RAEB-1) at different stages of the disease / Starodub G.S., Goriainova N.V., Basova O.V // Fundamental and applied researches in practice of leading scientific schools. Issue: 4 (16) - 2016. - Р. 28-33. (Здобувачем проведено відбір пацієнтів для дослідження, аналіз клініко-гематологічних даних та ефективності лікування, написано статтю).

9. Starodub G.S. Peculiarities of changes in expression of Ki-67 proliferation marker by haematopoietic peripheral blood and bone marrow cells in patients with myelodysplastic syndrome / G.S. Starodub // Fundamental and applied researches in practice of leading scientific schools. Issue: 3 (15) - 2016. - Р. 66-70.

10. Третяк Г.С. Комплексна оцінка клінічного стану для вивчення мієлодиспластичного синдрому (МДС) / Третяк Г.С., Вакульчук О.М., Калініна С.Ю., Третяк Н.М. // Матеріали науково-практичної конференції “Сучасні аспекти медицини та фармакології”. - (Запоріжжя, 13-14 травня 2010р.). - Запоріжжя, 2010 - Том 28.- С. 69-71.

11. Третяк Г.С. Досвід застосування Дакогену для лікування хворих на мієлодиспластичний синдром та хронічну мієломоноцитарну лейкемію / Третяк Г.С. // Український науково-медичний молодіжний журнал. - 2012. - № 1- С. 108-110.

12. Г.С. Стародуб, Н.М. Третяк, А.І. Гордієнко, В.О. Кубарова, Н.В. Горяінова, О.В. Басова, Є.В. Шороп Імунофенотип пухлинних клітин кісткового мозку у хворих на мієлодиспластичний синдром / Г.С. Стародуб, Н.М. Третяк, А.І. Гордієнко, В.О. Кубарова, Н.В. Горяінова, О.В. Басова, Є.В. Шороп // Гематологія і переливання крові: міжвідомчий збірник. - К., 2015. - Випуск 38. - С. 470-471.

13. Стародуб Г.С. Клініко-гематологічний статус та вміст окремих цитокінів у сироватці крові хворих на мієлодиспластичний синдром / Стародуб Г.С., Кубарова О.В., Гордієнко А.І., Третяк Н.М. // Матеріали конгресу VІ міжнародний медичний форум “Іновації в медицині-здоров'я нації”. - (Київ, 15-17 квітня 2015р.). - С. 65 [електронний доступ Katalog IMF 16 tezisy all pdf 2015].

14. Стародуб Г.С. Динаміка експресії маркера проліфератівної активності Кі-67 на гемопоетичних клітинах переферичної крові та кісткового мозку хворих на мієлодиспластичний синдром при лікуванні імуномодулюючими засобами / Стародуб Г.С., Горяінова Н.В., Басова О.В. // Міжнародна науково-практична конференція «Медична наука та практика: актуальні питання взаємодії» (м. Київ, 2-3 вересня 2016 р.). - Київ, 2016. - С. 134-136.

15. Стародуб Г.С. Експресія внутрішньоядерного білка Ki-67 у клітинах крові хворих на МДС РАНБ І / Стародуб Г.С., Кубарова В.О., Гордієнко А.І., Басова О.В., Третяк Н.М. // V Ювілейний міжнародний медичний конгрес «Впровадження сучасних досягнень медичної науки у практику охорони здоров'я Україи» (м. Київ, 19-21 квітня 2016 р.). - Київ, 2016. - С. 64 [електронний доступ Katalog IMF 16 tezisy all pdf 2016].

16. Стародуб Г.С. Динаміка експресії імунологічних показників у хворих на МДС РАНБ I з різною відповіддю на лікування талідомідом / Стародуб Г.С., Горяінова Н.В., Басова О.В. // «Сучасні тенденції розвитку медичної науки та медичної практики». - (м. Львів, 23-24 грудня 2016 р.). - Львів, 2016. - С. 79-81.

17. Деклараційний патент 286 МПК G01N 33/48 Спосіб прогнозування перебігу МДС РАНБ І та РАНБ ІІ з врахуванням динаміки експресії маркера проліферативної активності Кі-67 / Н.М. Третяк, Г.С. Стародуб, Н.В. Горяінова, О.В. Басова, Т.П. Перехрестенко, В.О. Кубарова, А.І. Гордієнко (Україна); заявник та патентовласник Н.М. Третяк №1449 u 201700764 від 27 січня 2017 року. (Автор брала участь у проведенні патентно-інформаційного пошуку, розробці способу та його апробації).

18. Деклараційний патент 287 МПК G01N 33/48 Спосіб прогнозування перебігу МДС РАНБ І та РАНБ ІІ на основі визначення вмісту субстратних клітин КМ та ПК, що експресують маркери диференціації CD 34+, CD 34+/117, CD 33+ / Н.М. Третяк, Г.С. Стародуб, Н.В. Горяінова, О.В. Басова, Т.П. Перехрестенко, В.О. Кубарова, А.І. Гордієнко (Україна); заявник та патентовласник Н.М. Третяк №1450 u 201700765 від 27 січня 2017 року. (Автор розробила спосіб, проводила його апробацію брала участь у проведенні патентно-інформаційного пошуку).

АНОТАЦІЯ

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.31 - гематологія та трансфузіологія. - ДУ “Інститут гематології та трансфузіології НАМН України”, Київ, 2017.

У дисертаційній роботі представленні критерії прогнозування прогресії МДС та ефективності терапії на підставі визначення інтенсивності експресії маркерів проліферації CD34, CD34/CD117, CD33 та Кі-67 субстратними клітинами КМ та ПК. Наведені результати клініко-гематологічного обстеження, дані імунофенотипування та визначення маркера проліферації Кі-67. Визначено прогностичну та діагностичну валідність маркерів диференціації субстратних клітин ПК та КМ CD34+, CD34+/117+, CD33+ та внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67 у хворих на МДС РАНБ І і МДС РАНБ ІІ, на підставі чого уточнені додаткові предиктори отримання позитивної відповіді на лікування або прогресування патологічного процесу з трансформацією в ГЛ. Встановлено оптимальний рівень вмісту субстратних клітин ПК та КМ для прогнозування повної відповіді на терапію імуномодулятором. Отримано нові докази прогностичної ефективності визначення експресії внутрішньоядерного маркера проліферативної активності Кі-67 субстратних клітин КМ та ПК при МДС РАНБ І та РАНБ ІІ. Встановлено існування прямого кореляційного зв'язку між відсотком мієлобластів у КМ та рівнем субстратних клітин з експресією CD34+, CD34+/117+ у ПК у хворих на МДС РАНБ ІІ. На підставі статистичного аналізу розраховано, що ймовірність отримати загальну та повну відповідь на терапію імуномодулюючим препаратом при МДС РАНБ І в 1,89 та 2,39 рази вища відповідно, ніж при застосуванні цитостатичних засобів. Встановлено, що у хворих на МДС РАНБ I, лікованих талідомідом, спостерігається більша медіана безпрогресивної виживаності - 19,00 міс. (частота отримання загальної відповіді 55,55 % та повної відповіді 25,92 %) порівняно з пацієнтами, що лікувались цитостатичними препаратами - медіана виживаності - 15,00 (частота повної відповіді - 7,14 %, загальної відповіді - 32,14 %). На основі отриманих результатів проведеного дослідження запропоновані нові критерії прогнозу та стратифікації хворих на МДС, які ґрунтуються на визначенні маркерів диференціації та проліферативної активності КМ та ПК.

Ключові слова: мієлодиспластичний синдром, прогнозування, маркери диференціації CD34, CD34/CD117, CD33, маркер проліферації Кі-67, лікування.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.31 - гематология и трансфузиология. - ГУ "Институт гематологии и трансфузиологии НАМН Украины", Киев, 2017.

Цель исследования: Установить критерии прогнозирования прогрессии МДС и эффективности терапии на основании определения предикативной интенсивности экспрессии CD34, CD33, CD117, Кі-67 субстратными клетками ПК и КМ.

Предметом исследования были субстратные клетки КМ и ПК, маркеры дифференциации CD34, CD34/CD117, CD33 на субстратных клетках ПК и КМ, внутриядерный маркер пролиферативной активности Кі-67 субстратных клеток КМ и ПК при МДС, программы терапии, длительность ремиссии.

Использовали такие методы исследования: клинико-гематологические, иммунофенотипические, иммуногистохимические, статистические.

Группа больных МДС РАИБ І представлена ??47 (56,63%) мужчинами и 36 (43,37%) женщинами, а когорта МДС РАИБ II - 17 (56,66%) мужчинами и 13 (43,34%) женщинами. Возраст больных МДС РАИБ І и РАИБ ІІ колебался от 39 до 80 лет и от 45 до 77 лет соответственно, а его среднее значение составляло 67,05 ± 11,17 и 66,73 ± 8,44 лет соответственно. Длительность заболевания пациентов на МДС РАИБ І и РАИБ ІІ на время включения в исследование, варьировала от 4 до 30 месяцев и от 3 до 25 месяцев соответственно. Медиана общего клинического наблюдения за больными МДС РАИБ І и РАИБ ІІ составляла 15,00 мес. (25-процентиль - 11,00 мес и 75-процентиль - 18,00 мес.) и 10,75 мес. (25-процентиль - 6,20 мес. и 75-процентиль - 15,00 мес.) соответственно.

Проведен анализ лабораторно-гематологических данных, в частности цитоморфологическое исследование крови с подсчетом лейкограммы и миелограмы больных МДС. При анализе учитывали, какая именно специфическая терапия инициально была назначена больным МДС РАИБ ІІ - цитостатическая или иммуномодулирующая талидомидом. Всем пациентам с МДС РАИБ ІІ проводилась терапия цитостатиками. Обращали внимание на факт трансфузионной зависимости. Отдельно оценена эффективность лечения иммуномодулирующим средством - (талидомид) 27 больных МДС РАИБ І, в соответствии с критериями Международной рабочей группы по оценке ответа МДС, просмотренных в 2006 году.

В диссертационной работе представлены критерии прогнозирования прогрессии МДС и эффективности терапии на основании определения интенсивности экспрессии маркеров пролиферации CD34, CD34/CD117, CD33 и Кі-67 субстратными клетками КМ и ПК. Приведены результаты клинико-гематологического обследования, данные имунофенотипирования и определения маркера пролиферации Кі-67. Определена прогностическая и диагностическая валидность маркеров дифференциации субстратных клеток ПК и КМ CD34, CD34/117, CD33 и внутриядерного маркера пролиферативной активности Кі-67 у больных МДС РАИБ I и МДС РАИБ ІІ, на основании чего уточнены дополнительные предикторы положительного ответа на лечение или прогрессирования патологического процесса с трансформацией в ОЛ. Установлен оптимальный уровень содержания субстратных клеток ПК и КМ для прогнозирования полного ответа на терапию иммуномодулятором. Получены новые доказательства прогностической эффективности определения экспрессии внутриядерного маркера пролиферативной активности Кі-67 субстратными клетками КМ и ПК при МДС РАИБ І и РАИБ ІІ. Установлено существование прямой корреляционной связи между процентом миелобластов в КМ и уровнем субстратных клеток с экспрессией CD34, CD34/117 в ПК у больных МДС РАИБ ІІ. На основании статистического анализа рассчитано, что вероятность получить общий и полный ответ на терапию иммуномодулирующим препаратом при МДС РАИБ І в 1,89 и 2,39 раза выше соответственно, чем при применении цитостатиков. Установлено, что у больных МДС РАИБ I, леченных талидомидом, наблюдается большая медиана безпрогрессивной выживаемости - 19,00 мес. (частота получения общего ответа 55,55% и полного ответа 25,92%) по сравнению с пациентами, которые лечились цитостатическими препаратами - медиана выживаемости - 15,00 (частота полного ответа - 7,14%, общего ответа - 32,14%). На основании полученных результатов проведенного исследования предложены новые критерии прогноза и стратификации больных МДС, базирующиеся на определении маркеров дифференциации и пролиферативной активности клеток КМ и ПК. Рекомендовано к существующему комплексу обследований больных МДС РАИБ I и РАИБ II включать определение маркеров дифференциации CD34, CD34/117, CD33 и ядерного маркера пролиферативной активности Кі-67, которые экспрессируются субстратными клетками ПК и КМ. При назначении иммуномодулирующих средств, в частности талидомида, больным МДС РАИБ I необходимо учитывать, что вероятность получения полного ответа возможна при уровне Кі-67 положительных клеток в ПК ? 1,2%, в КМ ? 6,9%. Рекомендуется учитывать уровень содержания субстратных клеток в КМ, которые экспрессируют антигены CD34 ? 13,6, CD34/117 ? 12,2 и CD33 > 20,1%, что является прогностически значимым для получения полного ответа при лечении талидомидом больных МДС РАИБ I. Для назначения оптимальной программы цитостатической терапии больным МДС РАИБ I и РАИБ II рекомендуется исследовать маркеры дифференциации субстратных клеток в КМ, учитывая, что предиктором отрицательного ответа или прогрессирования патологического процесса является уровень CD34 > 14,6%, CD34/117 > 18 , 9% и CD33 <19,2%.

Ключевые слова: миелодиспластический синдром, прогнозирование, маркеры дифференциации CD34, CD34/CD117, CD33, маркер пролиферации Кі-67, лечение.

Dissertation for the scientific degree of the Candidate of Medical Sciences on specialty 14.01.31 - hematology and transfusiology. - The State Institution “Institute of Haematology and Transfusion of NAMS of Ukraine”, Kyiv, 2017.

The dissertation presents the criterias for forecasting the progressions of MDS and effectiveness of the therapy based on determination of the intensity of expression of proliferation markers CD34, CD34/CD117, CD33 and Ki-67 substrate cells of bone marrow and peripheral blood. The results of clinical and hematological survey as well as data for immunophenotyping and specification of proliferation marker Ki-67 are presented in the research. The prognostic and diagnostic differentiation substrate cells markers PC CD34, CD34/117, CD33 and intranuclear proliferative activity marker Ki-67 validity has been determined for patients with MDS and MDS RAEB and RAEB II, whereby additional predictors for receiving positive response to treatment or progression of the pathological process of transformation to acute leukemia were specified. We have determined the optimum level of substrate in Peripheral blood and bone marrow cells for predicting complete response to the immunomodulator therapy. In the research we present new evidences for predictive effectiveness in determination of expression of intranuclear proliferative activity marker of the Ki-67 of substrate cells bone marrow and peripheral blood with MDS RAEB I and RAEB II. We have proved the existence of direct corelation between the percentage of myeloblasts in bone marrow and the level of substrate cells with expression CD 34, CD 34/117 in peripheral blood for patients with MDS RAEB II. Based on the statistical analysis, probability to obtain the complete response for the immunomodulatory drug therapy with MDS RAEB I is by 1,89 and 2,39 times higher, respectively, than with usage of cytotoxic drugs. In the research we show, that patients with MDS RAEB I who were treated with thalidomide have higher median of non-progressing survival - 19 months (frequency of obtaining general response 55,55% and complete response - 25,92%) comparing to the patients, who were treated with cytotoxic drugs, survival median - 15,00 (frequency of complete response - 7,14%, general response - 32,14%). Based on the obtained results of the research, we propose new criterias for predicting and stratification of patients with MDS, which are build on identification of differentiation markers and proliferative activity of bone marrow and peripheral blood.

...